用抗CCR4抗体介导细胞因子表达的方法与流程

相关申请

本申请要求2015年5月1日提交的美国临时申请号62/155966、2015年9月11日提交的美国临时申请号62/217419和2015年10月6日提交的美国临时申请号62/237942的优先权，其各自的内容在此全部并入。

本发明主要涉及调节t细胞功能。

政府利益

本发明是在美国国立卫生研究院(nationalinstituteofhealth)授予的u01ca-152990的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术：

趋化因子是主要由于其在白细胞激活和趋化性中的作用而已知的分泌蛋白家族。它们与靶细胞上趋化因子受体的特异性相互作用触发信号级联，导致炎性介质释放、细胞形状改变和细胞迁移。cc趋化因子受体4(ccr4)是cc趋化因子ccl17和ccl22的同源受体，并在功能上不同的t细胞亚组(包括t辅助2型细胞(th2))和大多数调节性t细胞(treg)上表达。越来越多的证据表明，ccl17/22分泌促进恶性实体如结肠直肠癌、卵巢癌、霍奇金淋巴瘤(hodgkin'slymphoma)和胶质母细胞瘤肿瘤浸润性treg数量增加。肿瘤中treg水平增加阻碍有效的抗肿瘤免疫应答，并且通常与不良的临床结果和肿瘤进展相关。

因此，成功的癌症治疗的一个主要障碍可能是由于treg迁移到肿瘤中以及它们抑制肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫应答而引起的。为了消除treg抑制功能并因此促进抗肿瘤免疫性，作为针对treg的免疫疗法的单克隆抗体(mab)近年来已经在临床前和临床研究中进行了评估。然而，对mab免疫疗法系统性耗尽treg的警告是其高度预期的与自体免疫的关联。避免treg诱导癌症免疫逃避的另一种策略是开发肿瘤相关treg靶向治疗，其直接阻碍treg在肿瘤组织中的吸引和累积。

技术实现要素：

本发明提供通过向有需要的受试者施用人源化抗ccr4抗体来耗尽受试者中的调节性t细胞(treg)的方法，所述抗体具有三个cdr分别具有氨基酸序列gytfasaw(seqidno:9)、inpgnvnt(seqidno:11)和styyrpldy(seqidno:13)的重链和三个cdr分别具有氨基酸序列qsilyssnqkny(seqidno:10)、wastre(seqidno:12)和hqymssyt(seqidno:14)的轻链。任选地，抗体具有igg1重链恒定区。

另一方面，本发明提供抑制受试者中调节性t细胞(treg)向细胞因子分泌性肿瘤迁移的方法，其通过向具有细胞因子分泌性肿瘤的受试者施用人源化抗ccr4抗体，所述抗体具有三个cdr分别具有氨基酸序列gytfasaw(seqidno:9)、inpgnvnt(seqidno:11)和styyrpldy(seqidno:13)的重链和三个cdr分别具有氨基酸序列qsilyssnqkny(seqidno:10)、wastre(seqidno:12)和hqymssyt(seqidno:14)的轻链。任选地，抗体具有igg4重链恒定区。在一些方面，恒定区包含s228p突变。细胞因子是ccl2、ccl4、ccl5、ccl17或ccl22。

效应t细胞实质上不耗尽。在肿瘤或受试者中效应t细胞与调节性t细胞的比例被调节，例如增加。效应t细胞增殖增加或不实质降低。效应t细胞数目增加或不实质降低。

在一些方面，调节性t细胞是滤泡调节性t细胞。

在各个方面，调节效应t细胞群的细胞因子释放。细胞因子例如干扰素-γ。另一方面，从效应t细胞群释放的效应多肽被调节。效应多肽例如粒酶b或穿孔素。

另一方面，本发明提供通过向有需要的受试者施用人源化抗ccr4抗体来抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，所述抗体具有三个cdr分别包含氨基酸序列gytfasaw(seqidno:9)、inpgnvnt(seqidno:11)和styyrpldy(seqidno:13)的重链和三个cdr分别包含氨基酸序列qsilyssnqkny(seqidno:10)、wastre(seqidno:12)和hqymssyt(seqidno:14)的轻链。该抗体具有igg4重链恒定区或igg1重链恒定区。

肿瘤是实体瘤或血液肿瘤。血液肿瘤是皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)、蕈样肉芽肿(mf)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(皮肤alcl)、塞扎里综合征(sezarysyndrome)或成人t细胞白血病/淋巴瘤(atll)。

实体瘤是肾细胞癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、皮肤癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、肝癌、胰腺癌、肾癌或胃癌、霍奇金病(hodgkinsdisease)或多形性胶质母细胞瘤(gbm)。

另一方面，本发明提供通过向受试者施用抗原和抗ccr4抗体来接种抗原的方法。抗ccr4抗体在施用抗原之前、同时或之后施用。

另一方面，本发明提供抑制il-2与ccr4⁺treg结合的方法，其包括使treg与人源化抗ccr4抗体接触，所述抗体具有三个cdr分别包含氨基酸序列gytfasaw(seqidno:9)、inpgnvnt(seqidno:11)和styyrpldy(seqidno:13)的重链和三个cdr分别包含氨基酸序列qsilyssnqkny(seqidno:10)、wastre(seqidno:12)和hqymssyt(seqidno:14)的轻链。

另一方面，本发明提供诱导cd25切割的方法，其包括使treg与人源化抗ccr4抗体接触，所述抗体具有三个cdr分别包含氨基酸序列gytfasaw(seqidno:9)、inpgnvnt(seqidno:11)和styyrpldy(seqidno:13)的重链和三个cdr分别包含氨基酸序列qsilyssnqkny(seqidno:10)、wastre(seqidno:12)和hqymssyt(seqidno:14)的轻链。

在不同的方面，人源化抗ccr4抗体是双特异性抗体的第一成员。双特异性抗体的第二成员对肿瘤相关抗原、t细胞功能调节分子、t细胞受体多肽是特异性的。肿瘤相关抗原是ca-ix、erbb2或hvem。t细胞功能调节分子是pd-l1、pd1、ctla4、gitr、il21、il21r、cd160、tim3、lag3或gal9。t细胞受体多肽是cd3。

本发明还提供药物组合物，其具有人源化抗ccr4抗体，所述抗体的量有效增加药物组合物被施用一次或多次的人受试者中存在的肿瘤中或与之相关的效应t细胞与调节性t细胞的比例。肿瘤例如是实体瘤。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践中可以使用与本文所述相似或等同的方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献全文通过引用明确地并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。另外，这里描述的材料、方法和实例仅是说明性的，并不意在限制。

本发明的其他特征和优点将从下面的详细描述和权利要求书中显而易见，并且被其涵盖。

附图说明

图1：cd4⁺t细胞群上ccr4分子的鉴定。(a)用于鉴定人t细胞群和表达ccr4的t细胞亚组的门控(gating)策略。(b)t细胞亚群的百分比。(c)在三个独立的健康供体中通过流式细胞术进行quantibritepe珠(红线)、cd25^高cd127^dim/-ccr4⁺treg(蓝线)和cd25^dim/-cd127⁺ccr4⁺t细胞(黄线)的荧光直方图。pe珠显示荧光染料包含低水平(474个pe分子/珠)、中低水平(5359个pe分子/珠)、中高水平(23843个pe分子/珠)和高水平(62336个pe分子/珠)的pe分子。(d)每个t细胞亚群中ccr4⁺亚组的百分比。(e)ccr4分子在cd4⁺cd25^-cd127⁺teff和cd4⁺cd25^高cd127^dim/-treg上的表达水平。所有实验在三个独立的供体中进行，并显示出平均值±s.e.m。

图2：ccr4⁺treg介导的免疫抑制。(a)ccr4在cd4⁺cd25⁺foxp3⁺treg上的表达通过流式细胞术进行评估。在健康供体血液样品中在cd3⁺cd4⁺淋巴细胞(左两个图)上门控的cd25和foxp3表达的代表性荧光激活细胞分选仪(facs)图和在cd25⁺foxp3⁺淋巴细胞上门控的ccr4染色(右图)。(b)用或不用20μg/mlpha和treg或ccr4^-treg(以teff：treg=10：1的比率)培养的cd4⁺效应t细胞的cfse细胞增殖概况通过门控cfse⁺细胞用流式细胞术分析。通过使用mab2-3缀合珠分离ccr4^-treg。百分比表示在培养7天后划分cfse标记的cd4⁺teff的比例。实验在三个独立的供体中重现。(c)在ccr4耗尽的treg的共培养中teff的体外抑制测定。抑制测定通过在来自三个独立的健康供体的cd4⁺cd25⁺cd127^dim/-ccr4⁺treg的存在或不存在下以teff/treg比例为10/1共培养并用pha刺激5天的cfse-标记的teff的增殖来测量。计算cfse-稀释的teff的百分比。显示平均值±s.e.m，通过双向anova分析。值˂0.05。

图3：在体外和体内通过mab2-3抑制卵巢癌细胞介导的treg趋化性。(a)在卵巢癌细胞系igrov-1、ovcar-5和ovcar-8的培养物中，添加(蓝线)或不添加(红线)布雷菲德菌素a(bfa)进行细胞内趋化因子ccl22染色。(b)使用transwell测定进行由表达ccl22的卵巢癌细胞上清液诱导的cd4⁺cd25⁺treg的体外趋化性。treg募集被mab2-3igg1和igg4抑制，但不被对照抗体抑制。(c)注射荧光化(luciferized)的cd4⁺t细胞和(d)cd4⁺cd25⁺cd127^dim/-treg后18小时的卵巢癌异种移植小鼠模型的体内生物发光图像。目标区域(roi)(红圈，异种移植的肿瘤)的强度在左图中进一步定量。结果表示为平均值±s.d。“*”和“**”分别表示斯氏t检验(student'st-test)p值<0.05和0.01。

图4：igrov-1细胞上肿瘤致敏(prime)t细胞的活性。(a)通过抗cd3、cd4、cd8、cd25和(b)ccr4抗体染色肿瘤致敏t细胞。通过流式细胞术分析通过mab2-3缀合珠的ccr4耗尽的肿瘤致敏t细胞和肿瘤致敏t细胞中的t细胞亚组。(c)将肿瘤致敏t细胞和mab2-3耗尽的肿瘤致敏t细胞与igrov-1细胞温育24和48小时，然后收集上清液并检测ifn-γ的表达水平。共培养物上清液中的ifn-γ通过mesoscalediscovery(msd)进行测量，并显示在肿瘤致敏t细胞培养物上清液中ifn-γ浓度的倍数。(d)来自共培养物的cd4和cd8t细胞的细胞内ifn-γ染色。细胞在共培养后48小时收获；在布雷菲德菌素a存在下温育6小时；染色cd3、cd4和cd8；用多聚甲醛固定；渗透；并对细胞内ifn-γ染色。通过大小和cd标志物将细胞在淋巴细胞上门控，并通过流式细胞术分析。(e)通过ldhelisa测定进一步检测肿瘤致敏t细胞和mab2-3耗尽的肿瘤致敏t细胞的细胞毒性活性。所有实验在每个时间点用平均值±s.d表示一式三份，并在两个独立的实验中进行。*、**和***分别表示斯氏t检验p值<0.05、0.01和0.005。

图5：用igrov-1-致敏t细胞重建的igrov-1-异种移植小鼠中的mab2-3介导的肿瘤生长抑制。(a)nsg小鼠皮下接种2×10⁶个荧光化的igrov-1肿瘤细胞，静脉内注射4×10⁶个igrov-1-致敏t细胞，并用抗ccr4抗体处理。测量nsg小鼠中荧光化的igrov-1人卵巢癌肿瘤异种移植物的肿瘤生长曲线。用3mg/kg的对照igg4(n=2)、mab2-3igg1(n=3)和mab2-3igg4(n=3)和等体积的pbs(n=2)处理小鼠。每周两次静脉内施用抗体，持续5周。每10天使用ivis成像系统对小鼠进行成像。色标：发光信号强度：蓝色，最弱信号；红色，最强信号。(b)对各组肿瘤组织的萤光素酶信号进行定量。(c)每周两次测量用抗体处理的小鼠中的肿瘤大小和(d)体重。(e)收集肿瘤组织和(f)测量肿瘤重量。图解比例尺，1厘米。*，p<0.05；***，p<0.005；用双向anova计算p值。所有数据以±s.e.m表示。

图6：在il-2和cd25之间的相互作用中mab2-3的中介作用(intermediation)。(a)在不存在外源il-2的情况下，通过elisa分析与或不与mab2-3一起温育的1×10⁴个cd4⁺cd25^-teff培养物上清液中的内源il-2水平。(b)在存在或不存在20μg/ml的mab和0.5/1μg/ml的平板结合的抗cd3/28抗体的情况下，用0.25iu/ml的外源il-2温育cd4⁺cd127^dimcd49d^-treg(3000/反应)。条棒(bar)表示±s.d。(c)在不存在外源il-2的情况下，显示来自1×10⁴个teff单独或与treg一起并用20μg/ml的mab2-3处理的内源il-2浓度。条棒表示±s.d。(d)在4iu/ml外源加入的il-2存在下，来自用mab2-3处理的teff和treg共培养物的上清液中il-2的浓度。条棒表示±s.d。(e)在存在外源il-2(20iu/ml)的情况下，来自用或不用抗体(mab2-3或抗-cd25，包括抗-tac和对照mab)处理的2x10⁵个mac-1细胞的上清液的il-2浓度通过elisa检测。条棒表示±s.d。(f)通过测量存在或不存在0.5iu/mlil-2、20μg/mlmab2-3igg1和20μg/ml对照igg1下处理的培养的treg中的存活力染料5天，进行体外细胞存活测定。显示自发性死亡treg中不同组的死亡treg的归一化百分比。每个点表示每个组中的个体供体。条棒表示平均值±s.e.m。“**”和“***”分别表示p值<0.01和0.005，使用斯氏t检验。

图7：人外周血t细胞和藻红蛋白(pe)缀合珠的代表性流式细胞术图。(a)门控cd3⁺cd4⁺t细胞并用pe-cy5缀合的抗cd45ra和percp-cy5缀合的抗ccr7抗体染色以区分tcm、tem、teff和t未致敏(如图1所示)。将cd4⁺cd25^-cd127⁺ccr4⁺t细胞亚群门控用于进一步分析。pe珠和t细胞亚群的荧光直方图分别以红色和蓝色线显示。(b)将pe荧光与每个珠的pe分子数量相关联的校准曲线。(c)ccr4分子在t细胞亚群上的表达水平。所有的实验都在三个独立的供体中进行，并显示平均值±s.d。

图8：在存在和不存在mab2-3的情况下人pbmc的体内分布。(a)向小鼠静脉内注射1×10⁷个人pbmc和抗体。体内循环24小时后，收集小鼠血液，并用太平洋蓝(pacificblue)缀合的抗cd3、亮紫(brilliantviolet)缀合的抗cd4、apc缀合的抗cd25和pe-cy7缀合的抗cd127染色人pbmc，门控以区分treg。(b)cd25⁺cd127^-treg的百分比显示为每组三只个体小鼠的平均值。*，p值<0.05。(c)体内循环后treg的分析。

图9：在hupbl-nsg动物模型中人pbmc对mab2-3igg4的体内应答。(a)通过尾静脉将10⁷个新鲜分离的人pbmc静脉内注射到成年nsg免疫缺陷小鼠中。hupbl-nsg小鼠每周两次通过尾静脉接受1mg/kg抗体。每周从hupbl-nsg小鼠收集外周血，并用抗人特异性抗体染色人cd45，(b)cd19与cd45，(c)cd3与cd45，(d)cd4与cd3和cd45，(e)cd8与cd3和cd45，(f)cd25与cd3和cd45，并通过流式细胞术定量每10⁴个pbmc。(g)每周在不同处理中检查来自血液的cd45⁺细胞中cd3⁺cd4⁺cd25⁺cd127^-细胞的百分比。(h)第3周显示来自血液、脾和骨髓的cd45⁺细胞中cd3⁺cd4⁺cd25⁺cd127^-细胞的百分比。进行双向anova检验。每个数据点表示平均值(n=6只nsg小鼠，2个pbmc供体)±s.e.m。*和**分别表示p值<0.05和0.01。

图10：mab2-3抑制由ccl22介导的化学吸引(chemoattraction)。(a)igrov-1卵巢癌细胞上ccr4的表达。(b)mab2-3以剂量依赖方式有效地抑制cd4⁺cd25^-和(c)cd4⁺cd25⁺t细胞对ccr4配体ccl22的趋化性。

图11：ccl22分泌性卵巢癌细胞对人淋巴细胞的化学吸引受到mab2-3的抑制。(a)图像显示在注射荧光化的cd4⁺cd25⁺cd127^dim/-t细胞后48小时(成像)的卵巢癌异种移植小鼠模型的体内生物发光图像。(b)roi强度的定量(红圈，异种移植肿瘤)显示mab2-3抑制treg募集到肿瘤组织。(c)收获肿瘤组织，胶原酶消化，然后用抗cd3、cd4和cd25抗体染色。cd3⁺cd4⁺cd25⁺t细胞通过流式细胞术分析和计数，并显示为来自肿瘤组织的总细胞的百分比。

图12：igrov-1脉冲的树突细胞和igrov-1致敏t细胞的发育。(a)通过粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)和白细胞介素-4(il-4)组合来单核细胞分化成树突细胞(dc)。从人pbmc中分离单核细胞并在gm-csf(100ng/ml)和il-4(100ng/ml)组合的存在下培养。培养7天后，收获细胞并通过流式细胞术分析如所示的用于dc分化的各种标志物的表面表达。(b)从肿瘤致敏t细胞(tp-t细胞)、未处理dc和肿瘤脉冲的dc的共培养物上清液中检测ifn-γ分泌。条棒表示±s.d。“*”表示斯氏t检验p<0.05。

图13：在携带igrov-1-致敏t细胞的大规模igrov-1-异种移植小鼠中的mab2-3介导的肿瘤生长抑制。(a)nsg小鼠皮下接种5×10⁶个igrov-1肿瘤细胞，静脉内注射1×10⁷个igrov-1致敏t细胞，并用抗ccr4抗体处理。测量nsg小鼠中igrov-1人卵巢癌肿瘤异种移植物的肿瘤生长曲线。用3mg/kg的对照igg4(n=2)、mab2-3igg1(n=2)、mab2-3igg4(n=2)和等体积的pbs(n=2)处理小鼠。每周两次静脉内施用抗体，持续4周。每周一次测量用抗体处理的小鼠的肿瘤大小和(b)体重。(c)收获肿瘤组织。图解比例尺，1厘米。(d)将小鼠pbmc用抗人cd3、cd4、(e)cd8和(f)cd25抗体染色，并使用流式细胞术分析。*，p<0.05；**，p<0.01；p值采用双向anova计算；黑色和灰色星号分别表示与对照组相比的mab2-3igg1和igg4。所有数据显示为平均值±s.e.m。(g)在各组的肿瘤组织中使用抗cd3(上图)和抗cd25(下图)抗体进行免疫组织化学染色。暗红色染色膜(箭头)表示肿瘤中的cd3或cd25tp-t细胞。图解比例尺，50微米。

图14：treg抑制性细胞因子产生。使用从未处理的、对照mab或mab2-3与cd4⁺cd25^-和cd4⁺cd25⁺t细胞的培养物中收集的上清液中的il-10和tgf-β细胞因子的elisa测量，来评估抗体处理对treg抑制性细胞因子产生的影响。使用不含mab培养的t细胞作为任何检测到的背景水平的il-10和tgf-β的对照。数据表示为平均值±s.d。

图15：基于流式细胞术的il-2结合和竞争分析。(a)用冷pbs洗涤mac-1细胞，然后依次用20μg/ml或(b)三种浓度的竞争性抗体(mab2-3、抗-tac或对照mab)、100nm生物素化的il-2和apc标记的链霉亲和素染色。通过流式细胞术检测生物素化的il-2与mac-1细胞的结合。

图16：ab2-3对il-2结合的作用机制。在il-2和cd25之间的相互作用中的mab2-3的中介作用。(a)在不存在外源il-2的情况下，通过elisa分析与或不与mab2-3一起温育的1×10⁴个cd4⁺cd25^-teff培养物上清液中的内源il-2水平。(b)在存在或不存在20μg/ml的mab和0.5/1μg/ml的平板结合的抗cd3/28抗体的情况下，用0.25iu/ml的外源il-2温育cd4⁺cd127^dimcd49d^-treg(3000/反应)。条棒表示±s.d。(c)在不存在外源il-2的情况下，显示来自1×10⁴个teff单独或与treg一起并用20μg/ml的mab2-3处理的内源il-2浓度。条棒表示±s.d。(d)在4iu/ml外源加入的il-2存在下，来自用mab2-3处理的teff和treg共培养物的上清液中il-2的浓度。条棒表示±s.d。(e)在存在外源il-2(20iu/ml)的情况下，来自用或不用抗体(mab2-3或抗cd25，包括抗-tac和对照mab)处理的2x10⁵个mac-1细胞的上清液的il-2浓度通过elisa检测。条棒表示±s.d。

图17：mab2-3和趋化因子诱导的cd25自mac-1细胞的脱落(shedding)。(a)将mac-1细胞与mab2-3、ccl17或ccl22在存在或不存在mmp-9抑制剂的情况下或与mmp抑制剂的阴性对照一起温育。温育24小时后，收获培养物上清液并通过elisa测试可溶性cd25的浓度。条棒表示±s.e.m.(b)用elisa研究用mab2-3或对照mab处理的mac-1细胞的12小时、(c)24小时和(d)48小时培养物上清液中可溶性cd25的浓度。该图显示培养物上清液中可溶性cd25浓度表示为pg/ml。条棒表示±s.e.m。“*”表示p值<0.05，通过斯氏t检验。

图18：mab2-3诱导的cd25自treg的脱落。将treg与mab2-3和对照igg1温育。温育48小时后，收获培养物上清液，并通过elisa测试可溶性cd25的浓度。(a)用elisa研究在用mab-2-3或对照igg1处理的treg的48小时培养物上清液中可溶性cd25(scd25)的浓度。提供的数据是三个独立供体的平均值。条棒表示±s.e.m。“*”和“**”分别表示p值<0.05和0.01，通过使用双向anova。(b)表示通过测量在存在或不存在il-2、mab2-3igg1和对照igg1的情况下处理的培养的treg中的存活力染料5天进行的体外细胞存活测定的结果。显示treg自发性死亡中不同组treg死亡的归一化百分比。条棒表示±s.e.m。“*”和“**”分别表示p值<0.01和0.005，通过使用斯氏t检验。

图19：对猕猴(macaque)pbmc的cd4⁺cd25⁺foxp3⁺t细胞中ccr4表达的代表性表型分析。针对cd4、cd25、ccr4和细胞内foxp3染色新鲜分离的pbmc。在cd4⁺cd25⁺foxp3⁺群中分析ccr4表达。在三个独立的猕猴中计算平均的treg上ccr4表达。

具体实施方式

本发明部分地基于以下发现：抗ccr4抗体mab2-3可以抑制调节性t细胞(treg)趋化活性、恢复效应t细胞(teff)增殖并耗尽ccr4⁺treg。

人mab在癌症免疫疗法中的一个重要作用在于它们逆转由肿瘤细胞征用(commandeering)促进免疫逃避的蛋白质的表面表达和分泌引起的免疫调节异常的能力。肿瘤微环境含有大量的混合免疫细胞类型，其通过激活抗肿瘤应答或促进肿瘤进展在肿瘤免疫监视(immunosurveillance)中起到自相矛盾的作用。在这些肿瘤浸润淋巴细胞(til)中，cd4⁺cd25⁺foxp3⁺treg已经在几种恶性肿瘤中显示在抑制局部肿瘤免疫中起关键作用。通过肿瘤细胞和微环境巨噬细胞高水平分泌ccr4受体趋化因子ccl22来介导treg募集到肿瘤中。这些ccr4⁺treg为局部抗肿瘤免疫失调和增强肿瘤生长创造了良好的环境。此外，在不同类型的癌症患者中检测到ccr4的肿瘤相关趋化因子。因此，本文描述的人抗ccr4mab免疫疗法的靶向方法在改善癌症免疫治疗效力方面提供显著的优势，同时减少其副作用。

如以下实施例中详细描述的，检查了人抗ccr4mab即mab2-3对treg的体外和体内活性。与teff相比，约85%的cd4⁺cd25⁺foxp3⁺treg过表达ccr4(图1和7)，并且它们负责大部分抑制活性。此外，通过mab2-3去除ccr4⁺treg恢复teff增殖(图2)。体外研究表明，mab2-3可以抑制treg对表达ccl22的ovca细胞的趋化活性。在携带ovca异种移植物的人源化小鼠模型中，mab2-3显示出调节人treg功能和增强抗肿瘤活性的治疗能力(图4、5和13)。

之前已经证实，mab2-3igg1在体外和体内表现出针对ccr4表达肿瘤(18、42)的强效抗体依赖性细胞毒性(adcc)和补体依赖性细胞毒性(cdc)活性(参见wo2009/086514和wo2013/166500，其内容通过引用整体并入)。在本文提供的实施例中，测试了mab2-3的igg1和igg4同种型的生物学功能，显示体外阻断ccr4⁺treg迁移的类似能力(图3b和10b)，但揭示了它们在体内的不同作用机制。特别地，通过体内清除研究(图3d和8b)和降低的肿瘤细胞浸润(图11)证明，mab2-3igg1诱导深度的treg免疫耗尽。在ovca异种移植研究中，mab2-3igg1处理导致肿瘤细胞生长的显著抑制(图5和13)，并且在两项动物研究中，小鼠显示明显的体重减轻(图5d和13b)。相比之下，igg4同种型似乎主要通过配体-受体阻断发挥作用(图3、9和11)。体内运输研究显示，这种同种型引起阻断treg向ccl22分泌性ovca肿瘤的趋化和减少肿瘤细胞浸润(图11)。igg4同种型也导致较慢且不太完全的treg耗尽(图9g)。对igg4介导的treg耗尽所观察到的体内清除较慢可能通过不同的作用机制，因为最近的报道显示igg4同种型与igg1具有相似的adcp能力(43)。另外，mab2-3igg4处理显示较低的抗肿瘤效果，然而，小鼠没有体重减轻(图5d和5f)。这些结果表明，两种mab2-3同种型在ovca疾病的不同阶段可能具有独特的作用，其中igg4治疗在肿瘤负荷较小并且免疫功能障碍更容易逆转的较早阶段具有可能优选的作用。

此外，显示mab2-3可以抑制il-2与ccr4⁺il-2r⁺mac-1和treg细胞的结合(图6)，但是不与单独il-2r亚基或组合使用转染的293t细胞交叉结合。对于mac1细胞，mab2-3处理导致scd25增强的切割，这是ccr4配体ccl22和ccl17共有的性质(图18a和图17b-d)。这种共同的活性表明，mab2-3具有激动剂活性并触发导致cd25切割的细胞活化。通过ccl22/ccl17结合的ccr4信号传导研究显示pi(3)激酶/akt激活的证据(25、26)。另外，据报道ccr4的不同构象对两种配体的应答不同，这一特性得到我们证据的支持，即ccl22和mab2-3与ccl17相比是更有效的scd25切割活化剂(图17a)(44、45)。treg上的高水平cd25表达导致支持更大的il-2结合的三聚体高亲和力il-2受体的形成，这已被证明是存活所需的(46)。cd25增加的切割可能导致il-2与treg结合的亲和力降低，并且释放的scd25可能与阻断treg对il-2的摄取及其降低的存活有关(图6a-f)(47)。

本文呈现的数据证明与teff相比，大约85%的外周血cd4⁺cd25⁺foxp3⁺treg过表达ccr4，并且它们负责大部分抑制活性。体外研究表明，通过mab2-3的ccr4⁺treg耗尽抑制treg对表达ccl22的卵巢癌(ovca)细胞的趋化活性，并恢复teff增殖和抗ovca免疫。在带有ovca异种移植物的人源化小鼠模型中，mab2-3igg1和igg4同种型均显示出调节人treg功能和增强抗肿瘤活性的治疗能力。

此处提供的数据还表明，mab2-3处理还导致阻断treg对il-2的摄取和抑制il-2介导的存活，这可能在对非免疫耗尽的mab2-3igg4观察到的体内抗肿瘤作用中起作用。

测试了mab2-3的igg1和igg4同种型的生物学功能，显示类似的在体外阻断ccr4⁺treg迁移的能力，但揭示了它们在体内的不同作用机制。具体而言，mab2-3igg1诱导treg的深度免疫耗尽，如通过体内清除研究和降低的肿瘤细胞浸润所证明的。在ovca异种移植研究中，mab2-3igg1治疗导致对肿瘤细胞生长的显著抑制，并且在两项动物研究中，小鼠显示明显的体重减轻。相比之下，igg4同种型似乎主要通过配体-受体阻断来起作用。体内运输研究表明，这种同种型引起阻断treg向ccl22分泌性ovca肿瘤的趋化和肿瘤细胞浸润的减少。igg4同种型也导致较慢且较不完全的treg耗尽。

治疗方法

本发明提供通过施用抗ccr4抗体来治疗处于患有(或易感)癌症或其他疾病或病症的风险的受试者的预防和治疗方法。这样的疾病或病症包括但不限于例如与调节性t细胞介导的免疫抑制相关的那些疾病或病症。调节性t细胞意指包括treg和/或滤泡调节性t细胞(tfr)。预防药物的施用可以在疾病表现之前发生，从而预防疾病，或者延迟其进展。本发明还提供接种方法，其中ccr4抗体被包括或与抗原联合施用。ccr4抗体充当佐剂以通过耗尽调节性t细胞和/或增加效应t细胞增殖来增加对抗原的免疫应答。

例如，所述方法用于通过使细胞接触ccr4抗体或将其施用于受试者来耗尽调节性t细胞(treg和/或tfr)和/或抑制调节性t细胞向细胞因子分泌性肿瘤的迁移(例如趋化)。细胞因子分泌性肿瘤分泌ccl1、ccl4、ccl5、ccl17和/或ccl22。当ccr4抗体用于耗尽调节性细胞时，抗体优选具有igg1重链恒定区。当ccr4抗体用于抑制调节性t细胞的迁移时，抗体优选具有igg4重链恒定区。

在各种实施方案中，效应t细胞实质上不耗尽。“实质上不耗尽”是指不超过1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%。20%、25%的效应t细胞被耗尽。在其他实施方案中，效应t细胞增殖和/或数目增加或不实质降低。“不实质降低”是指效应t细胞增殖和/或降低不超过1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%，相较于未经处理的细胞群。

在其他实施方案中，所述方法用于增加效应t细胞增殖。相较于未处理的细胞群，效应t细胞增殖增加1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。

在其他实施方案中，所述方法调节(例如增加)肿瘤或受试者中效应t细胞与调节性t细胞的比例。比例增加1、2、3、4、5或更多倍。

该方法调节自效应t细胞群释放的细胞因子(例如干扰素-γ)或效应多肽(例如粒酶b或穿孔素)。调节是指增加或减少细胞因子或效应多肽的释放。相较于未处理的细胞群，细胞因子或效应多肽释放被增加或减少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、50%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。

在另一方面，肿瘤细胞生长通过使细胞接触ccr4抗体或向受试者施用ccr4抗体来抑制或减缓。例如，肿瘤是皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)、蕈样肉芽肿(mf)、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤(皮肤alcl)、塞扎里综合征或成人t细胞白血病/淋巴瘤(atll)等血液学癌症。

或者，肿瘤是实体瘤如肾细胞癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、皮肤癌(例如黑素瘤)、肝癌、胰腺癌、霍奇金病、多形性胶质母细胞瘤(gbm)或胃癌。在具体的实施方案中，癌症是卵巢癌或黑素瘤。

抑制或减缓肿瘤生长增加患有肿瘤的受试者的存活。存活增加1年、2年、3年、4年、5年或更多年。

另一方面，本发明提供通过使调节性t细胞与ccr4抗体接触来抑制il-2与ccr4⁺调节性t细胞结合或诱导cd25切割的方法。由于il-2对调节性t细胞存活的依赖性，通过cd25的il-2结合损失导致代谢性饥饿，从而诱导调节性t细胞死亡。调节性t细胞的增加提高效应t细胞与调节性t细胞的比例。

在一些方面，用于上述方法的ccr4抗体具有igg1或igg4重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区具有一个或多个突变。例如，igg4恒定区具有s228p突变。

在本发明的具体实施方案中，受试者接受具有igg1重链恒定区的ccr4抗体和具有igg4重链恒定区的ccr4抗体。或者，根据疾病阶段选择受试者接受具有igg1重链恒定区的ccr4抗体或具有igg4重链恒定区的ccr4抗体。例如，疾病早期的患者接受具有igg4重链恒定区的ccr4抗体的治疗可能是有利的，因为肿瘤负荷较小并且免疫功能障碍更容易逆转。相比之下，当患者患有晚期疾病，例如高肿瘤负荷时，受试者接受具有igg1重链恒定区的ccr4抗体治疗可能是有利的

细胞是表达ccr4的任何细胞。例如，细胞是t细胞。t细胞包括调节性t细胞、滤泡调节性t细胞和效应t细胞。

ccr4抗体

ccr4抗体是本领域已知的并且适用于本发明的方法中。示例性的人源化ccr4抗体描述于例如wo2009/086514、wo2013/166500和pct/us2015/054202中，其内容通过引用整体并入并在下文中描述。优选的ccr4抗体是mab2-3。本文所述的示例性抗体与其他人源化ccr4抗体(例如莫甘珠单抗(mogamulizumab))相比具有有利的特征。例如，本发明的示例性抗体(特别是mab2-3)识别涵盖n端结构域和介导生物信号传导的胞外环的构象表位。在这方面，mab2-3处理mac1细胞和treg导致增强的scd25脱落，这是与ccr4配体ccl22和ccl17共享的特性。因此，本发明的示例性抗体(特别是mab2-3)具有激动剂活性并触发细胞活化。此外，与莫甘珠单抗相比，本发明的示例性抗体(特别是mab2-3)介导补体依赖性细胞毒性(cdc)。这可能是fc区的最佳取向的直接结果，使得连接角度允许补体孔形成。

下表9中显示所选抗体的重链和轻链互补决定区的氨基酸序列。

表9.重链和轻链的氨基酸序列

本文所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(免疫反应)的抗原结合位点的分子。所谓“特异性结合”或“与…免疫反应”意指与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应而不与其它多肽反应的抗体。抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、dab(结构域抗体)、单链、fab、fab’和f(ab')2片段、scfv和fab表达文库。

单链fv(“scfv”)多肽分子是共价连接的vh::vl异二聚体，其可自包括通过肽编码接头连接的vh-和vl-编码基因的基因融合物表达(参见huston等(1988)procnatacadsciusa85(16):5879-5883)。描述了辨别用于将来自抗体v区的天然聚集的而非化学分离的多肽轻链和重链转化成scfv分子的多种方法，所述scfv分子可折叠成与抗原结合位点的结构大致相似的三维结构。参见例如美国专利号5091513、5132405和4946778。

非常大的未致敏人scfv文库已被创建且能创建以提供针对大量靶分子的重排抗体基因极大的来源。可从患有感染性疾病的个体构建较小的文库以分离疾病特异性抗体(参见barbas等,proc.natl.acad.sci.usa89:9339-43(1992)；zebedee等,proc.natl.acad.sci.usa89:3175-79(1992))。

一般来说，获自人的抗体分子与igg、igm、iga、ige和igd类别的任一种有关，所述类别因存在于分子中的重链的性质而彼此不同。某些类别还具有亚类，例如igg1、igg2、igg3、igg4等。此外，在人中，轻链可为κ链或λ链。术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的一部分。抗原结合位点由重(“h”)和轻(“l”)链的n端可变(“v”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链v区内的3个高度趋异的序列段(称为“超变区”)插入在更保守的侧翼序列段(称为“构架区”或“fr”)之间。因此，术语“fr”是指天然存在于免疫球蛋白的超变区之间并与之相邻的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的3个超变区和重链的3个超变区彼此相对配置在三维空间中形成抗原结合表面。抗原结合表面与被结合的抗原的三维表面互补，重链和轻链各自的3个超变区称为“互补决定区”或“cdr”。

本文所用术语“表位”包括能够与免疫球蛋白、scfv或t细胞受体特异性结合的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子(例如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面群聚组成，并通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，抗体可针对多肽的n端或c端肽产生。

本文所用术语“免疫结合”和“免疫结合性质”是指免疫球蛋白分子与免疫球蛋白特异性的抗原之间产生的非共价相互作用类型。免疫结合相互作用的强度或亲和力可用相互作用的解离常数(kd)表示，其中较小的kd表示较大的亲和力。所选多肽的免疫结合性质可采用本领域众所周知的方法定量。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这类速率取决于复合的配偶体的浓度、相互作用的亲和力和同等影响两个方向的速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(koff)两者可通过计算浓度及结合和解离的实际速率确定(参见nature361:186-87(1993))。koff/kon之比使得能够消除与亲和力无关的所有参数，并等于解离常数kd(一般参见davies等(1990)annualrevbiochem59:439-473)。当平衡结合常数(kd)≤1μm、优选≤100nm、更优选≤10nm、最优选≤100pm-约1pm时，本发明的抗体被称为与ccr4表位特异性结合，通过测定例如放射性配体结合测定或本领域技术人员已知的类似测定来测量。

ccr4蛋白或其衍生物、片段、类似物、同系物或直向同源物(ortholog)可在产生免疫特异性结合这些蛋白质组分的抗体时用作免疫原。

本领域技术人员应认识到，可以无需过度实验，通过确定人单克隆抗体是否防止本发明的人单克隆抗体与ccr4结合，来确定前者是否与后者具有相同的特异性。如果受测试的人单克隆抗体与本发明的人单克隆抗体竞争，正如通过本发明的人单克隆抗体的结合降低所示，则很可能2种单克隆抗体结合相同的表位或与紧密相关的表位。

测定人单克隆抗体是否具有本发明的人单克隆抗体的特异性的另一方法是使本发明的人单克隆抗体与通常与之有反应性的ccr4蛋白一起预温育，然后加入要测试的人单克隆抗体以确定受测试的人单克隆抗体结合ccr4的能力是否受抑制。如果受测试的人单克隆抗体被抑制，则很可能具有与本发明的单克隆抗体相同的或在功能上等同的表位特异性。还可通过使用ccr4并确定测试的单克隆抗体是否能够中和ccr4，来进行本发明的人单克隆抗体的筛选。

本领域已知的各种方法可用于产生针对本发明的蛋白质或针对其衍生物、片段、类似物、同系物或直向同源物的多克隆或单克隆抗体(参见例如antibodies:alaboratorymanual,harlowe和laned,1988,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny，通过引用并入本文)。

抗体可通过众所周知的技术纯化，例如使用a蛋白或g蛋白的亲和层析(其主要提供免疫血清的igg部分)。随后或备选地，可将作为所寻找的免疫球蛋白的靶标的特异性抗原或其表位固定在柱上，以通过免疫亲和层析来纯化免疫特异性抗体。免疫球蛋白的纯化见述于例如d.wilkinson(thescientist,thescientist,inc.,philadelphiapa出版,第14卷,第8期(2000年4月17日),第25-28页)。

本文所用的术语“单克隆抗体”或“mab”或“单克隆抗体组合物”是指只含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子的一种分子物类的抗体分子群。具体地说，单克隆抗体的互补决定区(cdr)在该群的所有分子中相同。mab含有能够与特征在于对其有独特结合亲和力的抗原的特定表位免疫反应的抗原结合位点。

可采用杂交瘤方法，例如kohler和milstein，nature，256:495(1975)描述的那些方法，制备单克隆抗体。在杂交瘤方法中，小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物通常用免疫剂免疫以诱导产生或能够产生可与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可体外免疫。

免疫剂通常可包括蛋白质抗原、其片段或其融合蛋白。一般而言，如果需要人源的细胞，则使用外周血淋巴细胞，或如果需要非人哺乳动物源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)使淋巴细胞与永生化细胞系融合，形成杂交瘤细胞(goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,academicpress,(1986)第59-103页)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、牛和人源的骨髓瘤细胞。通常使用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在合适的培养基中培养杂交瘤细胞，培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞的生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hgprt或hprt)，则用于杂交瘤的培养基通常可包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“hat培养基”)，这些物质防止hgprt缺陷型细胞的生长。

优选的永生化细胞系是这样的细胞系，其有效融合、支持所选的产抗体细胞稳定高水平表达抗体且对培养基(例如hat培养基)敏感。更优选的永生化细胞系是鼠骨髓瘤系，其可获自例如salkinstitutecelldistributioncenter,sandiego,california和美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection,manassas,virginia)。还描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见kozbor,j.immunol.,133:3001(1984)；brodeur等,monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,marceldekker,inc.,newyork,(1987)第51-63页))。

然后可就针对抗原的单克隆抗体的存在情况对培养杂交瘤细胞的培养基进行测定。优选通过免疫沉淀或通过体外结合测定，例如放射免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa)，测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。这类技术和测定是本领域已知的。例如，可通过munson和pollard,anal.biochem.,107:220(1980)的scatchard分析来测定单克隆抗体的结合亲和力。此外，在单克隆抗体的治疗应用中，重要的是鉴定对靶抗原具有高特异性程度和高结合亲和力的抗体。

在鉴定出所需的杂交瘤细胞后，克隆可通过有限稀释方法亚克隆，并通过标准方法培养(参见goding,monoclonalantibodies:principlesandpractice,academicpress,(1986),第59-103页)。用于此目的的合适培养基包括例如dulbecco改良的eagle培养基和rpmi-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为腹水体内生长。

可通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如a蛋白-琼脂糖凝胶、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基或腹水流体中分离并纯化由亚克隆分泌的单克隆抗体。

还可通过例如描述于美国专利号4816567的重组dna方法制备单克隆抗体。可采用常规方法(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，容易地分离编码本发明的单克隆抗体的dna并测序。本发明的杂交瘤细胞用作这类dna的优选来源。一旦分离，可将dna置于表达载体中，然后将表达载体转染至不再另产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(例如猿猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞)中，以在重组宿主细胞中实现单克隆抗体的合成。还可通过例如置换人重链和轻链恒定结构域的编码序列以代替同源鼠序列(参见美国专利号4816567；morrison，nature368，812-13(1994))或通过共价连接免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分，来修饰dna。这类非免疫球蛋白多肽可取代本发明抗体的恒定结构域，或可取代本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域以产生嵌合二价抗体。

完全人抗体是其中轻链和重链两者的完整序列(包括cdr)产生于人基因的抗体分子。这类抗体在本文被称为“人源化抗体”、“人抗体”或“完全人抗体”。可通过采用trioma技术；人b细胞杂交瘤技术(参见kozbor等,1983immunoltoday4:72))和产生人单克隆抗体的ebv杂交瘤技术(参见cole等,1985,载于:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,第77-96页)，来制备人单克隆抗体。可使用人单克隆抗体，且可通过使用人杂交瘤(参见cote等,1983.procnatlacadsciusa80:2026-2030)或通过体外用eb病毒转染人b细胞(参见cole等,1985,载于:monoclonalantibodiesandcancertherapy,alanr.liss,inc.,第77-96页)，来产生人单克隆抗体。

另外，还可采用其它技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库(参见hoogenboom和winter,j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等,j.mol.biol.,222:581(1991))。同样，可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物(例如小鼠)中，来制备人抗体。在攻击时，观察到人抗体产生，这在所有方面都极类似于在人中所观察到的，包括基因重排、装配和抗体库。该方法描述于例如美国专利号5545807、5545806、5569825、5625126、5633425、5661016及marks等,bio/technology10,779-783(1992)；lonberg等,nature368856-859(1994)；morrison,nature368,812-13(1994)；fishwild等,naturebiotechnology14,845-51(1996)；neuberger,naturebiotechnology14,826(1996)；以及lonberg和huszar,intern.rev.immunol.1365-93(1995)。

另外可采用经修饰使得在响应抗原攻击时产生完全人抗体而非动物的内源抗体的转基因非人动物，来产生人抗体(参见pct公开文本wo94/02602)。使编码免疫球蛋白重链和轻链的内源基因在非人宿主中失能，并将编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座插入宿主的基因组中。例如，使用含有必要人dna区段的酵母人工染色体，掺入人基因中。然后通过使含有少于修饰的完全互补序列的中间转基因动物杂交，获得提供所有所需修饰的动物作为子代。这类非人动物的优选实施方案是小鼠，称为xenomouse^tm，正如pct公开文本wo96/33735和wo96/34096所公开的。该动物产生分泌完全人免疫球蛋白的b细胞。抗体可直接获自用目标免疫原免疫后的动物，例如多克隆抗体的制备物，或备选获自来源于动物的永生化b细胞，例如产生单克隆抗体的杂交瘤。此外，编码具有人可变区的免疫球蛋白的基因可回收或表达以直接获得抗体，或可进一步修饰以获得抗体例如单链fv(scfv)分子的类似物。

产生缺乏内源免疫球蛋白重链表达的非人宿主(以小鼠为例)的方法的实例公开于美国专利号5939598。还可通过这样的方法获得，所述方法包括：自胚胎干细胞中的至少一个内源重链基因座缺失j区段基因以防止基因座的重排并防止重排免疫球蛋白重链基因座的转录物形成，所述缺失通过含有编码选择性标志物的基因的靶向载体实现；并从胚胎干细胞产生其体细胞和生殖细胞含有编码选择性标志物的基因的转基因小鼠。

用于产生目标抗体(例如人抗体)的一种方法公开于美国专利号5916771。该方法包括将含有编码重链的核苷酸序列的表达载体导入培养中的哺乳动物宿主细胞中，将含有编码轻链的核苷酸序列的表达载体导入另一种哺乳动物宿主细胞中，并将两种细胞融合以形成杂交细胞。杂交细胞表达含有重链和轻链的抗体。

在对该方法的进一步改进中，鉴定免疫原上的临床相关表位的方法和选择以高亲和力与相关表位免疫特异性结合的抗体的相关方法公开于pct公开文本wo99/53049。

可通过含有编码上述单链抗体的dna区段的载体表达抗体。

这些可包括载体、脂质体、裸dna、佐剂辅助dna(adjuvant-assisteddna)、基因枪、导管等。载体包括化学缀合物(例如描述于wo93/64701，其具有靶向部分(例如细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如聚赖氨酸))；病毒载体(例如dna或rna病毒载体)；融合蛋白(例如描述于pct/us95/02140(wo95/22618)，其是含有靶向部分(例如对靶细胞有特异性的抗体)和核酸结合部分(例如鱼精蛋白)的融合蛋白)；质粒；噬菌体等。载体可为染色体的、非染色体的或合成的。

优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病毒。优选dna病毒载体。这些载体包括痘病毒载体(poxvector)例如正痘病毒或禽痘病毒载体(orthopox或avipoxvector)；疱疹病毒载体例如i型单纯疱疹病毒(hsv)载体(参见geller,a.i.等,j.neurochem,64:487(1995)；lim,f.等,载于dnacloning:mammaliansystems,d.glover编辑(oxforduniv.press,oxfordengland)(1995)；geller,a.i.等,procnatl.acad.sci.:u.s.a.90:7603(1993)；geller,a.i.等,procnatl.acad.sciusa87:1149(1990))；腺病毒载体(参见legallasalle等,science,259:988(1993)；davidson等,nat.genet3:219(1993)；yang等,j.virol.69:2004(1995))和腺伴随病毒载体(参见kaplitt,m.g.等,nat.genet.8:148(1994))。

痘病毒载体将基因导入细胞的细胞质中。禽痘病毒载体只引起核酸的短期表达。优选腺病毒载体、腺伴随病毒载体和单纯疱疹病毒(hsv)载体以将核酸导入神经细胞中。腺病毒载体导致短的表达(约2个月)，相较于腺伴随病毒(约4个月)，其进而比hsv载体短。所选的具体载体将取决于靶细胞和待治疗的病况。导入可通过标准技术进行，例如感染、转染、转导或转化。基因转移方式的实例包括例如裸dna、capo4沉淀、deae葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂转染、细胞显微注射和病毒载体。

载体可用来靶向基本上任何所需的靶细胞。例如，可采用立体定位注射以将载体(例如腺病毒、hsv)引导至所需位置。此外，可使用小型泵输注系统，例如synchromedinsufionsystem，通过脑室内(icv)输注递送颗粒。也已证实基于称为对流的总体流动的方法在将大分子递送至脑的延伸区域是有效的，并可用于将载体递送至靶细胞(参见bobo等,proc.natl.acad.sci.usa91:2076-2080(1994)；morrison等,am.j.physiol.266:292-305(1994))。可采用的其它方法包括导管、静脉内、胃肠外、腹膜内和皮下注射及口服或其它已知的施用途径。

可使用这些载体以表达可以多种方式使用的大量抗体。例如检测样品ccr4的存在情况。抗体还可用来尝试与ccr4结合并破坏ccr4活性。

可改变用于产生对本发明的抗原蛋白有特异性的单链抗体的技术(参见例如美国专利号4946778)。另外，可改变用于构建fab表达文库的方法(参见例如huse等,1989science246:1275-1281)，以允许快速有效地鉴定具有对蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同系物有所需特异性的单克隆fab片段。含有蛋白质抗原的个体遗传型的抗体片段可通过本领域已知技术产生，包括但不限于：(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的f(ab')2片段；(ii)通过还原f(ab')2片段的二硫桥产生的fab片段；(iii)通过抗体分子用木瓜蛋白酶和还原剂处理产生的fab片段；和(iv)fv片段。

异源缀合物抗体也在本发明的范围内。异源缀合物抗体由2种共价连接的抗体组成。这类抗体被提议为例如使免疫系统细胞靶向不需要的细胞(参见美国专利号4676980)和用于治疗hiv感染(参见wo91/00360、wo92/200373、ep03089)。预期可采用合成蛋白质化学的已知方法(包括涉及交联剂的方法)体外制备抗体。例如，免疫毒素可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建。用于该目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐和4-巯基丁酰亚氨酸甲酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)和公开于例如美国专利号4676980中的那些。异源缀合物抗体也可指双特异性抗体，其中双特异性抗体由例如2个共价连接的单链抗体或scfv，或2个共价连接的来自识别不同抗原的两种抗体的可变重链-可变轻链二聚体组成。

对于效应子功能，可合乎需要地修饰本发明的抗体，以提高例如抗体在治疗癌症中的有效性。例如，可将半胱氨酸残基引入fc区中，因此允许这个区中的链间二硫键形成。由此产生的同二聚体抗体可具有改进的内化能力和/或升高的补体介导的细胞杀死和依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(adcc)(参见caron等,j.expmed.,176:1191-1195(1992)和shopes,j.immunol.,148:2918-2922(1992))。或者，抗体可经工程改造以具有双重fc区，因此可具有提高的补体溶解和adcc能力(参见stevenson等,anti-cancerdrugdesign,3:219-230(1989))。

本发明还涉及包含与细胞毒性剂例如毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)缀合的抗体的免疫缀合物。

可使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉毒素a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白a链、相思豆毒蛋白a链、塑莲根毒蛋白a链、α-帚曲霉素、油桐(aleuritesfordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆(phytolacaamericana)蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜(momordicacharantia)抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢菌霉素。可获得用于产生放射性缀合的抗体的各种放射性核素。实例包括²¹²bi、¹³¹i、¹³¹in、⁹⁰y和¹⁸⁶re。

使用各种双官能蛋白质偶联剂例如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(spdp)、亚氨基噻烷(it)、亚氨基酯的双官能衍生物(例如己二酰亚胺二甲酯hcl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮基化合物(例如双(对叠氮基苯甲酰基)己烷二胺)、双-重氮衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)，制备抗体和细胞毒性剂的缀合物。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可按vitetta等,science238:1098(1987)所述制备。碳-14标记的1-异硫氰酸基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于放射性核苷酸(radionucleotide)与抗体缀合的示例性螯合剂(参见wo94/11026)。

本领域普通技术人员应认识到，各种各样可能的部分可与所得抗体或本发明的其它分子偶联(参见例如"conjugatevaccines",contributionstomicrobiologyandimmunology,j.m.cruse和r.e.lewis,jr(编辑),cargerpress,newyork,(1989)，其全部内容通过引用并入本文)。

偶联可通过使两种分子结合的任何化学反应实现，只要抗体和另一部分保留其各自的活性。这种连接可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和结合、插入、配位结合和络合。然而优选的结合是共价结合。共价结合可通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的掺入实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白质分子(例如本发明的抗体)与其它分子偶联。例如，代表性偶联剂可包括有机化合物例如硫酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮基苯和六亚甲基二胺。该列表非旨在穷尽本领域已知的各种类别的偶联剂，而相反只是典型的更常见的偶联剂(参见killen和lindstrom,jour.immun.133:1335-2549(1984)；jansen等,immunologicalreviews62:185-216(1982)；以及vitetta等,science238:1098(1987))。优选的接头描述于文献中(参见例如描述mbs(m-马来酰亚胺苯甲酰基-n-羟基琥珀酰亚胺酯的使用的ramakrishnan,s.等,cancerres.44:201-208(1984))。另参见美国专利号5030719，其描述了通过寡肽接头与抗体偶联的卤化乙酰基酰肼衍生物的使用。特别优选的接头包括：(i)edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)smpt(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基(pridyl)联硫基)甲苯(piercechem.co.，目录(21558g)；(iii)spdp(琥珀酰亚胺基-6-[3-(2-吡啶基联硫基)丙酰胺基]己酸酯(piercechem.co.，目录号21651g)；(iv)磺基-lc-spdp(磺基琥珀酰亚胺基-6-[3-(2-吡啶基联硫基)-丙酰胺]己酸酯(piercechem.co.目录号2165-g)；和(v)与edc缀合的磺基-nhs(n-羟基磺基琥珀酰亚胺：piercechem.co.，目录号24510)。

上述接头含有具有不同属性的组分，因此产生具有不同生理化学性质的缀合物。例如，烷基羧酸酯的磺基-nhs酯比芳族羧酸酯的磺基-nhs酯稳定。与磺基-nhs酯相比，含nhs-酯的接头较不溶解。此外，接头smpt含有位阻二硫键，并可形成稳定性提高的缀合物。二硫键与其它健相比一般较不稳定，因为二硫键体外被切割，导致可获得较少的缀合物。具体地说，磺基-nhs可提高碳二亚胺偶联物的稳定性。碳二亚胺偶联物(例如edc)当与磺基-nhs联用时，形成比仅碳二亚胺偶联反应更耐水解的酯。

在一些实施方案中，将突变引入mab的恒定区，使得mab的依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(adcc)活性改变。例如，突变是ch2结构域中的lala突变，其中fc区第234和235位的亮氨酸突变成丙氨酸，并消除被特异性fc受体结合。一方面，mab在异二聚体mab的一个scfv分子上含有突变，这降低adcc活性。另一方面，mab在异二聚体mab的两条链上含有突变，这完全消除adcc活性。例如，引入mab的一个或两个scfv分子的突变是ch2结构域中的lala突变。可优化具有可变的adcc活性的这些mab，使得mab对表达被mab识别的一种抗原的细胞显示最大选择性杀灭，然而对被mab识别的第二种抗原显示最小杀灭。

本文公开的抗体还可作为免疫脂质体配制。含有抗体的脂质体通过描述于例如以下的本领域已知方法制备：epstein等,proc.natl.acad.sci.usa,82:3688(1985)；hwang等,proc.natlacad.sci.usa,77:4030(1980)以及美国专利号4485045和4544545。循环时间延长的脂质体公开于美国专利号5013556。

特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和peg衍生化磷脂酰乙醇胺(peg-pe)的脂质组合物通过反相蒸发方法产生。使脂质体通过规定孔径的过滤器挤出，得到具有所需直径的脂质体。可按martin等,j.biol.chem.257:286-288(1982)所述通过二硫化物交换反应使本发明抗体的fab'片段与脂质体缀合。

药物组合物

可将ccr4抗体(本文亦称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同系物掺入适于施用的药物组合物中。这类组合物通常包含抗体或药物和药学上可接受的载体。本文所用术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣材料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载体描述于本领域的标准参考教材remington’spharmaceuticalsciences的最近版本，其通过引用并入本文。这类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、林格氏液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。还可使用脂质体和非水性载体例如固定油。用于药用活性物质的这类介质和物质的使用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或物质与活性化合物不相容，考虑其在组合物中的使用。还可将补充活性化合物掺入组合物中。

配制本发明的药物组合物与其既定施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(即局部)、经黏膜和直肠施用。用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液剂或混悬剂可包括下列组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张度的物质例如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱(例如盐酸或氢氧化钠)调节ph。可将胃肠外制剂装入安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制造的多剂量小瓶中。

适于注射用的药物组合物包括无菌水性溶液剂(水溶性情况下)或用于即时制备无菌注射用溶液剂或分散体的分散体和无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophorel™(basf，parsippany，n.j.)或磷酸缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且就存在流畅注射性而言应是流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须针对微生物(例如细菌和真菌)的污染作用进行防腐。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可通过使用包衣材料例如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需粒径和通过使用表面活性剂，保持适当的流动性。可通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，实现微生物作用的防止。在许多情况下，优选可在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、氯化钠。可在组合物中包括延迟吸收的物质(例如单硬脂酸铝和明胶)，来引起注射用组合物的吸收延长。

可通过将所需量的活性化合物与按需要与上列成分的一种或组合一起掺入合适的溶剂中，接着过滤除菌，来制备无菌注射用溶液剂。一般而言，分散体通过将活性化合物掺入含有基础分散介质和上列所需的其它成分的无菌溶媒中来制备。在用于制备无菌注射用溶液剂的无菌粉剂的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥，得到来自其前述无菌过滤溶液的活性成分加任何其它所需成分的粉剂。

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。可将它们包封在明胶胶囊中或压制成片剂。对于口服治疗性施用的目的，活性化合物可与赋形剂一起掺入，并以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可以使用流体载体制备以用作漱口剂，其中流体载体中的化合物口内使用、漱口并吐出或吞咽。可包括药学上相容的粘合剂和/或辅料作为组合物的部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有下列成分的任一种或类似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖、崩解剂例如藻酸、primogel或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或sterotes；助流剂例如胶态二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或矫味剂例如欧薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味料(orangeflavoring)。

对于吸入施用，从含有合适抛射剂(例如二氧化碳等气体)的加压容器或分配器或喷雾器中以气溶胶喷雾剂的形式递送化合物。

全身施用还可通过经黏膜或经皮手段。对于经黏膜或经皮施用，在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这类渗透剂通常是本领域已知的，且对于经黏膜施用包括例如洗涤剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经黏膜施用可通过使用鼻内喷雾剂或栓剂完成。对于经皮施用，按本领域普遍已知的，将活性化合物配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。

还可以栓剂(例如用常规栓剂基料例如可可脂和其它甘油酯)或滞留型灌肠剂的形式制备化合物用于直肠递送。

在一个实施方案中，活性化合物用保护化合物免于从身体快速清除的载体制备，例如控释制剂，包括植入剂和微囊化递送系统。可使用生物可降解的生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的方法对本领域技术人员而言将是显而易见的。原料还可市购获自alzacorporation和novapharmaceuticals，inc。脂质体混悬液(包括具有抗病毒抗原的单克隆抗体的靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可按照本领域技术人员已知的方法例如美国专利号4522811中的描述制备。

尤其有利的是将口服或胃肠外组合物配制在剂量单位形式中以易于施用和剂量均一性。本文所用剂量单位形式是指适于作为待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单位；各单位含有经计算产生所需治疗作用的预定量的活性化合物以及所需要的药用载体。本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于活性化合物的独特性质和要达到的具体治疗作用及配混用于治疗个体的这类活性化合物领域中的固有限制。

药物组合物可与施用说明一起包括在容器、药包或分配器中。

双特异性抗体

双特异性抗体(bsab)是包含2个可变结构域或scfv单元的抗体，使得所得抗体识别2种不同的抗原。本发明提供识别ccr4和第二抗原的双特异性抗体。示例性第二抗原包括肿瘤相关抗原、细胞因子和细胞表面受体，例如t细胞受体多肽。在一些实施方案中，第二抗原可以是caix(碳酸酐酶ix或g250)、erbb2、pd-l1、ctla-4、pd1、il21、il21r、hvem、cd160、cd3、tim3或gal9。

本发明的双特异性抗体包括ccr4抗体的重链和轻链组合或scfv。

本发明的双特异性抗体可采用本领域已知方法构建。在一些实施方案中，双特异性抗体是单一多肽，其中各识别不同抗原的2个不同的重链-轻链异二聚体或2个不同的scfv抗体或其片段通过足够长度的长接头多肽连接，以允许2个scfv分子之间的分子内缔合以形成具有2条重链和2条轻链的双特异性抗体。在一个实施方案中，scfv分子之一识别ccr4，例如本文所述scfv抗体的任一种。在其它实施方案中，双特异性抗体由通过共价或非共价键连接的多于一个多肽(例如2个单独的scfv抗体或其片段)组成，其中scfv抗体之一识别ccr4。

在一个实施方案中，双特异性抗体采用“柞臼结构(knobintohole)”方法构建(ridgway等,proteineng7:617-621(1996))。在该方法中，使2个不同的可变结构域的ig重链还原以选择性地断开重链配对，同时保留重链-轻链配对。将识别2个不同抗原的2个重链-轻链异二聚体混合以促进异源连接配对，这通过工程改造的ch3结构域的“柞臼结构”介导。

在另一个实施方案中，可通过来自两个或更多个不同抗体的重链-轻链异二聚体交换产生其中第一重链-轻链异二聚体识别ccr4和第二重链-轻链异二聚体识别第二抗原的杂合抗体，来构建双特异性抗体。用于产生由2个来自2种不同抗体的重链-轻链异二聚体组成的双特异性抗体的机制类似于人igg4的形成，其还起双特异性分子的作用。igg重链的二聚化受分子内力的驱动，例如使各重链的ch3结构域配对和二硫桥。ch3结构域中特定氨基酸的存在(r409)显示促进二聚体交换和igg4分子的构建。抗体铰链区中的重链间二硫桥还进一步稳定重链配对。具体地说，在igg4中，铰链区在第226-230位氨基酸含有氨基酸序列cys-pro-ser-cys(与含有序列cys-pro-pro-cys的稳定的igg1铰链区相比)。第229位丝氨酸的这种序列差异与igg4在铰链区中形成新的链内二硫键的趋势有关(vanderneutkolfschoten,m.等,2007,science317:1554-1557和labrijn,a.f.等,2011,journalofimmunol187:3238-3246)。

在另一个实施方案中，谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物的使用可用于从2种截然不同的完全抗体产生双特异性抗体。例如，使各识别不同抗原的完全抗体与还原谷胱甘肽一起温育，以将抗体分成重链-轻链异二聚体或分子。可将重链-轻链异二聚体与氧化谷胱甘肽(gssg)混合，这允许重新装配和再次氧化以形成高纯的双特异性抗体。

因此，本发明的双特异性抗体可如下产生：将r409残基引入ch3结构域并将cys-pro-ser-cys序列引入识别ccr4或第二抗原的抗体的铰链区，使得重链-轻链二聚体交换以产生具有识别ccr4的1个重链-轻链二聚体和识别第二抗原的第二重链-轻链二聚体的抗体分子，其中第二抗原是本文公开的任何抗原。还可加入还原剂(例如还原谷胱甘肽)促进交换，来提高重链-轻链异二聚体交换。如本文所公开的，还可改变已知的igg4分子，使得重链和轻链识别ccr4或第二抗原。由于fc区不同于其它igg亚型的igg4分子的固有特征，构建本发明的双特异性抗体的该方法的应用可能是有益的，因为它与例如由某些白细胞表达的补体和fc受体等免疫应答的效应器系统相互作用差。这种特殊性质使这些基于igg4的双特异性抗体对治疗应用有吸引力，其中需要抗体结合靶标，并且在功能上改变与靶标有关的信号传导途径，但不引发效应子活性。

在一些实施方案中，将突变引入bsab的恒定区，使得bsab的依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(adcc)活性改变。例如，突变是ch2结构域中的lala突变，其中fc区第234和235位的亮氨酸突变成丙氨酸，且消除特异性fc受体结合。一方面，bsab在异二聚体bsab的一个scfv分子上含有突变，这降低adcc活性。另一方面，bsab在异二聚体bsab的两条链上含有突变，这完全消除adcc活性。例如，bsab的一个或两个scfv分子引入的突变是ch2结构域的lala突变。可使具有可变的adcc活性的这些bsab优化，使得bsab显示针对表达被bsab识别的一种抗原的细胞的最大选择性杀灭，然而显示针对被bsab识别的第二抗原的最小杀灭。

本发明提供识别ccr和第二抗原的双特异性抗体。在一个实施方案中，第二抗原是pd-l1。在另一个实施方案中，第二抗原是caix。在其它实施方案中，第二抗原是ca-ix、erbb2、pd-l1、pd-1、cd3、il21、il21r、hvem、cd160、tim3、gitr、lag3或gal9。

本文公开的双特异性抗体可用于治疗疾病或医学病况，例如癌症。癌症是例如实体癌，例如肾细胞癌、乳腺癌或前列腺癌。在其它实施方案中，癌症是当与未患癌症的组织或受试者相比时caix、pd-l1或hvem过表达的癌症。本发明的双特异性抗体可用于治疗、预防或减轻癌症的症状。

本发明的双特异性抗体可用于增加t细胞增殖，其中t细胞是调节性t细胞。本发明的双特异性抗体对于提高或加强t细胞应答(例如抗原特异性t细胞应答)可能是特别有用的。本发明的双特异性抗体还可用于逆转调节性t细胞介导的效应t细胞增殖的抑制。

融合蛋白

在一些实施方案中，ccr4抗体或其功能片段与第二蛋白质直接连接。在其它实施方案中，ccr4抗体或其功能片段通过接头(例如柔性多肽链)与第二蛋白质连接。接头可以是任何长度的任何合适的接头，但长度可为至少1、2、3、4、5、10、15、20、25或30个氨基酸。在一个实施方案中，接头是天然存在于宿主的免疫球蛋白分子中的氨基酸序列，使得接头的存在不导致哺乳动物针对接头序列的免疫应答。包括多于一种的其它蛋白质与ccr4抗体的本发明融合蛋白可具有连接各个其它蛋白质或肽序列的多个接头序列。

本发明的融合蛋白可通过技术人员已知的重组方法构建。例如，可使含有编码本发明的ccr4抗体的核酸序列的表达载体与编码第二蛋白质的核酸序列有效连接，并可引入表达系统中以翻译和产生融合蛋白。或者，本领域技术人员应容易地利用从头蛋白质合成技术以产生本文所述融合蛋白。

组合方法

本发明提供施用与ccr4蛋白的相同表位或备选ccr4蛋白的2个不同表位结合的2种抗体的方法。此外，通过施用与ccr4结合的第一抗体和与ccr4以外的蛋白质结合的第二抗体治疗癌症。

此外，本发明提供与ccr4蛋白结合的抗体和抗肿瘤剂例如小分子、生长因子、细胞因子或包括例如肽、肽模拟物、拟肽、多核苷酸、脂质衍生的介质、小的生物胺、激素、神经肽和蛋白酶等生物分子在内的其它治疗剂的施用。小分子包括但不限于无机分子和有机小分子。合适的生长因子或细胞因子包括il-2、gm-csf、il-12和tnf-α。小分子文库是本领域已知的(参见lam,anticancerdrugdes.,12:145,1997)。

应该理解，本发明不限于在此描述的具体方法、方案和试剂以及实例。这里使用的术语和实例仅用于描述特定实例的目的，为了向本领域技术人员提供指导的意图和目的，而不是为了限制本发明的范围。

实施例

实施例1通用方法

确定t细胞表面上的分子密度

将t细胞与pacblue-抗-cd3、bv570-抗-cd4、apc-抗-cd25、pe-cy7-抗cd127、pe-cy5-抗cd45ra、percp-cy5.5-ccr7和pe-抗-ccr4mab在数据表中推荐的浓度下温育。将细胞在100μlfacs缓冲液(补充有5mmedta和1%bsa的pbs)中于4℃染色30分钟。根据cd标志物将t细胞门控到不同的t细胞亚组中，并分析pe荧光强度。将荧光强度与标准校准bdquantibritepebeads(bdbiosciences，sanjose，ca)进行比较，以确定每个细胞/珠的总分子数，将其除以细胞/珠表面积以获得位点密度。

treg抑制测定

用浓度为5μm的cfse(biolegend，sandiego，ca)标记cd4⁺cd25^-t细胞，并在存在和不存在20μg/ml植物血凝素(pha，sigma，st.louis，mo)下以5×10⁴个细胞/孔培养于96孔板中，分别作为t细胞增殖的阳性和阴性对照。使用tregenrichmentkit(stemcell，vancouver，canada)和mab2-3缀合的dynabeadsm-280(lifetechnologies，carlsbad，ca)分离cd4⁺和cd4⁺ccr4^-treg。将5×10³个cd4⁺和cd4⁺ccr4^-treg分别与cfse标记的cd4⁺cd25^-t细胞在37℃温育7天。为了测量cfse-标记的t细胞的增殖，用viabilitydyeefluor506(ebioscience，sandiego，ca)对共培养的细胞进行染色，然后门控活cfse⁺细胞并使用流式细胞术进行分析。

对于存活测定，使用tregcellenrichmentkit从pbmc分离cd4⁺cd127^dim/-cd49dtreg。用0.5iu/mlil-2、20μg/mlmab2-3igg1和20μg/ml对照igg1分别或组合地培养1×10⁵个treg，并在37℃温育5天。然后用存活力染料(viabilitydye,ebioscience)染色细胞并使用流式细胞术分析。

细胞

将ovca细胞系igrov-1、ovcar-5和ovcar-8在37℃、含5%co2的气氛中温育。将ovcar-5和ovcar-8在补充有10%胎牛血清(fbs)和1%青霉素/链霉素(lifetechnologies)的rpmi-1640(lifetechnologies)中培养。将igrov-1在10%fbs和1%青霉素/链霉素dulbecco改良的eagle培养基(dmem，lifetechnologies)中培养。用萤光素酶报道逆转录病毒稳定转导表达萤光素酶的igrov-1和t细胞，并通过检测发光进行鉴定。作者没有对这些细胞系进行额外的鉴定。

动物

在该研究中使用6-8周龄的雌性nod.cg-prkdc^scidil2rg^tm1wj1/szj(nsg)小鼠(thejacksonlaboratory，barharbor，me)。在nsg小鼠中皮下(s.c.)将2×10⁶个或5×10⁶个表达萤光素酶的igrov-1细胞注射到背外侧腹部，分别温育一天或三天。然后，将小鼠随机分入不同组，并用igrov-1致敏t细胞(4×10⁶个或1×10⁷)和3mg/kgmab2-3igg1、mab2-3igg4和对照mab(每周两次持续5周)通过iv注射来处理。使用数字卡尺和xenogen成像来测量体重和肿瘤大小。肿瘤体积计算为长度×(宽度)²×0.52。根据dana-farbercancerinstitute(boston,ma)的动物护理和使用委员会(animalcareandusecommittee)的指导进行动物护理。

趋化性

将t细胞(1×10⁶个细胞/孔)在37℃置于具有或不具有mab2-3的transwell迁移孔(corning，tewksbury，ma)中持续5小时。从含有培养过ovca细胞的培养基或100ng/ml人ccl22(r＆dsystems)的底部室收获迁移的细胞，并通过facs分析计数。从培养过igrov-1-、ovcar-5-和ovcar-8-的培养基(1×10⁶个细胞/ml)的上清液中收获培养过ovca细胞的培养基。t细胞迁移计算为相对于培养物或补充ccl22的培养基的百分比。

建立肿瘤致敏t(tp-t)细胞

在含有重组il-2(30iu/ml)和il-7(5ng/ml)的完全培养基中，将pbmc(2x10⁶/ml)与自体igrov-1-脉冲的树突细胞(dc，2x10⁵/ml)一起温育。将细胞在50-ml组织培养瓶中于37℃在5%co2培养箱中温育。每2周用裂解物脉冲的自体dc再次刺激pbmc，每5天用含有重组il-2和il-7的新鲜培养基喂养培养物。经过3~4轮抗原刺激和选择后，建立tp-t细胞，将细胞在含有重组il-2和il-7的完全培养基中扩繁2周，并进行功能测试。

细胞因子产生的分析

将tp-t细胞(1×10⁵)与自体igrov-1脉冲的dc(2×10⁴)、未脉冲的dc(2×10⁴)或dynabeadshumant-activatorcd3/cd28(lifetechnologies)一起在完全培养基中在37℃温育。温育48小时后，收获上清液，使用humanifn-γreagentkit(piercebiotechnology，rockford，il)和mesoscalediscoverysectorimager2400(msd，rockville，md)检测ifn-γ。此外，将tp-t细胞与mab2-3缀合珠一起温育以耗尽ccr4⁺tp-t细胞。在存在或不存在20μg/mlmab2-3igg1或igg4的完全培养基中，将tp-t或ccr4^-tp-t细胞(1×10⁵)与igrov-1(1×10⁴)一起温育。温育24和48小时后，通过msd和细胞内facs分析评估tp-t细胞产生的ifn-γ。

上清液细胞因子，il-2和scd25检测

根据生产商的说明，使用elisaready-set-go！kit(用于il-2、il-10和tgf-β)(ebioscience)和humanil-2srαelisaset(bdbiosciences)在细胞培养物上清液中检测细胞因子和可溶性cd25。将样品在rpmi-1640培养基中稀释(必要时)。对于il-10和tgf-β，将自体的cd4⁺cd25^-和cd4⁺cd25⁺t细胞(1:1)在存在或不存在20μg/ml抗体的情况下用抗-cd3/28(1/0.5μg/ml)包被的平板中的10%fbsrpmi-1640培养基培养。对于il-2，在存在或不存在外源il-2或抗体的情况下，将teff和treg单独或共培养物与10%fbsrpmi-1640培养基一起温育。在存在外源il-2(20iu/ml)的情况下，用或不用抗体(mab2-3或抗-cd25，包括抗-tac和对照mab)培养2x10⁵个mac-1细胞。对于竞争测定，在存在或不存在不同浓度的抗体的情况下用生物素化的il-2对mac-1细胞进行染色，然后通过facs检测。对于scd25研究，在存在和不存在mmp-9抑制剂(cas1177749-58-4)或来自calbiochem(emdbiosciences，sandiego，ca)的阴性对照gm6001下，将mac-1细胞与mab2-3、ccl17或ccl22一起温育。将细胞温育12、24和48小时，然后收获培养物上清液用于elisa。

统计分析

对于体外和体内实验，分别使用双侧不配对斯氏t检验和双向anova分析数据。*、**和***分别表示p值<0.05、0.01和0.005。

实施例2：人t细胞群上的ccr4表达谱

从健康供体分离人外周血单核细胞(hpbmc)，并用多个t细胞表面标志物染色以描绘t细胞亚群(图1a)。使用细胞标志物(cd3、cd4、cd25和cd127)来鉴定cd4⁺cd25^高cd127^dim/-treg和cd4⁺cd25^-cd127⁺teff。此外，使用抗ccr7和抗cd45ra抗体将teff分为四个亚组，即未致敏(tnaïve)、中枢记忆(tcm)、效应记忆(tem)和其他teff群(oteff)。测量了来自hpbmc的每种cd4⁺t细胞亚组的百分比(图1b)。使用流式细胞术，通过quantibritepe珠和pe标记的抗ccr4抗体进一步筛选和定量cd4⁺t细胞亚组的ccr4表达谱(图1c、7a和s1b)。ccr4分子在treg上均匀表达(图1d)，表面密度(19,717±1416，n=3)是teff上(8063±165，n=3)的大约2.5倍高(图1e)。虽然teff上的ccr4表达是可变的(4-40%)(图1d)，但ccr4阳性细胞上存在相似数目的ccr4分子(图7c)。

实施例3：ccr4⁺treg对teff细胞增殖的免疫抑制能力

为了评估ccr4⁺treg是否介导免疫抑制，ccr4染色与cd25和foxp3共染色一起进行。在图2a中，发现cd3⁺、cd4⁺、cd25⁺和foxp3⁺t细胞门(gate)中有85%的细胞共表达ccr4。然后进行treg抑制测定以确定ccr4⁺treg的生物学功能。如图2b和2c所示，teff增殖在与总treg的共培养中被抑制，但在与ccr4^-treg的共培养中不被抑制，表明ccr4⁺treg亚组在抑制活性中起重要作用。

实施例4：通过mab2-3igg1在hupbl-nsg小鼠中体内耗尽treg

为了研究mab2-3处理是否可以在体内调节treg群，使用mab2-3-igg1和igg4同种型的两种同种型，由于其范围窄且对fcγ受体(fcγr)的亲和力低，后者具有有限的体内耗尽活性(20)。将这些抗体注射到人外周血淋巴细胞nsg小鼠(又名hupbl-nsg小鼠)中，并检查小鼠血液中的treg百分比。如图8a所示，在处理后第1天，mab2-3igg1组中的cd4⁺cd25⁺cd127^dim/-treg群显著降低，但如预期的，在mab2-3igg4或对照mab处理组中不如此(图8b和8c)。在第7天，与mab2-3igg4和对照mab处理组相比，在mab2-3处理的小鼠中treg的回收<50%。还研究了mab2-3igg4多剂量处理在hu-pbl-nsg小鼠中的长期作用。图9显示在三周的研究中，小鼠血液、脾和骨髓中的人cd45⁺淋巴细胞中cd3⁺cd4⁺cd25⁺cd127^-细胞的百分比没有显著改变。引人关注的是，在最后一个时间点用mab2-3igg4处理的小鼠中cd3⁺t细胞和cd8⁺t细胞的总数增加(分别为图9c＆e)。这些结果表明，mab2-3igg1，而不是igg4，导致体内耗尽treg。

实施例5：通过mab2-3体外和体内抑制ovca介导的treg迁移

检查三种ovca细胞系igrov-1、ovcar-5和ovcar-8中的ccl22表达水平。与转录谱分析研究一致(数据未显示)，igrov-1中ccl22表达最高，ovcar-5中适中，ovcar-8细胞中不可检测(图3a)。在这些细胞系中都没有检测到ccr4表达(图10a)。我们进一步使用来自这些细胞系的培养物上清液或重组人ccl22进行趋化性测定。与新鲜培养基相比，所有三种培养过的培养基都显示出treg迁移增加。然而，mab2-3igg1和igg4都能够抑制含有ccl22的igrov-1和ovcar-5上清液诱导的treg趋化性，但是不能抑制由ovcar-8上清液诱导的(图3b)。treg对ccl22的趋化性也以剂量依赖性方式被mab2-3抑制(图10b)。这些结果表明，mab2-3igg1和igg4都能够体外抑制treg向ccl22分泌性ovca细胞的募集。

为了评估mab2-3是否可阻断体内treg募集，将w萤光素酶转导的cd4⁺或cd4⁺cd25⁺t细胞注射到携带igrov-1异种移植肿瘤的小鼠中，接着用mab2-3或对照抗体处理。18小时后，生物发光成像显示，ccl22分泌性肿瘤在用对照igg1处理的小鼠中募集cd4⁺和cd4⁺cd25⁺t细胞，但是通过用mab2-3igg1处理减少了这种募集(分别见图3c和3d)。研究mab2-3处理48小时后募集的cd4⁺cd25⁺cd127^dim/-treg，发现a)treg在对照igg1组的肿瘤组织中累积，b)treg被mab2-3igg1耗尽和c)在用mab2-3igg4处理的小鼠中treg弥散分布(图11a)。与对照组相比，mab2-3igg1和igg4处理导致肿瘤组织的生物发光强度较低(图11b)和较少的肿瘤浸润treg(图11c)。这些结果表明，mab2-3igg1处理导致treg耗尽，而mab2-3igg4处理导致体内肿瘤浸润treg募集的抑制。

实施例6：通过mab2-3体外介导的增强的抗肿瘤免疫

为了建立携带人源化小鼠模型的ovca异种移植物，在体外产生igrov-1-特异性t细胞，随后可以测试其体内免疫疗法。树突细胞(dc)从收获自hpbmc(图12a)的单核细胞分化，用igrov-1细胞裂解物脉冲，并与自体hpbmc共培养以产生肿瘤致敏t(tp-t)细胞。这些tp-t细胞能够响应肿瘤抗原，导致在与igrov-1脉冲的dc共培养中产生ifn-γ(图12b)。此外，如图4a中的代表性实验所示，在所有cd4⁺t细胞中，tp-t细胞由约31.6±1.4%(n=3)cd25⁺ccr4⁺t细胞组成。这些ccr4⁺tp-t细胞也可以使用mab2-3缀合磁珠去除(图4b)。如图4c所示，与单独培养的tp-t细胞相比，与igrov-1细胞共培养的tp-t细胞表现出ifn-α释放增加。细胞染色研究显示，与来自相同供体的未致敏t细胞相比，与igrov-1细胞反应的cd8⁺和cd4⁺tp-t细胞的ifn-γ表达增加(图4d)。

此外，当ccr4⁺细胞用来自tp-t群的mab2-3耗尽时，共培养物显示出增强的ifn-γ活性(图4c)。然而，与对照igg1相比，可溶性mab2-3igg1或igg4处理没有增强的作用。这种mab2-3增强的缺乏表明，在该体外系统中可能需要treg耗尽，以实现可能的tp-t抑制的逆转，因为共培养物中treg的高百分比、其抑制介质的释放和/或需要细胞与细胞的接触。此外，与非耗尽的tp-t细胞相比，mab2-3耗尽的tp-t细胞可以诱导对igrov-1细胞更高的细胞毒性(图4e)。这些数据表明，tp-t细胞，特别是mab2-3耗尽的ccr4⁺tp-t细胞，可以诱导抗肿瘤应答并介导肿瘤细胞死亡。

实施例7：体内mab2-3抗肿瘤作用的评价

确认了通过mab2-3介导的耗尽或阻断来降低肿瘤浸润性treg可以增强抗肿瘤活性的发现结果的功能相关性和因此潜在的治疗相关性。携带表达萤光素酶的igrov-1异种移植物的小鼠接受4×10⁶个tp-t细胞，并用mab2-3每周两次处理，持续5周。每十天拍摄生物发光图像以定量肿瘤大小(图5a)。与对照组相比，用mab2-3igg1和igg4处理的小鼠显示出较低的相对低的发光强度，mab2-3igg1处理显示比mab2-3igg4更大的抗肿瘤作用(图5b)。在肿瘤大小测量中观察到相同的观察结果(图5c)。引人关注的是，在用mab2-3igg1处理的组中观察到小鼠体重的最大降低(图5d)。在肿瘤组织(图5e)和肿瘤重量(图5f)中也观察到mab2-3的抗肿瘤作用。这些结果显示，mab2-3介导的针对肿瘤的tp-t细胞抑制体内肿瘤生长。

为了证实mab2-3的有效治疗效果，我们将注射到携带igrov-1异种移植物的小鼠中的tp-t细胞的数量增加了2.5倍。在这些实验条件下，用mab2-3igg1和igg4处理的小鼠中的肿瘤生长曲线具有统计学显著的抑制(图13a)。体重和肿瘤组织显示与图5相似的结果(图13b和13c)。发现tp-t细胞(cd3+)渗入所有处理组的肿瘤移植位点(图13g，上图)。另外，在用pbs和对照mab处理的异种移植肿瘤中cd25⁺tp-t细胞可被检测到并累积，但在用mab2-3igg1和igg4处理的肿瘤中cd25⁺tp-t细胞的累积减少(图13g，下图)。通过facs进一步研究小鼠血液中的tp-t细胞，结果显示各处理组中cd4⁺和cd8⁺t细胞没有差异，但仅在mab2-3igg1处理组中treg群降低(图13d-f)。总之，这些数据表明，mab2-3igg1的treg耗尽和mab2-3igg4的肿瘤募集treg阻断可以增强体内抗肿瘤免疫。

实施例8：mab2-3的作用机制

treg使用的抑制机制包括释放抑制性细胞因子和细胞溶解酶，以及介导cd25/il-2和cd39/腺苷的代谢干扰(21)。研究了由treg产生的细胞因子，发现mab2-3不改变抑制性细胞因子(即il-10和tgf-β)的水平(图14)。接下来确定mab2-3与teff和treg上的ccr4的结合是否可以影响cd25(tac)、il-2受体(il-2r)的α链和il-2之间的相互作用。图6a显示来自teff的内源il-2分泌不是通过mab2-3处理诱导。相比之下，当向treg培养物中加入外源il-2时，在仅用mab2-3的上清液中检测到il-2累积的显著增加(图6b)。另外，建立teff/treg共培养系统，其中用mab2-3或对照mab处理细胞，并且也不用(图6c)或用(图6d)外源il-2温育细胞。结果显示，mab2-3而非对照mab处理导致两者的共培养物上清液中il-2水平的升高。

然后使用表达ccr4和il-2r的mac-1细胞在竞争测定中进一步检查mab2-3是否影响il-2与il-2r的结合。结果显示，与用不阻断il-2结合的对照抗cd25mab处理相比，与抗-tac(il-2rα)mab类似，mab2-3有效抑制生物素化的il-2与mac-1细胞的结合(图15a和15b)(22)。另外，用外源il-2和不同的mab处理后收获mac-1培养物上清液，并进行检测可溶性il-2的elisa测定。用抗-tacmab和mab2-3两者处理导致培养物上清液中il-2水平增加，这大概是由于外源il-2与mac-1细胞结合的抑制，但对照mab处理或未处理组没有(图6e)。

已知il-2r由三个亚基α、β和γ链组成，并且α链显著增加受体对il-2的亲和力，从kd=1nm(βγ链)到kd=10pm(αβγ链)。在用瞬时转染的293t细胞的对照实验中，发现对il-2结合的抑制不是由于mab2-3与个体α、β和γ亚基链或复合物的直接结合。据报道cd25在t细胞活化后被切割成可溶形式(scd25)(23)，kd=30nm(24)。监测用mab2-3或对照mab处理后的培养物上清液中的scd25。数据证明，当以剂量依赖性方式用mab2-3处理细胞时，上清液中scd25的水平增加(图18a)，并且该效应与温育时间正相关(图17b-17d)。这一结果表明，mab2-3与ccr4的接合(engagement)导致t细胞活化，可能类似于其配体ccl17和ccl22(25、26)。事实上，两种配体也诱导scd25脱落(图17a)。为了进一步确定mab2-3介导的scd25脱落对treg存活的功能，将treg与il-2和/或mab2-3/对照igg1一起培养。il-2显示维持treg存活的能力，但引人关注的是，il-2对treg存活的积极作用被mab2-3抑制(图6f)。这些结果表明，mab2-3与treg上ccr4的接合导致对il-2/il-2r复合物的调节，导致treg死亡增加。

由于mab2-3可以阻断ccl17/22与ccr4的相互作用，我们试图了解ccr4的ccl17/22接合是否可以类似于mab2-3诱导scd25脱落。图17a显示，ccl17和ccl22配体均显示出诱导scd25脱落的活性，这在先前尚未见报道。

一些研究显示，基质金属蛋白酶9(mmp-9)具有切割cd25的能力(27-29)。为了研究mab2-3、ccl17和ccl22在诱导scd25脱落中的作用机制，用mmp-9抑制剂或对照mmp抑制剂处理培养物(图17a)。引人关注的是，mmp-9抑制剂减少了所有处理组中scd25的脱落，而对照抑制剂没有观察到效果(图17a和图18a-b)。这些结果表明，mab2-3处理以与ccl22/17类似的方式导致cd25的切割，表明mab2-3具有激动剂活性并与ccr4配体共享活化mmp-9功能和scd25切割的能力，最终的结果是丧失了il-2的结合。

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其他实施例

虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求书的范围内。