Tau结合抗体的制作方法

文档序号：14028975阅读：2098来源：国知局

发明领域

本发明尤其是涉及治疗性和诊断性tau结合抗体和其结合片段、制备此类抗体的方法以及其用于治疗和/或诊断tau蛋白病的用途，诸如阿尔茨海默氏病；肌肉萎缩性侧索硬化/帕金森氏症-痴呆综合症；嗜银颗粒疾病；慢性创伤性脑病变；皮质基底核退化症；弥漫性神经原纤维缠结伴钙化；唐氏症候群；英国家族性痴呆症；丹麦家族性痴呆症；与mapt突变所产生的染色体17关联的额颞叶型痴呆症和帕金森氏症；格斯曼-斯陶思勒-谢恩克尔疾病；瓜德罗普岛帕金森氏症；肌紧张性营养不良；神经退化伴脑铁积聚；c型尼曼-匹克疾病；非关岛运动神经元疾病伴神经原纤维缠结；匹克疾病；脑炎后帕金森氏症；朊病毒蛋白质大脑淀粉样蛋白血管病变；渐进性皮层下神经胶样变性；进行性核上麻痹；slc9a6相关智力迟钝；亚急性硬化性全脑炎；唯缠结型痴呆症；出现球状神经胶质包裹体的白质tau蛋白病(clavaguera等人，brainpathology23(2013)342-349)。本发明还涉及治疗罹患或怀疑易患上述tau蛋白病(具体地，诸如阿尔茨海默氏病和进行性核上麻痹的tau蛋白病)的人受试者的方法。

阿尔茨海默氏病(ad)和渐进性核上麻痹(psp)是医学需要未得到高度满足、对于社会健康系统而言成本较高且对所影响家庭的负担较重的神经退化性疾病。ad临床症状包括记忆、认知、推理、判断和情感稳定性的降低以及最终死亡。psp包括严重和渐进性步态控制和平衡问题、摔倒、垂直眼球运动障碍、认知问题、抑郁症、无表情和轻度痴呆症。后期症状包括视力模糊、眼球运动不可控、言语不清、吞咽困难和死亡。

对于超过十年的ad疾病而言，改良规划已经通过各种机制靶向淀粉样蛋白-β肽。相比之下，解决细胞内tau病理学(ad的第二大标志)的进展小得多。含有过磷酸化tau聚集物的神经原纤维包裹体或缠结界定ad病理学特征和多种其他tau蛋白病，包括psp。

在此等疾病中，症状进展与神经内tau聚集物水平和分布之间存在强相关性。在ad神经元中，tau缠结首先出现于经内嗅皮层中，其从经内嗅皮层散布至海马体和新皮层中。ad神经元中所观测到的缠结是由过磷酸化的不溶性tau聚集物组成。已提出病理性tau物质的直接毒性作用和/或轴突传输损失(由于功能tau螯合成过磷酸化的聚集形式，其不再能够支持轴突传输)导致疾病。

tau在其非病理性状态下为高度可溶性细胞质微管结合蛋白，由于可变剪接，其以长度范围为352至441个氨基酸的6种主要亚型出现于人中枢神经系统(cns)中。此等亚型可具有零、一或二个n端插入序列(0n、1n、2n)，和三或四个c端“重复”序列(3r或4r)。这些30至32个氨基酸c端重复序列r1、r2、r3和r4一起构成tau微管结合区(mtbr)。实际上，tau的主要作用据信为组装和稳定化轴突微管。微管形成用于轴突传输的轨道和用于细胞生长的细胞骨架组件(clavaguera等人，brainpathology23(2013)342-349)。三种tau亚型已证明含有三个微管结合区(mtbr)：

-亚型4，也称为3r0n，ncbi参考序列np_058525.1(352个氨基酸)，

-亚型7，也称为3r1n，ncbi参考序列np_001190180.1(381个氨基酸)

-亚型8，也称为3r2n，ncbi参考序列np_001190181.1(410个氨基酸)。

而其他三种tau亚型含有四个mtbr：

-亚型2，也称为4r2n，ncbi参考序列np_005901.2(441个氨基酸)，

-亚型3，也称为4r0n，ncbi参考序列np_058518.1(383个氨基酸)，和

亚型5，也称为4r1n，ncbi参考序列np_001116539.1(412个氨基酸)。

当前可用于这些疾病的唯一症状疗法功效轻微或无功效。当前不存在可用于减缓或理想地中止疾病发展的疗法。因此，现有技术中仍需要适用于治疗tau蛋白病的新化合物和组合物。

发明目的和概述

本发明的目标尤其为提供用于治疗或诊断tau蛋白病(诸如阿尔茨海默氏病(ad)或进行性核上麻痹(psp))的药剂。另外，本发明的目标尤其为提供治疗或诊断tau蛋白病(诸如阿尔茨海默氏病(ad)或进行性核上麻痹(psp))的方法。

这些和其他目标(由下文的描述，其将变得明显)通过独立权利要求的主题实现。本发明所涵盖的一些特定方面和其实施方案形成从属权利要求的主题。本发明所涵盖的其他方面和其实施方案可自接下来的描述获得。

在第一方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含：

轻链可变区，其包含选自seqidno.：1或与其至少90％同一的序列的cdr1、选自seqidno.：2或与其至少90％同一的序列的cdr2和选自seqidno.：3或与其至少90％同一的序列的cdr3；和/或

重链可变区，其包含选自seqidno.：4或与其至少90％同一的序列的cdr1、选自seqidno.：5或与其至少90％同一的序列的cdr2和/或选自seqidno.：6或与其至少90％同一的序列的cdr3。

在第二方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含：

轻链可变区，其包含seqidno.：7或与其至少80％同一的序列，和/或

重链可变区，其包含seqidno.：8或与其至少80％同一的序列。

在第三方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含：

轻链可变区，其包含seqidno.：9或与其至少80％同一的序列，和/或

重链可变区，其包含seqidno.：10或与其至少80％同一的序列。

在第四方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合至少包含seqidno.:35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246的表位。

作为第一和第四方面的一个实施方案，本公开内容提供了单克隆抗体或其结合片段，其可以是嵌合的、人源化的或完全人抗体或其结合片段。

作为第二方面的一个实施方案，本公开内容提供了单克隆抗体或其结合片段，其可以是嵌合抗体或其结合片段。

作为第三方面的一个实施方案，本公开内容提供了单克隆抗体或其结合片段，其可以是人源化抗体或其结合片段。

在第五方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或结合片段结合与第一至第四方面和其实施方案中的任一个的tau结合抗体或其结合片段竞争结合tau。

在第六方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段与第一至第四方面和其实施方案中任一个的tau结合抗体或其结合片段结合基本上相同的tau表位。

作为第五和第六方面的一个实施方案，本公开内容提供单克隆抗体或其结合片段，其可以是人源化抗体或其结合片段。

第一至第六方面和其实施方案的抗体和其结合片段能够结合人tau的可溶形式、人tau的配对螺旋丝(pairedhelicalfilaments；phf)，或结合人tau的可溶形式与人tau的配对螺旋丝(phf)二者。

在第七方面中，本公开内容提供包含核酸序列(诸如编码第一至第六方面和其实施方案的抗体和结合片段的dna序列)的核酸分子。

在第八方面中，本公开内容提供包含这些前述核酸分子的克隆或表达载体。

在第九方面中，本公开内容提供包含这些前述核酸分子、克隆载体或表达载体的宿主细胞。

在第十方面中，本公开内容提供制造第一至第六方面和其实施方案的抗体和其结合片段的方法。

本公开内容的第十一方面是关于第一至第六方面和其实施方案的抗体和其结合片段用于治疗tau蛋白病(特定而言，诸如ad和psp)的用途。

本公开内容的另一方面是关于第一至第六方面和其实施方案的抗体和其结合片段用于诊断tau蛋白病(特定而言，诸如ad和psp)的用途。

附图说明

图1：a)显示seqidno.:7的ab1的供体vl(vl_ab1)，其中cdr1(seqidno.:1),2(seqidno.:2)和3(seqidno.:3)加下划线。b)显示seqidno.:31的人受体区igkv2-29的vl序列，其中受体cdr1,2和3加下划线。c)显示seqidno.:9的cdr移植的序列gvl3_ab1，其中cdr1(seqidno.:1),2(seqidno.:2)和3(seqidno.:3)加下划线。

图2：a)显示seqidno.:8的ab1的供体vh(vh_ab1)，其中cdr1(seqidno.:4),2(seqidno.:36)和3(seqidno.:6)加下划线。b)显示seqidno.:32的人受体区ighv4-59的vh序列，其中受体cdr1,2和3加下划线。c)显示seqidno.:12的cdr移植的序列gvh17_ab1，其中cdr1(seqidno.:4),2(seqidno.:37)和3(seqidno.:6)加下划线。供体残基以斜体和高亮显示：m48。框架中的突变以高亮显示(e1)。cdr2相对于vh_ab1包含s61a置换。d)显示seqno.:13的cdr移植的序列gvh18_ab1，其中cdr1(seqidno.:4),2(seqidno.:38)和3(seqidno.:6)加下划线。供体残基以斜体和高亮显示(m48)。框架中的突变以高亮显示(e1)。cdr2相对于vh_ab1包含s61t置换。

图3：说明实验3.1的细胞聚集分析的图。

图4：在使用自人ad患者回收的人tau病理性原纤维(ad-phf8)作为晶种的细胞tau聚集分析中，具有seqidno.：14的轻链和seqidno.：18的重链的tau结合抗体(a)和具有seqidno.：14的轻链和seqidno.：17的重链的tau结合抗体(b)或阴性对照igg4抗体a33(c)的功效。

图5：western印迹，其显示具有seqidno.:7的vl和seqidno.:8的vh的tau结合抗体ab1(a)，以及具有seqidno.:14的轻链和seqidno.:17的重链的人源化抗体(b)，具有seqidno.:14的轻链和seqidno.:18的重链的tau结合抗体(c)与回收自人ad、psp或对照患者的级分8样品的tau的结合。a33抗体用作阴性对照。

图6:具有seqidno.:14的轻链和seqidno.:17的重链的tau结合抗体、具有seqidno.:14的轻链和seqidno.:18的重链的tau结合抗体、具有seqidno.:14的轻链和seqidno.:54的重链的tau结合抗体、具有seqidno.:14的轻链和seqidno.:55的重链的tau结合抗体的热谱图的叠加。

图7:用于在大肠杆菌中表达的编码人tau亚型2的dna构建体(pet6histev-htauiso2(1-441))(bioregid:d0003105)(seqidno.:39.编码氨基酸序列的bamhi/xhoi插入物被亚克隆入经修饰的pet32载体，其以bamhi/xhoi切割(编码6his-tev-tau的序列以粗体斜体显示)。

图8:a)来自pet6histev-htauiso2(1-441)的表达的序列(seqidno.:40)；b)tev切割后，来自pet6histev-htauiso2(1-441)的最终的氨基酸序列(seqidno.:41)。

图9:用于在大肠杆菌中表达的编码人tau亚型3的dna构建体(pet6histev-htauiso3(1-383))(bioregid:d0003104)(seqidno.:42。编码氨基酸序列的bamhi/xhoi插入物亚克隆入经修饰的pet32载体，其以bamhi/xhoi切割(编码6his-tev-tau的序列以粗体斜体显示)。

图10:a)来自pet6histev-htauiso3(1-383)的表达的序列(seqidno.:43)；b)tev切割后，来自pet6histev-htauiso3(1-383)的最终的氨基酸序列(seqidno.:44)。

图11:用于在大肠杆菌中表达的编码人tau亚型4的dna构建体(pet6histev-htauiso4(1-352))(bioregid:d0003093)(seqidno.:45。编码氨基酸序列的bamhi/xhoi插入物亚克隆入经修饰的pet32载体，其以bamhi/xhoi切割(编码6his-tev-tau的序列以粗体斜体显示)。

图12:a)来自pet6histev-htauiso4(1-352)的表达的序列(seqidno.:46)；b)tev切割后，来自pet6histev-htauiso4(1-352)的最终的氨基酸序列(seqidno.:47)。

图13:用于在大肠杆菌中表达的编码人tau亚型5的dna构建体(pet6histev-htauiso5(1-412))(bioregid:d0003103)(seqidno.:48。编码氨基酸序列的bamhi/xhoi插入物亚克隆入经修饰的pet32载体，其以bamhi/xhoi切割(编码6his-tev-tau的序列以粗体斜体显示)。

图14:a)来自pet6histev-htauiso5(1-412)的表达的序列(seqidno.:49)；b)tev切割后，来自pet6histev-htauiso5(1-412)的最终的氨基酸序列(seqidno.:50)。

图15:用于在hek293细胞中表达的编码人tau亚型2的dna构建体(pmh-10his-tev-htauiso2(1-441))(bioregid:d0003109)(seqidno.:51)。编码氨基酸序列的bamhi/xhoi插入物被亚克隆入哺乳动物表达载体pmh-10histev，其以bamhi/xhoi切割(编码10his-tev-tau的序列以粗体斜体显示，用于除去限制性位点的沉默点突变a1032t以下划线显示)。

图16:a)从pmh-10his-tev-htauiso2(1-441)表达的序列(seqidno.:52)；b)在tev切割后，从pmh-10his-tev-htauiso2(1-441)表达的最终的序列(seqidno.:53)。

图17：在使用自人ad患者或人psp患者或人ftd患者回收的人tau病理性原纤维作为晶种的细胞tau聚集分析中，具有seqidno：14的轻链和seqidno：18的重链的tau结合抗体的功效。

发明详述

下文说明性描述的本公开内容可在本文未具体公开的任一组件或多个组件、限制或多个限制缺乏的情况下适合地实施。

本公开内容将根据特定方面和其实施方案且参照某些附图和实施例来描述，但本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。

除非另外指明，否则技术术语是根据其常见含义使用。若向某些术语赋予特定含义，则下文在使用术语的上下文中提供术语定义。

若本发明说明书和权利要求书中使用术语“包含”，其不排除其他组件。出于本公开内容的目的，术语“由……组成(consistingof)”视为术语“包含(comprisingof)”的优选实施方案。若下文中将群组定义为包含至少一定数目的实施方案，则此还理解为公开优选仅由这些实施方案组成的群组。

出于本公开内容的目的，术语“获得”视为术语“可获得”的优选实施方案。若在下文中，例如抗体定义为可获自特定来源，则此还应理解为公开抗体获自此来源。

当提及单数名词时，若使用不定冠词或定冠词，例如“一(a)”、“一(an)”或“所述(the)”，则此包括复数个所述名词，除非另外特别地指明。术语“约”或“大约”表示本领域技术人员将理解仍确保相关特征的技术效果的准确度区间。该术语通常指示相对于指定数值偏离±10％，且优选偏离±5％。

应理解，任何提及tau结合抗体或其结合片段作为各种方面的优选实施方案均涵盖单克隆tau结合抗体或其结合片段。

在各种方面中，本公开内容提及包含相应轻链和/或重链区域的cdr和可变区的抗体和其结合片段。仅包含轻链可变区或重链可变区的抗体或其结合片段可适用于例如制造方法，或适用于例如筛选可有效地与相应其他可变区缔合的可变区。然而，应理解，每当提及包含相应轻链和/或重链区域的cdr和可变区的抗体和其结合片段时，其总是考虑为包含相应轻链和重链区域的cdr和可变区的优选实施方案抗体和其结合片段。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和其类似术语是指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可具预防性，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的不良影响而言可具治疗性。因此疗法涵盖哺乳动物、尤其人的疾病的任何疗法，且包括：(a)预防可能易患所述疾病、但尚未诊断出患有所述疾病的受试者中出现所述疾病；(b)抑制所述疾病，即阻滞其发展；以及(c)缓解所述疾病，即促使所述疾病消退。

将tau结合抗体或其结合片段称为“治疗活性剂”是指tau结合抗体或其结合片段用于治疗疾病的用途。

“治疗有效量”是指tau结合抗体或其结合片段的量，当施用至哺乳动物或其他受试者用于治疗疾病时，所述量足以对所述疾病实现这样的治疗。治疗有效量将视以下而变化：tau结合抗体或其结合片段、疾病和其严重度以及待治疗受试者的年龄、体重等。

将tau结合抗体或其结合片段称为“诊断活性剂”是指tau结合抗体或其结合片段用于诊断疾病的用途。

“诊断有效量”是指tau结合抗体或其结合片段的量，当用于对生物样品进行诊断测试时，所述量足以允许鉴别疾病或作为监测治疗性干预的功效的手段来监测疾病组织的量。

本申请部分地基于结合人tau的抗体(名称为ab1)的鉴别。如本领域中所惯用的，本文中的tau残基编号是指seqidno.：35的tau亚型2(ncbi参考序列：np_005901.2)。如下文中所展示，ab1自免疫大鼠中分离且识别至少包含seqidno.：35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246的表位。该区域恰好是在中枢神经系统中发现的tau的所有6个亚型中存在的第一个mtbr重复区之前。

实施例证实，ab1能够结合人tau的可溶形式和人tau的配对螺旋丝(phf)(参见实施例2.3)且ab1能够检测人样品冷冻切片中的神经元内神经原纤维缠结(nft)、神经元外nft、神经炎斑样结构和神经纤维网丝(参见实施例3.2)。在一些测试和模型中，所测试的ab1显示出低于现有技术抗体的ic50。假定此行为至少部分地由ab1的轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)中的互补决定区(cdr)介导似乎为合理的。

针对此背景，本公开内容提供包含ab1的vl区域(seqidno.：7)的cdr或特异性决定残基和/或ab1的vh区域(seqidno.：8)的cdr的tau结合抗体或其结合片段。

抗体可变结构域中的残基常规地根据kabat等人所设计的系统编号。此系统阐述于kabat等人，1987,insequencesofproteinsofimmunologicalinterest,usdepartmentofhealthandhumanservices,nih,usa(下文称“kabat等人(同上)”。本说明书中使用此编号系统，除非其中另有说明。

kabat残基名称不总是直接与氨基酸残基的线性编号对应。对应于基本可变结构域结构的结构组分(构架或互补决定区(cdr))的缩短或向其中的插入，实际线性氨基酸序列含有的氨基酸可比严格kabat编号少或含有其他氨基酸。就指定抗体而言，可通过将抗体序列中的同源残基与“标准”kabat编号序列比对来确定残基的正确kabat编号。然而，根据chothia(chothia,c.andlesk,a.m.j.mol.biol.,196,901-917(1987))，等效于cdr-h1的环自残基26延伸至残基32。

因此鉴别出ab1的vl中的cdr1、cdr2和cdr3分别对应于seqidno.：1、2和3。因此鉴别出ab1的vh中的cdr1、cdr2和cdr3分别对应于seqidno.：4、36和6。普遍知晓的是，可以对本发明的公开内容提供的cdr进行一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失而不显著改变抗体结合tau的能力。本领域技术人员可容易测试任何氨基酸置换、添加和/或缺失的影响，例如通过使用实施例中所述的方法或普遍的一般性知识中已知的方法来测试。在vh的最初鉴别的cdr2(cdrh2)(即seqidno.：36)中，鉴别例如潜在的天冬酰胺去酰胺化位点且通过以丙氨酸或苏氨酸置换连续丝氨酸残基来修饰。cdrh2由此分别产生序列seqidno.：37和38。为了简洁起见，将cdrh2的三个序列(即seqidno.：36、37和38)组合为seqidno.：5。

应理解，可进一步修饰cdr，诸如取代、添加和/或缺失，而不会实质性改变例如结合特性(相较于ab1)。此主要可通过例如用相似氨基酸置换cdr中的氨基酸来达成。如本文所用，“相似性”表示在所比对序列中的任何特定位置，氨基酸残基的类型在序列之间相似。举例而言，可用亮氨酸取代异亮氨酸或缬氨酸。彼此间通常可取代的其他氨基酸包括(但不限于)：

-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳族侧链的氨基酸)；

-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸)；

-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸)；

-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸)；以及

-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。

针对此背景，本公开内容在一个方面中提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含：

如本文所用，“同一性”表示在所比对序列的任何特定位置，序列之间的氨基酸残基相同。同一性程度可容易使用例如获自ncbi的blast^tm软件计算(altschul,s.f.等人，1990,j.mol.biol.215：403-410；gish,w&states,d.j.1993,naturegenet.3：266-272.madden,t.l.等人，1996,meth.enzymol.266：131-141；altschul,s.f.等人，1997,nucleicacidsres.25：3389-3402；zhang,j.kmadden,t.l.1997,genomeres.7：649-656)。

cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1、cdrh2和cdrh3分别与seqidno.：1、2、3、4、5和6的同一性可为至少90％，但也可为更高的，诸如至少95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高的同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。

在此上下文中，本公开内容特别地考虑了tau结合抗体或其结合片段，其包含具有分别为seqidno：1、2、3的cdrl1、cdrl2和cdrl3的vl和具有分别为seqidno：4、5和6的cdrh1、cdrh2和cdrh3的vh。本公开内容还考虑包含以下的tau结合抗体或其结合片段：具有分别为seqidno.：1、2、3的cdrl1、cdrl2和cdrl3的vl和具有分别为seqidno：4、36和6的cdrh1、cdrh2和cdrh3的vh,具有分别为seqidno.：1、2、3的cdrl1、cdrl2和cdrl3的vl和具有分别为seqidno：4、37和6的cdrh1、cdrh2和cdrh3的vh，以及具有分别为seqidno.：1、2、3的cdrl1、cdrl2和cdrl3的vl和具有分别为seqidno：4、38和6的cdrh1、cdrh2和cdrh3的vh。

所述第一方面所涵盖的tau结合抗体或其结合片段可包含嵌入不同来源的构架区中的这些cdr。因此，cdr可包含于ab1的原始构架区(即seqidno.：7的大鼠vl区域和seqidno.：8的大鼠vh区域)内。然而，cdr也可嵌入不同物种来源的构架区(诸如小鼠或人构架区)中。视可与这样的构架区组合的构架区和恒定区的来源而定，可获得嵌合、人源化的或完全人的tau结合抗体或其结合片段。

嵌合tau结合抗体或其结合片段将在与人来源的恒定区组合的非人来源的构架区内包含cdr。人源化tau结合抗体或其结合片段将在与人来源的恒定区组合的人来源的构架区内包含cdr。

针对此背景，本公开内容在另一个方面中提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含：

轻链可变区，其包含seqidno.：7或与其至少80％同一的序列，和/或

重链可变区，其包含seqidno.：8或与其至少80％同一的序列。

vl和vh分别与seqidno.：7和8的同一性可为至少80％，但也可为更高的，诸如至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。应理解，就同一性而言，构架区相对于cdr可存在更大灵活性。

在此上下文中，本发明特定地考虑包含seqidno.：7的vl和seqidno.：8的vh的tau结合抗体或其结合片段。

本公开内容尤其涵盖人源化tau结合抗体或其结合片段。

为此目的，可将cdr移植至人构架区上。应理解，这样的人源化的cdr移植的tau结合抗体或其结合片段的鉴别可利用本领域中已确立的方法实现。当移植cdr或特异性决定残基时，可使用与cdr所来源的供体抗体类别/类型相关的任何适当受体人可变区构架序列(参见例如cabilly等人，美国专利号4,816,567；cabilly等人，欧洲专利号0,125,023b1；boss等人，美国专利第4,816,397号；boss等人，欧洲专利第0,120,694b1号；neuberger,m.s.等人，wo86/01533；neuberger,m.s.等人，欧洲专利第0,194,276b1号；winter，美国专利第5,225,539号；winter，欧洲专利第0,239,400b1号；padlan,e.a.等人，欧洲专利申请第0,519,596a1号)。

另外，在本公开内容的cdr移植的抗体可变区中，构架区无需具有与受体抗体的序列完全相同的序列。从而可移植具有或不具有构架变化的cdr。根据供体可变区构架区与受体构架区之间的比较来引入构架变化可允许保持例如抗体亲和力，否则作为人源化的结果，可能会使抗体亲和力降低。举例而言，可将异常残基改变为受体链类别或类型中较频繁存在的残基。或者，可改变受体构架区中的所选残基，使得其对应于供体抗体中的相同位置所发现的残基(参见reichmann等人，1998,nature,332,323-324)。这样的变化应减少至为恢复供体抗体亲和力所必需的最小程度。可使用adair等人(1991)(humanisedantibodies.wo91/09967)概述的方案选择供改变的残基。在本公开内容的cdr移植抗体中，受体重链和轻链不必来源于相同抗体且必要时可包含具有来源于不同链的构架区的复合链。

可用于本公开内容的人受体构架实例为kol、newm、rei、eu、tur、tei、lay和pom(kabat等人，同上)。举例而言，kol和newm可用于重链，rei可用于轻链且eu、lay和pom可用于重链与轻链。或者，可使用人生殖系序列；这些序列可获得于：(http：//vbase.mrc-ce.cam.ac.uk/，或http：//www.imgt.org)。本发明特别地考虑使用人v区igkv2-29+jk2j区seqidno.：31(imgt，http：//www.imgt.org/)作为轻链cdr的受体构架区和人v区ighv4-59+jh3j区seqidno.：32(imgt，http：//www.imgt.org/)作为重链cdr的受体构架区。在seqidno.：32中，可考虑例如位置1和48进行构架区中的残基变化。位置1的谷氨酰胺残基可变为谷氨酸或天冬氨酸。位置48中的异亮氨酸残基可变为甲硫氨酸。seqidno.：32中的用于进行构架区中的残基变化的其他位置可为位置37和/或71。举例而言，seqidno：32的位置37的异亮氨酸残基可变为缬氨酸。位置71的缬氨酸残基可变为精氨酸。seqidno.：31中用于进行构架区中的残基变化的位置可为位置68。seqidno.：31的位置68的丝氨酸残基可变为异亮氨酸。

针对此背景，本公开内容在另一个方面中提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含：轻链可变区，其包含seqidno.：9或与其至少80％同一的序列，和/或重链可变区，其包含seqidno.：10或与其至少80％同一的序列。

这样的经分离的tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链可变区，其包含seqidno.：9或与其至少80％同一的序列，和/或重链可变区，其包含seqidno.：11、12、13或与其至少80％同一的序列。

vl和vh分别与seqidno.：9和10的同一性可为至少80％，但也可为较高的，诸如至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。应理解，就同一性而言，构架区相对于cdr可存在更大灵活性。

在此上下文中，本申请特别地考虑包含seqidno.：9的vl和seqidno.：11的vh的tau结合抗体或其结合片段；包含seqidno.：9的vl和seqidno.：12的vh的tau结合抗体或其结合片段；包含seqidno.：9的vl和seqidno.：13的vh的tau结合抗体或其结合片段。

人源化的cdr移植的tau结合抗体或其结合片段可包含人来源的恒定区。抗体或免疫球蛋白视其重链的恒定区氨基酸序列而定，分成以下类别：iga、igd、ige、igg和igm，且其中几个可进一步分成亚类(亚型)，例如igg1、igg2、igg3和igg4、iga1和iga2。特定而言，当抗体分子意欲用于治疗用途且需要抗体效应功能时，可使用人igg恒定区结构域，尤其igg1和igg3同种型。或者，当抗体分子意欲用于治疗目的且不需要抗体效应功能时，可使用igg2和igg4同种型。本发明特别地考虑igg1和igg4亚型的人源化抗体。

应理解也可使用这些恒定区结构域的序列修饰。举例而言，抗体恒定域中也可进行一或多个氨基酸(诸如1或2个氨基酸)取代、添加和/或缺失，而不会显著改变抗体结合tau的能力。也可使用其中位置241的丝氨酸已变成脯氨酸的igg4分子，如angal等人，molecularimmunology,1993,30(i),105-108中所述。

抗体效应功能包括adcc和cdc。adcc是指抗体依赖性细胞的细胞毒性。为了判定抗体原则上是否能够介导addc，可通过例如所谓的cr⁵¹、eu和s³⁵释放分析来测量adcc。含有所关注的抗原(即tau)的靶细胞可用这些化合物标记。治疗抗体结合之后，洗涤细胞且将表达fc受体(诸如fcγriii)的效应细胞与经抗体标记的靶细胞一起共孵育且可根据标记的释放来监测靶细胞的溶解。另一种方法是利用所谓的acellatox^tm分析。cdc是指补体依赖性细胞的细胞毒性。为了判定抗体原则上是否能够介导cdc，可如例如以下文献中所述来体外测量cdc：delobela等人，methodsmolbiol.(2013)；988：115-43或currentprotocolsinimmunology，第13章complement(printissn：1934-3671)。

针对此背景，本公开内容在另一个方面中提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含：轻链，其包含seqidno.：14或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含seqidno.：15或与其至少70％同一的序列。

这样的经分离的tau结合抗体或其结合片段可包含：轻链，其包含seqidno.：14或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含seqidno.：16、17、18或与其至少70％同一的序列。

轻链和重链分别与seqidno.：14和15的同一性可为至少70％，但也可为较高的，诸如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。应理解，就同一性而言，构架区相对于cdr可存在更多灵活性且恒定区可存在甚至更多的灵活性。

在此上下文中，本申请特别地考虑包含seqidno.：14的轻链和seqidno.：16的重链的tau结合抗体或其结合片段、包含seqidno.：14的轻链和seqidno.：17的重链的tau结合抗体或其结合片段、包含seqidno.：14的轻链和seqidno.：18的重链的tau结合抗体或其结合片段。

另外，本发明在另一方面中提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含：轻链，其包含seqidno.：14或与其至少70％同一的序列，和/或重链，其包含seqidno.：54或seqidno.：55或与其至少70％同一的序列。

轻链和重链分别与seqidno.：14和seqidno.：54或55的同一性可为至少70％，但也可为较高的，诸如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，视情况优选较高同一性。不同的同一性位置可根据相似性考虑因素选择。应理解，就同一性而言，构架区相对于cdr可存在更多灵活性且恒定区可存在甚至更多的灵活性。

本公开内容还提供人tau的特异性区域或表位，其被本公开内容所提供的抗体或其结合片段结合，特定而言，包含以下中的任一个的抗体或其结合片段：cdr-h1(seqidno.：4)、cdr-h2(seqidno.：5)、cdr-h3(seqidno.：6)、cdr-l1(seqidno.：1)、cdr-l2(seqidno.：2)或cdr-l3(seqidno.：3)，例如包含seqidno.：7的vl和seqidno.：8的vl的抗体。

本公开内容进一步提供人tau的特异性区域或表位，具体地，seqidno.：35的氨基酸235-250内的表位，其被本公开内容中所提供的抗体或其结合片段所结合，具体地，包含seqidno.：7的vl和seqidno.：8的vh的抗体或其结合片段。

tau的此特异性区域或表位可通过本领域中已知的任何适合的表位定位方法与本公开内容所提供的任一种抗体的组合来鉴别。这样的方法的实例包括：利用能特异性结合抗体的含有由tau结合抗体或其结合片段识别的表位的序列的最小片段筛选用于结合本公开内容的tau结合抗体或其结合片段的来源于seqidno.：35的不同长度的肽。若中枢神经系统中存在不同的tau亚型，则应理解本文详述的方法中可使用任何这样的亚型。在特定实例中，可使用tau的最长亚型，即如seqidno.：35中所定义的亚型2。seqidno.：35的tau肽可以重组方式、合成方式或通过蛋白分解消化tau多肽来产生。结合抗体的肽可通过例如western印迹或质谱分析来鉴别。在另一实例中，nmr光谱法或x射线结晶学可用于鉴别tau结合抗体或其结合片段所结合的表位。一旦鉴别，结合本公开内容的抗体的表位片段必要时可用作免疫原以获得结合相同表位的其他抗体。另外，结合本公开内容的抗体的表位片段可用于获得结合相同表位的蛋白质，且必要时抑制tau的至少一种生物学活性，诸如包含超过10个氨基酸的蛋白质或多肽化合物，所述氨基酸是基于来源于例如以下的蛋白质骨架：脂质运载蛋白(“抗运载蛋白”)、纤维结合蛋白(“阿德奈汀(adnectins)，特林奈汀(trinectins)”、昆尼兹域、c型凝集素、转铁蛋白、γ-结晶体、半胱氨酸-nots、锚蛋白重复(“darpins”)或蛋白质a(“亲和抗体”)，如本领域中所知(tomlinson,2004；mosavi等人，2004；gill和damle,2006；nilsson和tolmachev,2007；binz等人，2004)。另外，结合相同表位的分子包括其他有机分子，包括包含不超过10个氨基酸的肽和环肽，以及肽模拟物。肽模拟物为基于在蛋白质-蛋白质相互作用位点所发现的氨基酸序列且在本领域中已知的化合物(sillerud和larson,2005)。

针对此背景，本公开内容在另一方面中提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合至少包含seqidno.：35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246的表位。总体表位似乎是从seqidno.：35的氨基酸232延伸至251。在一个实例中，本发明的抗体结合的人tau的表位包含seqidno.：35的氨基酸s238、a239、s241、t245、a246和选自s235、s237、k240、r242、l243、q244、v248和m250的一个或多个残基。

在另一方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合至少包含seqidno.：35的氨基酸残基s235、s238、a239、k240、s241、q244、t245和a246的表位。在一个实例中，本发明的抗体结合的人tau的表位包含seqidno.：35的氨基酸s235、s238、a239、k240、s241、q244、t245、a246和选自s237、r242、l243,v248和m250的一个或多个残基。

在另一方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合至少包含seqidno.：35的氨基酸残基s235、s237、s238、a239、k240、s241、q244、t245和a246的表位。在一个实例中，本发明的抗体结合的人tau的表位包含seqidno.：35的氨基酸s235、s237、s238、a239、k240、s241、q244、t245、a246和选自r242、l243、v248和m250的一个或多个残基。

在一个实例中，本发明的抗体结合的人tau的表位包含seqidno.：35的氨基酸残基s235、s237、s238、a239、k240、s241、r242、l243、q244、t245、a246、v248和m250。包含seqidno.:7的vl和seqidno.:8的vh的tau结合抗体或其结合片段是结合上述表位的tau结合抗体或其结合片段的代表。

这样的抗体可为嵌合、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、人源化或完全人单克隆抗体。

在另一方面中，本公开内容提供经分离的中和tau结合抗体或其结合片段，其中所述中和tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246的表位。在一个实例中，本发明的中和抗体结合的人tau的表位包含seqidno.：35的氨基酸s238、a239、s241、t245、a246和选自s235、s237、k240、r242、l243、q244、v248和m250的一个或多个残基。

在另一方面中，本公开内容提供经分离的中和tau结合抗体或其结合片段，其中所述中和tau结合抗体或其结合片段结合至少包含seqidno.：35的氨基酸残基s235、s237、s238、a239、k240、s241、q244、t245和a246的表位。在一个实例中，本发明的中和抗体结合的人tau的表位包含seqidno.：35的氨基酸s235、s238、a239、k240、s241、q244、t245和a246和选自s237、r242、l243,v248和m250的一个或多个残基。

在另一方面中，本公开内容提供经分离的中和tau结合抗体或其结合片段，其中所述中和tau结合抗体或其结合片段结合至少包含seqidno.：35的氨基酸残基s235、s238、a239、k240、s241、q244、t245和a246的表位。在一个实例中，本发明的中和抗体结合的人tau的表位包含seqidno.：35的氨基酸s235、s237、s238、a239、k240、s241、q244、t245、a246和选自r242、l243、v248和m250的一个或多个残基。

在一个实例中，本发明的中和抗体结合的人tau的表位包含seqidno.：35的氨基酸残基s235、s237、s238、a239、k240、s241、r242、l243、q244、t245、a246、v248和m250。

包含seqidno.:7的vl和seqidno.:8的vh的tau结合抗体或其结合片段是结合上述表位的中和tau结合抗体或其结合片段的代表。

这样的中和抗体可为嵌合、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、人源化或完全人单克隆抗体。

在另一方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段与上述tau结合抗体或其结合片段结合基本上相同的tau表位。对表位的结合可如针对表位定位所述，使用例如包含seqidno.：7的vl和seqidno.：8的vh的tau结合抗体或其结合片段作为参考物来测定。

这样的抗体可为嵌合、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、人源化或完全人单克隆抗体。

本公开内容还提供了特异性结合人tau的区域或表位的tau结合抗体或其结合片段，特别是特异性结合seqidno.：35的氨基酸235-250内的表位(如通过异核单量子相干核磁共振(hsqcnmr)所确定)的tau结合抗体或其结合片段。

这样的抗体可为嵌合、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、人源化或完全人单克隆抗体。

在另一方面中，本公开内容提供经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段与上述tau结合抗体竞争结合tau。

在此上下文中，本发明特别地涵盖经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段与包含seqidno.：7的vl和seqidno.：8的vh的tau结合抗体或其结合片段竞争结合tau。

这样的抗体可为嵌合、人源化或完全人单克隆抗体或可用于获得嵌合、人源化或完全人单克隆抗体。

对tau的竞争结合可根据在可包含seqidno.：7的vl和seqidno.：8的vh的参考抗体或其结合片段存在下，抗体或其结合片段对tau的结合减少至少约50％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％或约100％来确定。结合可使用表面等离子体共振(使用设备)、各种荧光检测技术(例如荧光相关光谱法、荧光交叉关联法、荧光寿命测量等)或各种类型的放射免疫分析或用于追踪结合靶标分子的抗体的其他分析来测量。

术语“tau结合抗体或其结合片段”意谓抗体或其结合片段借助于其可变区特异性结合tau，即结合tau抗原的亲和力大于不为tau同源物的其他抗原。“tau结合抗体或其结合片段”借助于其可变区结合tau的亲和力是不为tau同源物的其他抗原的至少两倍、至少五倍、至少10、20、100、10³、10⁴、10⁵或至少10⁶倍。应理解，tau结合抗体和其结合片段然而也可经由与tau结合抗体和其结合片段的可变区外部序列的相互作用而与其他蛋白质(例如金黄色葡萄球菌蛋白质a或elisa技术中的其他抗体)发生相互作用。术语“tau结合抗体或其结合片段”不意欲涵盖这样的后者结合特性，这些特性是由tau结合抗体和其结合片段的可变区外部的序列介导且具体地，是由tau结合抗体和其结合片段的恒定区介导。测定抗体结合特异性的筛选分析已熟知且在本领域中常规地实施。就抗体(或其结合片段)结合其抗原的亲和力而言，tau结合抗体或其结合片段可具有纳摩尔浓度范围内的平衡解离常数(kd)。因此，kd可低于约1*10^-6，例如低于约5*10^-7，诸如约2*10^-7或低于2*10^-7，且可使用例如表面等离子体共振和biacore装置测量，如实施例中所述。

如上所述，本公开内容提供tau结合抗体或其结合片段。全长抗体包括恒定域和可变区。恒定区在抗体的抗原结合片段中可不一定以其全长形式存在。然而应理解，每当本申请考虑使用抗体介导的adcc和/或cdc时，结合片段必须包含长度仍足以能够介导adcc和/或cdc的恒定区。

如上所述，本发明还涉及人tau结合抗体或其结合片段，其可作为人源化的替代方案产生。举例而言，可以产生在免疫接种后能够在不产生内源鼠抗体的情况下产生人抗体的完整库的转基因动物(例如小鼠)。举例而言，已描述嵌合和生殖系突变小鼠中的抗体重链接合区(jh)基因的纯合缺失导致内源抗体产生被完全抑制。将人生殖系免疫球蛋白基因阵列转移至这样的生殖系突变型小鼠中将产生特异性针对特定抗原的人抗体(用所述抗原免疫接种携带人生殖系免疫球蛋白基因的转基因动物后)。用于产生这样的转基因动物的技术和自这样的转基因动物中分离和产生人抗体的技术在本领域中已知(lonberg,2005；green,1999；kellermann和green,2002；nicholson等人，1999)。或者，在转基因动物(例如小鼠)中，只有编码小鼠抗体的可变区的免疫球蛋白基因用相应的人可变免疫球蛋白基因序列置换。编码抗体恒定区的小鼠生殖系免疫球蛋白基因保持不变。以此方式，转基因小鼠的免疫系统中的抗体效应功能和因此b细胞发育基本上不变，从而可在活体内抗原攻击后使得抗体反应改善。一旦编码所关注的特定抗体的基因已自这样的转基因动物中分离，则编码恒定区的基因可用人恒定区基因置换以便获得完全人抗体。用于体外获得人抗体的抗体片段的其他方法是基于展示技术，诸如噬菌体展示或核糖体展示技术，其中使用至少部分地以人工方式或从供体的免疫球蛋白可变(v)域基因库产生的重组dna文库。用于产生人抗体的噬菌体和核糖体展示技术在本领域中已熟知(winter等人，1994；hoogenboom,2002；kretzschmar和vonruden,2002；groves和osbourn,2005；dufner等人，2006)。

人抗体也可自经分离的人b细胞中产生，所述人b细胞用所关注的抗原离体免疫且随后融合而产生杂交瘤，接着可筛选这些杂交瘤以产生最佳人抗体(grasso等人，2004；li等人，2006)。

如本文所用，术语“tau结合抗体”或其结合片段是指结合tau且抑制tau的至少一种生物活性的抗体或其结合片段。tau的生物活性是本领域已知的，包括但不限于tau分子的聚集从而形成不同类型的聚集物例如上文描述的缠结或原纤维。在一个特定实施方案中，如本文所用，“中和tau结合抗体”或其结合片段是指体外分析中，诸如下文实验3.1所述的体外分析中，结合tau且抑制tau聚集的抗体或其结合片段。

如本文所用，术语‘抗体’基本上是指完整(完全，全长)抗体，即包含两条重链和两条轻链的组件。抗体可包含其他结合结构域，例如wo2007/024715中所公开的分子dvd-ig，或wo2011/030107中所述的所谓(fabfv)2fc。因此，如本文所使用的抗体包括二价、三价或四价全长抗体。

抗体结合片段包括单链抗体(即全长重链和轻链)；fab、经修饰的fab、fab’、经修饰的fab’、f(ab’)2、fv、fab-fv、fab-dsfv、fab-scfv、fab-scfc、二硫键稳定化fab-scfv、单域抗体(例如vh或vl或vhh)、scfv、scfv-scfc、dsscfv、dsscfv-scfc、二价、三价或四价抗体、双scfv、双功能抗体、三功能抗体、三功能抗体、四功能抗体；结构域抗体(dabs)，诸如sdab；vhh和vnar片段，和上述任一个的表位结合片段(参见例如holliger和hudson,2005,naturebiotech.23(9)：1126-1136；adair和lawson,2005,drugdesignreviews-online2(3),209-217)。用于产生和制造这些抗体片段的方法在本领域中已熟知(参见例如verma等人，1998,journalofimmunologicalmethods,216,165-181)。fab-fv形式首次公开于wo2009/040562中且其二硫化物稳定型fab-dsfv首次公开于wo2010/035012中。fab-scfv的二硫化物稳定化形式描述于wo2013/068571中。包含scfc形式的抗体形式首次描述于wo2008/012543中。用于本公开内容中的其他抗体片段包括国际专利申请wo2005/003169、wo2005/003170和wo2005/003171中所述的fab和fab’片段。

多价抗体可包含多特异性，例如双特异性，或可具单特异性(参见例如wo92/22583和wo05/113605)。后者的一个实例为如wo92/22583中所述的tri-fab(或tfm)。

在一个实施方案中，提供fab片段。

在一个实施方案中，提供fab’片段。

典型fab’分子包含重链和轻链对，其中重链包含可变区vh、恒定域ch1和天然或经修饰的铰链区且轻链包含可变区vl和恒定域cl。

在一个实施方案中，提供根据本公开内容的fab’的二聚物以产生f(ab’)2，例如可经由铰链发生二聚化。

在一个实施方案中，抗体或其结合片段包含结合结构域。结合结构域通常将包含6个cdr，三个来自重链且三个来自轻链。在一个实施方案中，cdr位于一个构架中且一起形成可变区。因此，在一个实施方案中，抗体或结合片段包含特异于抗原的结合结构域，其包含轻链可变区和重链可变区。

应理解，本公开内容所提供的tau结合抗体或其结合片段的亲和力可使用本领域中已知的适合方法改变。本公开内容因此还涉及本公开内容的抗体分子的变体，其对tau具有改良的亲和力。这样的变体可通过多种亲和力成熟方案获得，包括使cdr发生突变(yang等人，j.mol.biol.,254,392-403,1995)、链改组(marks等人，bio/technology,10,779-783,1992)、使用大肠杆菌突变菌株(low等人，j.mol.biol.,250,359-368,1996)、dna改组(patten等人，curr.opin.biotechnol.,8,724-733,1997)、噬菌体展示(thompson等人，j.mol.biol.,256,77-88,1996)和有性pcr(crameri等人，nature,391,288-291,1998)。vaughan等人(同上)论述这些亲和力成熟方法。

tau结合抗体和其结合片段因此也可涵盖例如具有一或多个保守取代(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个保守取代)的前文特定提及的轻链或重链氨基酸序列中的任一个。可确定氨基酸序列中的位置作为保守取代的候选位置，且可选择合成和天然存在的氨基酸来实现任何特定氨基酸的保守取代。用于选择保守取代的考虑因素包括产生任何特定氨基酸取代的背景、侧链的疏水性或极性、侧链的一般尺寸，和在生理学条件下具有酸性或碱性特征的侧链的pk值。举例而言，赖氨酸、精氨酸和组氨酸彼此间取代通常为适合的。如本领域中所知，这是因为全部三种氨基酸具有碱性侧链，然而与组氨酸(约6)相比，赖氨酸和精氨酸的侧链的pk值彼此间更接近(约10和12)。类似地，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸彼此间的取代通常为适合的，其限制条件为甘氨酸不宜频繁地取代群组中的其他成员。彼此间适宜频繁取代的其他氨基酸群组包括(但不限于)由谷氨酸和天冬氨酸组成的群；由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成的群；和由丝氨酸、苏氨酸和视情况存在的酪氨酸组成的群。

如在本公开内容的上下文中提及的tau结合抗体和其结合片段可涵盖本文公开的例示性抗体、片段和序列的衍生物。“衍生物”包括已经化学修饰的tau结合抗体和其结合片段。化学修饰的实例包括共价连接一或多个聚合物，诸如水溶性聚合物、n连接或o连接型碳水化合物、糖类、磷酸盐和/或其他这样的分子，诸如可检测标记，诸如荧光团。

必要时，用于本公开内容中的tau结合抗体或其结合片段因此可与一个或多个效应分子结合。应理解效应分子可包含单个效应分子或两个或多于两个如此连接以形成可连接至本发明抗体的单一部分的这样的分子。在需要获得连接至效应分子的抗体片段的情况下，这可通过其中抗体片段直接或经由偶合剂连接至效应分子的标准化学或重组dna程序来制备。用于这样的效应分子与抗体结合的技术在本领域中已熟知(参见hellstrom等人，controlleddrugdelivery，第2版，robinson等人编，1987，第623-53页；thorpe等人，1982,immunol.rev.,62：119-58和dubowchik等人，1999,pharmacologyandtherapeutics,83,67-123)。用于结合效应分子的这些技术可包括位点特异性结合或非位点特异性或随机结合。特定化学程序包括例如wo93/06231、wo92/22583、wo89/00195、wo89/01476和wo03/031581中所述的程序。或者，在效应分子为蛋白质或多肽的情况下，可使用重组dna程序，例如如wo86/01533和ep0392745中所述来实现键联。或者，效应分子中的特定连接位点可工程改造成本公开内容的抗体或其抗原结合片段，例如如wo2008/038024中所述。另外，可利用偶合剂使效应分子与本公开内容的抗体或其抗原结合片段连接，例如如wo2005/113605中所述。本领域技术人员应理解，上述可能性可单独或组合使用。

如本文所用，术语效应分子包括例如药物、毒素、生物学活性蛋白质(例如酶)、其他抗体或抗体片段、合成或天然存在的聚合物、核酸和其片段(例如dna、rna和其片段)、放射性核素(尤其放射性碘)、放射性同位素、螯合金属、纳米颗粒和报告基团，诸如荧光化合物或可通过nmr或esr光谱法检测的化合物。如本文所用，效应分子还包括治疗剂，诸如化学治疗剂、治疗多肽、纳米颗粒、脂质体或治疗性核酸。

其他效应分子可包括螯合放射性核素，诸如¹¹¹in和⁹⁰y、lu¹⁷⁷、铋²¹³、锎²⁵²、铱¹⁹²和钨¹⁸⁸/铼¹⁸⁸；或药物，诸如(但不限于)烷基磷酸胆碱、拓扑异构酶i抑制剂、类紫杉醇和苏拉明(suramin)。

其他效应分子包括蛋白质、肽和酶。所关注的酶包括(但不限于)蛋白水解酶、水解酶、裂解酶、异构酶、转移酶。所关注的蛋白质、多肽和肽包括(但不限于)免疫球蛋白；毒素，诸如相思子毒素、蓖麻毒素a、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，诸如胰岛素、肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板源生长因子或组织纤维蛋白溶酶原活化因子；血栓药剂或抗血管生成剂，例如血管生长抑素或内皮生长抑素；或生物反应调节剂，诸如淋巴激素、白细胞介素-1(il-i)、白细胞介素-2(il-2)、粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(gm-csf)、粒细胞群落刺激因子(g-csf)、神经生长因子(ngf)或其他生长因子和免疫球蛋白，或包含超过10个氨基酸的其他蛋白质或多肽化合物，所述氨基酸是基于来自例如以下的蛋白质骨架：脂质运载蛋白(“抗运载蛋白”)、纤维结合蛋白(“阿德奈汀”，特林奈汀)、昆尼兹域、c型凝集素、转铁蛋白、γ-结晶体、半胱氨酸结、锚蛋白重复(“darpins”)、fynsh3域(“非诺莫(fynomers)”)或蛋白质a(“亲和抗体”)，如本领域中所知(tomlinson,2004；mosavi等人，2004；gill和damle,2006；nilsson和tolmachev,2007；binz等人，2004；silacci等人，2014)。

其他效应分子包括增强或促进血脑屏障渗透的肽和蛋白质。举例而言，wo2010/043047、wo2010/063122、wo2010/063123或wo2011/041897描述可充当能够传输治疗分子跨越血脑屏障的载体的肽或多肽和使其与治疗分子结合的方法。在血脑屏障渗透的情形下，所关注的肽和蛋白质包括(但不限于)结合血脑屏障受体(诸如转铁蛋白受体、葡萄糖受体、胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白8、低密度脂蛋白受体相关蛋白1和肝素结合表皮生长因子样生长因子)的肽和蛋白质。或者，效应分子为特异性结合上述血脑屏障受体的一的抗体片段，诸如域抗体、骆驼科抗体或鲨鱼源抗体(vnar)。

其他效应分子可包括适用于例如诊断的可检测物质。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性核素、正电子发射金属(诸如可用于正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机化断层摄影术中)和非放射性顺磁金属离子。关于适用于诊断学中的可与抗体结合的金属离子，一般参见美国专利第4,741,900号。适合的酶包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基包括抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白和生物素；适合的荧光物质包括伞酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯和藻红素；适合的发光物质包括鲁米诺(luminol)；适合的生物发光物质包括荧光素酶、荧光素和水母素；且适合的放射性核素包括¹²⁴i、¹²⁵i、¹³¹i、¹¹¹in、⁹⁹tc、⁸⁹zr、⁹⁰y、⁶⁴cu、⁶⁸ga和¹⁸f。作为可检测物质适用于诊断的效应分子的特定类型包括缺电子四嗪和反-环辛烯(tco)，如wyffels等人，2014,nuclearmedicineandbiology41(2014)：513-523中所述，其中可施用至连接至四嗪的本发明的tau结合抗体且使其达到最大吸收和自非靶标位点足够清除，接着随后施用至经适合放射性核素标记的tco或优化tco类似物，使得tco共价结合本公开内容的tau结合抗体上的四嗪，且通过例如正电子发射断层摄影术或单光子发射计算机化断层摄影术实现其检测。

在一个实施方案中，提供连接至放射性核素或连接至四嗪的tau结合fab、fab’或scfv。连接至放射性核素或连接至四嗪可经由位于抗体片段中的任何可利用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能基(例如任何游离胺基、亚胺基、硫醇、羟基或羧基)、借助于连接来实现。这样的氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组dna方法经工程改造至片段中(参见例如us5,219,996；us5,667,425；wo98/25971、wo2008/038024)。在一个实施例中，本公开内容的tau结合抗体或其结合片段为经修饰的fab片段，其中所述修饰为向其重链的c末端添加一个或多个氨基酸以实现效应分子的连接。适合的是，其他氨基酸形成经修饰的铰链区，其含有一个或多个可连接至效应分子的半胱氨酸残基。在一个实施方案中，若放射性核素为金属离子，诸如¹¹¹in、⁹⁹tc、⁸⁹zr、⁹⁰y、⁶⁴cu或⁶⁸ga，则其可被巨环螯合剂结合，例如如turner等人(br.j.cancer,1994,70：35-41；comparativebiodistributionofindium-111-labelledmacrocyclechimericb72.3antibodyconjugatesintumour-bearingmice)所述，其中后者又共价连接至抗体或抗体片段之前述氨基酸侧链或末端氨基酸官能基。在另一个实施方案中，结合放射性核素之后者巨环螯合剂可为wo05/113605中所述的效应分子，所述效应分子为连接两个或超过两个抗tau抗体或其片段的交联剂的一部分。

在另一实例中，效应分子可延长抗体的活体内半衰期，和/或降低抗体的免疫原性和/或增强抗体跨越上皮屏障传送至免疫系统。适合的这样的型效应分子的实例包括聚合物、白蛋白和白蛋白结合蛋白或白蛋白结合化合物，诸如wo05/117984中所述的那些。

在效应分子为聚合物的情况下，其一般可为合成或天然存在的聚合物，例如视情况经取代的直链或分支链聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧亚烷基聚合物或分支链或非分支链多醣(例如均多醣或杂多醣)。

可视情况存在于上述合成聚合物上的特定取代基包括一个或多个羟基、甲基或甲氧基。

合成聚合物的特定实施例包括视情况经取代的直链或分支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，尤其视情况经取代的聚(乙二醇)，诸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。

天然存在的特定聚合物包括乳糖、直链淀粉、聚葡萄糖、糖原或其衍生物。

在一个实施方案中，聚合物为白蛋白或其片段，诸如人血清白蛋白或其片段。

聚合物尺寸可根据需要变化，但平均分子量通常在500da至50000da的范围内，例如5000da至40000da，诸如20000da至40000da。聚合物尺寸尤其可基于产品的预定用途来选择，例如局限于某些组织(诸如脑)中或延长循环半衰期的能力(关于综述，参见chapman,2002,advanceddrugdeliveryreviews,54,531-545)。因此，举例而言，希望产物离开循环且渗入组织中。

适合的聚合物包括聚亚烷基聚合物，诸如聚(乙二醇)或尤其甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，且尤其分子量在约15000da至约40000da范围内。

在一个实施例中，用于本公开内容中的抗体连接至聚(乙二醇)(peg)部分。在一个特定实例中，抗体为tau结合抗体或其结合片段且peg分子可经由位于抗体片段中的任何可利用的氨基酸侧链或末端氨基酸官能基连接，例如任何游离氨基、亚氨基、巯基、羟基或羧基。这样的氨基酸可天然存在于抗体片段中或可使用重组dna方法经工程改造至片段中(参见例如us5,219,996；us5,667,425；wo98/25971、wo2008/038024)。在一个实例中，本公开内容的tau结合抗体或其结合片段为经修饰的fab片段，其中所述修饰为向其重链的c末端添加一个或多个氨基酸以实现效应分子的连接。适合的是，其他氨基酸形成经修饰的铰链区，其含有一个或多个可连接至效应分子的半胱氨酸残基。可利用多个位点连接两个或超过两个peg分子。

peg分子适宜经由位于抗体片段中的至少一个半胱氨酸残基的巯基共价连接。连接至经修饰的抗体片段的每个聚合物分子可共价连接至位于片段中的半胱氨酸残基的硫原子。共价键一般为二硫键或尤其硫-碳键。在巯基用作连接点的情况下，可使用适当活化的效应分子，例如巯基选择性衍生物，诸如马来酰亚胺和半胱氨酸衍生物。活化聚合物可用作起始物质来制备如上所述的经聚合物修饰的抗体片段。活化聚合物可为含有硫醇反应基的任何聚合物，诸如α-卤基羧酸或酯，例如碘乙酰胺、酰亚胺(例如马来酰亚胺)、乙烯基砜或二硫化物。这样的起始物质可市购(例如购自nektar，前身为shearwaterpolymersinc.,huntsville,al,usa)或可使用常规化学程序由市售起始物质制备。特定peg分子包括20k甲氧基-peg-胺(可获自nektar，前身为shearwater；rapppolymere；以及sunbio)和m-peg-spa(可获自nektar，前身为shearwater)。

在另一方面中，本公开内容提供包含编码tau结合抗体和其结合片段的核酸序列的核酸分子；包含编码其可变轻链和/或重链的核酸序列的核酸分子；和包含编码其可变轻链和/或重链的cdr1、cdr2和/或cdr3的核酸序列的核酸分子。

举例而言，ab1的vl(seqidno.：7)可由seqidno.：19编码。ab1的vh(seqidno.：8)可由seqidno.：20编码。

seqidno.：9的人源化vl可由seqidno.：21编码。seqidno.：12的人源化vh可由seqidno.：22编码。seqidno.：13的人源化vh可由seqidno.：23编码。

seqidno.：14的人源化轻链可由seqidno.：24编码。seqidno.：17的人源化重链可由seqidno.：25编码且seqidno.：18的人源化重链可由seqidno.：26编码。seqidno.：54的人源化重链可由seqidno.：56编码且seqidno.：55的人源化重链可由seqidno.：57编码。

tau结合抗体和其结合片段可由单一核酸(例如包含编码抗体的轻链和重链多肽的核苷酸序列的单一核酸)编码，或由两个或超过两个分开的核酸编码(各编码抗体或抗体片段的不同部分)。就此而言，本公开内容提供一个或多个编码任一种前述抗体或结合片段的核酸。核酸分子可为dna、cdna、rna和其类似物。

举例而言，编码抗体重链和轻链的一部分或全部的dna序列可根据需要自经测定的dna序列或基于相应氨基酸序列来合成。编码受体构架序列的dna可由本领域技术人员广泛获得且容易基于其已知氨基酸序列合成。

可利用标准分子生物学技术制备编码本公开内容的抗体分子的dna序列。期望dna序列可使用寡核苷酸合成技术完全或部分地合成。适当时可使用定点突变诱发和聚合酶链反应(pcr)技术。

优选地，编码核酸序列可操作地连接至表达控制序列，从而允许在原核或真核细胞中表达。所述聚核苷酸的表达包含将聚核苷酸转录成可翻译mrna。确保在真核细胞(优选为哺乳动物细胞)中实现表达的调控元件已为本领域技术人员熟知。其通常包含确保转录起始的调控序列且视情况包含确保转录终止和转录物稳定化的聚a信号。其他调控元件可包括转录以及翻译增强子，和/或天然相关的或异质启动子区域。

因此，本公开内容在另一方面中提供包含编码tau结合抗体和其结合片段的这样的核酸序列的克隆或表达载体。

“载体”是能够将核酸序列运载至适合宿主细胞(例如其中可发生所编码多肽的合成)中的任何分子或组合物。通常且优选地，载体为一种核酸，其已使用在本领域中已知可并入期望核酸序列(例如本公开内容的核酸)的重组dna技术工程改造。表达载体通常含有以下组分中的一个或多个(如果其未由核酸分子提供)：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、用于分泌的前导序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码待表达的多肽的核酸的多接头区域，和选择性标记物元件。

通常选择在使用载体(所述载体与宿主细胞机构兼容，使得可发生基因扩增和/或基因表达)的宿主细胞中发挥作用的载体。

本公开内容因此在另一方面中提供包含如上文所述的克隆或表达载体的宿主细胞和/或编码如上文所述的tau结合抗体和其结合片段的核酸序列。

宿主细胞可以是能够经核酸或载体转化以便产生由其编码的tau结合抗体或其结合片段的任何细胞类型。包含核酸或载体的宿主细胞可用于产生tau结合抗体或其结合片段，或其部分(例如由核酸或载体编码的重链序列或轻链序列)。将核酸或载体引入细胞中之后，在适合于表达所编码序列的条件下培养细胞。接着可自细胞中分离抗体、抗原结合片段或所述抗体的一部分。

宿主细胞可以是原核宿主细胞(诸如大肠杆菌)或真核宿主细胞(诸如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。在适当条件培养下培养时，宿主细胞表达抗体或其结合片段，随后可自培养基收集(如果宿主细胞将抗体或其结合片段分泌至培养基中)或直接自产生抗体或其结合片段的宿主细胞收集(如果不分泌抗体或其结合片段)。适当宿主细胞的选择将视多种因素而定，诸如所需表达量、活性所需或必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)和折叠成生物学活性分子的容易性。宿主细胞的选择部分地取决于抗体或其结合片段是否经转录后修饰(例如糖基化和/或磷酸化)。若如此，则酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞是优选的。

适合的哺乳动物宿主细胞包括cho、骨髓瘤或杂交瘤细胞。适用于本公开内容中的中国仓鼠卵巢(cho细胞)的类型可包括cho和cho-k1细胞，包括dhfr-cho，诸如可结合dhfr选择性标记物使用的cho-dg44细胞和chodxb11细胞或可结合谷氨酰胺合成酶选择性标记物使用的choki-sv细胞。许多可获自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection；atcc),manassas,va。实例包括哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(cho)(atcc第ccl61号)、人胚肾(hek)293或293t细胞(atcc第crl1573号)、3t3细胞(atcc第ccl92号)或per.c6细胞。用于表达抗体的其他细胞类型包括淋巴细胞性细胞系，例如nso骨髓瘤细胞和sp2细胞、cos细胞。

本公开内容的另一方面提供一种产生tau结合抗体或其结合片段的方法，所述方法包含在适合于从例如编码tau结合抗体或其结合片段的dna表达tau结合抗体或其结合片段的条件下培养含有例如载体的宿主细胞和分离抗体分子。

tau结合抗体或其结合片段可仅包含重链或轻链多肽，在此情况下仅需使用重链或轻链多肽编码序列转染宿主细胞。为产生包含重链与轻链的产物，细胞系可经两种载体转染，第一载体编码轻链多肽且第二载体编码重链多肽。或者，可使用单一载体，载体包括编码轻链和重链多肽的序列。

tau结合抗体或其结合片段(根据本公开内容的抗体和片段)在宿主细胞中得到高量的表达。因此，抗体和/或片段的特性有助于商业加工。

因此，提供一种培养宿主细胞且表达tau结合抗体或其结合片段、分离后者且视情况纯化其以提供经分离的tau结合抗体或其结合片段的方法。在一个实施方案中，所述方法进一步包含使效应分子与经分离的抗体或片段结合(例如与尤其如本文所述的peg聚合物结合)的步骤。

tau结合抗体或其结合片段可配制成组合物，尤其药物或诊断组合物。药物组合物包含治疗或预防有效量的tau结合抗体或其结合片段与适合的载剂(例如药学上可接受的药剂)的混合物。诊断组合物包含诊断有效量的tau结合抗体或其结合片段与适合载剂(例如诊断学上可接受的药剂)的混合物。

本发明药物组合物中使用的药学上可接受的药剂包括载剂、赋形剂、稀释剂、抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味和稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增积剂、缓冲液、递送媒介物、张力剂、共溶剂、湿润剂、络合剂、缓冲剂、抗微生物剂和表面活性剂。

组合物可呈液体形式或呈冻干或冷冻干燥形式且可包括一种或多种冻干保护剂、赋形剂、表面活性剂、高分子量结构添加剂和/或增积剂(参见例如美国专利6,685,940、6,566,329和6,372,716)。

组合物可适于肠胃外施用。例示性组合物适合于通过可供本领域技术人员使用的任何路径注射或输注至动物中，诸如关节内、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内或病灶内途径。肠胃外配制物通常为无菌、无热原质的等张水溶液，其视情况含有药学上可接受的防腐剂。

非水性溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。水性载剂包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬浮液，包括生理盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(ringer’sdextrose)、右旋糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏右旋糖的那些)，和其类似物。也可存在防腐剂和其他添加剂，诸如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体和其类似物。一般参见remington’spharmaceuticalscience，第16版，mack编，1980，所述文献以引用的方式并入本文中。

本文所述的药物组合物可以以在特定局部环境中提供产物的局部浓度和/或增加稳定性或半衰期的方式(例如推注、储集式作用)配制成用于受控或持续递送。组合物可包括本公开内容的抗体、结合片段、核酸或载体与以下的配制物：聚合物化合物(诸如聚乳酸、聚乙醇酸等)的微粒制剂，以及诸如以下的药剂：生物可降解基质、可注射微球体、微胶囊颗粒、微胶囊、生物溶蚀性颗粒珠粒、脂质体，和提供活性剂的受控或持续释放、接着可以储集式注射递送的可植入传送装置。

或者或另外，组合物可通过将已吸收或囊封有本公开内容的抗体、结合片段、核酸或载体的膜、海绵或其他适当材料植入到所影响区域中来局部施用。在使用植入装置的情况下，可将装置植入任何适合组织或器官中，且本公开内容的抗体、结合片段、核酸或载体可直接经由所述装置，通过推注或通过连续施用或通过使用连续输注的导管来递送。

包含tau结合抗体或其结合片段的药物组合物可配制成用于吸入，诸如干粉形式。吸入溶液也可配制于液化推进剂中用于气溶胶递送。在又另一个配制物中，溶液可雾化。

本公开内容的一个方面涉及tau结合抗体和其结合片段作为治疗活性剂治疗疾病的用途。

本公开内容的另一方面涉及tau结合抗体和其结合片段用于治疗tau蛋白病的用途。已描述含有tau包裹体(clavaguera等人，brainpathology23(2013)342-349)的tau蛋白病包括阿尔茨海默氏病(ad)；肌肉萎缩性侧索硬化/帕金森氏症-痴呆综合症；嗜银颗粒疾病；慢性创伤性脑病变；皮质基底核退化症；弥漫性神经原纤维缠结伴钙化；唐氏症候群；英国家族性痴呆症；丹麦家族性痴呆症；与mapt突变所引起的染色体17关联的额颞叶型痴呆症和帕金森氏症；格斯曼-斯陶思勒-谢恩克尔疾病；瓜德罗普岛帕金森氏症；肌紧张性营养不良；出现脑铁积聚的神经退化；c型尼曼-匹克疾病；非关岛运动神经元疾病伴神经原纤维缠结；匹克疾病；脑炎后帕金森氏症；朊病毒蛋白大脑淀粉样蛋白血管病变；渐进性皮层下神经胶样变性；进行性核上麻痹(psp)；slc9a6相关智力迟钝；亚急性硬化性全脑炎；仅缠结痴呆症；和出现球状神经胶质包裹体的白质tau蛋白病。

本公开内容的另一方面因此涉及tau结合抗体和其结合片段用于治疗阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹的用途。

相应地，本发明还涉及通过向有需要的受试者施用治疗活性量的tau结合抗体或其结合片段来治疗tau蛋白病(特定而言，阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的方法。

本发明还涉及tau结合抗体或其结合片段用于制造用于治疗tau蛋白病(具体地，阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的药剂的用途。

在本公开内容的另一方面中，tau结合抗体或其结合片段可单独或与其他药剂组合使用以用于治疗。举例而言，tau结合抗体或其结合片段可与至少一种其他治疗剂共施用。在某些方面中，其他治疗剂是当使用tau结合抗体或其结合片段治疗时有效治疗相同或不同病症的治疗剂。例示性其他治疗剂包括(但不限于)：胆碱酯酶抑制剂(诸如多奈哌齐(donepezil)、加兰他敏(galantamine)、卡巴拉汀(rovastigmine)和他可林(tacrine))、nmda受体拮抗剂(诸如美金刚(memantine))、淀粉样蛋白β肽聚集抑制剂、抗氧化剂、γ分泌酶调节剂、神经生长因子(ngf)模拟物或ngf基因疗法、ppary激动剂、hms-coa还原酶抑制剂(抑制素)、安目帕克(ampakines)、钙离子通道阻断剂、gaba受体拮抗剂、糖原合成酶激酶抑制剂、静脉内免疫球蛋白、蕈毒碱受体激动剂、烟碱受体调节剂、主动或被动淀粉样蛋白β肽免疫接种、磷酸二酯酶抑制剂、血清素受体拮抗剂和抗淀粉样蛋白β肽抗体或其他抗tau抗体。其他例示性神经学药物可选自生长激素或神经营养因子；实例包括(但不限于)脑源性神经营养因子(bdnf)、神经生长因子(ngf)、神经营养素-4/5、纤维母细胞生长因子(fgf)-2和其他fgf、神经营养素(nt)-3、红血球生成素(epo)、肝细胞生长因子(hgf)、表皮生长因子(egf)、转化生长因子(tgf)-α、tgf-β、血管内皮生长因子(vegf)、白细胞介素-1受体拮抗剂(il-lra)、睫毛神经营养因子(cntf)、神经胶质源神经营养因子(gdnf)、neurturin、血小板源生长因子(pdgf)、海瑞古林(heregulin)、神经调节蛋白、青蒿琥酯(artemin)、珀瑟芬(persephin)、白细胞介素、神经胶质细胞系源神经营养因子(gfr)、粒细胞群落刺激因子(csf)、粒细胞-巨噬细胞-csf、轴突导向因子(netrins)、心营养素-1、刺猬蛋白(hedgehogs)、白血病抑制因子(lif)、中期因子(midkine)、多效生长因子(pleiotrophin)、骨形态发生蛋白(bmp)、轴突导向因子、皂角素(saposins)、信号素(semaphorins)和干细胞因子(scf)。在某些实施方案中，选择能够缓解神经学药物的一种或多种副作用的至少一种其他治疗剂。上文提及的这样的组合疗法涵盖组合施用(其中两种或超过两种治疗剂包括于相同或分开的配制物中)和分别施用，在此情况下，tau结合抗体或其结合片段的施用可在其他治疗剂和/或佐剂施用之前、同时和/或之后进行。tau结合抗体或其结合片段也可与其他干预疗法组合使用，诸如(但不限于)辐射疗法、行为疗法，或本领域中已知且适于治疗或预防神经病症的其他疗法。

本公开内容的另一方面涉及tau结合抗体和其结合片段用作诊断活性剂的用途。

本公开内容的一个方面还涉及tau结合抗体和其结合片段用于诊断tau蛋白病(特定而言，阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的用途。

这样的诊断测试优选可针对生物样品进行。“生物样品”涵盖获自受试者的多种样品类型且可用于诊断或监测分析。定义涵盖脑脊髓液、血液和生物学来源的其他液体样品、实体组织样品(诸如活检试样)或组织培养基或来源于其的细胞和其子代。定义还包括在获取之后已以任何方式操控的样品，诸如通过试剂处理、增溶，或富集某些组分，诸如聚核苷酸。术语“生物样品”涵盖临床样品且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物体液和组织样品。术语“生物样品”包括尿液、唾液、脑脊髓液、血液部分(诸如血浆和血清)，和其类似物。

诊断测试优选可针对不与人或动物身体接触的生物样品进行。这样的诊断测试也称为体外测试。

体外诊断测试可依赖于体外检测已获自受试者的生物样品中的tau的方法，所述方法包含以下步骤：i)使生物样品与如本文所述的tau结合抗体或其结合片段接触；和ii)检测如本文所述的tau结合抗体或其结合片段对tau的结合。通过比较所检测的tau水平与适合的对照，接着可诊断tau蛋白病(诸如阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的存在或存在可能性。因此可使用这样的检测方法判定受试者是否患有tau蛋白病(包括确定tau蛋白病的阶段(严重度))或处于出现tau蛋白病的风险中。

本公开内容因此提供体外诊断受试者中的tau蛋白病(诸如阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹)的方法，所述方法包含以下步骤：i)通过使用如本文所述的tau结合抗体或其结合片段评估自受试者获得的生物样品中的tau水平或状态；和ii)将tau水平或状态与指示正常对照受试者中的tau水平或状态的参考值、标准值或或正常对照值进行比较。生物样品中的tau多肽水平和/或状态与正常对照值之间的显著差异表示受试者患有tau蛋白病，诸如阿尔茨海默氏病和/或进行性核上麻痹。

根据本文已描述的这些各种方面和实施方案，本公开内容尤其涵盖：

1.一种经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含

2.如实施方案1的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含

轻链可变区，其包含选自seqidno.：1的cdr1、选自seqidno.：2的cdr2和选自seqidno.：3的cdr3；和

重链可变区，其包含选自seqidno.：4的cdr1、选自seqidno.：5的cdr2和/或选自seqidno.：6的cdr3。

3.如实施方案1或2的tau结合抗体或其结合片段，其中seqidno.：5中的x1为a。

4.如实施方案1或2的tau结合抗体或其结合片段，其中seqidno.：5中的x1为t。

5.如实施方案1、2、3或4中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为单克隆抗体。

6.如实施方案5的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为嵌合、人源化或完全人抗体。

7.如实施方案6的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为igg1或igg4亚型的人源化抗体。

8.如实施方案1、2、3、4、5、6或7中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基a246、a239、s241、t245、s238的表位。

9.如实施方案1、2、3、4、5、6、7或8中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246和选自s235、s237、k240、r242、l243、q244、v248和m250的一个或多个残基的表位。

10.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合可溶性人tau。

11.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合人tau的配对螺旋丝(phf)。

12.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合可溶性人tau和人tau的配对螺旋丝(phf)二者。

13.一种经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含

轻链可变区，其包含seqidno.：7或与其至少80％同一的序列，和/或

重链可变区，其包含seqidno.：8或与其至少80％同一的序列。

14.如实施方案13的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含

包含seqidno：7的轻链可变区，和

包含seqidno.：8的重链可变区。

15.如实施方案13或13的tau结合抗体或其结合片段，其中seqidno.：8中的x1为a。

16.如实施方案13或13的tau结合抗体或其结合片段，其中seqidno.：8中的x1为t。

17.如实施方案13、14、15或16中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为单克隆抗体。

18.如实施方案17的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为嵌合抗体。

19.如实施方案13、14、15、16、17或18中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基a246、a239、s241、t245、s238的表位。

20.如实施方案13、14、15、16、17、18或19中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246和选自s235、s237、k240、r242、l243、q244、v248和m250的一个或多个残基的表位。

21.如实施方案13、14、15、16、17、18、19或20中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合可溶性人tau。

22.如实施方案13、14、15、16、17、18、19或20中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合人tau的配对螺旋丝(phf)。

23.如实施方案13、14、15、16、17、18、19或20中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合可溶性人tau和人tau的配对螺旋丝(phf)二者。

24.一种经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含

轻链可变区，其包含seqidno.：9或与其至少80％同一的序列，和/或

重链可变区，其包含seqidno.：10或与其至少80％同一的序列。

25.根据实施方案24的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含

包含seqidno.:9的轻链可变区，和

包含seqidno.:10的轻链可变区。

26.根据实施方案24或25的tau结合抗体或其结合片段，其中seqidno.:10的x3是a。

27.根据实施方案24或25的tau结合抗体或其结合片段，其中seqidno.:10的x3是t。

28.根据实施方案24的tau结合抗体或其结合片段，其中重链可变区包含seqidno.:11或12。

29.根据实施方案24、25、26、27或28的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段是单克隆抗体。

30.根据实施方案29的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段是人源化抗体。

31.根据实施方案30的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段是igg1或igg4亚型。

32.如实施方案24、25、26、27、28、29、30或31中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基a246、a239、s241、t245、s238的表位。

33.如实施方案24、25、26、27、28、29、30、31或32中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246和选自s235、s237、k240、r242、l243、q244、v248和m250的一个或多个残基的表位。

34.如实施方案24、25、26、27、28、29、30、31或32中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合可溶性人tau。

35.如实施方案24、25、26、27、28、29、30、31或32中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合人tau的配对螺旋丝(phf)。

36.如实施方案24、25、26、27、28、29、30、31或32中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合可溶性人tau和人tau的配对螺旋丝(phf)二者。

37.一种经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含

轻链，其包含seqidno.：14或与其至少70％同一的序列，和/或

重链，其包含seqidno.：15或与其至少70％同一的序列。

38.如实施方案37的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段包含

包含seqidno：14的轻链，和

包含seqidno.：15的重链。

39.如实施方案37或38的tau结合抗体或其结合片段，其中seqidno.：15中的x3为a。

40.如实施方案37或38的tau结合抗体或其结合片段，其中seqidno.：15中的x3为t。

41.如实施方案37的tau结合抗体或其结合片段，其中重链可变区包含seqidno.:17或18。

42.如实施方案37、38、39、40或41任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段是单克隆人源化抗体。

43.如实施方案42的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段是igg1或igg4亚型。

44.如实施方案37、38、39、40、41、42或43任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基a246、a239、s241、t245、s238的表位。

45.如实施方案37、38、39、40、41、42、43或44中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246和选自s235、s237、k240、r242、l243、q244、v248和m250的一个或多个残基的表位。

46.如实施方案37、38、39、40、41、42、43、44或45中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合可溶性人tau。

47.如实施方案37、38、39、40、41、42、43、44或45中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合人tau的配对螺旋丝(phf)。

48.如实施方案37、38、39、40、41、42、43、44或45中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合可溶性人tau和人tau的配对螺旋丝(phf)二者。

49.经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基a246、a239、s241、t245、s238的表位。

50.如实施方案49的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246和选自s235、s237、k240、r242、l243、q244、v248和m250的一个或多个残基的表位。

51.如实施方案50的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为单克隆抗体。

52.如实施方案50或51的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段是嵌合的、人源化或完全人抗体。

53.如实施方案52的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段是igg1或igg4亚型的单克隆人源化抗体或其结合片段。

54.如实施方案50、51、52或53中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或结合片段结合可溶性人tau。

55.如实施方案50、51、52或53中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或结合片段结合人tau的配对螺旋丝(phf)。

56.如实施方案50、51、52或53中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或结合片段结合可溶性人tau与人tau的配对螺旋丝(phf)二者。

57.一种经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段与实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55或56中任一项的tau结合抗体或其结合片段竞争结合tau。

58.如实施方案57的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段与包含以下的tau结合抗体或结合片段竞争结合tau：包含seqidno：9的轻链可变区，和包含seqidno.：12或13的重链可变区。

59.一种经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段与实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55或56中任一项的tau结合抗体或其结合片段竞争结合基本上相同的tau表位。

60.如实施方案59的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段与包含以下的tau结合抗体或结合片段结合基本上相同的tau表位：包含seqidno：9的轻链可变区，和包含seqidno.：12或13的重链可变区。

61.如实施方案57、58、59或60中任一项的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为单克隆抗体。

62.如实施方案61的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为嵌合、人源化或完全人抗体。

63.如实施方案62的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为igg1或igg4亚型的人源化抗体。

64.如实施方案57、58、59、60、61、62或63中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基a246、a239、s241、t245、s238的表位。

65.如实施方案57、58、59、60、61、62、63或64中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合包含seqidno.：35的氨基酸残基s238、a239、s241、t245、a246和选自s235、s237、k240、r242、l243、q244、v248和m250的一个或多个残基的表位。

66.如实施方案57、58、59、60、61、62、63、64或65中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段结合可溶性人tau。

67.如实施方案57、58、59、60、61、62、63、64或65中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或结合片段结合人tau的配对螺旋丝(phf)。

68.如实施方案57、58、59、60、61、62、63、64或65中任一项的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或结合片段结合可溶性人tau与人tau的配对螺旋丝(phf)二者。

69.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一项的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau结合抗体或其结合片段为fab、fab’、f(ab’)2、fd和fv、scfv、fab-fv、fab-scfv、fab-dsfv、fab-scfc、scfv-scfc、dsscfv、dsscfv-scfc、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、线性抗体或含vhh抗体。

70.一种经分离的核酸分子，其编码如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69中任一项的tau结合抗体或其结合片段的轻链和/或重链。

71.一种克隆或表达载体，其包含一种或多种如实施方案70的核酸序列。

72.一种宿主细胞，其包含一种或多种如实施方案70的核酸序列或一种或多种如实施方案71的克隆或表达载体。

73.如实施方案72的宿主细胞，其不为人胚胎干细胞。

74.一种制造如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68或69中任一项的tau结合抗体或其结合片段的方法，所述方法至少包含以下步骤：a)培养如实施方案72或73的宿主细胞，和b)分离所述tau结合抗体或其结合片段。

75.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一项的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其用作治疗活性剂。

76.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一项的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其用于治疗tau蛋白病。

77.如实施方案76使用的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau蛋白病为阿尔茨海默氏病。

78.如实施方案76使用的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau蛋白病为进行性核上麻痹。

79.一种治疗tau蛋白病的方法，所述方法包含向有需要的受试者施用至如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一项的tau结合抗体或其结合片段的步骤。

80.如实施方案79的方法，其中所述tau蛋白病为阿尔茨海默氏病。

81.如实施方案79的方法，其中所述tau蛋白病为进行性核上麻痹。

82.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一项的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其用作诊断剂。

83.如实施方案1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68中任一项的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其用于诊断tau蛋白病。

84.如实施方案83使用的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau蛋白病为阿尔茨海默氏病。

85.如实施方案83使用的经分离的tau结合抗体或其结合片段，其中所述tau蛋白病为进行性核上麻痹。

本发明现根据一些实施例加以描述，然而，所述实施例不应理解为具限制性。

实验

实验1-tau结合抗体的产生

1.1重组tau表达

在两种宿主系统中表达人tau蛋白：大肠杆菌bl21(de3)和hek293细胞(人胚胎肾细胞系)。在大肠杆菌中产生了4种不同的tau亚型：亚型2、3、4和5，在hek293细胞中产生了1种亚型：亚型2。在图5至14中显示了所有表达载体和所产生的蛋白质的全部序列。

大肠杆菌中tau的产生

以合成方式产生编码不同tau亚型的基因且将密码子优化以便在大肠杆菌中表达。使用标准分子生物学技术亚克隆入经修饰的pet32载体中，所述载体经工程改造以产生具有n端6his-tev标记的tau。

大肠杆菌bl21(de3)细胞经上述载体转化，且使用标准技术表达蛋白质。

接着通过离心回收大肠杆菌细胞，裂解且通过使用ninta(qiagen)的亲和层析从可溶级分中捕获tau蛋白。使用tev蛋白酶移除6his标记，随后进行第二ninta层析步骤。取决于应用，经纯化的tau于合适的缓冲液中进行缓冲交换。为了免疫而产生的样品经使用proteusnoendo^tm管柱(vivaproducts)移除内毒素。

产生同位素标记的tau用于核磁共振(nmr)研究：如上文所述进行蛋白质表达，但其中使用最小限度培养基将¹⁵n、¹³c和²h并入蛋白质中。裂解大肠杆菌细胞沉淀且使用ninta(qiagen)亲和层析步骤纯化tau蛋白，利用tev蛋白酶移除6his标记且接着通过凝胶过滤、使用superdex200单元(ge-healthcare)纯化tau蛋白。

在hek293中产生tau

使用野生型dna序列，以合成方式产生编码tau亚型2的基因。使用标准分子生物学技术将其亚克隆入表达载体pmv-10histev(含有cmv启动子)中，其经工程改造以产生具有n端10his-tev标记的tau(seqidno.:51)。

所得载体使用expi293^tm表达系统(invitrogen)、依据制造商方案转染。此系统是使用来源于hek293细胞系的expi293f人细胞。

tau蛋白聚积于培养基中，使用固定金属离子亲和层析nisepharoseexcel(gehealthcare)从其中回收。接着使用tev蛋白酶移除10his标记，随后再施加至nisepharose管柱上且收集流过的经切割的tau。经纯化的tau于合适的缓冲液中进行缓冲交换，这取决于应用。

原纤维形成

无菌过滤450μm的tau蛋白并使用thermomixer(eppendorf)于750rpm在37℃在1.5mleppendorf管中摇动310小时。使用thioflavin-t染料监视原纤维形成，并在fluostaromega分光光度计(bmglabtech)上读取吸光度。通过负染色电子显微镜确认配对螺旋丝(phf)的形成。

1.2免疫接种

使用注射器，使用通过剧烈混合所得的于等体积的完全弗氏佐剂(cfa)中乳化的50μg重组tau蛋白将10只雌性spraguedawley大鼠(260-280g)皮下免疫。使用不完全弗氏佐剂(ifa)，以14天时间间隔给予大鼠3次追加注射，也从尾巴放血。最后一次追加免疫后14天终止，制备脾脏和骨髓并于胎牛血清(fcs)中10％二甲基亚砜(dmso)中在-80℃冷冻。在大肠杆菌中表达重组人tau蛋白，纯化并在体外聚集，然后进行免疫。tau的4种亚型(2、3、4和5)的等摩尔混合物的最终样品用于免疫，其包含可溶性tau和不可溶原纤维tau的混合物。

1.3b细胞培养

使用类似于zubler等人(1985)所述的方法制备b细胞培养物。简言之，来自免疫大鼠的pbmc源b细胞以每孔约3000个细胞的密度在条形码编码的96孔组织培养板中、在37℃、在5％co2氛围中培养七天，所述组织培养板具有每孔200μlrpmi1640培养基(gibcobrl)，所述培养基补充有10％fcs(paalaboratoriesltd)、2％hepes(sigmaaldrich)、1％l-谷氨酰胺(gibcobrl)、1％青霉素/链霉素溶液(gibcobrl)、0.1％β-巯基乙醇(gibcobrl)、3％活化脾细胞培养物上清液和γ照射突变型el4鼠胸腺瘤细胞(5x10⁴/孔)。总共获取约1.2×10⁸个b细胞样品。

1.4初始筛选

使用基于荧光的均质结合分析，使用涂有生物素化可溶性或不可溶tau(如第1.1部分中所描述而获得的)的superavidin^tm珠粒(bangslaboratories)，测定b细胞培养物上清液中的tau结合抗体的存在。所产生的tau具有可溶性和不可溶级分。使用工作台eppendorf迷你离心机以14,500rpm离心10分钟来除去不可溶tau。使用ez-linksulfo-nhs-lc-biotinylation试剂盒，根据生产商的说明书，对每个级分分别进行生物素化。使用zeba离心脱盐柱，根据生产商的说明书，从游离生物素除去可溶性生物素化的级分。通过使用eppendorf迷你离心机以14,500rpm离心10分钟，从游离生物素除去不可溶级分，回收含有tau的沉淀并重悬于1.5ml磷酸缓冲盐水(pbs)，重复该过程5次。该测定允许筛选表现出与可溶性或不可溶tau形式结合的上清液。使用matrixplatemate液体处置器，从条形码编码的96孔组织培养板转移10ul上清液置于条形码编码的384孔黑壁分析板中，所述384孔分析板含有固定于珠粒上的可溶性或不可溶tau(10ul/孔)。结合经由山羊抗大鼠iggfcγ特异性cy-5缀合物(jackson)展现。在appliedbiosystems8200细胞检测系统上读板。

1.5二次筛选

初始筛选之后，使用avisoonyx拣选机器人将阳性上清液合并于条形码编码的96孔母液板上且将细胞培养板中的b细胞在-800℃冷冻。接着在elisa分析中，针对可溶性tau级分筛选母液板。这是为了在更严格的筛选中测定抗体结合tau的能力并检测它们在初级筛选中不结合珠粒。elisa分析包括将可溶性tau于碳酸盐涂布缓冲液(dh2o+0.16％na2co3+0.3％nahco3)中以3μg/ml涂覆于384孔maxisorp板(thermoscientific/nunc)上。板用pbs中的1％w/v酪蛋白+1％w/vbsa封闭且接着与每孔10ulb细胞培养物上清液一起孵育。向板中添加hrp缀合的山羊抗大鼠iggfc二抗(stratechscientificltd/jacksonimmunoresearch)，随后利用tmb底物(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，获自emdmillipore；10μl/孔)显示结合。使用bioteksynergy2微定量板式读取器，在630nm测量光密度。选择对tau展现特异性的b细胞上清液用于可变区复原。

1.6可变区复原

为了允许从所关注的选择孔复原抗体可变区基因，必须进行解褶积步骤以能够在含有异质b细胞群的指定孔中鉴别出抗原特异性b细胞。这通过使用荧光焦点方法(clargo等人，2014)实现。简言之，将获自阳性孔的分泌免疫球蛋白的b细胞与涂有生物素化可溶性tau的抗生蛋白链菌素珠粒(newenglandbiolabs)和1：1200最后稀释的山羊抗大鼠fcγ片段特异性fitc缀合物(jackson)混合。在37℃静态孵育1小时之后，由于在所述b细胞周围存在荧光光环而可鉴别出抗原特异性b细胞。接着利用eppendorf微操作器挑选使用olympus显微镜所鉴别的这些个别b细胞且沉积至pcr管中。

使用重链和轻链可变区特异性引物，通过逆转录(rt)-pcr从单细胞中复原抗体可变区基因。在avisoonyx液体处置机器人上进行两轮pcr，巢式第二pcr在3’端和5’端引入了限制性酶切位点，从而允许将可变区克隆入小鼠γ1igg(vh)或小鼠κ(vl)哺乳动物表达载体中。使用fectin293(invitrogen)将重链和轻链构建体共转染至hek-293细胞中且在125ml锥形瓶(erlenmeyerflask)中以30ml体积表达重组抗体。5-7天培养之后，收集上清液且使用亲和层析纯化抗体。

实验2-进一步筛选所鉴别的抗体

2.1phf制备

根据ksiezak-reding和wall公开的方案(neurobiologyofaging15,11-19,1994)，从获自患有阿尔茨海默氏病或进行性核上麻痹或额颞叶型痴呆症的供者的脑样品中纯化配对螺旋丝(phf)-tau蛋白。回收先前已描述的phf-tau富集的级分8(等效于此参考文献中的蔗糖梯度离心之前的粗phf-tau)和级分11(等效于级分a2，如此参考文献中所述的sds可溶phf)且用于实验3的biacore分析和细胞分析。

2.2elisa筛选

elisa分析包括将可溶性tau于碳酸盐涂布缓冲液(dh2o+0.16％na2co3+0.3％nahco3)中以3μg/ml捕获于384孔maxisorp板(thermoscientific/nunc)上。板用pbs中的1％w/v酪蛋白+1％w/vbsa封闭且接着与每孔10ul纯化的抗体一起孵育。向板中添加hrp缀合的山羊抗小鼠iggfc二抗(stratechscientificltd/jacksonimmunoresearch)，随后利用hrp底物tmb底物(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，获自emdmillipore；10μl/孔)显示结合。使用bioteksynergy2微定量板式读取器，在630nm测量光密度。

2.3biacore筛选

所选单克隆fab片段(mfab)是使用pierceficin裂解试剂盒(目录号44980，thermoscientific)、根据制造商方案，由嵌合migg1抗体制备。

在biacore分析中使用280nm吸光度测定fab储备溶液的浓度。将获自阿尔茨海默氏病患者的不溶性tau蛋白制剂(ad-phf，级分11)、hek源tau亚型-2单体(氨基酸1-441)和大肠杆菌中所表达的亚型-2单体用胺固定至cm5芯片上，且使用biacoret200仪器测量抗taumfab的结合。使用获自gehealthcare的缓冲液hbs-ep进行固定，但其中ad-phf使用10mm乙酸(ph3.0)。hbs-ep+缓冲液补充有300mmnacl和1.25％cm-dextran(sigma)且用作分析缓冲液。虽然使用流动池(fc)1作为参考物，但针对fc2-4获得以下ru值：5ug/ml大肠杆菌tau为44ru，5ug/mlhektau为56ru，且ad-phf物质的1：20稀释溶液为500ru。使用两个60秒10mm甘氨酸(ph1.7)循环进行再生。使用10ul/min流速进行固定和再生，而使用30ul/min流速进行分析物结合。对于ad-phf而言，应用多次人工注射以达到500ru，包括edc/nhs和etoa封端。使用90ul分析物注射180秒或300秒用于解离，每个mfab样品或缓冲液对照物应用五个启动循环和12个循环。各mfab使用600nm溶液的11个1：3稀释液与缓冲液。使用biacore测试法分析ab1。

结果显示于表1，其显示了具有seqidno.:7的大鼠vl和seqidno.:8的大鼠vh的mfabab1与大肠杆菌中表达的单体tau亚型2、与源自哺乳动物细胞hek293细胞的单体tau亚型2，以及与来自阿尔茨海默氏症患者的分离的tauphf原纤维(聚集的tau)的结合。ab1和上述现有技术抗体的结合谱显示于表3。

表1

nb＝无结合

*显示主要结合成分值

实验3-所鉴别的抗体的进一步表征

3.1细胞分析

利用tau转基因小鼠制备粗可溶性和不溶性级分以诱导tau聚集

在这些实验中，使用表达人taup301s(allen等人，2002j.neurosci.22(21)：9340-51)和表达人taup301l(lewis等人，2000natgenet.(4)：402-5.；j等人，2001jbiolchem.276(1)：529-34)的转基因小鼠。

粗可溶性和不溶性级分是由p301s和p301ltau转基因小鼠的脑通过差速离心来制备。简言之，使用手持式均质器pelletpestlemotor(kontes)，在1.5ml微量离心管中，在冰上，将获自p301s(脊髓和脑干)和p301l(中脑和脑干)tau转基因小鼠的脑组织在冰冷tbs(fisherscientific)中均质化。接着，使匀浆(h)在4℃下以4,000g离心10分钟以移除组织残渣。所得上清液(s0)在4℃下以20,000g离心20分钟，以提供对应于粗可溶性级分(s1)的上清液。将剩余沉淀(p1)再悬浮于1ml于tbs中制备的1％十二烷基肌酸钠(sarkosyl)溶液中，在室温下孵育1小时，且接着在4℃下以100,000g离心1小时。舍弃上清液(s2)。沉淀(p2)用5ml冰冷tbs洗涤，且接着再悬浮于tbs中以提供粗不溶性级分(p2’)。

制备表达具有p301s突变的人tau的hek-293-f细胞

使用293fectin(lifetechnologies)，根据制造商说明书，用表达具有p301s突变的人tau亚型2的pcdna3.1(+)载体转染hek-293-f细胞(lifetechnologies)。经转染的细胞的等分试样于液氮中储存。

诱导tau聚集

图3说明用于表征tau治疗抗体的活性的细胞聚集分析的不同步骤。第1天，使表达具有p301s突变的人tau亚型2(p301s-tau)的hek-293-f细胞在37℃解冻且在含有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素(ffbs)的293表达培养基(lifetechnologies)中稀释。使用自动细胞计数器(vi-cellxr,beckmancoulter)对细胞计数，且接着以每孔25,000个活细胞的密度涂铺于聚-d-赖氨酸预涂的96孔板(greinerbio-one)中。使细胞在37℃、5％co2中维持。同日，在4℃下，在温和搅拌下，将获自患有阿尔茨海默氏病(ad-phf，级分8)或进行性核上麻痹(psp-phf，级分8)或额颞叶型痴呆症(ftd-phf，级分8)的患者的经超声处理的人不溶性tau或获自p301s或p301l转基因小鼠大脑的脑级分(作为晶种用于诱导tau聚集)与抗tau抗体一起或不与抗tau抗体一起在ffbs培养基中孵育隔夜。对于ad和psp样品而言，ad-phf(级分8)分别在80ng/μl和60ng/μl使用；获自转基因小鼠p301s和p301l的可溶性脑级分分别在0.1μg/μl和1.2μg/μl使用。第2天，将晶种或晶种/抗体混合物施加至细胞中维持24小时。第3天，培养基用含有抗体的新鲜ffbs培养基置换，且使细胞在培养物中再维持24小时。第4天，使用tau聚集分析试剂盒(cisbio)，基于均质时差式荧光能量转移(htrf)，根据制造商说明书测量tau聚集。利用spectramaxparadigm(moleculardevices)测量荧光。聚集是作为相对于对照(-)的聚集百分比来报告，对照对应于不存在抗体的情况下，外源性原纤维或级分所诱导的最大聚集反应。

测试ab1和现有技术的其他tau结合抗体对所诱导的tau聚集的影响。现有技术抗体为wo2014/028777a2的ipn002、wo2013/096380a2的pt3、wo2010/142423a2的mab2.10.3和wo2014/008404的hj8.5。

此分析的结果概述于表2和图4中。

表2概述具有seqidno：7的大鼠vl和seqidno.：8的大鼠vh的ab1、具有seqidno.：14的轻链和seqidno.：17的重链的tau结合抗体(l14h17)、具有seqidno.：14的轻链和seqidno.：18的重链的tau结合抗体(l14h18)以及针对一系列获自各种脑提取物的tau晶种的竞争抗体的效力(ic50)和最大功效(imax，300nm)。而图4显示具有seqidno.：14的轻链和seqidno.：17的重链的tau结合抗体(l14h17)和具有seqidno.：14的轻链和seqidno.：18的重链的tau结合抗体(l14h18)的功效(在使用获自人ad患者的人tau病理性原纤维的细胞聚集分析中)。

3.2组织学分析

分析具有seqidno：7的大鼠vl和seqidno.：8的大鼠vh的ab1以及现有技术的抗体ipn002、pt3和mab2.10.3，且使用获自患有阿尔茨海默氏病的供者的人海马体的冷冻切片测定最佳浓度，所述供者先前已显示含有病理性tau结构(使用at8免疫染色)(诸如以下文献中所述：braak和braak,1995,neurobiolaging；16(3)：271-8)。除101.4(阴性对照抗体)的外，ab1和所有现有技术抗体展现特异性和浓度依赖性免疫反应性。根据这些资料，选择单一、最佳浓度的抗体且用于筛选一组六个人脑样品。三个样品来源于患有阿尔茨海默氏病的供者或来源于展现高程度tau病理学(使用at8免疫染色所检测的阳性tau病理学)的年迈供者，且三个样品来源于无tau病理学(使用at8免疫染色检测到阴性tau病理学)的供者。

ab1和ipn002显示在tau阳性病理学样品内神经原纤维缠结(神经元内nft)的特异性免疫染色、神经原纤维缠结(神经元外nft)、神经炎斑样结构和神经纤维网丝的的细胞质染色。在分类为tau阴性病理学的样品中它们也显示免疫染色。

实验2和3的结果总结于下表2和3中。

表2

表3

¹代表检测确认的tau病理学样品中的tau。

²代表检测tau阴性病理学样品中的tau。

³代表大肠杆菌中表达的单体tau亚型2和源自哺乳动物细胞hek293细胞的单体tau亚型2的单体tau形式。

⁴代表来自阿尔茨海默氏症患者的分离的tauphf原纤维的聚集的tau形式

nd：未测

(*)100nm时的最大功效

3.3western印迹

使用化学发光读出进行western印迹法：将由ad、psp或对照人制备的匀浆物装载至10％聚丙烯酰胺凝胶上(每个泳道20μg蛋白质)。通过sds-page(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离蛋白质且电转移至pvdf(聚偏二氟乙烯)膜上。膜于含有4％bsa(牛血清白蛋白)的tbst(50mmtris、150mmnacl、0.05％tween20，ph经hcl调节至ph7.6)中封闭。膜在4℃与一级抗体或非免疫igg对照抗体一起孵育隔夜，用tbst冲洗，与二级抗体(小鼠抗生物素)一起孵育1小时，用tbst冲洗，与三级抗体(抗小鼠igg-过氧化酶)一起孵育1小时，用tbst冲洗，且使用ecl(增强式化学发光)膜曝光2至5分钟来显色。

或者，使用荧光读出进行western印迹。将来自tau转基因鼠或ad-phf级分8的匀浆物(h)、可溶性(s1)和不溶性(p2’)级分装载于novex4-12％bis-tris凝胶(lifetechnologies)，然后通过sds-page分离。使用turbo^tmtransfersystem(bio-rad)，将分离的蛋白电转移至聚偏氟乙烯膜上。使用封闭缓冲液(li-cor)封闭膜并在含有0.1％tween-20的相同缓冲液中稀释的不同的一抗在4℃过夜孵育。在含有0.1％tween-20和0.01％sds的封闭缓冲液中稀释irdye二抗(1:5,000；li-cor)并在室温孵育1小时，使用odysseyclx成像系统(li-cor)进行显色。vr4295(ucbbiopharmas.p.r.l)、ipn002,ptr3和mab2.10.3抗体以0.1-1μg/ml使用。抗-taups202/t205(at8；thermoscientific)、抗-taupthr231(at180；thermoscientific)和抗-总tau(ht7；thermoscientific)以1:200稀释来使用。为了控制上样量，针对β-肌动蛋白(1:2,000；sigma)分析印迹。使用imagestudio3.1(li-cor)定量信号强度。

具有seqidno.:7的大鼠vl和seqidno.:8的大鼠vh的ab1和具有seqidno.:14的轻链和seqidno.:17的重链或seqidno.:14的轻链和seqidno.:18的重链的人源化形式结合来自p301s和p301l转基因小鼠和来自人ad、psp和对照患者的样品的病理性tau。所有三种抗体均显示出相似的结合模式(通过wester印迹)并揭示出ad和psp中典型的50至75kda间的条带模式，这对应于来自ad和psp的病理性tau(见图5)。ipn002显示出相似的行为，而ptr3和mab2.10.3抗体结合来自p301s和p301l转基因小鼠的病理性tau，与人ad的结合弱，但显示出不同的模式(通过western印迹)。阴性对照101.4和a33抗体不显示任何显著信号。激动蛋白用作上样对照。

3.4确定ab1的表位

使用抗体的fab片段，通过异核单量子相干核磁共振(hsqcnmr)确定具有seqidno.:7的vl和seqidno.:8的vh的抗体ab1的表位结合。

tau亚型4的骨架分配

nmr样品的体积通常为350μl，其蛋白浓度为270μm²h/¹³c/¹⁵n标记的人tau亚型4，处于5mmshigemi管中。缓冲剂条件为：100mmnacl，25mm磷酸钠ph6.4，10μmaebsf，0.02％nan3。所有的实验在20℃在装配有低温冷却探针的600mhzbrukerdrx或800mhzbrukeravance仪器上记录。使用3d(h)n(ca)nnh实验(weisemannetal.,19933dtriple-resonancenmrtechniquesforthesequentialassignmentofnhand15nresonancesin15n-and13c-labelledproteins.j.biomol.nmr3.doi:10.1007/bf00242479)产生蛋白质中的残基的骨架nmr信号之间的次序连接，hn(i)-n(i)-n(i±1)，以1640，1640和7000hz的谱宽和¹⁵n,¹⁵n和¹h维度中分别为120(f1)、120(f2)和150(f3)ms的获取时间来记录，每次增量扫描8次，1.5s松弛延迟。以13％(40000个超复杂点中的5200个)取样密度应用非均一取样，这产生3.5天的总获取时间。使用hnca(grzesiekandbax,1992improved3dtriple-resonancenmrtechniquesappliedtoa31kdaprotein.j.magn.reson.96,432–440.doi:10.1016/0022-2364(92)90099-s)和hncacb(wittekindandmueller,1993hncacb,ahigh-sensitivity3dnmrexperimenttocorrelateamide-protonandnitrogenresonanceswiththealpha-andbeta-carbonresonancesinproteins.j.magn.reson.ser.b101,201–205.doi:10.1006/jmrb.1993.1033)实验确认次序连接并鉴定残基类型。hnca实验以1640、4830和6600hz的谱宽和¹⁵n,¹³c和¹h维度中分别为24(f1)、6.6(f2)和80(f3)ms的获取时间来记录(每个增量8个扫描，1.5s松弛延迟，19小时的总获取时间)，而hncacb以9800、1640和6600hz的谱宽和¹³c、¹⁵n和¹h维度中分别为6(f1)、24(f2)和80(f3)ms的获取时间来记录(每个增量8个扫描，1.5s松弛延迟，1.5天的总获取时间)。nmr谱使用nmrpipe(delaglioetal.,1995nmrpipe:amultidimensionalspectralprocessingsystembasedonunixpipes.j.biomol.nmr6,277–93)来处理，使用harvard迭代软阈值法(hybertsetal.,2012)进行nus数据的重构。使用(goddardandkneller,,d.g.sparky3.in.,universityofcalifornia,sanfrancisco)进行数据分析，产生胺质子的分配和304残基的氮共振，对应于96％残基(不包括脯氨酸残基和n-末端甘氨酸)。

ab1的结合位点的定位

使用浓度为80至150μm、含有10％摩尔过量的对应ab1fab的²h/¹³c/¹⁵n标记的人tau亚型4进行ab1的结合位点的定位。样品在如上文所述用于tau的骨架分配的相同缓冲液中制备样品。从hnco(grzesiekandbax,1992improved3dtriple-resonancenmrtechniquesappliedtoa31kdaprotein.j.magn.reson.96,432–440.doi:10.1016/0022-2364(92)90099-s)确定¹h、¹⁵n和¹³c化学偏移改变，在tau/fab复合物样品以及游离tau样品上记录光谱(如上文所述)。hnco实验以2190、2210和8800hz的谱宽和¹⁵n、¹³c和¹h维度上分别为25(f1)、29(f2)和80(f3)ms的获取时间来记录(每个增量8个扫描，1.8s松弛延迟)，以25-35％的取样密度进行nus，将总获取时间从60小时减少至15-21小时。使用最小偏移方法分析化学偏移变化(williamsonetal.,1997mappingthebindingsiteformatrixmetalloproteinaseonthen-terminaldomainofthetissueinhibitorofmetalloproteinases-2bynmrchemicalshiftperturbation.biochemistry36,13882–9.doi:10.1021/bi9712091)，基本上如之前所描述(veverkaetal.,2008structuralcharacterizationoftheinteractionofmtorwithphosphatidicacidandanovelclassofinhibitor:compellingevidenceforacentralroleofthefrbdomaininsmallmolecule-mediatedregulationofmtor.oncogene27,585–95.doi:10.1038/sj.onc.1210693)，除了对用于计算组合的化学偏移改变δδ的公示进行以下改变，以包括羰基化学偏移，得到下列公示：

其中δδhn、δδn和δδc分别是¹h、¹⁵n和¹³c化学偏移中的变化。αn和αc分别对应于0.2和0.35的放大因子，用于补偿胺质子的化学偏移范围、氮和羰基化学偏移。

为了鉴定tau上的fab结合位点(表位)，使用组合的最小偏移相对于蛋白质序列的直方图来揭示含有显著扰乱信号的tau区域。如果个别氨基酸的组合的化学偏移改变的尺寸超过阈值(所有氨基酸的组合的化学偏移改变的平均值+该平均值的1个标准偏差)，则选择这些残基进行进一步评估，作为fab结合位点中的可能的接触残基。

显著扰乱的残基鉴定为其最小偏移至少大于平均值+所有计算的偏移的1个标准偏差的那些。应用4个不同的阈值来鉴定fab结合的残基。参与结合位点的残基以下列渐增的严格性评分：其最小偏移大于平均值+所有计算的偏移的1个标准偏差的那些(即>0.009817)；其最小偏移大于平均值+所有计算的偏移的2个标准偏差的那些(即>0.016913)；其最小偏移大于平均值+所有计算的偏移的3个标准偏差的那些(即>0.024009)；其最小偏移大于平均值+所有计算的偏移的4个标准偏差的那些(即>0.031105)。在该分析中，脯氨酸被鉴定，因为它们不具有酰胺质子。

因此以渐增的严格性定义ab1fab的表位：平均值+所有计算偏移的1个标准偏差：a246、a239、s241、t245、s238、s235、k240、q244、s237、v248,l243、m250、r242；平均值+所有计算偏移的1个标准偏差：a246、a239、s241、t245、s238、s235、k240、q244、s237；平均值+所有计算偏移的1个标准偏差：a246、a239、s241、t245、s238、s235、k240、q244；平均值+所有计算偏移的1个标准偏差：a246、a239、s241、t245、s238。

使用ncbireferencesequencenp_005901.2中的氨基酸编号(seqidno.:35)，发现ab1结合至少下列残基(平均值+3sd)a246、a239、s241、t245、s238、s235、k240、q244。抗体可结合所有下列残基(平均值+1sd)a246、a239、s241、t245、s238、s235、k240、q244、s237、v248、l243、m250、r242。

实验4-所鉴别抗体的人源化

具有seqidno.：7的vl和seqidno.：8的vh的抗体ab1通过将来自大鼠抗体v区的cdr移植至人生殖系抗体v区构架上来发生人源化。

为复原抗体活性，来自大鼠v区的许多构架残基也保留在人源化序列中。可使用adair等人(1991)(humanisedantibodies.wo91/09967)概述的方案选择这些残基。大鼠抗体(供体)v区序列与人生殖系(受体)v区序列的比对以及所设计的人源化序列显示于图1和图2中。自供体移植至受体序列的cdr如kabat(kabat等人，1987)所定义，但其中cdr-h1使用组合的chothia/kabat定义(参见adair等人，1991humanisedantibodies.wo91/09967)。

选择人v区igkv2-39与jk2j区(imgt，http：//www.imgt.org/)(seqidno.:31)作为抗体ab1轻链cdr的受体。移植物gvl3_ab1(seqidno.:14)中的轻链构架残基皆来自人生殖系基因。

选择人v区ighv4-59与jh3j区(imgt，http：//www.imgt.org/)(seqidno.:32)作为抗体ab1的重链cdr的受体。移植物gvh17_ab1(seqidno.:17)和gvh18_ab1(seqidno.:18)中的重链构架残基皆来自人生殖系基因，除了残基48(kabat编号)，其中供体残基甲硫氨酸(m48)被保留。残基m48的保留允许实现人源化抗体的完全效力。人构架位置1的谷氨酰胺残基经谷氨酸(e1)置换，以提供均质产物的表达和纯化：将抗体和抗体片段的n端的谷氨酰胺转化成焦谷氨酸已被广泛报导。在移植物gvh17_ab1和gvh18_ab1使seqidno.:37和38的cdrh2发生突变，以修饰潜在去酰胺化位点。

设计编码抗体的许多变体重链和轻链v区序列的基因且通过dna2.0inc的自动化合成方法构建。重链和轻链v区的其他变体是通过寡核苷酸定点诱变修饰vh和vk基因来产生(在一些情况下，包括cdr内的突变以修饰潜在去酰胺化位点)。为了在哺乳动物细胞中瞬时表达，将人源化轻链v区基因克隆入ucb人轻链表达载体pmhck中，所述表达载体含有编码人κ链恒定区的dna(km3同种异型)。将人源化重链v区基因克隆入ucb人γ-4重链表达载体pmhγ4pfl中，所述表达载体含有编码具有铰链稳定化突变s241p的人γ-4重链恒定区的dna(angal等人，molimmunol.1993,30(1)：105-8)。或者，将人源化vh基因克隆入ucb人γ-1重链表达载体pmhγ1fl中，所述表达载体含有编码人γ-1重链恒定区的dna(g1m17，1个同种异型)。为了评估人源化抗体的单价结合动力学，还将人源化vh基因克隆入ucb人fab-his表达载体pmhfab10his中，所述表达载体含有编码人γ-1ch1-铰链结构域的dna，所述结构域具有十个组氨酸残基的c端标记：所述组氨酸标记有助于亲和层析纯化所表达的fab。将所得重链和轻链载体共转染至hek293悬浮细胞中是使用293fectin(12347-019invitrogen)实现，且使人源化重组抗体以人igg4p、igg1或fab-his形式表达。

使变体人源化抗体链和其组合表达且评估其效力(相对于亲本抗体)、其生物物理学特性和用于下游处理的适合性。

为了使哺乳动物细胞稳定表达人源化重组抗体，使人源化轻链v区基因与编码人c-κ恒定区的dna序列(km3同种异型)连接，以产生相邻的轻链基因。使人源化重链基因与编码人γ-4p重链恒定区或人γ-1重链恒定区(g1m17，1个同种异型)的dna连接，以产生相邻的重链基因。将重链和轻链基因克隆入哺乳动物表达载体中。

实验5-热稳定性测定

使用thermofluor测定法测定熔解温度(tm)或解折叠的中点时的温度。在该方法中，使用荧光染料syproorange通过结合疏水性区域(其随着温度升高变得暴露)监控蛋白的解折叠过程。

反应混合物包含5μl30xorange染料(invitrogen)(使用pbs从5000x贮液稀释)和45μl0.12mg/ml的样品(在ph7.4的pbs中)。将10μl混合物一式四份分散于384孔pcr板中并在7900htfastreal-timepcrsystem(appliedbiosystems)中运行。将pcr系统的加热装置设置于20℃至99℃，升高速率为1.1℃/分钟。使用电荷耦合的装置监控孔中的荧光变化。将强度增加值作图，使用斜率的拐点计算tm，如下文所述。

图6和下表3中显示了对于抗体的分析，所述抗体包含seqidno.:14的轻链和seqidno.:12或seqidno.:13的重链可变区，对于igg1同种型：seqidno.:14的轻链与seqidno.:54的重链(l14/h54)或seqidno.:14的轻链与seqidno.:55的重链(l14/h55)；对于igg4同种型：seqidno.:14的轻链与seqidno.:17的重链(l14/h17)或seqidno.:14的轻链与seqidno.:18的重链(l14/h18)。对于两种同种型均观察到2个解折叠结构域。第一个可归因于ch2结构域的tm；对于igg1同种型，发现其比igg4形式更高(更稳定)，这与文献报道(garbere,demarestsj.biochembiophysrescommun.2007apr13；355(3):751-7)是一致的。第二个解折叠结构域可促成fab解折叠结构域和ch3结构域的tm的平均值。

实验6–x-射线晶体学

通过x-射线晶体学研究了具有seqidno.:14的轻链和seqidno.:18的重链的tau结合性抗体(l14h18)与由seqidno.:35的残基234-250组成的肽(肽：n-乙酰基-kspssaksrlqtapvpm-酰胺，如seqidno.:所定义)之间的相互作用。

与l14h18fab复合的tau肽的晶体结构的结晶、结构确定和精化。

结晶

在mrc板中，针对含有30％w/v聚乙二醇4000，0.1mhepes，ph7.5，0.2m无水氯化钙的贮库，通过蒸汽相从坐滴结晶l14h18fab/tau肽234-250复合物1-2周。

所述滴含有11mg/ml的400nll14h18fab蛋白质以及2摩尔过量的tau肽234-250和400nl贮液。

晶体属于p3121空间群，在非对称单元中具有2个拷贝的l14h18fab/tau肽234-250。

x-射线衍射收集

我们通过单个l14h18fab/tau肽234-250晶体收集了x-射线衍射数据。将晶体短暂通过含有30％聚乙二醇4000，0.2m氯化钙，ph7.5的0.1mhepes缓冲液和10％乙二醇的冷冻保护液之后，将晶体悬浮于石环并在液氮下急骤冻结。在英国牛津夏州didcot的钻石同步加速器的i04-1光束线站的pilatis6m收集衍射数据。单色x-射线光束的波长是在角度稳定器轴附近以0.2°振荡步幅进行倒易空间的取样。从同步加速器设备提供的经加工的数据xia文件用于结构确定。

结构确定

使用fab以pdb编码4hix通过分子置换程序移相器(read,rj,actacryst.d57,1373-1382(2001))定位fab的位置。matthews系数指示晶胞中可能为100kda的分子量，溶液发现在非对称单元中的2个拷贝的fab。

模型构建和精化

使用2fo-fc和fo-fc电子密度图，根据l14h18fab的序列置换fab分子中的残基，通过电子密度图对位置进行指导。

第二个拷贝的fab的fab链c和d比第一个拷贝(链h和l)具有更清晰的密度。

在一个拷贝的fab(链c和d)的cdr附近可以看到额外的电子密度。这揭示了具有螺旋结构的肽链，在所述螺旋结构内可以构建肽234-250的序列的一部分。使用精氨酸和赖氨酸残基的清晰密度对齐肽，然后根据已知序列进行构建。更多轮次的模型构建和精化改善了肽区域的密度，显示出与另一个拷贝的fab(链h和l)结合的肽的一些密度。

对于模型构建，使用计算机程序coot(emsleyp.,lohkampb.,scottw.g.,cowtonk.actacrystallographydbiolcrystallography,2010apr；66(pt4):486–501)。使用程序refmac(murshudovg.n.,skubakp.,lebedeva.a.,pannun.s.,steinerr.a.,nichollsr.a.,winnm.d.,longf.,vagina.a.actacrystallogrdbiolcrystallogr2011apr；67(pt4):355-67)进行精化。

l14h18fab/tau肽234-250复合物的模型由seqidno.:35所示的tau肽的残基234-244以及重链的残基2-219和轻链的残基1-219组成。

模型的r-因子是0.234，r-free是0.291(对于36483反射)。rms标准几何偏差对于键长而言是0.0145，对于键角而言是1.93o。

表位

使用通过将l14h18fab片段与肽一起温育而制备的共复合物，通过x-射线晶体学研究了抗体l14h18与tau肽n-乙酰基-kspssaksrlqtapvpm-酰胺(基于人tau同种型2的序列234-250)之间的相互作用。得到的结构揭示了l14h18fab与tau肽之间的主要接触位点，鉴定为主要在抗体的cdr环和对应于tau蛋白的残基235-244的肽残基spssaksrlq处聚簇。根据如seqidno.:35所示的序列编号，与l14h18fab的cdr区域的5.0a内最紧密相互作用的残基是s235,p236,s237,s238,a239,k240,r242,l243,q244和t245。

序列表

<110>ucbbiopharmasprl

<120>tau结合抗体

<130>pf0032-wo

<160>57

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>16

<212>prt

<213>褐家鼠

<400>1

argserserglnserleuglutyrseraspglytyrthrtyrleuglu

151015

<210>2

<211>7

<212>prt

<213>褐家鼠

<400>2

gluvalserasnargpheser

<210>3

<211>9

<212>prt

<213>褐家鼠

<400>3

pheglnalathrhisasnprotyrthr

<210>4

<211>10

<212>prt

<213>褐家鼠

<400>4

glypheserleuthrserasnaspileala

1510

<210>5

<211>16

<212>prt

<213>褐家鼠

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>xaa可以是ser,ala,thr

<400>5

thriletrpthraspglyserthrasntyrasnxaaalavalglnser

151015

<210>6

<211>10

<212>prt

<213>褐家鼠

<400>6

hisargleutyrtyrglyalapheasptyr

1510

<210>7

<211>112

<212>prt

<213>褐家鼠

<400>7

aspilevalmetthrglnthrprovalserleuservalthrleugly

151015

aspglnalaserilesercysargserserglnserleuglutyrser

202530

aspglytyrthrtyrleuglutrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrgluvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheileglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalgluprogluaspleuglyvaltyrtyrcyspheglnala

859095

thrhisasnprotyrthrpheglyalaglythrlysleugluilelys

100105110

<210>8

<211>117

<212>prt

<213>褐家鼠

<400>8

gluvallysleuglugluserglyproglyleumetglnproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrserasn

202530

aspilealatrpvalargglnproleuglylysglyleuvaltrpmet

354045

glythriletrpthraspglyserthrasntyrasnseralavalgln

505560

serargleuserileserargaspthrserlysserglnphepheleu

65707580

lysmetasnserleuglnprogluaspthrglythrtyrtyrcysala

859095

arghisargleutyrtyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

metvalthrvalser

115

<210>9

<211>112

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>9

aspilevalmetthrglnthrproleuserleuservalthrprogly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuglutyrser

202530

aspglytyrthrtyrleuglutrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrgluvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcyspheglnala

859095

thrhisasnprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluilelys

100105110

<210>10

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<220>

<221>misc_feature

<222>(48)..(48)

<223>xaa可以是ileandmet

<220>

<221>misc_feature

<222>(61)..(61)

<223>xaa可以是ser,ala,thr

<400>10

glxvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrserasn

202530

aspilealatrpileargglnproproglylysglyleuglutrpxaa

354045

glythriletrpthraspglyserthrasntyrasnxaaalavalgln

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

arghisargleutyrtyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

metvalthrvalserser

115

<210>11

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>11

gluvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrserasn

202530

aspilealatrpileargglnproproglylysglyleuglutrpmet

354045

glythriletrpthraspglyserthrasntyrasnseralavalgln

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

arghisargleutyrtyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

metvalthrvalserser

115

<210>12

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>12

gluvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrserasn

202530

aspilealatrpileargglnproproglylysglyleuglutrpmet

354045

glythriletrpthraspglyserthrasntyrasnalaalavalgln

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

arghisargleutyrtyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

metvalthrvalserser

115

<210>13

<211>118

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>13

gluvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrserasn

202530

aspilealatrpileargglnproproglylysglyleuglutrpmet

354045

glythriletrpthraspglyserthrasntyrasnthralavalgln

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

arghisargleutyrtyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

metvalthrvalserser

115

<210>14

<211>219

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>14

aspilevalmetthrglnthrproleuserleuservalthrprogly

151015

glnproalaserilesercysargserserglnserleuglutyrser

202530

aspglytyrthrtyrleuglutrptyrleuglnlysproglyglnser

354045

proglnleuleuiletyrgluvalserasnargpheserglyvalpro

505560

aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile

65707580

serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcyspheglnala

859095

thrhisasnprotyrthrpheglyglnglythrlysleugluilelys

100105110

argthrvalalaalaproservalpheilepheproproseraspglu

115120125

glnleulysserglythralaservalvalcysleuleuasnasnphe

130135140

tyrproargglualalysvalglntrplysvalaspasnalaleugln

145150155160

serglyasnserglngluservalthrgluglnaspserlysaspser

165170175

thrtyrserleuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglu

180185190

lyshislysvaltyralacysgluvalthrhisglnglyleuserser

195200205

provalthrlysserpheasnargglyglucys

210215

<210>15

<211>445

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<220>

<221>misc_feature

<222>(48)..(48)

<223>xaa可以是ileormet

<220>

<221>misc_feature

<222>(61)..(61)

<223>xaa可以是seralaorthr

<400>15

glxvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrserasn

202530

aspilealatrpileargglnproproglylysglyleuglutrpxaa

354045

glythriletrpthraspglyserthrasntyrasnxaaalavalgln

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

arghisargleutyrtyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

metvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaprocysserargserthrsergluserthralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproser

195200205

asnthrlysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocys

210215220

proprocysproalaproglupheleuglyglyproservalpheleu

225230235240

pheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrproglu

245250255

valthrcysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalgln

260265270

pheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlys

275280285

proargglugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleu

290295300

thrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslys

305310315320

valserasnlysglyleuproserserileglulysthrileserlys

325330335

alalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproser

340345350

glngluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallys

355360365

glyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglygln

370375380

progluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly

385390395400

serphepheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpgln

405410415

gluglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasn

420425430

histyrthrglnlysserleuserleuserleuglylys

435440445

<210>16

<211>445

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>16

gluvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrserasn

202530

aspilealatrpileargglnproproglylysglyleuglutrpmet

354045

glythriletrpthraspglyserthrasntyrasnseralavalgln

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

arghisargleutyrtyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

metvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaprocysserargserthrsergluserthralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproser

195200205

asnthrlysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocys

210215220

proprocysproalaproglupheleuglyglyproservalpheleu

225230235240

pheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrproglu

245250255

valthrcysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalgln

260265270

pheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlys

275280285

proargglugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleu

290295300

thrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslys

305310315320

valserasnlysglyleuproserserileglulysthrileserlys

325330335

alalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproser

340345350

glngluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallys

355360365

glyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglygln

370375380

progluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly

385390395400

serphepheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpgln

405410415

gluglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasn

420425430

histyrthrglnlysserleuserleuserleuglylys

435440445

<210>17

<211>445

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>17

gluvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrserasn

202530

aspilealatrpileargglnproproglylysglyleuglutrpmet

354045

glythriletrpthraspglyserthrasntyrasnalaalavalgln

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

arghisargleutyrtyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

metvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaprocysserargserthrsergluserthralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproser

195200205

asnthrlysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocys

210215220

proprocysproalaproglupheleuglyglyproservalpheleu

225230235240

pheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrproglu

245250255

valthrcysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalgln

260265270

pheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlys

275280285

proargglugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleu

290295300

thrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslys

305310315320

valserasnlysglyleuproserserileglulysthrileserlys

325330335

alalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproser

340345350

glngluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallys

355360365

glyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglygln

370375380

progluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly

385390395400

serphepheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpgln

405410415

gluglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasn

420425430

histyrthrglnlysserleuserleuserleuglylys

435440445

<210>18

<211>445

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>18

gluvalglnleuglngluserglyproglyleuvallysproserglu

151015

thrleuserleuthrcysthrvalserglypheserleuthrserasn

202530

aspilealatrpileargglnproproglylysglyleuglutrpmet

354045

glythriletrpthraspglyserthrasntyrasnthralavalgln

505560

serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu

65707580

lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala

859095

arghisargleutyrtyrglyalapheasptyrtrpglyglnglythr

100105110

metvalthrvalserseralaserthrlysglyproservalphepro

115120125

leualaprocysserargserthrsergluserthralaalaleugly

130135140

cysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasn

145150155160

serglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleugln

165170175

serserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserser

180185190

serleuglythrlysthrtyrthrcysasnvalasphislysproser

195200205

asnthrlysvalasplysargvalgluserlystyrglyproprocys

210215220

proprocysproalaproglupheleuglyglyproservalpheleu

225230235240

pheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrproglu

245250255

valthrcysvalvalvalaspvalserglngluaspprogluvalgln

260265270

pheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlys

275280285

proargglugluglnpheasnserthrtyrargvalvalservalleu

290295300

thrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslys

305310315320

valserasnlysglyleuproserserileglulysthrileserlys

325330335

alalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproser

340345350

glngluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallys

355360365

glyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglygln

370375380

progluasnasntyrlysthrthrproprovalleuaspseraspgly

385390395400

serphepheleutyrserargleuthrvalasplysserargtrpgln

405410415

gluglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasn

420425430

histyrthrglnlysserleuserleuserleuglylys

435440445

<210>19

<211>336

<212>dna

<213>褐家鼠

<400>19

gatattgtgatgacccagactccagtttccctgtctgtcacacttggagatcaagcttct60

atatcttgcaggtctagtcagagcctggaatatagtgatggctacacttatttggaatgg120

tacctacagaagccaggccagtctcctcagctcctcatctatgaagtttccaaccgattt180

tctggggtcccagacaggttcattggcagtgggtcagggacagatttcaccctcaagatc240

agcagagtagagcctgaggacttgggagtttattactgcttccaagctacacataatccg300

tacacgtttggagctgggaccaagctggaaataaaa336

<210>20

<211>354

<212>dna

<213>褐家鼠

<400>20

gaggtgaagctggaggagtctggacctggcttgatgcagccctcagagaccctgtccctc60

acctgcactgtctctggcttctcactaaccagcaatgatatagcctgggttcgacaacct120

ctaggaaagggtttggtgtggatgggaacaatatggactgatggaagtacaaattataat180

tcagctgtccaatcccgactgagcatcagcagggacacctccaagagccaatttttctta240

aaaatgaacagtctgcaacctgaagacacaggcacttactactgtgccagacatcgccta300

tactacggggcctttgattactggggccaaggaaccatggtcaccgtctcgagt354

<210>21

<211>336

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>21

gatatcgtgatgactcagaccccactctcactgtccgtcaccccgggacagcccgcgtca60

atctcgtgtaggagctcccaatccctcgaatactcggacggctatacttacctggagtgg120

tacttgcagaagcccggacagagcccgcagcttctgatctacgaagtgtccaacagattc180

tccggcgtgcctgaccgcttttcggggtcgggctccggtactgatttcaccctgaaaatc240

tcccgggtggaagccgaggacgtgggagtctactactgcttccaagccacccacaaccct300

tacaccttcggacaggggaccaagctggagatcaag336

<210>22

<211>354

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>22

gaggtgcagctgcaggaatccggtcccggcctcgtgaagccttcagaaaccctgtcgctc60

acatgcactgtgtccgggttctccctgacctctaacgacatcgcctggattcggcagccg120

ccaggaaagggactggagtggatgggcaccatttggaccgacgggtcaaccaactacaat180

gccgcggtgcaatccagagtgaccatcagcgtggacacgtccaagaaccagttctcgctg240

aaattgagctccgtgactgccgctgatactgccgtgtattactgtgcccggcaccgcctt300

tactacggcgcatttgactactggggacagggaaccatggtcactgtctcgagt354

<210>23

<211>354

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>23

gaggtgcaactgcaggaatccggtcccggcctcgtgaagccttcagaaaccctgtcgctc60

acatgcactgtgtccgggttctccctgacctctaacgacatcgcctggattcggcagccg120

ccaggaaagggactggagtggatgggcaccatttggaccgacgggtcaaccaactacaat180

accgcggtgcaatccagagtgaccatcagcgtggacacgtccaagaaccagttctcgctg240

aaattgagctccgtgactgccgctgatactgccgtgtattactgtgcccggcaccgcctt300

tactacggcgcatttgactactggggacagggaaccatggtcactgtctcgagt354

<210>24

<211>657

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>24

gatatcgtgatgactcagaccccactctcactgtccgtcaccccgggacagcccgcgtca60

atctcgtgtaggagctcccaatccctcgaatactcggacggctatacttacctggagtgg120

tacttgcagaagcccggacagagcccgcagcttctgatctacgaagtgtccaacagattc180

tccggcgtgcctgaccgcttttcggggtcgggctccggtactgatttcaccctgaaaatc240

tcccgggtggaagccgaggacgtgggagtctactactgcttccaagccacccacaaccct300

tacaccttcggacaggggaccaagctggagatcaagcggaccgtggccgctccctccgtg360

ttcatcttcccaccctccgacgagcagcttaagtccggcaccgcctccgtcgtgtgcctg420

ctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcag480

tccggcaactcccaggaatccgtcaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctg540

tcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaa600

gtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagtccttcaaccggggcgagtgc657

<210>25

<211>1335

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>25

gaggtgcagctgcaggaatccggtcccggcctcgtgaagccttcagaaaccctgtcgctc60

acatgcactgtgtccgggttctccctgacctctaacgacatcgcctggattcggcagccg120

ccaggaaagggactggagtggatgggcaccatttggaccgacgggtcaaccaactacaat180

gccgcggtgcaatccagagtgaccatcagcgtggacacgtccaagaaccagttctcgctg240

aaattgagctccgtgactgccgctgatactgccgtgtattactgtgcccggcaccgcctt300

tactacggcgcatttgactactggggacagggaaccatggtcactgtctcgagtgcctcc360

accaagggcccctccgtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtctacc420

gccgctctgggctgcctggtcaaggactacttccccgagcccgtgacagtgtcctggaac480

tctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctg540

tactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccctcctccagcctgggcaccaagacctacacc600

tgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtac660

ggccctccctgccccccctgccctgcccctgaatttctgggcggaccttccgtgttcctg720

ttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtg780

gtggtggacgtgtcccaggaagatcccgaggtccagttcaattggtacgtggacggcgtg840

gaagtgcacaatgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactccacctaccgggtg900

gtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaag960

gtgtccaacaagggcctgccctccagcatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccag1020

ccccgcgagccccaggtgtacaccctgccccctagccaggaagagatgaccaagaaccag1080

gtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccctccgacattgccgtggaatgggag1140

tccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggc1200

tccttcttcctgtactctcggctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaacgtc1260

ttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtcc1320

ctgagcctgggcaag1335

<210>26

<211>1335

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人源化的

<400>26