本发明涉及分析单分子的方法，特别是用于单个核酸分子的测序。
由约3×109个碱基组成的人类基因组或其他生物体的基因组的测序以及个体序列变体的确定和比较需要提供首先是快速的其次可以常规且成本有效地使用的测序方法。为了加速熟知的测序方法已经做了大量努力，例如根据Sanger等人的酶促链终止法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)5463)，特别是通过自动化(Adams等人，Automated DNA Sequencing and Analysis(1994)，New York，Academic Press)。
成本有效测序的高需求推动了高通量测序技术的发展，其并行化测序过程，从而同时产生多个序列。这些测序技术的实例是大规模并行标记测序(Lynx Therapeutics)，polony测序(Life Technologies)，454焦磷酸测序(Roche Diagnostics)，Illumina测序(Solexa Inc.)，连接测序(Life Technologies)，离子激流半导体测序(Life Technologies)或DNA纳米测序(Complete Genomics)。这些技术允许快速分析核酸群体中的共有序列。然而，存在于待分析的核酸群体中的少数序列中(例如在少数细胞基因组中)的突变，由于它们被群体中存在的大多数其他序列遮蔽，所以不能被检测到。
另一种方法是单分子测序(Dorre等人，Bioimaging 5(1997)，139-152)，其中核酸的测序通过荧光标记的单链DNA分子的渐进性酶降解和通过检测微结构通道中的顺序释放的单体分子来进行。这个过程的优点是只有一个分子的靶核酸足以进行序列测定。
PCT/EP01/07462公开了一种多重测序方法，其包括以固定形式提供在支持物上的携带多个荧光标记基团的核酸分子，并基于核酸分子和/或裂解的核苷酸结构单元的荧光的在核苷酸结构单元被切除时引起的时间依赖性变化来同时确定所述多个核酸分子的碱基序列。根据WO 2003/052137，通过将光照射到支持物中并且通过在固定的核酸分子的区域中的支持物表面上的内反射产生瞬逝激发场来确定序列。
WO 2006/013110描述了一种多重测序方法，其包括以固定形式提供核酸降解和/或核酸合成酶分子，使固定化酶与游离核酸分子接触，并基于核酸结构单元被掺入核酸分子中和/或从核酸分子中切除时所引起的时间依赖性荧光变化来同时确定多个核酸分子的碱基序列。
WO2013/131888公开了核酸分子(特别是单分子)的并行高通量测序的方法，其涉及使用环状核酸模板分子。
还参考论文\"Brownian Motion of Single Molecule in Electric Field Electrophoresis\"2001,22,3813-3818。
最近，已经开发了用于测定单个DNA链的序列的单分子测序技术，例如，heliscope单分子测序(Helicos Biosciences)或单分子实时测序(Pacific Bioscience)。
目前的商业单分子DNA测序技术进行DNA测序的方法是通过对相同DNA分子的数次读取的重复分析的所谓共有确定(consensus determination)DNA序列。因此，通过分析几个相似的被分析的DNA片段并通过使用复杂的统计算法来估计正确的DNA序列，实现对DNA片段序列的准确(优选99.9％或更好)的确定。其他单分子DNA测序技术所使用的算法假定存在仅一个序列。因此，如果与样本中的其他DNA分子相比，样本中少数部分的序列存在差异，那么序列中的这样的差异将不被考虑，但将被算法视为“噪音”或“误差”。如果样品含有几乎相同浓度的DNA序列的混合物，分析将不能得出“共有”序列，结果将是无效的(失效的)。复杂算法的目的是尽可能补偿其他单分子DNA测序技术的约85-90％的低原始准确度。
为了克服这些问题。EP 14 150 807.7公开了用于分析单分子的方法和设备，特别是用于分析多个单分子，更特别地用于对单个核酸分子进行测序，其包括以下特征：
-具有至少一个样品点的支持物，所述样品点用于将待分析的单分子定位在支持物上，
-在支持物上的至少一个单分子的位置处的光源，特别是提供至少一个照射体积元件(volume element)的多点激光器，例如共焦体积元件，和
-检测器，特别是多像素检测器，其允许来自支持物上单独的单分子的单光子检测。
本发明的问题是提供用于分析单分子的支持物和设备，特别是用于分析多个单分子，更特别地用于对单个核酸分子进行测序，其允许支持物的样品点上待分析的单分子的有效浓缩。发明人发现，通过应用跨越单分子检测的反应空间的电场，待分析的分子(例如，单独的单个核酸分子)可以在样品点处被浓缩102或更高、103或更高或者104或更高的因子。
本发明涉及分析单分子的方法，其包括以下步骤：
(a)提供支持物，其上包含至少一个单独的样品点，其中所述样品点至少部分由导电材料制成，
(b)使所述支持物与包含至少一个待分析的单分子的液体介质接触，由此在所述样品点上形成液体介质的反应空间，
(c)在所述反应空间上施加电场，由此实现在所述样品点处所述至少一个待分析的单分子的浓缩，以及
(d)单独分析所述至少一个单分子。
本发明具体涉及分析多个单分子的方法，包括以下步骤：
(a)提供支持物，其上包括多个单独的样品点，其中所述样品点至少部分由导电材料制成，
(b)使所述支持物与包含多个待分析的单分子的液体介质接触，由此在所述样品点上形成至少一个反应空间，
(c)在所述反应空间上施加电场，由此实现所述样品点处所述单分子的浓缩，和
(d)单独分析所述单分子。
本发明的方法涉及单分子的分析，特别涉及多个单分子的并行分析。它适合于检测相互作用，例如单分子和/或反应之间的结合，例如，单分子的伸长或降解。特别地，本发明的方法涉及单个核酸分子的测序。
在本发明中，提供了支持物，其包含至少一个样品点，特别是用于在其上定位待分析的单分子的多个单独的样品点。这些样品点的直径可以在约1-20nm的范围内，例如约1-15nm，约2-15nm或约4-12nm。为了避免单独的样品点之间的串扰，支持物上单独的样品点中心之间的距离(即样品点距离)优选为样品点直径大小的至少约2倍，更优选至少约3倍，至少约5倍，至少约10倍。上限可以高达约5000nm，例如高达约1000nm，高达约500nm，高达样品点直径的大小的约100，或高达约50倍。支持物上的单独的样品点的中心之间的距离可以具有从下限和上限的任何值中选择的距离范围，例如，样品点直径大小的约2倍至约5000倍，或约2倍至约500倍，例如约2倍至约100倍，约5至500倍。
待分析的单分子以游离形式存在，即溶解或悬浮在液体介质中，在样品点周围形成的反应空间内。根据本发明，在反应空间上施加电场，由此在样品点处(即在其周围或区域内)实现单分子，特别是单个核酸分子的浓缩。由此，样品点处待分析的单分子的量显著增加。为此目的，样品点至少部分由导电材料制成。例如，样品点可以具有导电表面。样品点的表面可以是诸如Au，Ag，Cr，Ni或Al的金属，特别是诸如Au的贵金属。在特别优选的实施方案中，样品点可以包括多个不同的层，例如，金属层，例如第一Cr层和第二(顶部)Au层。
支持物可以是任何平面或结构化的支持物。优选地，支持物是平面的。合适的支持物材料的实例是玻璃，石英，塑料，金属，半金属例如硅，例如金属氧化物例如二氧化硅，或例如包含所述材料的复合材料。支持物可以至少在样品点的区域中具有足够的光学透明度和合适的表面特性，用于用荧光激发光照射和/或通过支持物的荧光发射光的反向散射或用于基于瞬逝(evanescence)的荧光检测。
在一些实施方案中，支持物可以包括导电材料，例如，金属，金属氧化物和/或聚合物。例如，支持物可以在单独的样品点之间的区域中具有至少部分导电的表面。例如，该支持物可以包括具有导电表面层，其厚度为例如10-1000nm，20-500nm或50-200nm，例如约100nm。表面层可以是合适的金属氧化物例如氧化铟锡或导电聚合物。
在特别优选的实施方案中，支持物由玻璃或石英制成并具有导电的光学透明表面。在特别优选的实施方案中，支持物来自厚度为例如约0.175nm的玻璃，例如超纯石英，和来自金属氧化物诸如氧化铟锡和/或导电有机聚合物的厚度为约100nm的导电透明表面。
本发明的方法可以在横跨支持物或其一部分形成的单个反应空间中进行，样品点位于该支持物或其一部分上。或者，该方法也可以在支持物上的多个分开的反应空间中进行，其中分开的反应空间至少在该方法的某些步骤期间不相互连通。多个分开的反应空间例如由支持物上的纳米孔和/或微孔和/或纳米点或微斑点形成。
本发明的方法涉及在整个反应空间中施加电场。如果在单独的点之间存在导电支持物表面，则单独的导电的样品点例如Au点可以具有相同的电位。电场可以施加在导电样品点和另一个电极(例如，光学测量装置的导电结构，例如，测量物镜(objective)的金属外壳)之间。或者，如果使用结构化支持物，则对电极可以由导电纳米孔或微孔壁表示。导电的纳米孔或微孔可以通过在纳米或混合井的内壁上沉积一层导电材料(例如，如上所述的)来产生。
所施加的电场可以具有约1-5000V/cm，特别是约10-2000V/cm，更特别是约20-200V/cm的场强。电场优选地以直流电压施加，由此带电分子可以通过场迁移到具有相反电荷的电极的方向上。在一个优选实施方案中，电场具有约100V/cm的强度，其可以例如通过在光学测量物镜的尖端和支持物平面之间以1mm的距离施加10V的电场来实现。选择场强是为了提供在支持物表面，特别是在发生单分子的光学分析的样品点周围的带电单分子例如带负电荷的核酸分子的浓缩。或者，可以使用包含其中具有样品点的多个微孔或纳米孔和在微孔壁中的对电极的支持物。
根据本发明，单独分析存在于样品点上的至少一个单分子。该光学分析可以包括以下步骤：
-利用光源单独地照射在单独的样品点处的单分子，其中所述光源提供在样品点处多个单独的照射体积元件，
-用光检测器单独地检测从所述单分子发射的光，其中所述光检测器包括多个检测像素，其中检测器上的所述检测像素优选地具有在约0.5μm至50μm范围内的直径，并且所述检测像素之间的距离优选为检测像素的直径的至少约2倍，更优选约3-10倍，和
-将来自单独的检测像素的检测光与与位于单独的点上的单分子相关的事件相关联。
优选地，支持物上的检测像素的光学投影具有在约100nm-5μm范围内的直径，并且其中单独的样品点与支持物上的单个检测像素的投影对齐，特别是与支持物上单个检测像素的投影的中心对齐。
为了照射支持物上单独的样品点处的单分子，可以使用适合于多点照射的光源，例如，激光光源。优选地，光源是多点光源，例如多点激光光源。光源能够在单独的样品点处提供多个单独的照射体积元件。体积元件具有10-10至10-24l，例如10-12至10-21l的尺寸。优选地，体积元件可以是由全内反射(TIR)产生的瞬逝场或共焦体积元件。优选地，体积元件是由全内反射(TIR)产生的瞬逝场。在另一个实施方案中，样品点的矩阵可以被来自光源(例如，激光光源)的单个光束照射。
本发明的方法包括检测位于支持物上的单分子发射的光。优选地，检测的光从光学可检测的标记基团，特别是从荧光标记基团发射。随后用光检测器检测所发射的光并与位于支持物上的单个点处的单分子相关的事件相关联。
发射光的检测可以包括检测激发态的寿命，和/或检测旋转移动性和/或检测横向移动性和/或检测特定波长。此外，可以使用基于Raman、Raman/Antistokes和/或表面增强Raman(SER)的检测方法来鉴定单分子。优选地，发射光的检测包括任选地与特定波长的检测相组合的寿命检测。例如，已经表明，如果不同成分的平均寿命相差大约1纳秒，则可以以0.998的精度来区分这些不同成分。
待检测的事件可能由例如标记基团与待分析的单分子的缔合和/或解离，或通过引起光发射的时间依赖性变化的任何其它事件，例如，时间依赖性荧光变化引起。
照射体积元件例如共焦体积元件激发体积中存在的标记基团，使得它们发光，例如荧光，其通过检测器测量。照射体积元件的图案可以由经由衍射光学元件产生的激光点矩阵(例如，如WO 2002/097406中所述，其内容通过引用掺入本文)或量子阱激光器产生。
在优选的实施方案中，光照射到支持物中，由此通过在待分析的分子的区域中的支持物表面处的内反射产生瞬逝激发场。在待分析的分子的区域中的支持物表面的一个或多个位置处的内反射产生瞬逝激发场，其引起存在于各个点中的标记基团的激发。在特别优选的实施方案中，检测包括全内反射(TIR)，特别是全内反射荧光(TIRF)检测。
衍射光学元件(DOE)可用于在支持物上提供多点照射。DOE也可用于涉及内反射的检测方法，例如，通过在TIR(F)设置中将衍射光学元件引入到激发光束中。
根据本发明，利用光检测器检测从单分子发射的光，所述光检测器包括与支持物上的样品点阵列对齐的多个检测像素。优选地，检测器是多点单光子雪崩检测器(SPAD)。它组合广泛的光谱范围内例如350-900nm的高灵敏度，具有例如≤1ns的高时间分辨率，当荧光激发态的寿命用于分子分析时其是有利的。
为了精确鉴定标记基团，例如荧光标记基团，激发态的寿命优选与波长特异性发射一起测定。寿命优选在1-6ns的范围内。从选自寿命、每分子特征计数率(由波长依赖性激光强度确定)、激发系数(例如约105/M cm)、量子产率(例如0.3-0.9)和/或波长依赖性检测器灵敏度的参数的组合，标记基团的鉴定可以在不使用特定的波长依赖性发射滤光片的情况下进行。
此外，为了消除或减少由Raleigh和Raman散射引起的杂散光以及形成三重态和光子漂白，优选对待分析的单分子进行脉冲激发。优选的脉冲激发时间小于1ns，例如，约50-500ps。
检测器上的单独的检测像素的直径通常为约0.5μm-50μm。各个检测像素被分开一定距离(即像素间距长度)，其长度至少是像素直径，优选检测像素的直径的至少约2倍，更优选至少约3-10倍。优选地，检测器上的像素之间的距离是大约2-200μm，更优选大约4-150μm。
如上所述，检测像素的光学投影形成在支持物上。支持物上的光学投影是例如比检测器上的检测像素的尺寸小约10-200倍或者约40-120倍。支持物上的光学投影应对应于支持物上单独的样品点的中心之间的距离。因此，光学投影通常具有约20nm至约1μm的直径，优选约100-600nm。
支持物上的各个检测像素投影的中心之间的距离(即投影间距长度)优选为支持物上各个检测像素投影的中心的尺寸的至少约2倍，更优选为至少约3倍，至少约5倍，至少约10倍。上限可以高达约5000nm，例如高达约1000nm，高达约500nm，高达点直径的尺寸的约100，或高达约50倍。支持物上的各个检测像素投影的中心之间的距离可以具有从下限和上限的任何值中选择的距离范围，例如，支持物上各个检测像素投影的中心的距离的约2倍至约5000倍，或约2倍至约500倍，例如约2倍至约100倍，约5至500倍。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法用于单核酸分子的测序。在该实施方案中，该方法优选地包括以下步骤：
-在支持物的单独的样品点处提供(i)单个核酸分子，(ii)核酸合成酶分子和/或核酸降解酶分子，和(iii)游离形式和/或掺入核酸分子中的荧光标记核苷酸结构单元，
-进行酶促反应，其中核苷酸结构单元结合到所述单个核酸分子中和/或从所述单个核酸分子上切除，和
-基于在核苷酸结构单元被掺入所述单个核酸分子和/或从所述单个核酸分子中切除时引起的时间依赖性荧光变化来单独确定核酸分子的碱基序列。
将核苷酸结构单元掺入核酸分子和从核酸分子切除核苷酸结构单元可引起标记基团的荧光发射的时间依赖性变化。
在涉及通过降解进行测序的实施方案中，核酸降解酶分子与具有掺入的标记基团特别是荧光标记基团的待测序的核酸分子接触。
在涉及通过延伸进行测序的实施方案中，使核酸合成酶分子与具有退火至其上的引物的待测序核酸分子和具有标记基团，特别是荧光标记基团的游离核苷酸结构单元接触。
在涉及延伸测序的一个实施方案中，使核酸合成酶分子与具有退火至其上的引物的待测序核酸分子和具有标记基团，特别是荧光标记基团的游离核苷酸结构单元接触。通过延伸进行测序还可以包括核酸扩增，即从单个模板合成多个核酸分子。
在一个实施方案中，核酸合成酶分子和/或核酸降解酶分子可被固定在例如支持物上或位于支持物上的纳米颗粒上。待测序的核酸分子以游离形式存在，因此可通过如上所述施加电场而在样品点处浓缩。
在一个实施方案中，本申请涉及对单个核酸分子进行测序的方法，包括以下步骤：
(a)提供至少一个固定形式的核酸合成酶分子，游离形式的环状或线性核酸模板，与所述模板退火或能够与所述核酸模板退火的引物，以及荧光标记的核苷酸结构单元，
(b)在通过所述固定化的核酸合成酶分子催化的引物延伸中产生掺入了所述核苷酸结构单元的与核酸模板分子的序列互补的核酸分子，
(c)任选地使所述生成的核酸分子与核酸降解酶分子接触，并在由所述核酸降解酶分子催化的核酸酶消化中从所述生成的核酸分子切除单独的核苷酸结构单元，以及
(d)基于在核苷酸结构单元在引物延伸期间掺入和/或在核酸酶消化期间切除时引起的时间依赖性荧光变化来确定所述核酸模板分子的碱基序列。
在另一个实施方案中，本申请涉及一种方法，包括以下步骤：
(a)提供至少一个固定化形式的核酸降解酶分子和游离形式的包含荧光标记的核苷酸结构单元的核酸分子，
(b)使所述核酸降解酶分子与所述核酸分子接触，并且在由所述核酸降解酶分子催化的核酸酶消化中从所述核酸分子切除单独的核苷酸结构单元，以及
(c)基于在核酸酶消化过程中核苷酸结构单元被切除时引起的时间依赖性荧光变化来确定所述核酸分子的碱基序列。
本发明的方法是基于支持物的多重测序方法，其能够对多个单独的核酸分子进行测序。这通过提供包含待测序的核酸分子和核酸降解和/或核酸合成酶的反应空间用于并行测定多个核酸合成和/或降解反应中的时间依赖性荧光变化来实现。该方法优选以并行高通量单分子分析的形式进行。
在优选的实施方式中，以固定化形式提供核酸合成酶分子。核酸降解酶分子也可以以固定形式或游离形式存在。在其他实施方案中，可以使用核酸合成酶分子和核酸降解酶分子的杂交体和/或缀合物，例如由双功能接头分子连接的遗传融合体和/或缀合物。
酶分子可以通过共价或非共价相互作用来固定。例如，特定结合对的配偶体(例如生物素/链霉亲和素或抗生物素蛋白，半抗原/抗半抗原抗体，糖/凝集素等)之间的高亲和力相互作用可介导多肽或核酸的固定。因此有可能将生物素化的酶分子偶联到链霉亲和素包被的表面上。或者，酶分子也可以通过吸附固定化。因此，通过引入链烷硫醇基团而改性的酶分子可以结合到金属支持物上，例如由黄金制成的支持物。另一种选择是共价固定化，其中可能通过二氧化硅表面上的反应性硅烷基团介导酶或核酸分子结合。
根据本发明，分析至少一个单分子。优选分析多个单分子。这些分子位于支持物上的样品点。它们与含有游离反应配偶体的样品液体接触。从而定义一个或多个反应空间。优选至少100个，特别优选至少1000个，特别优选至少10000个和多达106个以上的分子可以在单个支持物例如单个平面支持物上分析。
可以将待固定在样品点上的分子，例如酶分子施加到支持物表面上的特定点上，例如通过将生物素化分子的稀释溶液与支持物接触，仅将支持物的特定区域用链霉亲和素包被。在固定核酸降解酶分子的实施方案中，它们可以与核酸合成酶分子共固定，即两种类型的酶分子结合在支持物表面的相同点中。
待测序的核酸分子可以选自例如DNA分子例如基因组DNA片段，cDNA分子，质粒等，或选自RNA分子例如mRNA分子。核酸分子可以源自基因组或表达文库，由细胞或生物体产生，例如，真核或原核细胞或生物体。本发明的方法允许多个相同、相等或不同的核酸模板分子例如至少10，100，1000或10,000和至多100,000，106或107或甚至更多相同、相等或不同的核酸分子的并行测序。
优选地，待测序的核酸分子是线性或环状的例如以共价键连接的环状的单链核酸分子。为了获得环状核酸模板，线性核酸分子可以在样品制备过程中经历环化过程和任选的链分离过程。环化可根据已知的方案通过连接实现，例如，使用DNA或RNA连接酶。在一些实施方案中，衔接子和/或标识符分子，即已知序列的核酸分子可以偶联至核酸分子。
核酸分子的长度优选为20至5000000个核苷酸，特别优选50至1000000或100至100000个核苷酸。该方法特别适用于测序具有超过150个核苷酸，超过500个核苷酸，超过1000个，超过10000个，超过500000个核苷酸的核酸分子。序列测定可以包括核酸延伸和/或核酸降解。测序过程包括一个或多个测序循环。
核酸合成酶分子能够延伸与核酸模板分子退火的引物。优选地，引物延伸通过在生长的核酸链的3'末端逐渐掺入单独的核苷酸结构单元来进行，其中产生与环形核酸模板的序列互补的核酸分子。核酸合成酶选自能进行模板特异性核酸聚合的聚合酶，优选选自DNA聚合酶和RNA聚合酶，例如天然或修饰的聚合酶，包括热稳定的DNA聚合酶。
合适的DNA聚合酶的具体实例包括Taq聚合酶，核酸外切酶缺陷型Taq聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶I，Klenow片段，逆转录酶，Φ29相关聚合酶(包括野生型Φ29聚合酶)和这些聚合酶的衍生物，如外切核酸酶缺陷形式，T7DNA聚合酶，T5DNA聚合酶，RB69聚合酶等。
核酸降解酶分子能够从核酸分子上逐渐切除单独的核苷酸结构单元。优选使用以3'→5'方向或5'→3'方向降解的外切核酸酶，更优选单链外切核酸酶。特别优选使用的外切核酸酶是3'→5'外切核酸酶如大肠杆菌外切核酸酶I和大肠杆菌外切核酸酶III，和5'→3'外切核酸酶如T7外切核酸酶，大肠杆菌外切核酸酶II和大肠杆菌外切核酸酶VIII。此外，例如可以使用各种聚合酶的外切核酸酶活性，例如Klenow片段，Taq聚合酶或T4聚合酶。
使核酸合成酶分子与线性或环状核酸模板分子(例如，单链DNA或RNA分子)以及与核酸模板分子退火或能够与其退火的引物分子接触。引物分子优选为具有游离的3'末端的单链核酸或核酸类似物分子，其可以通过由固定的核酸合成酶分子催化的酶促反应而延伸。选择引物分子的长度以允许在反应条件下对模板进行有效退火。通常，引物分子的长度是至少8个，至少10个，至少12个或至少15个核苷酸，多达20，25，50或100个核苷酸，或甚至更高。在一些实施方案中，引物抵抗核酸降解酶分子的消化，例如，通过掺入对降解稳定的核苷酸类似物结构单元和/或核苷酸结构单元之间的键。在其他实施方案中，引物对核酸降解酶分子的消化敏感。
选择引物的序列是因为它在反应条件下与模板分子有效地退火。例如，引物可以是能够与未知核酸序列统计学退火的通用简并引物。在其他实施方案中，引物可以能够与核酸模板分子的已知序列部分进行退火。在该实施方案中，可以将已知的衔接子和/或标识符序列整合到核酸模板分子中。引物可以是未标记的或包含荧光标记基团。
此外，需要携带至少一个荧光标记基团的核苷酸结构单元的存在。优选地，每个不同的核苷酸结构单元(A，G，C，T/U)含有不同的荧光标记基团。
荧光标记基团可以选自用于标记生物聚合物特别是核酸的已知荧光标记基团，例如荧光素，若丹明，恶嗪，例如Evoblue或Gnothis Blue，藻红蛋白，Gy3，Cy5，IR染料或其衍生物等等。
核苷酸结构单元可以携带(i)当在由核酸合成酶分子催化的引物延伸期间结构单元掺入到核酸分子中时保留在结构单元上的荧光标记基团，和/或(ii)当在由核酸合成酶分子催化的引物延伸期间将结构单元掺入到核酸分子中时从结构单元上切除的荧光标记基团。保留在结构单元上的荧光标记基团优选与α-磷酸基团、糖和/或核碱基连接。优选地，保留在结构单元上的荧光标记基团与核碱基连接，例如，通过可具有至多15个，优选10-12个碳原子的链长的接头(任选地包含杂原子，N，O或S原子)与核碱基连接。当结构单元掺入到核酸分子中时从结构单元上切除的荧光标记基团可以连接到末端磷酸基团，例如六-，五-，四-或三磷酸酯结构单元的磷酸基团，例如三磷酸酯结构单元的γ-磷酸基团。在某些实施方案中，选择含有(i)掺入后保留的荧光标记基团和(ii)掺入期间切除的荧光标记基团两者的结构单元。在这种情况下，可以选择能够彼此相互作用的荧光基团，例如，通过淬灭和/或能量转移。
在使用核酸降解酶分子对核酸分子进行直接测序的情况下，待测序的核酸分子将包含荧光标记基团。另一方面，如果核酸分子在引物延伸中用作模板，则待测序的核酸分子可能不包含荧光标记基团。
本发明的方法可以涉及在由核酸合成酶分子催化的引物延伸中产生具有掺入的核苷酸结构单元的核酸分子的步骤，和/或由核酸降解酶分子催化的从产生的核酸中切除单个核苷酸结构单元的第二步骤。取决于荧光标记的类型，可以在引物延伸和/或降解过程中进行核酸序列测定。
在引物延伸过程中的序列测定涉及使用携带荧光标记基团的核苷酸结构单元，所述荧光标记基团在结构单元掺入到核酸分子中时从结构单元上切除。在这种情况下，可以确定由荧光标记基团从核苷酸结构单元切除引起的时间依赖性荧光变化。核酸降解过程中的序列测定涉及使用核苷酸结构单元，其携带当其结构单元掺入到核酸分子中时保留在结构单元中的荧光标记基团。当从核酸分子释放标记的核苷酸结构单元时，从核酸分子逐渐切除单独的核苷酸结构单元引起荧光的时间依赖性变化。在某些实施方案中，还可以在延伸和降解期间进行序列测定，即当使用携带当结构单元结合到核酸分子中时保留在结构单元上的荧光标记基团和从结构单元切除的荧光标记基团两者的核苷酸结构单元时。在这个实施方案中，两个荧光基团可以相同或不同。
在一些实施方案中，本发明的方法涉及核酸合成和核酸降解的一个或多个循环以确定核酸分子模板的碱基序列。核酸合成包括核酸合成酶分子催化的延长与核酸模板分子退火的引物，其中产生与核酸模板序列互补的核酸分子。在下一步中，生成的核酸分子被核酸降解酶分子降解。
当将核苷酸结构单元掺入伸长的核酸分子中时，荧光的时间依赖性变化可能发生，这可以如上所述进行检测。优选地，将核苷酸结构单元掺入伸长的核酸分子中与荧光的可检测增加有关，优选伴随着荧光的瞬时增加。例如，可以使用核苷酸结构单元，其在结构单元结合到引物中时被切除掉的分子部分上例如，在γ-磷酸基团上携带荧光标记基团。
当从合成的核酸分子切除核苷酸结构单元时，可以确定荧光的时间依赖性变化，这是由于掺入核酸链中的荧光标记基团与相邻基团的相互作用，例如与核酸的化学基团特别是核碱基，例如G，和/或相邻的荧光标记基团的相互作用，由于淬火过程和/或能量转移过程，与“分离”形式的荧光标记基团相比，这些相互作用导致荧光变化，尤其是荧光强度的变化。通过切除单独的核苷酸结构单元的去除会改变整个荧光，例如固定的核酸链的荧光强度，并且这种改变是通过切除单独的核苷酸结构单元的去除的函数，即时间的函数。
延伸和/或降解过程中荧光的这种时间依赖性变化可以对多个核酸分子并行记录并且与各个核酸链的碱基序列相关联。优选使用这些荧光标记基团，所述荧光标记基团当掺入核酸链中时至少部分淬灭，使得在含有标记基团的核苷酸结构单元或引起猝灭的相邻结构单元已通过切除去除之后荧光强度增加。
在掺入和/或除去单独的核苷酸结构单元期间，由于淬灭过程或能量转移过程，有可能测量核酸链和/或掺入或切除的核苷酸结构单元的荧光强度的变化。荧光强度随时间的这种变化取决于研究的核酸链的碱基序列，因此可以与序列相关联。
核酸分子的完整序列可以通过使用在所有四个不同碱基上例如在A，G，C和T上或在两个或三个不同碱基的组合上标记的核苷酸结构单元的混合物来确定。在适当的情况下，也可以将“序列标识符”，即已知序列的标记核酸连接到待研究的核酸链，例如通过使用连接酶和/或末端转移酶的酶促反应，从而获得在测序开始的最初的已知的荧光图案和仅在之后获得对应于待研究的未知序列的荧光图案。
检测包括优选借助于激光器或通过另一合适的光源将光照射到支持物中，以引起荧光标记基团的激发。就此而言，有可能使用一个或多个激光束，例如具有大约1-20毫米的横截面的扩大的激光束，和/或多个激光束。检测优选包括激光的多点荧光激发，例如经由衍射光学器件产生的激光点的点阵(参见WO 2002/097408)或量子阱激光器。
可以使用检测器矩阵并行地检测多个核酸链的荧光发射，所述检测器矩阵包括例如电子检测器矩阵，例如CCD照相机，CMOS检测器矩阵，例如CMOS相机或雪崩光电二极管矩阵。检测可以以在研究的所有核酸链上并行进行荧光激发和检测的方式进行。对此可能的替代方法是在每种情况下在几个步骤中研究核酸链的一部分。优选对基本上垂直地从支持物表面通过反应空间或通过支持物主体发射的荧光进行检测。
检测可以例如通过荧光相关光谱进行，该荧光相关光谱包括将非常小体积例如从10-10到10-24l的元件暴露于激光或另一合适的光源的激发光，该光激发存在于该测量体积中的受体，使得后者发出荧光，由光电检测器测量从所述测量体积发出的荧光，并且测量的发射随时间的变化与分析物的浓度相关，这使得可以以适当高的稀释度鉴定所述测量体积中的单独的分子。小体积元件可以通过使用提供共焦体积元件的光学器件或借助于通过全内反射(TIR)建立的体积元件来提供。用于检测的程序和装置的细节可以在欧洲专利0 679 251的公开内容中找到。在Rigler和Mets(Soc.Photo-Opt.Instrum.Eng.1921(1993),239ff.)和Mets和Rigler(J.Fluoresc.4(1994)259-264)中进一步描述了单分子的共焦测定。
可选地或另外地，还可以通过时间分辨衰减测量(称为“时间门控(time gating)”)来进行检测，如例如由Rigler等人，\"Picosecond Single Photon Fluorescence Spectroscopy of Nucleic Acids\",in:\"Ultrafast Phenomenes\",D.H.Auston,Ed.,Springer 1984描述的。这里，荧光分子在测量体积中被激发，随后，优选以大于等于100ps的时间间隔，在光电检测器上打开检测间隔。以这种方式，可以使由拉曼效应产生的背景信号保持足够低，从而能够以基本无干扰的方式检测单分子。
本发明还涉及一种用于分析至少一个单独的单分子的设备，例如用于对至少一个单个核酸分子进行测序，所述设备包含：
(i)在其上包含至少一个单独的样品点的支持物，其中所述样品点至少部分由导电材料制成，
(ii)适于使所述支持物与包含至少一个待分析的单分子的液体介质接触的装置，
(iii)适于在使支持物与液体介质接触时形成的反应空间上施加电场的装置，
(iv)光源，其在支持物上的样品点处提供至少一个单独的照射体积元件，用于在单个样品点处单独照射单分子，和
(v)光检测器，用于单独检测在单独的样品点处从单分子发射的光。
本发明进一步涉及用于并行分析多个单独的单分子或多个单独的单个核酸分子的设备，其包含：
(i)其上包含多个单独的样品点的支持物，其中所述样品点至少部分由导电材料制成，
(ii)适于使所述支持物与包含多个待分析的单分子的液体介质接触的装置，
(iii)适于在使支持物与液体介质接触时形成的反应空间上施加电场的装置，
(iv)光源，其在支持物上的样品点处提供至少一个单独的照射体积元件，用于在单个样品点处单独照射单分子，和
(v)光检测器，用于并行地单独检测在单独的样品点处从多个单分子发射的光。
支持物表面上的导电点可以由例如金属或半金属的区域构成。金属点可以通过气相沉积金属(如Au，Ag，Al，Cr，Ni等)而制备，所述金属在被栅格掩模覆盖的支持物上气化，所述栅格掩模可以通过电子束光刻或等效技术产生。栅格掩模中的孔的大小可以对应于支持物表面上的点的大小。优选地，栅格掩模中的孔直径是5nm或更小。或者，可以通过zeptoliter精确吸取颗粒到支持物上，特别是具有平坦表面的支持物上，通过位点特异性沉积例如具有2-10nm的尺寸的导电纳米颗粒来制备支持物上的点。颗粒可以具有选自金属例如Au，Ag，Al，Cr，Ni等或半金属的表面。如上所述，颗粒和/或支持物上的点表面区域可以通过生物素和/或链霉亲和素或其他亲和试剂进行修饰。
支持物上的样品点优选与各个检测像素的投影中心对齐。样品点与检测像素投影之间的对齐的调整可以通过检测器驱动的反馈回路中的纳米精度压电调整元件来执行。样品点的中心与检测像素投影的中心之间的调整容限优选为约5nm或更小，约2nm或更小或约1nm或更小。
本发明的方法和本发明的设备可用于例如分析基因组和转录组或者用于差异分析，例如关于物种内个体物种或生物体的基因组或转录组的差异的研究。特别优选的是确定序列群体(例如至少10个，102个，至少103个或至少104个单独的序列)内的单独的子序列的频率和/或分布。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法和本发明的设备可以用于类似物种(quasi-species)序列的分析(参见M.Eigen等人,\"Molecular Quasi Species\",J.Phys.Chem.92,December 1988,8881-6891；M.Eigen&C.Biebricher,\"Role of Genome Variation in Virus Evolution\",in RNA Genetics,Vol.3:Variability of RNA Genomes；CRC Press 1988；M.Eigen&R.Winkler-Oswatitsch,\"Statistical Geometry on Sequence Space\",in Molecular Evolution:Computer Analysis of Protein and Nucleic Acid Sequences,Academic Press,1990,M.Eigen et al,\"The Hypercycle-Coupling of RNA and Protein Biosynthesis in the Infection Cycle of an RNA Bacteriophage\",Biochemistry 30,November 1991,1 1005-1 1018,M.Eigen,\"Viral Quasispecies\",Scientific American,July 1993,42-49,E.Domingo等人\"Quasispecies and RNA Virus Evolution:Principles and Consequences\",Landes Bioscience Madame Curie Database,2000以及其中引用的参考文献)。
通过单分子测序，可以确定物种内的生物体群体内或生物体内的细胞群体内个体序列的分布。例如，诸如细菌或病毒的生物体群体或诸如精子的细胞群体在其基因组的某些序列中不包含相同的遗传信息。相反，存在不同的个体序列(对应于所谓的类似物种或亚物种)，其在给定的长度上的一个或多个(例如，2、3或4个)核苷酸上不同。本发明现在允许通过单分子测序，特别是通过个体变体的单分子测序的重复循环，精确测定各个变体序列。由此，可以确定诸如细菌或病毒的生物体群体或诸如精子的细胞群体内的各个子序列的频率和分布。通过这些信息，可以精确地确定给定的生物体群体或细胞群体内的亚物种的分布。这允许在病原体如细菌或病毒的情况下改善诊断和治疗，例如，通过检测是否存在耐药突变。在细胞例如精子的情况下，可以执行改进的遗传分析，例如，通过检测某些基因型的存在或不存在。
此外，下面的附图旨在举例说明本发明。
图1示出了根据本发明的设备的第一实施方案。光学透明的支持物(10)包括非导电基底材料(例如玻璃或石英)板(12)。它涂有导电层(14)，例如氧化铟锡。在平面支持物表面上，设置导电样品点(16)。样品点包括来自第一金属例如Cr的基底层(18)以及来自第二金属例如贵金属如Au的第二(顶部)层(20)。在导电样品点(16)和第二电极(22)之间施加电场，第二电极可以是光学测量装置的一部分，例如，光学物镜的金属外壳和/或尖端。
通过使支持物(10)与包含待分析的单分子例如核酸分子的液体介质(28)接触，产生反应空间(24)。通过施加电场，核酸分子浓缩在样品点(16)的区域中或其周围。在样品点(16)上，核酸降解和/或合成酶分子(28)被固定。一旦核酸分子(28)与固定化酶分子(26)接触，就会发生核酸合成和/或降解，导致由荧光标记物基团(未示出)发射的荧光的时间依赖性变化。
图2示出了根据本发明的设备的另一个实施方案。在此，提供包括多个微孔(32a，32b)的支持物(30)。优选地，支持物是光学透明的。微孔包括含有金属层(18)和(20)(例如，如上所述)的导电样品点(16)。在样品点(16)和设置在微孔壁上的电极(34a，34b)之间施加电场。通过在样品点(16)和电极(34a，34b)之间施加电场，存在于孔(32a，32b)内的单独的反应空间中的单分子(28)被浓缩在样品点(16)处，其中核酸合成和/或降解酶分子(26)被固定化。