用于在浮萍中生产维生素B12的装置和方法与流程

发明领域

本发明一般涉及用于生产富含维生素b12的浮萍的装置和方法。具体地，涉及用于提供富含维生素b12的浮萍细菌培养物的装置和方法。

发明背景

维生素b12是水溶性维生素，其天然存在于某些食品中，添加到其他食品中，并可用作膳食补充剂和处方药。维生素b12以几种形式存在并含有矿物质钴，所以具有维生素b12活性的化合物统称为“钴胺素”。甲钴胺和5-脱氧腺苷钴胺素是在人类代谢中有活性的维生素b12的形式。

维生素b12是红细胞形成，神经功能和dna合成所必需的。它起蛋氨酸合酶和l-甲基丙二酰辅酶a变位酶的辅因子的作用。蛋氨酸合酶催化高半胱氨酸转化为蛋氨酸。蛋氨酸是形成s-腺苷蛋氨酸所必需的，s-腺苷蛋氨酸是几乎100种不同底物的通用甲基供体，包括dna，rna，激素，蛋白质和脂质。l-甲基丙二酰辅酶a变位酶在丙酸酯的降解中将l-甲基丙二酰辅酶a转化成琥珀酰辅酶a，这是脂肪和蛋白质代谢中必要的生化反应。琥珀酰辅酶a也是血红蛋白合成所必需的。

与食品中的蛋白质结合的维生素b12通过胃中的盐酸和胃蛋白酶的活性释放。当合成的维生素b12被添加到强化食品和膳食补充剂时，它已经是游离形式，因此不需要这个分离步骤。随后，游离维生素b12与内因子(由胃壁细胞分泌的糖蛋白)结合，并且由此产生的复合物通过受体介导的内吞作用在回肠末端吸收。1微克口服剂量的维生素b12的大约56％被吸收，但当超过内因子的容量(1-2微克维生素b12)时，吸收急剧下降。

内因子机能故障影响的一个例子是恶性贫血，这是一种影响胃粘膜并导致胃萎缩的自身免疫性疾病。这导致壁细胞的破坏，胃酸缺乏，以及不产生内因子，导致维生素b12吸收不良。如果恶性贫血未得到治疗，即使在维生素b12膳食摄入充足的情况下，也会导致维生素b12缺乏，导致巨幼红细胞性贫血和神经系统疾病。这种特定的病况表明，维生素b12的充足膳食摄入，即通过口服摄取合成形式的维生素b12食用，不能确保维生素在体内充分或适当的吸收。

维生素b-12缺乏症在素食主义者和严守素食主义者中尤其普遍，但在肉食者中也意外地普遍。维生素b-12只能在小肠中吸收，而由于常见的肠道疾病，许多食用高水平b-12的肉食者不能在他们肠道内吸收b-12，因此患有维生素b12缺乏症。

广义而言，b12是指一组称为钴胺素的含钴类维生素化合物：这些化合物包括氰钴胺(当羟钴胺被纯化时使用活性炭形成的人工制品，总是含有痕量的氰化物)，羟钴胺(由细菌产生的另一种药物形式)，以及最后，人体中b12的两种天然存在的辅因子形式：5′-脱氧腺苷钴胺素(腺苷钴胺素-adob12)，甲基丙二酰辅酶a变位酶(mut)的辅因子；和甲钴胺(meb12)，蛋氨酸合酶的辅因子，其负责将高半胱氨酸转化为蛋氨酸和将5-甲基四氢叶酸转化为四氢叶酸。

氰钴胺是用于食品和营养补充剂的主要b12形式。这种形式可能导致眼神经损害罕见案例的副作用，或者由于吸烟导致血液中的高氰化物水平，身体只能最低限度地使用这种形式。假维生素b12是指b12样类似物，其在人体中是无生物活性的，但在许多食品来源(包括动物)中，以及可能在补充剂和强化食品中，发现与b12一起存在。

维生素b12的主要来源是食品，补充剂和医疗处方。

维生素b12天然存在于动物来源的产品中，包括鱼，肉，家禽，蛋，奶和奶制品。然而，热处理后蛋黄和蛋清的结合能力明显下降。目前只有建议的生物活性b12的少数非动物食品来源，并且这些都没有经过人体试验。

藻类被认为通过与异养细菌的共生关系获得b12，其中细菌供给b12以换取固定碳。已经发现螺旋藻属和干燥的浅草紫菜(甘紫菜(porphyratenera))主要含有假维生素b12而不是生物活性的b12。虽然浅草紫菜(甘紫菜)在干燥状态主要含有假维生素b12，但据报道其在新鲜状态下主要含有生物活性的b12，但其新鲜状态的维生素活性尚未被动物酶分析所证实。

据报道，被称为susabi-nori(条斑紫菜(pyropiayezoensis))的紫菜海藻在其新鲜状态下含有大鼠模型中的b12活性，这暗示该来源在人体中将是活性的。这些结果尚未得到证实。

维生素b12通常不存在于植物性食品中，但是用b12强化的食品也是维生素的来源，尽管它们不能被认为是b12的真正食品来源，因为维生素以补充剂形式添加，来自商业性细菌生产来源，例如氰钴胺。b12强化食品的实例包括强化早餐麦片，强化大豆产品，强化能量棒和强化营养酵母。并非所有这些食品都可能含有标示量的维生素活性。在另一项研究中，添加到饮料中的补充b12被发现降解成含有不同水平的假维生素b12。

b12的非常规天然来源也存在，但它们作为b12的食品来源的效用是值得怀疑的。例如，从地上拔出并且没有经过严格清洗的植物可能含有来自周围土壤中存在的细菌的b12残留。如果水没有被消毒，b12也会在湖中被发现。某些昆虫如白蚁含有由它们的肠道细菌产生的b12，类似于反刍动物。人体肠道本身可能在小肠中含有产生b12的细菌，但是不清楚是否能够产生足够量的维生素以满足营养需要。

在膳食补充剂中，维生素b12通常以氰钴胺存在，这种形式容易被身体转化为活性形式甲钴胺和5-脱氧腺苷钴胺素。膳食补充剂还可以含有甲钴胺和其他形式的维生素b12。现有证据并不表明形式之间吸收或生物利用度的任何差异。然而，人体从膳食补充剂吸收维生素b12的能力很大程度上受内因子容量的限制。例如，500微克口服补充剂中的仅约10微克实际上被健康人吸收。

除口服膳食补充剂外，维生素b12还可从舌下制剂获得，如片剂或锭剂。这些制剂经常以具有优越的生物利用度销售，虽然证据表明口服和舌下形式之间的效力没有差异。

氰钴胺和偶尔的羟钴胺形式的维生素b12可以作为处方药非肠道给药，通常通过肌内注射。肠胃外给药通常用于治疗由恶性贫血和其他导致维生素b12吸收不良和严重维生素b12缺乏的病症引起的维生素b12缺乏症。

维生素b12也可作为鼻内施用的凝胶制剂中的处方药，作为替代维生素b12注射剂的市售产品，某些患者可能更喜欢。这种制剂似乎可以有效提高维生素b12的血液浓度，尽管在临床上还没有对其进行彻底的研究。

合成维生素b12是通过钴和氰化物发酵以制备氰钴胺而产生的。因此合成维生素b12含有氰化物。虽然量很少，但其对身体仍然有毒。氰钴胺这种维生素的一般合成形式不是天然存在的，但由于其成本较低而被用于许多药物和补充剂中，以及作为食品添加剂。在体内，它通过氰化物的形成转化为生理形式，甲钴胺和腺苷钴胺素。从维生素中除去氰化物分子，然后将其从体内除去需要使用体内的分子的“甲基”，分子的“甲基”是其他重要生理性所需要的，如降低高半胱氨酸水平(高水平导致心脏病)。最近，在更昂贵的药理学产品和食品补充剂中发现羟钴胺，甲钴胺和腺苷钴胺素。它们的额外效用目前是有争议的。

b12的工业生产目前是通过发酵选定的微生物。灰色链霉菌(streptomycesgriseus)细菌多年来是维生素b12的商业来源。现今更常用物种脱氨假单胞菌(pseudomonasdenitrificans)和费氏丙酸杆菌谢氏亚种(propionibacteriumfreudenreichiisubsp.shermanii)。这些细菌物种经常在特殊条件下生长以提高产量，一些公司使用这些物种中的一种或两种的基因工程版本。由于许多丙酸杆菌属(propionibacterium)物种不产生外毒素或内毒素，并且通常被美国食品药品监督管理局认为是安全的(已被授予gras状态)，它们目前是用于维生素b12生产的fda-优选的细菌发酵有机体。

通过细菌发酵商业地制备氰钴胺。各种微生物发酵产生甲钴胺、羟钴胺和腺苷钴胺素的混合物。通过在亚硝酸钠存在下加入氰化钾并加热将这些化合物转化为氰钴胺。氰钴胺的口服使用可能导致多种过敏反应，例如呼吸困难，脸部、嘴唇、舌头或咽喉肿胀。不太严重的副作用可能包括头痛，恶心，胃部不适，腹泻，关节痛，瘙痒或皮疹。

在治疗某些形式的贫血(例如巨幼红细胞性贫血)时，使用氰钴胺会导致严重的低钾血症，有时是致命的，这是由于贫血消除后细胞内的钾转移。当用维生素b12治疗时，莱伯氏病患者可能遭受快速视神经萎缩。浮萍物种是世界范围内发现的小型浮游水生植物，并且经常被发现生长在静止的营养丰富的新鲜和微咸水域中的厚的毯状垫子上。它们是属于植物浮萍科(lemnaceae)的单子叶植物，被归类为高等植物或水生植物，尽管它们经常被错误地称为藻类。

浮萍或浮萍科是漂浮在静止或缓慢移动的新鲜水体和湿地表面上或刚好在静止或缓慢移动的新鲜水体和湿地表面下方的开花水生植物。浮萍无根萍属(wolffia)的花是已知最小的，测量仅为0.3毫米长。

浮萍受到了研究的关注，因为它们有很大的潜力从污水处理厂，集约化畜牧业或集约化灌溉作物生产排放的废水中去除矿物污染物。需要对浮萍进行管理，防风，并保持最佳密度以获得最佳生长速率。在世界许多地方，浮萍被家养动物和野生动物(家禽，鱼类，草食动物和人类)消耗掉。最小的浮萍(芜萍(wolffiaarrhiza))已经被缅甸人、老挝人和泰国北部人世世代代用作营养蔬菜。浮萍是对沙拉很好的添加，并且非常好吃。

与其他水生植物相比，甚至与陆生植物相比，浮萍(大部分属的物种)具有对来自其生长培养基的各种矿物质(阳离子和阴离子)的很高的结合能力(固定)。该属性被用于清洁水源(水污染清除)，但同时该属性构成了使用这种植物作为人类食品替代来源的主要限制。

共生的浮萍-细菌培养物已被用于改善浮萍的营养素去除(废水处理)和从废水的淀粉-生物质生产(能源/化学原料的生产)(http://duckweed2013.rutgers.edu/presentations/16_toyama_tadashi.pdf)。还报道了来自内共生杆菌培养物的提取物显示了对浮萍(浮萍(l.minor))的除草剂活性(k.gebhardt,j.schimana,j.müller,h.p.fiedler,h.g.kallenborn,m.p.krastel,a.zeeck,j.vater,a.d.g.schmid,j.rheinheimer和k.dettner,screeningforbiologicallyactivemetaboliteswithendosymbioticbacilliisolatedfromarthropods。femsmicrobiologyletters217(2002)199-205)。

jps6352960公开文本(通过芜萍和浮萍收集酒精和甲烷的方法)教导了从形成淀粉的植物体的酒精发酵，通过在有机废液中培养光合细菌和微藻，向所得到的生长液体中加入轮虫和水蚤，在它们的存在下利用它们之间的食物链培养芜萍和浮萍，并利用浮萍和芜萍的淀粉形成能力。

鉴于上述情况，仍然有长期感受的未满足需求以提供富含维生素b12的天然来源的组合物及其方法。

发明概述

因此，本发明的一个目的是公开用于生产富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)在一定体积的生长培养基中接种至少一种浮萍亚科物种和至少一种产生维生素b12的细菌物种；(b)在预定条件下孵育所述至少一种浮萍亚科物种和所述至少一种产生维生素b12的细菌物种以提供浮萍细菌培养物(dbc)；(c)将所述预定条件下的浮萍亚科植物生物质针对时间作图；(d)将所述预定条件下的所述至少一种产生b12的细菌物种的细菌计数针对时间作图；(e)将所述预定条件下的所述dbc中的维生素b12含量针对时间作图；(f)确定所述图表中以具有最高维生素b12含量的dbc为特征的时间间隔；和(g)以所述预先确定的时间间隔收获所述dbc，由此提供富含维生素b12的dbc组合物。

本发明的另一个目的是公开上述定义的方法，其中，所述孵育步骤还包括选择所述预定条件的步骤，所述预定条件设计用于(i)所述至少一种浮萍亚科物种植物的最佳生长，和(ii)与之有关联的所述合成维生素b12的细菌的最佳发酵。

本发明的另一个目的是公开上述任一项所定义的方法，其中，所述孵育步骤还包括使所述至少一种浮萍亚科物种和所述至少一种产生维生素b12的细菌物种在预定条件下生长的步骤，以提供所述至少一种细菌物种与所述至少一种浮萍亚科物种之间的关联。

本发明的另一个目的是公开上述任一项所定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述关联的步骤：共生相互作用，持久互利共生，持久生物相互作用，互利共生，种间互惠利他行为，偏利共生相互作用，寄生共生，专性相互作用，兼性相互作用，两个物种均专性，一个专性但另一个兼性，两个物种均兼性，外共生，内共生，偏利外共生，互利外共生，外寄生，连接共生，分离共生，对抗或拮抗性共生或关系，尸养相互作用，活养相互作用，偏害共生，竞争关系，抗生关系，双损共生及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任一项所定义的方法，其中，所述接种步骤包括使所述至少一种浮萍亚科物种和所述至少一种产生b12的细菌物种以分批培养或连续培养生长的步骤。

本发明的另一个目的是公开上述任一项所定义的方法，其中，所述接种步骤包括从由以下组成的组中选择所述体积的生长培养基的步骤：水生植物生长设施和微生物生长设施。

本发明的另一个目的是公开上述任一项所定义的方法，其中，所述接种步骤包括从由以下组成的组中选择所述体积的生长培养基的步骤：池，渠，槽，发酵器，生物反应器，卵石和任何其它基质。

本发明的另一个目的是公开上述任一项所定义的方法，其中，所述孵育步骤还包括从由以下组成的组中选择用于生长所述浮萍亚科物种生物质的所述预定条件的步骤：生长培养基的矿物质组成，生长培养基的矿物质浓度，尿素浓度，亚硝酸盐和硝酸盐浓度，总氨浓度，生长培养基的温度范围，气氛温度范围，水处理程序，光照强度，曝气量，氧浓度，ph值及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从由mg²⁺，mn，zn，fe²⁺，zn²⁺，mn²⁺，cacl2及其任何组合组成的组中选择所述矿物质的步骤。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从由去硝化，机械，过滤及其任何组合组成的组中选择所述水处理程序的步骤。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，其中所述孵育步骤还包括以从由以下组成的组中选择用于所述细菌物种的共生发酵和维生素b12合成的所述预定条件的步骤：浓度范围为约0.01-3.0％w/v的糖，浓度范围为约0.01-3.0％w/v的氨基酸和/或肽和/或维生素源，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的氨基酸或其混合物，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的微量物质，维生素及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从由右旋糖，葡萄糖，乳糖及其任何组合组成的组中选择所述糖的步骤。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从由酵母提取物，酪蛋白的酶促消化物，明胶的酶促消化物及其任何组合组成的组中选择所述氨基酸和/或肽和/或维生素源的步骤。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述氨基酸或其混合物的步骤：l-盐酸精氨酸，l-半胱氨酸，l-谷氨酰胺，甘氨酸，l-盐酸组氨酸一水物，l-异亮氨酸，l-亮氨酸，l-盐酸赖氨酸，l-蛋氨酸，l-苯丙氨酸，l-丝氨酸，l-苏氨酸，l-色氨酸，l-酪氨酸二钠盐二水物，l-缬氨酸及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述微量物质的步骤：氯化胆碱，叶酸，肌-肌醇，烟酰胺，d-泛酸半钙，氯化钙，硝酸铁，硫酸镁，氯化钾，氯化钠，磷酸钠及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述细菌的步骤：假单胞菌属(pseudomonas)物种，例如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)，荧光假单胞菌(p.florescenza)，p.murina；芽孢杆菌属(bacillus)物种，甲烷杆菌属(methanobacterium)物种，丙酸杆菌(propionibacterium)物种，醋酸杆菌属(acetobacterium)，产气杆菌属(aerobacter)，农杆菌属(agrobacterium)，产碱杆菌属(alcaligenes)，固氮菌属(azotobacter)，梭菌属(clostridium)，黄杆菌属(flavobacterium)，乳杆菌属(lactobacillus)，小单孢菌属(micromonospora)，分枝杆菌属(mycobacterium)，诺卡氏菌属(nocardia)，丙酸杆菌属(propionibacterium)，精蛋白杆菌属(protaminobacter)，变形杆菌属(proteus)，假单胞菌属(pseudomonas)，根瘤菌属(rhizobium)，沙门氏菌属(salmonella)，沙雷氏菌属(serratia)，链霉菌属(streptomyces)，链球菌属(streptococcus)，黄单胞菌属(xanthomonas)及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，其中所述确定步骤还包括以下步骤：确定所述至少一种浮萍亚科物种和所述至少一种产生b12的细菌物种相对于时间的生长曲线，并鉴定以所述至少一种浮萍亚科物种的最高生物质和所述至少一种细菌物种的最高细菌细胞计数为特征的时间间隔。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述生物质的步骤：全浮萍亚科生物质，新鲜浮萍亚科生物质，干燥浮萍亚科生物质及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从属于由以下组成的组中的属的物种中选择所述至少一种浮萍亚科物种的步骤：斑萍属(landoltia)，浮萍属(lemna)，紫萍属(spirodela)，无根萍属(wolffia)，小芜萍属(wolffiella)及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述至少一种浮萍亚科物种的步骤：wolffiaangusta，芜萍(wolffiaarrhiza)，wolffiaaustraliana，wolffiaborealis，wolffiabrasiliensis，wolffiacolumbiana，wolffiacylindracea，wolffiaelongate，wolffiaglobose，wolffiamicroscopica，wolffianeglecta及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的方法，还包括提供富含维生素b12的dbc组合物的步骤，所述dbc组合物包含每100g所述dbc约0.01μg至约100μg维生素b12。

本发明的另一个目的是公开包含富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)的组合物，其中所述组合物包含至少一种浮萍亚科(lemnoideae)物种和至少一种产生b12的细菌物种，并且其中所述组合物中的所述维生素b12含量在每100g所述dbc约0.01至约100μg之间的范围。

本发明的另一个目的是公开上述定义的组合物，其中所述组合物中的所述维生素b12含量是维生素b12推荐每日量(dv)的至少20％的预定百分比。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的组合物，其中所述组合物中的所述维生素b12含量符合成年人维生素b12推荐每日摄入量(rdi)标准，每日约0.4μg至约3μg。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的组合物，其中所述至少一种产生b12的细菌物种与所述至少一种浮萍亚科物种相关联。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的组合物，其中所述关联选自由以下组成的组：共生相互作用，持久互利共生，持久生物相互作用，互利共生，种间互惠利他行为，偏利共生相互作用，寄生共生，专性相互作用，兼性相互作用，两个物种均专性，一个专性但另一个兼性，两个物种均兼性，外共生，内共生，偏利外共生，互利外共生，外寄生，连接共生，分离共生，对抗或拮抗性共生或关系，尸养相互作用，活养相互作用，偏害共生，竞争关系，抗生关系，双损共生及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的组合物，其中所述产生b12的细菌选自由以下组成的组：假单胞菌属(pseudomonas)物种，例如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)，荧光假单胞菌(p.florescenza)，p.murina；芽孢杆菌属(bacillus)物种，甲烷杆菌属(methanobacterium)物种，丙酸杆菌(propionibacterium)物种，醋酸杆菌属(acetobacterium)，产气杆菌属(aerobacter)，农杆菌属(agrobacterium)，产碱杆菌属(alcaligenes)，固氮菌属(azotobacter)，梭菌属(clostridium)，黄杆菌属(flavobacterium)，乳杆菌属(lactobacillus)，小单孢菌属(micromonospora)，分枝杆菌属(mycobacterium)，诺卡氏菌属(nocardia)，丙酸杆菌属(propionibacterium)，精蛋白杆菌属(protaminobacter)，变形杆菌属(proteus)，假单胞菌属(pseudomonas)，根瘤菌属(rhizobium)，沙门氏菌属(salmonella)，沙雷氏菌属(serratia)，链霉菌属(streptomyces)，链球菌属(streptococcus)，黄单胞菌属(xanthomonas)及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的组合物，其中所述至少一种浮萍亚科物种选自由以下组成的组：全浮萍亚科生物质，新鲜浮萍亚科生物质，干燥浮萍亚科生物质及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的组合物，其中所述至少一种浮萍亚科物种属于选自由以下组成的组的属：斑萍属(landoltia)，浮萍属(lemna)，紫萍属(spirodela)，无根萍属(wolffia)，小芜萍属(wolffiella)及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开上述任何一项所定义的组合物，其中所述至少一种浮萍亚科物种选自由以下组成的组：wolffiaangusta，芜萍(wolffiaarrhiza)，wolffiaaustraliana，wolffiaborealis，wolffiabrasiliensis，wolffiacolumbiana，wolffiacylindracea，wolffiaelongate，wolffiaglobose，wolffiamicroscopica，wolffianeglecta及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开组合物，含有通过上述任何一项中定义的方法生产的富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中所述预定条件选自由所述浮萍亚科物种生物质的生长条件，所述细菌物种的发酵和维生素b12合成条件及其组合组成的组。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中所述体积的生长培养基是分批培养或连续培养。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中所述体积的生长培养基选自由水生植物生长设施和微生物生长设施组成的组。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中所述体积的生长培养基选自由以下组成的组：池，渠，槽，发酵器，生物反应器，卵石和任何其它基质。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中用于所述浮萍亚科物种生物质生长的所述预定条件选自由以下组成的组：生长培养基的矿物质组成，生长培养基的矿物质浓度，尿素浓度，亚硝酸盐和硝酸盐浓度，总氨浓度，生长培养基的温度范围，气氛温度范围，水处理程序，光照强度，曝气量，氧浓度，ph值及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中所述矿物质选自由mg²⁺，mn，zn，fe²⁺，zn²⁺，mn²⁺，cacl2及其任何组合组成的组。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中所述水处理程序选自由去硝化，机械，过滤及其任何组合组成的组。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中用于所述细菌物种的发酵和维生素b12合成的所述预定条件选自由以下组成的组：浓度范围为约0.01-3.0％w/v的糖，浓度范围为约0.01-3.0％w/v的氨基酸和/或肽和/或维生素源，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的氨基酸或其混合物，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的微量物质，维生素及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中所述糖选自由右旋糖，葡萄糖，乳糖及其任何组合组成的组。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中所述氨基酸和/或肽和/或维生素源选自由酵母提取物，酪蛋白的酶促消化物，明胶的酶促消化物及其任何组合组成的组。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法制备的组合物，其中所述氨基酸或其混合物选自由以下组成的组：l-盐酸精氨酸，l-半胱氨酸，l-谷氨酰胺，甘氨酸，l-盐酸组氨酸一水物，l-异亮氨酸，l-亮氨酸，l-盐酸赖氨酸，l-蛋氨酸，l-苯丙氨酸，l-丝氨酸，l-苏氨酸，l-色氨酸，l-酪氨酸二钠盐二水物，l-缬氨酸及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开由上述任何一项所定义的方法生产的组合物，其中所述微量物质选自由以下组成的组：氯化胆碱，叶酸，肌-肌醇，烟酰胺，d-泛酸半钙，氯化钙，硝酸铁，硫酸镁，氯化钾，氯化钠，磷酸钠及其任何组合。

本发明的另一个目的是公开用于生产富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)组合物的系统，其中所述系统包括：(a)至少一种浮萍亚科物种接种物和至少一种产生维生素b12的细菌物种接种物，用于在一定体积的生长培养基中培养；(b)孵育装置，用于在预定条件下孵育所述至少一种浮萍亚科物种接种物和所述至少一种产生维生素b12的细菌物种接种物以提供浮萍细菌培养物(dbc)；(c)用于确定图表中以具有最高维生素b12含量的dbc为特征的时间间隔的装置；和(d)用于以所述预先确定的时间间隔收获所述dbc的装置，由此提供富含维生素b12的dbc组合物。

本发明的另一个目的是公开上述定义的系统，其中所述系统还包括至少一种作图装置，所述作图装置选自由以下组成的组：(a)用于将所述预定条件下的浮萍亚科植物生物质针对时间作图的作图装置，(b)用于将所述预定条件下的所述至少一种产生b12的细菌物种的细菌计数针对时间作图的作图装置；和(c)用于将所述预定条件下的所述dbc中的维生素b12含量针对时间作图的作图装置。

本发明的另一个目的是公开组合物，含有至少一种浮萍亚科物种和至少一种产生b12的细菌物种的富含维生素b12的提取物，并且其中所述组合物中的所述维生素b12含量在每100g所述dbc约0.01μg至约100μg之间的范围。

附图简述

现在将参照附图描述本发明，其中：

图1示意性地示出了现有技术中已知的典型的细菌生长曲线或动力学曲线；和

图2示意性地示出了作为本发明的实施方案的示例性浮萍细菌培养物(dbc)生长曲线或生长谱。

优选实施方案详述

在下面的描述中，将描述本发明的各个方面。出于解释的目的，阐述了具体细节以便提供对本发明的透彻理解。本领域技术人员将明白，本发明的其他实施方案在细节上不同，而不影响其基本性质。因此，本发明不受图中所示和说明书中所描述的限制，而仅限于如所附权利要求中所指出的那样，其适当的范围仅由所述权利要求的最宽解释来确定。

本发明的实质是提供富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)，其通过建立新的浮萍-细菌共生或关联系统和方案，用于培养，生长和维持浮萍-细菌。上述系统和方案是设计用于浮萍生物质的最佳生长与合成b12的细菌的生产性培养相结合。需要强调的是，维生素b12不能由浮萍生产或在浮萍中生产，但本发明表明，由上述细菌合成后，它可以有效地吸收到浮萍植物中，或与浮萍生物质结合。生成的富含维生素b12的dbc被用作人类食用的天然来源的维生素b12来源，作为维生素b12建议每日摄入量(rdi)标准的预定百分比。优选地，富含维生素b12的dbc组合物每100gdbc含有约0.01μg至约100μg维生素b12。

本发明提供用于生产富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)组合物的方法，其中，所述方法包括以下步骤：(a)在一定体积的生长培养基中接种至少一种浮萍亚科物种和至少一种产生维生素b12的细菌物种；(b)在预定条件下孵育所述至少一种浮萍亚科物种和所述至少一种产生维生素b12的细菌物种以提供浮萍细菌培养物(dbc)；(c)将所述预定条件下的浮萍亚科植物生物质针对时间作图；(d)将所述预定条件下的所述至少一种产生b12的细菌物种的细菌计数针对时间作图；(e)将所述预定条件下的所述dbc中的维生素b12含量针对时间作图；(f)确定所述图表中以具有最高维生素b12含量的dbc为特征的时间间隔；和(g)以所述预先确定的时间间隔收获所述dbc，由此提供富含维生素b12的dbc组合物。

如本文所使用的，术语“约”在下文中指低于或高于所述值25％的范围。

术语“浮萍”在下文中指漂浮在水和湿地表面上或刚好在水和湿地表面下方的开花水生植物。它们属于天南星科(araceae)，因此在天南星科中经常被分类为浮萍亚科(lemnoideae)。根据其他分类，他们被分类为一个独立的科，浮萍科(lemnaceae)。

浮萍科最知名的属种类是：

浮萍属(lemna)(例如lgibba；ldisperna；lgibba；ljaponica；lminima；lminor；lminuscula；lpaucicostata；lperpusilla；lpolyrrhiza；lturionifera；ltrisulca；lvaldiviana)

紫萍属(spirodela)(例如s.biperforata；s.intermedia；s.oligorrhiza；s.polyrrhiza；s.punctata)

无根萍属(wolffia)(例如芜萍(w.arrhiza)；w.australiana；w.columbiana；w.microscopia；w.neglecta，wolffiaangusta，wolffiaborealis，wolffiabrasiliensis，wolffiacylindracea，wolffiaelongata，wolffiaglobosa和wolffiamicroscopica)

小芜萍属(wolffiella)(例如w.caudate；w.denticulate；w.lingulata；w.oblonga；w.rotunda)。

术语“鲜重”在下文中指新鲜植物形式的浮萍植物，其中含水量包括在93-97重量％的范围内。

术语“干重”在下文中指干植物形式的浮萍植物，其中含水量包括在2-8重量％的范围内。

术语“维生素b12”在下文中称为术语b12或维生素b-12，也称为钴胺素。维生素b12是适当的红细胞形成，神经功能和dna合成所需的水溶性维生素。它通常参与人体各个细胞的代谢，特别是影响dna合成和调控，还涉及脂肪酸代谢和氨基酸代谢。维生素b12以几种形式存在并含有矿物质钴；因此具有维生素b12活性的化合物统称为“钴胺素”。

真菌，植物或动物都不能产生维生素b12。只有细菌和古细菌具有其合成所需的酶，尽管由于细菌共生，许多食品是b12的天然来源。该维生素是最大，结构最复杂的维生素，工业生产只能通过细菌发酵合成。

还认识到甲钴胺和5-脱氧腺苷钴胺素是在人类代谢中有活性的维生素b12的形式。

在膳食补充剂中，维生素b12通常以氰钴胺存在，这种形式容易被身体转化为活性形式甲钴胺和5-脱氧腺苷钴胺素。膳食补充剂还可以含有甲钴胺和其他形式的维生素b12。然而，人体从膳食补充剂吸收维生素b12的能力很大程度上受内因子容量的限制。例如，500微克口服补充剂中的仅约10微克实际上被健康人吸收。

假维生素b12是指b12样类似物，其在人体中是无生物活性的，但在人体中，许多食品来源(包括动物)中，以及可能在补充剂和强化食品中，发现与b12一起存在。

术语“产生维生素b12的细菌物种”在下文中是指能够通过发酵在细胞内或细胞外产生维生素b12的细菌物种。认识到下列属的物种已知合成b12：醋酸杆菌属，产气杆菌属，农杆菌属，产碱杆菌属，固氮菌属，芽孢杆菌属，梭菌属，棒状杆菌属，黄杆菌属，乳酸杆菌属，甲烷杆菌属，小单孢菌属，分枝杆菌属，诺卡氏菌属，丙酸杆菌属，精蛋白杆菌属，变形杆菌属，假单胞菌属，根瘤菌属，沙门氏菌属，沙雷氏菌属，链霉菌属，链球菌属，和黄单胞菌属。

本发明的范围内的产生维生素b12的细菌物种的非限制性实例包括假单胞菌属物种，例如铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌，p.murina；芽孢杆菌属物种，甲烷杆菌属物种，丙酸杆菌物种，醋酸杆菌属，产气杆菌属，农杆菌属，产碱杆菌属，固氮菌属，梭菌属，黄杆菌属，乳杆菌属，小单孢菌属，分枝杆菌属，诺卡氏菌属，丙酸杆菌属，精蛋白杆菌属，变形杆菌属，假单胞菌属，根瘤菌属，沙门氏菌属，沙雷氏菌属，链霉菌属，链球菌属，黄单胞菌属及其任何组合。

术语“浮萍细菌培养物”或“dbc”在下文中是指在一定体积的生长培养基中的至少一种浮萍亚科物种和至少一种产生维生素b12的细菌物种的任何类型的生长。前述的共培养物包括如本文所公开的至少一种浮萍亚科物种和至少一种产生维生素b12的细菌之间的任何类型的相互作用，关联或关联相互作用。

本文所用的术语“关联相互作用”或“相关联”或“共生的”在下文中通常是指两种或更多种不同的生物物种之间的密切且经常长期的相互作用。该术语是指任何类型的物种相互作用，包括但不限于共生，持久互利共生和持久生物相互作用，例如互利共生，偏利共生，或寄生共生。

在某些方面，物种之间的关系是专性的，这意味着这两个共生体的生存完全依赖彼此。或者，它们是兼性的，意味着它们可以但不必需与另一个有机体共存。范围内还包括物种之间的关系，包括其中一种有机体在另一种有机体上生存的那些关联，即外共生，或者其中一种有机体在另一种有机体内生存的那些关联，即内共生。更具体地说，内共生是其中一种共生体在另一种共同体的组织中，或者在细胞内或者在细胞外，生存的任何共生关系。而外共生是其中共生体在宿主体表，包括消化道或外分泌腺导管内表面，生存的共生关系。

现在提到互利共生或种间互惠利他行为，是指其中两种个体受益的不同物种个体之间的关系。互利关系可以是对两种物种都是专性的；对一个物种是专性，对另一个物种是兼性的；或对两者都是兼性的。根据某些方面，在互利共生期间，宿主细胞缺乏一些营养素，这些营养素由内共生体提供。因此，宿主可能会通过产生一些专门的细胞来支持其内部的内共生体的生长过程。这些细胞可能影响宿主的遗传组成，以调节内共生体增多的群体，并确保这些遗传变化通过垂直传播传递给后代。

现在提到偏利共生，它描述了两种有生命的有机体之间的关系，其中一种受益，另一种没有受到显著伤害或帮助。

现在提到寄生关系，其中关联的一种成员受益，而另一种受到损害。这个术语也被称为对抗共生或拮抗共生。寄生共生范围内还包括许多形式，从生活在宿主体内的体内寄生生物到生活在宿主表面上的体外寄生生物。另外，在本发明的范围内，寄生生物可以是尸养的，意味着它们杀死它们的宿主，或者是活养的，这意味着它们依赖于它们宿主的存活。

现在提到偏害共生，这是当一种物种被抑制或完全消灭，一种不受影响时存在的关系类型。范围内存在两种类型的偏害共生，竞争和抗生。竞争是其中更大或更强的有机体从较小或较弱的有机体剥夺资源。当一种有机体被另一种有机体通过化学分泌物而损害或杀死时，发生抗生。

现在提到双损共生，其中物种之间的相互作用是对所涉及的两种有机体都是有害的。这是一个短暂的情况，因为相互作用最终导致死亡。

还在范围内的是，物种之间的相互作用或关联也可以通过有机体的物理附着来分类。其中有机体具有身体联合的相互作用被称为连接共生，而其中它们不联合的相互作用被称为分离共生。

术语“生物质”在下文中是指有机体的总质量，即在给定面积或体积下的所述至少一种浮萍亚科物种，并且可以指体积，鲜重，干重或任何关于浮萍植物生长的常规测量值。

术语“细菌计数”在下文中是指细菌群体的任何定量测定或细菌生长指数和细胞数量(生物质)。这包括但不限于，两种广泛使用的测定细菌数量的方法，即标准或可行的平板计数法和分光光度计(浊度计)分析。平板计数的非限制性实例是菌落形成单位(cfu)技术。分光光度计(浊度计)分析可指培养物中浊度增加。通过使用分光光度计，透射光的量随着细胞群体的增加而减少。透射的光被转换成电能，并在检流计上显示。称为吸光度或光密度的读数间接地反映了细菌的数量。

术语“生长培养基”在下文中是指补充有组分的水，所述组分例如但不限于，氮，磷，钾，钙，铁，锌，铜，锰，镁，尿素，亚硝酸盐，硝酸盐，氨，浓度范围为约0.01-3.0％w/v的糖(例如右旋糖，葡萄糖，乳糖)，浓度范围为约0.01-3.0％w/v的氨基酸和/或肽和/或维生素源(例如酵母提取物，酪蛋白的酶促消化物，明胶的酶促消化物)，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的氨基酸或其混合物(例如l-盐酸精氨酸，l-半胱氨酸，l-谷氨酰胺，甘氨酸，l-盐酸组氨酸一水物，l-异亮氨酸，l-亮氨酸，l-盐酸赖氨酸，l-蛋氨酸，l-苯丙氨酸，l-丝氨酸，l-苏氨酸，l-色氨酸，l-酪氨酸二钠盐二水物，l-缬氨酸)，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的微量物质(例如氯化胆碱，叶酸，肌-肌醇，烟酰胺，d-泛酸半钙，氯化钙，硝酸铁，硫酸镁，氯化钾，氯化钠，磷酸钠)，维生素，(nh4)2so4；ca(no3)2·4h2o；cacl2·6h2o；cocl2·6h2o；coso4·7h2o；cucl2·2h2o；cuso4·5h2o；柠檬酸铁；fecl3·6h2o；feso4·7h2o；酸式酒石酸铁；h2moo4·4h2o；h3bo3；h3po4；ki；k2hpo4；k2so4；kcl；kh2po4；kno3；mg(no3)2；mgso4·7h2o；mncl2·4h2o；mnso4·h2o；na2moo4·2h2o；nacl；nh4h2po4；nh4no3；znso4·7h2o；无机(nh4)2so4；ca(no3)2·4h2o；cacl2·6h2o；h3bo3；h3po4；kcl；k2so4；k2co3；mgso4·7h2o；na2moo4·2h2o；nacl；nahco3；fe-edta；zn-edta；cu-edta，粪肥；尿素；na2edta；hutner；hoagland-a；hoagland-b；pirson；hoagland-c；steinberg；schenk和hildebrandt；murashige；及其任何组合。

根据一些实施方式，生长培养基被控制和操作以实现预定的条件和参数，例如生长培养基的温度范围，气氛的温度范围，含水量和处理程序(例如去硝化，机械，过滤)，光照强度，曝气量，氧浓度，ph值及其任何组合。

术语“膳食参考摄入量”或“dri”或“推荐的每日摄入量”或“rdi”在下文中是指与被认为足以满足维持健康个体的要求的营养素的每日摄入水平相关的任何标准。在非限制性实例中，rdi标准可包括推荐膳食容许量(rda)，估计平均需求量(ear)，充足摄入量(ai)和最高摄入水平(ul)标准。

本文承认维生素b12膳食参考摄入量范围为每日0.4μg至约3μg。在具体的实施方案中，成年人的维生素b12膳食参考摄入量范围根据美国卫生当局为每日约2μg至约3μg，根据英国卫生当局为每日约1.5μg。根据一项相对较新的研究，dri应该是每日约4μg至约7μg。

现在参考表1，列出了以微克(mcg)计的维生素b12的当前rda。对于0至12月龄的婴儿，美国国家科学院(原国家科学院)医学研究所(fom)的食品与营养委员会(fnb)建立了维生素b12的充足摄入量(ai)，相当于健康的母乳喂养的婴儿的维生素b12平均摄入量。

表1：维生素b12的推荐膳食容许量(rda)

根据本发明的一实施方案，公开了用于生产富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)组合物的方法，其中，所述方法包括以下步骤：(a)在一定体积的生长培养基中接种至少一种浮萍亚科物种和至少一种产生维生素b12的细菌物种；(b)在预定条件下孵育所述至少一种浮萍亚科物种和所述至少一种产生维生素b12的细菌物种以提供浮萍细菌培养物(dbc)；(c)将所述预定条件下的浮萍亚科植物生物质针对时间作图；(d)将所述预定条件下的所述至少一种产生b12的细菌物种的细菌计数针对时间作图；(e)将所述预定条件下的所述dbc中的维生素b12含量针对时间作图；(f)确定所述图表中以具有最高维生素b12含量的dbc为特征的时间间隔；和(g)以所述预先确定的时间间隔收获所述dbc，由此提供富含维生素b12的dbc组合物。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，其中，所述孵育步骤还包括选择所述预定条件的步骤，所述预定条件设计用于(i)所述至少一种浮萍亚科物种植物的最佳生长，和(ii)与之有关联的所述合成维生素b12的细菌的最佳发酵。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，其中所述孵育步骤还包括使所述至少一种浮萍亚科物种和所述至少一种产生维生素b12的细菌物种在预定条件下生长的步骤，以提供所述至少一种细菌物种与所述至少一种浮萍亚科物种之间的关联。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述关联的步骤：共生相互作用，持久互利共生，持久生物相互作用，互利共生，种间互惠利他行为，偏利共生相互作用，寄生共生，专性相互作用，兼性相互作用，两个物种均专性，一个专性但另一个兼性，两个物种均兼性，外共生，内共生，偏利外共生，互利外共生，外寄生，连接共生，分离共生，对抗或拮抗性共生或关系，尸养相互作用，活养相互作用，偏害共生，竞争关系，抗生关系，双损共生及其任何组合。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，其中所述接种步骤包括使所述至少一种浮萍亚科物种和所述至少一种产生b12的细菌物种以分批培养或连续培养生长的步骤。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，其中所述接种步骤包括从由以下组成的组中选择所述体积的生长培养基的步骤：水生植物生长设施和微生物生长设施。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，其中所述接种步骤包括从由以下组成的组中选择所述体积的生长培养基的步骤：池，渠，槽，发酵器，生物反应器，卵石和任何其它基质。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，其中所述孵育步骤还包括从由以下组成的组中选择用于生长所述浮萍亚科物种生物质的所述预定条件的步骤：生长培养基的矿物质组成，生长培养基的矿物质浓度，尿素浓度，亚硝酸盐和硝酸盐浓度，总氨浓度，生长培养基的温度范围，气氛温度范围，水处理程序，光照强度，曝气量，氧浓度，ph值及其任何组合。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由mg²⁺，mn，zn，fe²⁺，zn²⁺，mn²⁺，cacl2及其任何组合组成的组中选择所述矿物质的步骤。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由去硝化，机械，过滤及其任何组合组成的组中选择所述水处理程序的步骤。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，其中所述孵育步骤还包括以从由以下组成的组中选择用于所述细菌物种的共生发酵和维生素b12合成的所述预定条件的步骤：浓度范围为约0.01-3.0％w/v的糖，浓度范围为约0.01-3.0％w/v的氨基酸和/或肽和/或维生素源，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的氨基酸或其混合物，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的微量物质，维生素及其任何组合。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由右旋糖，葡萄糖，乳糖及其任何组合组成的组中选择所述糖的步骤。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由酵母提取物，酪蛋白的酶促消化物，明胶的酶促消化物及其任何组合组成的组中选择所述氨基酸和/或肽和/或维生素源的步骤。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述氨基酸或其混合物的步骤：l-盐酸精氨酸，l-半胱氨酸，l-谷氨酰胺，甘氨酸，l-盐酸组氨酸一水物，l-异亮氨酸，l-亮氨酸，l-盐酸赖氨酸，l-蛋氨酸，l-苯丙氨酸，l-丝氨酸，l-苏氨酸，l-色氨酸，l-酪氨酸二钠盐二水物，l-缬氨酸及其任何组合。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述微量物质的步骤：氯化胆碱，叶酸，肌-肌醇，烟酰胺，d-泛酸半钙，氯化钙，硝酸铁，硫酸镁，氯化钾，氯化钠，磷酸钠及其任何组合。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述细菌的步骤：假单胞菌属(pseudomonas)物种，例如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)，荧光假单胞菌(p.florescenza)，p.murina；芽孢杆菌属(bacillus)物种，甲烷杆菌属(methanobacterium)物种，丙酸杆菌(propionibacterium)物种，醋酸杆菌属(acetobacterium)，产气杆菌属(aerobacter)，农杆菌属(agrobacterium)，产碱杆菌属(alcaligenes)，固氮菌属(azotobacter)，梭菌属(clostridium)，黄杆菌属(flavobacterium)，乳杆菌属(lactobacillus)，小单孢菌属(micromonospora)，分枝杆菌属(mycobacterium)，诺卡氏菌属(nocardia)，丙酸杆菌属，精蛋白杆菌属(protaminobacter)，变形杆菌属(proteus)，假单胞菌属，根瘤菌属(rhizobium)，沙门氏菌属(salmonella)，沙雷氏菌属(serratia)，链霉菌属(streptomyces)，链球菌属(streptococcus)，黄单胞菌属(xanthomonas)及其任何组合。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，其中所述确定步骤还包括以下步骤：确定所述至少一种浮萍亚科物种和所述至少一种产生b12的细菌物种相对于时间的生长曲线，并鉴定以所述至少一种浮萍亚科物种的最高生物质和所述至少一种细菌物种的最高细菌细胞计数为特征的时间间隔。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述生物质的步骤：全浮萍亚科生物质，新鲜浮萍亚科生物质，干燥浮萍亚科生物质及其任何组合。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从属于由以下组成的组中的属的物种中选择所述至少一种浮萍亚科物种的步骤：斑萍属(landoltia)，浮萍属(lemna)，紫萍属(spirodela)，无根萍属(wolffia)，小芜萍属(wolffiella)及其任何组合。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括从由以下组成的组中选择所述至少一种浮萍亚科物种的步骤：wolffiaangusta，芜萍(wolffiaarrhiza)，wolffiaaustraliana，wolffiaborealis，wolffiabrasiliensis，wolffiacolumbiana，wolffiacylindracea，wolffiaelongate，wolffiaglobose，wolffiamicroscopica，wolffianeglecta及其任何组合。

范围内还公开上述任何一项中定义的方法，还包括提供富含维生素b12的dbc组合物的步骤，所述dbc组合物包含每100g所述dbc约0.01μg至约100μg维生素b12。

本发明进一步提供包含富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)的组合物，其中所述组合物包含至少一种浮萍亚科(lemnoideae)物种和至少一种产生b12的细菌物种，并且其中所述组合物中的所述维生素b12含量在每100g所述dbc约0.01μg至约100μg之间的范围。

根据一实施方案，公开了上述任何一项中定义的组合物，其中所述组合物中的所述维生素b12含量是维生素b12推荐每日量(dv)的至少20％的预定百分比。

根据另一实施方案，公开了上述任何一项中定义的组合物，其中所述组合物中的所述维生素b12含量符合成年人维生素b12推荐每日摄入量(rdi)标准，每日约0.4μg至约3μg。

根据另一实施方案，公开了上述任何一项中定义的组合物，其中所述至少一种产生b12的细菌物种与所述至少一种浮萍亚科物种相关联。

根据另一实施方案，公开了上述任何一项中定义的组合物，其中，所述关联选自由以下组成的组：共生相互作用，持久互利共生，持久生物相互作用，互利共生，种间互惠利他行为，偏利共生相互作用，寄生共生，专性相互作用，兼性相互作用，两个物种均专性，一个专性但另一个兼性，两个物种均兼性，外共生，内共生，偏利外共生，互利外共生，外寄生，连接共生，分离共生，对抗或拮抗性共生或关系，尸养相互作用，活养相互作用，偏害共生，竞争关系，抗生关系，双损共生及其任何组合。

根据另一实施方案，公开了上述任何一项中定义的组合物，其中所述产生b12的细菌选自由以下组成的组：假单胞菌属(pseudomonas)物种，例如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)，荧光假单胞菌(p.florescenza)，p.murina；芽孢杆菌属(bacillus)物种，甲烷杆菌属(methanobacterium)物种，丙酸杆菌(propionibacterium)物种，醋酸杆菌属(acetobacterium)，产气杆菌属(aerobacter)，农杆菌属(agrobacterium)，产碱杆菌属(alcaligenes)，固氮菌属(azotobacter)，梭菌属(clostridium)，黄杆菌属(flavobacterium)，乳杆菌属(lactobacillus)，小单孢菌属(micromonospora)，分枝杆菌属(mycobacterium)，诺卡氏菌属(nocardia)，丙酸杆菌属(propionibacterium)，精蛋白杆菌属(protaminobacter)，变形杆菌属(proteus)，假单胞菌属(pseudomonas)，根瘤菌属(rhizobium)，沙门氏菌属(salmonella)，沙雷氏菌属(serratia)，链霉菌属(streptomyces)，链球菌属(streptococcus)，黄单胞菌属(xanthomonas)及其任何组合。

根据另一实施方案，公开了上述任何一项中定义的组合物，其中所述至少一种浮萍亚科物种选自由以下组成的组：全浮萍亚科生物质，新鲜浮萍亚科生物质，干燥浮萍亚科生物质及其任何组合。

根据另一实施方案，公开了上述任何一项中定义的组合物，其中所述至少一种浮萍亚科物种属于选自由以下组成的组的属：斑萍属(landoltia)，浮萍属(lemna)，紫萍属(spirodela)，无根萍属(wolffia)，小芜萍属(wolffiella)及其任何组合。

根据另一实施方案，公开了上述任何一项中定义的组合物，其中所述至少一种浮萍亚科物种选自由以下组成的组：wolffiaangusta，芜萍(wolffiaarrhiza)，wolffiaaustraliana，wolffiaborealis，wolffiabrasiliensis，wolffiacolumbiana，wolffiacylindracea，wolffiaelongate，wolffiaglobose，wolffiamicroscopica，wolffianeglecta及其任何组合。

范围内还公开组合物，含有通过上述任何一项中定义的方法生产的富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中所述预定条件选自由所述浮萍亚科物种生物质的生长条件，所述细菌物种的发酵和维生素b12合成条件及其组合组成的组。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中所述体积的生长培养基是分批培养或连续培养。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中所述体积的生长培养基选自由水生植物生长设施和微生物生长设施组成的组。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中所述体积的生长培养基选自由以下组成的组：池，渠，槽，发酵器，生物反应器，卵石和任何其它基质。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中用于所述浮萍亚科物种生物质生长的所述预定条件选自由以下组成的组：生长培养基的矿物质组成，生长培养基的矿物质浓度，尿素浓度，亚硝酸盐和硝酸盐浓度，总氨浓度，生长培养基的温度范围，气氛温度范围，水处理程序，光照强度，曝气量，氧浓度，ph值及其任何组合。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中所述矿物质选自由mg²⁺，mn，zn，fe²⁺，zn²⁺，mn²⁺，cacl2及其任何组合组成的组。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中，所述水处理程序选自由去硝化，机械，过滤及其任何组合组成的组。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中用于所述细菌物种的发酵和维生素b12合成的所述预定条件选自由以下组成的组：浓度范围为约0.01-3.0％w/v的糖，浓度范围为约0.01-3.0％w/v的氨基酸和/或肽和/或维生素源，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的氨基酸或其混合物，浓度范围为约0.0001-0.3g/l的微量物质，维生素及其任何组合。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中所述糖选自由右旋糖，葡萄糖，乳糖及其任何组合组成的组。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中所述氨基酸和/或肽和/或维生素源选自由酵母提取物，酪蛋白的酶促消化物，明胶的酶促消化物及其任何组合组成的组。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中所述氨基酸或其混合物选自由以下组成的组：l-盐酸精氨酸，l-半胱氨酸，l-谷氨酰胺，甘氨酸，l-盐酸组氨酸一水物，l-异亮氨酸，l-亮氨酸，l-盐酸赖氨酸，l-蛋氨酸，l-苯丙氨酸，l-丝氨酸，l-苏氨酸，l-色氨酸，l-酪氨酸二钠盐二水物，l-缬氨酸及其任何组合。

范围内还公开通过上述任何一项中定义的方法生产的组合物，其中所述微量物质选自由以下组成的组：氯化胆碱，叶酸，肌-肌醇，烟酰胺，d-泛酸半钙，氯化钙，硝酸铁，硫酸镁，氯化钾，氯化钠，磷酸钠及其任何组合。

本发明的范围内还公开用于生产富含维生素b12的浮萍细菌培养物(dbc)组合物的系统，其中所述系统包括：(a)至少一种浮萍亚科物种接种物和至少一种产生维生素b12的细菌物种接种物，用于在一定体积的生长培养基中培养；(b)孵育装置，用于在预定条件下孵育所述至少一种浮萍亚科物种接种物和所述至少一种产生维生素b12的细菌物种接种物以提供浮萍细菌培养物(dbc)；(c)用于确定图表中以具有最高维生素b12含量的dbc为特征的时间间隔的装置；和(d)用于以所述预先确定的时间间隔收获所述dbc的装置，由此提供富含维生素b12的dbc组合物。

本发明的范围内还公开上述定义的系统，其中所述系统还包括至少一种作图装置，所述作图装置选自由以下组成的组：(a)用于将所述预定条件下的浮萍亚科植物生物质针对时间作图的作图装置，(b)用于将所述预定条件下的所述至少一种产生b12的细菌物种的细菌计数针对时间作图的作图装置；和(c)用于将所述预定条件下的所述dbc中的维生素b12含量针对时间作图的作图装置。

本发明的范围内还公开组合物，含有至少一种浮萍亚科物种和至少一种产生b12的细菌物种的富含维生素b12的提取物，并且其中所述组合物中的所述维生素b12含量在每100g所述dbc约0.01μg至约100μg之间的范围。

现在参考图1，图示了现有技术中已知的典型细菌生长曲线或动力学曲线。该曲线一般描述了在将细菌接种到选择的生长培养基中之后细菌生长相对于时间的阶段。可以看出，生长曲线的第一个阶段是适应期，称为迟缓期。在迟缓期，细菌适应生长条件。这是其中个体细菌成熟，尚不能分裂的时期。在细菌生长周期的迟缓期期间，发生rna，酶和其他分子的合成。

在迟缓期之后，有机体的生长速度稳步增加；这个时期是对数期或指数期。对数期是以细胞复制为特征的时期。复制率与具体群体成正比。如果生长不受限制，倍增将以恒定的速度继续下去，因此细胞数量和群体增长率在每个连续时期都会翻倍。对于这种类型的指数增长，绘制细胞数量的自然对数与时间的关系，产生一条直线。该线的斜率是有机体的特定生长速率，其是每单位时间每个细胞的分裂次数的量度。这种生长的实际速率(即图中线的斜率)取决于生长条件，生长条件影响细胞分裂事件的频率和两个子细胞均存活的概率。指数生长不能无限期地继续下去，因为培养基中的营养素被耗尽并且富含废弃物。

因此，经过一定时间的指数期后，由于营养素浓度不断下降和/或有毒物质浓度不断增加，生长速度减慢。这个生长增长停止的阶段称为稳定期或稳态。生物质保持恒定，除非培养液中某些积累的化学物质溶解细胞(化学溶解)。因此，稳定期通常是由于生长受限因素，例如必需营养素的耗竭和/或形成抑制性产物如有机酸。稳定期是由生长率和死亡率相等的情况造成的。所产生的新细胞的数量受到生长因子的限制，因此细胞生长速率与细胞死亡速率相匹配。结果是在稳定期曲线的水平线性部分。

除非其他微生物污染培养物，否则化学成分保持不变。当培养基中的所有营养素被消耗，或者如果毒素的浓度太高，细胞可能变得衰老并开始死亡。在这个死亡期，生物质的总量可能不会减少，但活有机体的数量会减少。在死亡期(衰亡期)，细菌死亡。这可能是由于缺乏营养，温度过高或过低等。

根据本发明的主要方面，已经根据图1中例示的细菌生长曲线鉴定了高细菌维生素b12浓度的时间间隔。可以看出，由于营养素浓度不断下降和/或有毒物质浓度不断增加(积累)，在指数期至生长速率减慢的稳定期之间鉴定到维生素b12浓度较高的时间段。在这个时间间隔内，检查到生长速率的增加。在稳定期结束和死亡期开始之前鉴定到维生素b12浓度较高的另一时间段或时间间隔。

现在参考图2，其示出了作为本发明的一个实施方案的示例性浮萍细菌培养物(dbc)生长曲线或生长谱。在本发明的范围内，在预定的条件下生长至少一种浮萍亚科物种和至少一种产生维生素b12的细菌物种，以便(i)所述浮萍亚科物种生物质的最大有效生长，和(ii)所述细菌物种的最大和有效的发酵和维生素b12合成。如图所示，确定了最大b12生产和浮萍生物质的时间间隔或时间范围。这些时间间隔以最大dbcb12生产为特征。换句话说，在这些时间间隔，收获富含维生素b12浓度的dbc。这种高营养的维生素b12来源可以作为新鲜或干燥的材料使用，其特征在于供人食用的高浓度的天然维生素b12。

在本发明的一些实施方案中，所述dbc中的维生素b12含量是维生素b12膳食参考摄入量(dri)标准的预定百分比。

在本发明的其他实施方案中，所述dbc中的维生素b12含量是维生素b12的每日量(dv)的预定百分比。

本文承认，美国国家科学院医学研究所(iom)食品与营养委员会(fnb)开发的膳食参考摄入量(dri)中提供了维生素b12和其他营养素的摄入量推荐。术语“dri”在此通常是指用于计划和评估健康人的营养素摄入量的一组参考值。这些值因年龄和性别而异，包括：

推荐膳食容许量(rda)，定义为足以满足几乎所有(97％-98％)健康个体的营养需求的平均每日摄入水平。

当证据不足以制定rda时，确定充足摄入量(ai)，并且设定在认定确保营养充足性的水平。

可耐受最高摄入水平(ul)定义为不大可能对健康造成不良影响的最大日摄入量。

还承认成人维生素b12的膳食参考摄入量(dri)在美国为每日0.4μg至3μg，在英国为每日1.5μg。但根据最近的研究，dri应该在每日4-7μg之间。注意到食品安全和应用营养中心建议，对于成年人和4岁或以上的儿童，基于2000卡路里的摄入热量，每日为6μg。

还注意到，当口服使用不超过推荐膳食容许量(rda)的量时，维生素b12被认为是安全的。

根据一些方面，维生素b12建议的膳食量(rda)为14岁及以上每日2.4微克，孕妇每日2.6微克，母乳喂养女性每日2.8微克。50岁以上的成年人应该通过食用b12加强的食品或服用维生素b12补充剂来满足rda。据报道，每日补充25-100微克已被用于维持老年人的维生素b12水平。

现在参考维生素b12的每日量(dv)。本文承认美国食品药品监督管理局(fda)制定dv以帮助消费者确定标准份食品中各种营养素的水平关于其大致的要求。维生素b12的dv是6.0微克。但是，fda并不要求食品标签列出维生素b12的含量，除非食品已经加强了这种营养素。提供20％或更多dv的食品被认为是营养素的高或富集来源，但提供较低百分比dv的食品也有助于健康饮食。

本发明提供了用于生产富含维生素b12的浮萍生物质组合物的装置和方法，所述组合物包含至少一种浮萍亚科物种和至少一种产生维生素b12的细菌物种，其在预先设计的条件下产生浮萍-细菌培养物(dbc)。富含维生素b12的组合物可以通过摄入预定量的所述组合物来消耗，每日一次或多次以满足每日约0.4微克至约3微克的推荐维生素b12膳食参考摄入量(dri)。

根据某些方面，本发明的组合物提供维生素b12dv的20％或更多，因此被认为是该重要营养素的高或富集来源。

根据其他方面，本发明的组合物包含每100g所述dbc约0.01μg至约100μg维生素b12。

如上所述，范围内包括富含维生素b12的组合物优选作为干燥材料提供，以在单次剂量的组合物中实现高浓度的维生素b12。