本发明涉及医学领域，特别是从白色脂肪组织或间充质干细胞获得褐色/米色脂肪细胞的方法。
背景技术：
肥胖以及与肥胖有关的代谢障碍例如糖尿病、心血管疾病和高血压是重要的全球健康问题。超过十亿成年人超重或肥胖，并且超过1.5亿成年人患有糖尿病，其中大部分是由肥胖相关的胰岛素抵抗导致的2型糖尿病(在cypessa.m.和kahnc.r.,2010,curr.opin.endocrin.diabetes&obesity,17,pp.143-149中综述)。现在美国25％的儿童也超重或肥胖，导致在这一原先不受影响的群体中也出现了2型糖尿病。这些数字预期到2025年全球再增加超过一半。
肥胖通常与脂肪细胞的异常积聚相关，在能量摄取超过能量消耗时出现。脂肪组织在肥胖、胰岛素抵抗和糖尿病中发挥重要作用。在哺乳动物中存在两种主要类型的脂肪组织：白色脂肪组织(wat)，其是甘油三酯储存和脂肪酸释放的主要位点，以及褐色脂肪组织(bat)，其通过表达解偶联蛋白(ucp-1)而专门用于产热能量消耗。
白色脂肪细胞亦称为白色脂肪组织(wat)细胞，其以围绕脂质或脂肪滴的细胞质薄环为特征。wat位于皮肤下面，提供了隔热、对冲击和震动的缓冲，以及能量储存。普通的瘦人具有约200亿至400亿个wat细胞。肥胖的人可以具有比普通的瘦人多出高达十倍的wat。
bat中用于产热的能量消耗用于在寒冷中维持体温或用于耗费食物能量。其在热量平衡和能量平衡中起作用，并且当有缺陷时，通常与肥胖相关。实际上，bat通常在肥胖动物中萎缩。bat在整体能量动态平衡中的重要性也被下面的发现所强调，即在小鼠中切除bat导致严重的肥胖，并伴有胰岛素抵抗、高血糖症、高脂血症和高胆固醇血症(lowell等,1993,nature366(6457):740-2；hamann等,l995,diabetes,44(11):1266-73；hamann等,1996,endocrinology137(l):2l-9)。
bat在啮齿类和人类新生儿中较为丰富，但成年人类具有非常少的bat，并且其量随年龄增加而降低。在过去几年中，wat与bat之间的比较导致了一个观念，即白色和褐色脂肪细胞具有不同的谱系(timmonsja等,2007,procnatlacadsciusa,13；104(11):4401-6)。褐色脂肪细胞起源于肌细胞谱系共同的祖细胞，并且以myf5的表达为特征(sealep等,2008,nature,21；454(7207):961-7.)。最近，出现了第三种类型的完全分化的脂肪细胞：白褐色脂肪细胞，其被认定为亮色(brite)(petrovicn等,2010,j.biol.chem.,285(10):7153–7164)或米色(ishibashij,sealep,2010,science,28；328(5982):1113-4.)。它具有褐色脂肪细胞共有的一部分特征例如表达解偶联蛋白1(ucp1)。在长期的ppary激动剂处理(petrovicn.等,2010)或β-3肾上腺素能受体刺激(sealep等,2008)下，在小鼠中的一些“传统的”wat库中出现了米色脂肪细胞。这些条件已经与对饮食诱导的肥胖和代谢改变的抵抗相关联。
目前并没有与亮色/米色脂肪细胞在不同wat位置中的存在与否及其作用相关的人类数据。白色和米色脂肪细胞是否具有共同的祖细胞(leeyh等,2012,adipocyte,1(4):230-236)和/或是否起源于白色脂肪细胞向褐色样脂肪细胞的分化转化(barbatellig等,2010,298(6):e1244-53)仍然需要进行明确。最近有人提出所有的成年人类bat均是米色，而不是传统的bat(wu等,2012,cell,150:1-11)。
由于啮齿类和人类二者中褐色/米色细胞的量与肥胖负相关，这强烈提示增加个体中褐色/米色细胞数量的方法可能是限制肥胖和肥胖相关病理的一个策略。实际上，增加褐色/米色脂肪细胞的相对比例可能增加整体体能消耗并由此防止肥胖的发生。
因此，治疗提议是将褐色/米色脂肪细胞引入到成年人类中以对抗肥胖。在该观点中，很少有报道描述了获得褐色样脂肪细胞的方法。然而，作者使用了特定的干细胞，尤其是来自多能干细胞如诱导的多能干细胞(ips细胞)的干细胞或来自细胞系的干细胞(hmad：人类专能脂肪来源的)。在遗传修饰后生成ips细胞，其在成人中与形成褐色/米色脂肪组织相比，与胚胎发育更为相关。由于ips细胞的致瘤性质，遗传修饰需要巨大的安全性。关于hmad，它们源自于非常年轻的供体(没有hmad是从成人脂肪组织中获得的)，并且通过生物工程程序进行选择，并且因此与成人脂肪组织以及调控其生物学的机制没有生理相关性。因此，对开发从人类成人样品和/或原代细胞中生产褐色/米色脂肪细胞的可靠方法仍然存在强烈需求。
技术实现要素：
本发明的目的是提出一种从人类白色脂肪组织或间充质干细胞生产成脂祖细胞并进一步将其分化成功能性褐色/米色脂肪细胞的新方法。
因此，在第一方面，本发明涉及一种生产褐色/米色脂肪细胞的方法，优选体外方法，其包括
-将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素以及包含vegf家族的生长因子、egf家族的生长因子、胰岛素样生长因子和fgf家族的生长因子的生长因子混合物，
-将所述成脂祖细胞与成脂剂接触直至获得褐色/米色脂肪细胞，以及
-任选地回收所述褐色/米色脂肪细胞。
优选地，与分化培养基接触的细胞为白色脂肪组织细胞，更优选为皮下白色脂肪组织细胞。
分化培养基可以包括
-约0.1ng/ml至约20ng/ml的egf家族的生长因子，
-约0.1ng/ml至约20ng/ml的fgf家族的生长因子，
-约5ng/ml至约40ng/ml的胰岛素样生长因子，和/或
-约0.05ng/ml至约10ng/ml、优选0.05ng/ml至约5ng/ml的vegf家族的生长因子。
特别地，egf家族的生长因子可以选自表皮生长因子(egf)、肝素结合性egf样生长因子(hb-egf)、转化生长因子-α(tgf-α)、双调蛋白(areg)、上皮调节蛋白(ereg)、上皮细胞有丝分裂蛋白(epgn)、乙胞素(btc)以及神经调节蛋白-1、-2、-3和-4(nrg1、2、3和4)，优选为egf；fgf家族的生长因子可以是fgf1或fgf2，优选为fgf2；胰岛素样生长因子可以选自igf-1、igf-2、igfl1、igfl2、igfl3和igfl4以及其合成类似物例如美卡舍明或long(r3)-igf-1，优选为igf-1或其类似物；和/或vegf家族的生长因子可以选自vegf-a，优选为vegf-a拼接形式vegf121、vegf145或vegf165、vegf-b、vegf-c、vegf-d和pgf，更优选为vegf，尤其是vegf-a。优选地，生长因子混合物包括以下物质或由以下物质组成：(i)vegf-a，优选vegf165，(ii)egf，(iii)igf-1或其类似物，优选long(r3)-igf-1，以及(iv)fgf2。
优选地，分化培养基包括约0.5％至约10％的血清，和/或约0.05μg/ml至约5μg/ml的糖皮质激素。
优选地，糖皮质激素选自氢化可的松、地塞米松、倍他米松和可的伐唑，更优选为氢化可的松。
优选地，所述血清是胎牛血清。
优选地，所述血清是胎牛血清，并且所述糖皮质激素是氢化可的松。
分化培养基还可包括自由基清除剂或抗氧化剂，优选抗坏血酸。
成脂剂可以选自胰岛素或其类似物、非选择性磷酸二酯酶(pde)抑制剂、β-肾上腺素能激动剂、噻唑烷二酮、糖皮质激素、骨形态生成蛋白(bmp)、它们的衍生物和混合物。
优选地，成脂剂是包含一种或多种选自胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、ibmx、罗格列酮、bmp4和bmp7的成脂剂的混合物。更优选地，成脂剂包括骨形态生成蛋白以及任选的胰岛素，所述骨形态生成蛋白优选选自bmp4和bmp7，更优选为bmp7。甚至更优选地，成脂剂为骨形态生成蛋白，优选选自bmp4和bmp7，更优选为bmp7。
在一些实施方式中，可以在能够形成3d球体的培养体系中将白色脂肪组织细胞或间充质干细胞与分化培养基接触，从而产生成脂祖细胞的球体。优选地，可以将成脂祖细胞的球体转移到模拟细胞外基质并允许三维生长的3d培养基质中，然后与成脂混合物接触。特别地，所述3d培养基质可以是3d培养水凝胶的微珠/液滴，优选基质胶(matrigel)的微珠/液滴。通过本发明的方法获得的褐色/米色脂肪细胞可以从所述3d培养基质中回收，即除去了3d培养基质，或者可以仍然被包埋在3d培养基质中。
在另一方面，本发明涉及通过本发明的方法获得的褐色/米色脂肪细胞群体。优选地，在所述群体中，褐色/米色脂肪细胞为类器官形式和/或包括单室脂肪细胞。褐色/米色脂肪细胞也可以被包含/包埋在3d培养基质中。
在又一方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的褐色/米色脂肪细胞群体和可药用载体，用于基于细胞的疗法。
优选地，所述药物组合物用于治疗肥胖和/或肥胖相关疾病，优选选自2型糖尿病、糖耐量受损、胰岛素抵抗、血脂异常、高血压和心血管疾病。
在另一方面，本发明还涉及筛选刺激白色脂肪细胞向褐色/米色脂肪细胞转变的化合物的体外方法，其包括
-将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素、自由基清除剂或抗氧化剂以及包含vegf家族的生长因子、egf家族的生长因子、胰岛素样生长因子和fgf家族的生长因子的生长因子混合物，
-将所述成脂祖细胞与候选化合物接触，以及
-评价褐色/米色脂肪细胞的获得情况，
其中如果获得褐色/米色脂肪细胞，则所述候选化合物刺激白色脂肪细胞向褐色/米色脂肪细胞转变。
本发明还涉及鉴定能够增加褐色/米色脂肪细胞的产热程序的化合物的体外方法，其包括
-将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素以及包含vegf家族的生长因子、egf家族的生长因子、胰岛素样生长因子和fgf家族的生长因子的生长因子混合物，
-将所述成脂祖细胞与成脂剂接触直至获得褐色/米色脂肪细胞，以及任选地回收所述褐色/米色脂肪细胞，
-将所述褐色/米色脂肪细胞与候选化合物接触，以及
-监测所述候选化合物对褐色/米色脂肪细胞的活性的影响。
本发明还涉及用于生产褐色/米色脂肪细胞的试剂盒，其包括(i)包含以下物质或基本上由以下物质组成的分化培养基：血清、糖皮质激素以及包含vegf家族的生长因子、egf家族的生长因子、胰岛素样生长因子和fgf家族的生长因子的生长因子混合物，(ii)一种或多种成脂剂。优选地，所述试剂盒还包含3d培养体系，优选包含一个或多个超低附着板(ultra-lowattachmentplate)和3d培养基质。本发明还涉及本发明的试剂盒用于根据本发明的方法生产褐色/米色脂肪细胞的用途。
附图说明
图1:血管周围脂肪组织来源的干细胞/祖细胞(padsc)是不成熟且成脂的。将来自白色脂肪组织的细胞培养在不同培养基中：标准培养基(fbs+fgf2或血小板裂解物富集的血浆，plp)或ecgm2培养基(padsc的扩增)。在扩增后，通过使用流式细胞仪对来自这些培养条件的细胞进行表型分析(a):未发现内皮(cd31)和造血(cd45)标志物，而检测到asc标志物(cd90、cd73、cd13和cd34)。(b):在padsc中均发现了干细胞性标志物，在标准asc中有少量发现。(c):在分化前，qrt-pcr数据显示，标准asc表达成骨细胞和血管平滑肌谱系标志物，而这些标志物在padsc中被显著下调。(d):不管何种条件(标准培养基或ecgm2)，在分化诱导后细胞均能够生成成骨细胞(茜素红)、成软骨细胞(阿尔新蓝)和脂肪细胞(油红o)，但padsc更易于分化成脂肪细胞。
图2:当用药理成脂剂处理时，padsc迅速分化成脂肪细胞。使用成脂药理剂来诱导脂肪细胞分化。这些脂肪细胞试剂为：罗格列酮(噻唑烷二酮家族pparγ活化剂)、胰岛素、地塞米松和吲哚美辛。在诱导后第7天，从培养的细胞提取mrna，进行qrt-pcr。对脂肪细胞标志物，尤其是pparγ2、cebpa、lpl、adipoq和ap2的表达进行了研究。绘出的数据是与作为参比转录本的管家基因ppia相比的相对表达(2-ddct法)。使用非参数配对的wilcoxon检验来比较平均差。*p<0.05；**p<0.001；***p<0.001。
图3:与标准asc相比的成脂祖细胞的基因表达谱。对成脂祖细胞和两种类型的标准asc(plp和fbs+fgf2-来源的asc)进行高通量研究。(a):主成分分析(pca)示出了所述三种群体。成脂祖细胞(padsc)在基因表达方面明显不同于其他群体。(b):数字探针组(ps)在每种类型的细胞之间显著不同。
图4:与标准asc相比成脂祖细胞的脂肪细胞与成骨细胞承诺。当与脂肪细胞基因列表(a)或成骨细胞基因列表(b)相比时，成脂祖细胞或标准asc中上调(左)或下调(右)最多的基因的gsea富集分数(es)曲线。fdrq-值在上面给出。
图5:在bmp诱导后padsc经历了成脂分化。通过媒介物(对照)、重组人类rhbmp4或rhbmp7对标准asc和padsc刺激三天，并在第10天回收。(a):提取mrna并进行qrt-pcr分析以定量关键的脂肪细胞标志物，包括pparγ2、cebpa、lpl、ap2和adipoq。还对白色脂肪细胞特异性标志物lep(瘦素)进行了评价。(b):在bmp处理后asc和padsc的油红o染色的相差显微镜检查。(c):由于bmp也能够诱导成骨，因此测试了成骨细胞标志物dlx5和osx的表达。与padsc相比，在标准asc中这些分子表达得显著更多。
图6:padsc生成了真正的褐色/米色脂肪细胞。在7天中使用了成脂剂以从标准asc或padsc诱导脂肪细胞命运。(a):然后提取mrna和蛋白用于分析关键的褐色/米色脂肪细胞标志物(通过qrt-pcr(ucp1、cidea、pgc1a)和western印迹(ucp1))。retn基因用作白色脂肪细胞标志物。(b):从标准asc或padsc分化的脂肪细胞在基础条件下(基础呼吸，白色框)或在cccp处理后(最大呼吸，黑色框)的o2消耗。未诱导细胞用作对照(ctrl)。数据以o2消耗百分比绘出，纯化的大鼠线粒体的速率用作参比。使用非参数配对的wilcoxon检验来比较平均差。**p<0.01；***p<0.001。(c):在bmp4或bmp7诱导后第3天和第10天通过western印迹(ucp1)、原位免疫荧光(ucp1)和qrt-pcr(ucp1、cidea和pgc1a)对褐色脂肪细胞标志物的表达进行评价。pparγ1和pparγ2用作脂肪细胞标志物对照，β-肌动蛋白用作内部对照。*p<0.05；**p<0.001；ns:不显著。
图7:源自egm2的msc产生褐色/米色脂肪细胞。促米色/褐色脂肪细胞因子bmp7用于诱导在标准培养基或在egm2中培养的bm-msc的分化。(a):然后提取mrna和蛋白用于通过qrt-pcr分析成脂标志物(adipoq、cebpa、lpl和pparγ2)、(b)关键的米色/褐色脂肪细胞标志物(ucp1、cidea)、还有(c)成骨细胞标志物(osx和dlx5)。
图8:脂肪类器官表达褐色/米色标志物。(a、b)2d(a)或3d(b)培养体系中生成的脂肪细胞的代表性图像。用dapi对核进行标记。比例尺：20μm。(c)在未分化球体中(对照)、或在用或未用50μm毛喉素(fsk)诱导4小时的脂肪细胞分化(ad)后通过rt-qpcr评价pparg2、ucp1和pgc1α的表达。
图9:在移植后类器官变得血管化。(a、b)注射后7天，含有球体的管塞的代表性图片。(c、d)由用特定凝集素标记的人类和小鼠内皮细胞组成的杂合型血管。(e)外植体中单室脂肪细胞用氟硼二吡咯标记，核用draq5标记。
具体实施方式
发明人开发了一种用于从人类成人白色脂肪组织(wat)生产褐色/米色脂肪细胞的简单和快速的新方法。他们出乎意料地发现，将wat培养在为培养来自大血管的内皮细胞所优化的培养基例如ecgm2培养基中，产生了表现出不同于通常分离自wat的祖细胞群体的特性的干细胞/祖细胞群体。实际上，这种成脂祖细胞群体，在本文中也称为padsc，具有较低的成骨细胞、成软骨细胞和平滑肌细胞谱系标志物的表达，并且在生理分化因子例如bmp4和bmp7的作用下能够非常高效地分化成功能性褐色/米色脂肪细胞。另外，它们的整体转录组数据非常不同于源自标准条件的细胞的数据。从来自骨髓的间充质干细胞获得了类似的结果。
因此，在第一方面，本发明涉及一种生产褐色/米色脂肪细胞的方法，其包括将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素以及包含vegf家族的生长因子、egf家族的生长因子、胰岛素样生长因子和fgf家族的生长因子的生长因子混合物。
优选地，所述方法还包括将所述成脂祖细胞与成脂剂、优选生理成脂剂接触直至获得褐色/米色脂肪细胞。
任选地，所述方法还包括回收所述褐色/米色脂肪细胞。
正如下面公开的，本发明的方法可以是体内、离体或体外方法，优选体外方法。
正如在本文中使用的，术语“褐色/米色脂肪细胞”指的是具有褐色或米色脂肪、优选人类褐色或米色脂肪的特性的细胞。特别地，该术语指的是表达以下蛋白的脂肪细胞：“产热素”蛋白或“解偶联蛋白-1”(ucp1，基因id:7350)、即在通过非颤抖性产热而产生热量的褐色脂肪细胞的线粒体中发现的解偶联蛋白、pparγ2(过氧化物酶体增殖物激活受体γ2，基因id:5468)、cidea(细胞死亡诱导性dffa样效应物a，基因id:1149)、lpl(脂蛋白脂肪酶，基因id:4023)、adipoq(脂连蛋白c1q和胶原结构域，基因id:9370)、pgc1α(或ppargc1a，过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1α，基因id:10891)、cebpa(ccaat/增强子结合蛋白(c/ebp)，α；基因id:1050)和ap2(或fabp4，脂肪酸结合蛋白4；基因id:2167)。
与分化培养基接触的细胞选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞。细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。在优选实施方式中，从任何年龄的人类、优选从成年人类获得细胞。
在一个实施方式中，与分化培养基接触的细胞是白色脂肪组织细胞。正如在本文中使用的，术语“白色脂肪组织细胞”指的是在白色脂肪、优选在人类白色脂肪、更优选在成年人类白色脂肪中存在的细胞。在哺乳动物中发现了两种类型的脂肪组织：白色脂肪组织(wat)和褐色脂肪组织(bat)。wat脂肪细胞含有很少的线粒体和单个大脂肪滴，后者迫使细胞核被挤入到周围的薄边缘处。它们还分泌多种激素，包括瘦素和脂连蛋白。wat脂肪细胞通常表达retn(抵抗素，基因id:56729)。在哺乳动物中，wat细胞基本上位于皮肤下面(皮下wat)、内脏周围(内脏wat)、骨髓中(黄骨髓wat)和乳腺组织中。优选地，本发明中使用的wat细胞为皮下wat细胞，更优选为人类皮下wat细胞，甚至更优选为成年人类皮下wat细胞。优选地，本发明中使用的皮下wat细胞包含皮下脂肪组织的基质血管级分(svf)或基本上由其组成。
在另一个实施方式中，与分化培养基接触的细胞为来自骨髓的间充质干细胞(msc)。正如在本文中使用的，术语“间充质干细胞”或“msc”指的是能够分化成多种细胞类型、包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞的专能基质细胞。本发明中使用的msc优选为人类msc，尤其是人类成年间充质干细胞。msc可以通过本领域技术人员已知的任何方法从受试者获得，尤其是使用集落形成单位-成纤维细胞(cfu-f)法从骨髓获得，其中将原始未纯化的骨髓或聚蔗糖(ficoll)-纯化的骨髓单核细胞直接铺板到细胞培养板或培养瓶中，通过与红细胞或造血祖细胞不同的对组织培养塑料的粘附性来选择msc。msc通常表达cd44、cd29、cd73、cd105和ssea4。
wat细胞或msc可以是原代或次生细胞。术语“原代细胞”包括从哺乳动物组织来源分离的细胞悬液(在它们被铺板、即附着到组织培养基底如培养皿或培养瓶之前)中存在的细胞、在源自于组织的外植体中存在的细胞、首次铺板的之前两种类型的细胞，以及源自这些铺板细胞的细胞悬液。术语“次生细胞”指的是培养中所有后续步骤的细胞，尤其是已经传代一次或多次的细胞。优选地，本发明的方法中使用的细胞是原代细胞。
本发明的方法还可以包括提供wat细胞或间充质细胞，尤其是来自哺乳动物、优选来自人类的wat细胞或间充质细胞。
wat细胞可以通过本领域技术人员已知的任何方法，尤其是通过吸脂或通过脂肪切除(lipodectomia)从受试者获得。将细胞通过酶法分离。
msc可以通过本领域技术人员已知的任何方法从受试者获得，例如通过使用抽吸从骨髓获得或从股骨头机械提取获得。
本发明的方法包括将wat细胞或msc与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素以及包含vegf家族的生长因子、egf家族的生长因子、胰岛素样生长因子和fgf家族的生长因子的生长因子混合物。
正如在本文中使用的，术语“基本上由......组成”指的是分化培养基不包含对细胞的分化有作用的任何其它活性物质，但可以包含允许细胞的维持或生长的其它化合物例如营养素、缓冲剂、有机盐、抗生素等。
分化培养基中包含的血清优选为动物来源，更优选为胎牛血清或合成替代物。所述培养基可以包括约0.5％至约10％的血清、优选约1％至约5％的血清、更优选约2％的血清。
正如在本说明书中使用的，术语“约”指的是指定值的±10％的值的范围。优选地，术语“约”指的是指定值的±5％的值的范围。
分化培养基包括至少一种糖皮质激素，即与糖皮质激素受体结合的甾类激素。糖皮质激素的实例包括但不限于地塞米松、倍他米松、可的伐唑和氢化可的松。优选地，糖皮质激素是氢化可的松。所述培养基可以包括约0.05μg/ml至约5μg/ml的糖皮质激素、优选约0.1μg/ml至约2μg/ml的糖皮质激素、更优选约0.2μg/ml的糖皮质激素。
优选地，分化培养基包括胎牛血清和氢化可的松。
分化培养基包括生长因子混合物，所述生长因子混合物包括至少一种vegf家族的生长因子、至少一种egf家族的生长因子、至少一种胰岛素样生长因子和至少一种fgf家族的生长因子。优选地，所述混合物由vegf家族的生长因子、egf家族的生长因子、胰岛素样生长因子和fgf家族的生长因子组成。
正如在本文中使用的，术语“vegf家族的生长因子”指的是属于血管内皮生长因子家族的生长因子，例如vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d和pgf(胎盘生长因子)。优选地，该术语指的是vegf-a。人类vegf-a基因编码121、145、165、189和209个氨基酸的五种同种型(neufeld等,1999,thefasebjournal,vol.13,no.1,9-22)。优选地，所述混合物包括分泌的vegf-a拼接形式，即vegf121、vegf145或vegf165。更优选地，vegf家族的生长因子能够选择性结合至vegf-r1、r2、r3以及神经纤毛蛋白-1和神经纤毛蛋白-2共受体。甚至更优选地，vegf家族的生长因子为vegf165。分化培养基可以包括约0.05ng/ml至约10ng/ml的vegf家族的生长因子、优选约0.1ng/ml至约5ng/ml、更优选约0.5ng/ml。
正如在本文中使用的，术语“egf家族的生长因子”指的是属于表皮生长因子家族的生长因子，例如表皮生长因子(egf)、肝素结合性egf样生长因子(hb-egf)、转化生长因子-α(tgf-α)、双调蛋白(areg)、上皮调节蛋白(ereg)、上皮细胞有丝分裂蛋白(epgn)、乙胞素(btc)、神经调节蛋白-1、-2、-3和-4(nrg1、2、3和4)。优选地，egf家族的生长因子为egf。分化培养基可以包括约0.1ng/ml至约20ng/ml的egf家族的生长因子、优选约1ng/ml至约10ng/ml、更优选约5ng/ml。
正如在本文中使用的，术语“胰岛素样生长因子”指的是分子结构类似于胰岛素的激素。特别地，胰岛素样生长因子可以选自胰岛素样生长因子1(igf-1或生长调节素c)、胰岛素样生长因子2(igf-2)、igfl1、igfl2、igfl3和igfl4以及其合成类似物。优选地，胰岛素样生长因子为igf-1或其合成类似物例如美卡舍明或long(r3)-igf-1(hill等domestanimendocrinol.1999may；16(4):219-29)。分化培养基可以包括约5ng/ml至约40ng/ml的胰岛素样生长因子、优选约10ng/ml至约30ng/ml、更优选约20ng/ml。
正如在本文中使用的，术语“fgf家族的生长因子”指的是属于成纤维细胞生长因子家族的生长因子。优选地，fgf家族的生长因子为fgf1(酸性成纤维细胞生长因子)或fgf2(碱性成纤维细胞生长因子、bfgf或fgf-β)。更优选地，fgf家族的生长因子为fgf2。分化培养基可以包括约0.1ng/ml至约20ng/ml的fgf家族的生长因子、优选约1ng/ml至约15ng/ml、更优选约10ng/ml。
在一个特定实施方式中，生长因子混合物包括以下物质或由以下物质组成：(i)vegf-a、优选vegf165、(ii)egf、(iii)igf-1或其类似物、优选long(r3)-igf-1，和(iv)fgf2。
在一个特定实施方式中，分化培养基包括以下物质或基本上由以下物质组成：
-约0.5％至约10％的血清、优选约1％至约5％的血清、更优选约2％的血清；
-约0.05μg/ml至约5μg/ml的糖皮质激素、优选约0.1μg/ml至约2μg/ml的糖皮质激素、更优选约0.2μg/ml的糖皮质激素；
-约0.1ng/ml至约20ng/ml的egf家族的生长因子、优选约1ng/ml至约10ng/ml、更优选约5ng/ml；
-约0.1ng/ml至约20ng/ml的fgf家族的生长因子、优选约1ng/ml至约15ng/ml、更优选约10ng/ml；
-约5ng/ml至约40ng/ml的胰岛素样生长因子、优选约10ng/ml至约30ng/ml、更优选约20ng/ml；和/或
-约0.05ng/ml至约10ng/ml的vegf家族的生长因子、优选约0.1ng/ml至约5ng/ml、更优选约0.5ng/ml。
优选地，所述血清是胎牛血清，所述糖皮质激素是氢化可的松，并且所述生长因子混合物包括以下物质或由以下物质组成：(i)vegf-a、优选vegf165，(ii)egf，(iii)igf-1或其类似物，优选long(r3)-igf-1，和(iv)fgf2。更优选地，所述血清是胎牛血清，所述糖皮质激素是氢化可的松，并且所述生长因子混合物由vegf165、egf、long(r3)-igf-1、和fgf2组成。
任选地，分化培养基还可包括至少一种自由基清除剂和/或抗氧化剂，即在活性氧物质会损伤细胞前将其清除并将蛋白维持在其还原状态的化合物。自由基清除剂或抗氧化剂的实例包括但不限于维生素c(抗坏血酸)、维生素a和维生素e以及它们的衍生物，谷胱甘肽，n-乙酰半胱氨酸，过氧化氢酶，超氧化物歧化酶和过氧化物酶。优选地，清除剂或抗氧化剂为抗坏血酸。分化培养基可以包括约0.2μg/ml至约10μg/ml的自由基清除剂或抗氧化剂，优选约0.5μg/ml至约5μg/ml、更优选约1μg/ml。
在优选实施方式中，分化培养基为培养基ecgm2(promocell,heidelberg,germany)。
将细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞。
尤其与通过在标准条件下例如在包含胎牛血清和fgf2或包含血浆来源的血小板裂解物(plp)的培养基中培养wat细胞所获得的标准脂肪来源的基质细胞(asc)相比，根据本发明的方法获得的成脂祖细胞强烈表达干细胞性因子nanog(nanog同源框，基因id:79923)、oct4(八聚体结合转录因子-4，基因id:5460)和sox2(sry(性别决定区y)-框2，基因id:6657)且弱表达成骨细胞(例如runx2、dlx5和alpl)、成软骨细胞和平滑肌细胞(例如acta2、cnni、cnn3和tagln)谱系标志物。正如在实验部分中所示的，发明人证实，通过将wat细胞或msc与上面限定的分化培养基接触而获得的成脂祖细胞更易于形成脂肪细胞，而asc更易于产生成骨细胞和成软骨细胞。优选地，如图1中所示，成脂祖细胞表达cd90、cd73、cd13和cd34，不表达cd31和cd45。
在一个特定实施方式中，将wat细胞或msc与分化培养基接触至少3天，优选7至21天，更优选3至14天。
可以在本领域技术人员公知且容易选择的任何合适的细胞培养体系中、尤其是适合于培养附着细胞的任何体系例如培养皿或培养瓶或能够形成3d球体的任何体系例如超低附着板或琼脂糖包被的孔板中，将细胞与分化培养基接触。
正如在实验部分中所证实的，发明人显示，3d球体培养提供了比2d单层培养更好的结果。因此，在优选实施方式中，在3d球体培养体系中将细胞与分化培养基接触。能够形成3d球体的培养体系对于本领域技术人员来说是公知的。优选地，这一体系是在超低附着板中的培养。正如在本文中使用的，术语“球体”指的是与单层或细胞悬液(在其中细胞聚集的潜力受限的条件下培养)中细胞的二维生长不同，被培养成允许三维生长的细胞的聚集物、簇或组装体。
培养基可以定期更换，优选每天更换，并且可以对细胞进行传代以防止汇合。这些程序对于本领域技术人员来说是公知的。
然后将成脂祖细胞与包含一种或多种成脂剂的成脂混合物接触来获得褐色/米色脂肪细胞。
正如在本文中使用的，术语“成脂剂”或“褐化剂”指的是能够诱导成脂祖细胞向褐色/米色脂肪细胞分化的试剂。通常，如果一种试剂导致编码ucp1的基因表达增加，则其被视为诱导褐色/米色脂肪生成。现有技术中已描述了成脂剂。成脂剂的实例包括但不限于胰岛素及其类似物例如igf-1、非选择性磷酸二酯酶(pde)抑制剂、β-肾上腺素能激动剂、噻唑烷二酮、糖皮质激素、骨形态生成蛋白(bmp)、它们的衍生物或混合物。
非选择性pde抑制剂为阻断磷酸二酯酶(pde)的五种亚型中的两种或更多种的药物。非选择性pde抑制剂的实例包括但不限于吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)、副黄嘌呤、己酮可可碱、可可碱、茶碱、甲基化黄嘌呤、咖啡因和氨茶碱。优选地，非选择性pde抑制剂为吲哚美辛和/或ibmx、更优选为吲哚美辛。
β-肾上腺素能激动剂为激活肾上腺素(也称为正肾上腺素)β受体的化合物。β-肾上腺素能激动剂的实例包括但不限于肾上腺素、去甲肾上腺素、沙丁胺醇、丙卡特罗、多巴酚丁胺、特布他林和异丙肾上腺素。
噻唑烷二酮为pparγ受体激动剂。噻唑烷二酮的实例包括但不限于罗格列酮、吡格列酮和曲格列酮。优选地，噻唑烷二酮为罗格列酮。
糖皮质激素为与糖皮质激素受体结合的试剂。糖皮质激素的实例包括但不限于地塞米松、倍他米松、可的伐唑和氢化可的松。优选地，糖皮质激素为地塞米松。
骨形态生成蛋白(bmp)为转化生长因子超家族中参与胚胎发育以及整个生命周期的多个关键步骤的成员(kishigami和mishina,2005,cytokinegrowthfactor.rev.16:265-278)。bmp的实例包括但不限于bmp1、bmp2、bmp3、bmp4、bmp5、bmp6、bmp7、bmp8和bmp9。优选地，bmp为bmp4和/或bmp7，更优选为bmp7。
在一个实施方式中，成脂混合物包括一种或多种选自胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、ibmx、罗格列酮、bmp4和bmp7的成脂剂。
在一个特定实施方式中，将成脂祖细胞与成脂混合物接触，所述成脂混合物包括非选择性pde抑制剂、噻唑烷二酮、胰岛素或其类似物，和糖皮质激素。优选地，成脂混合物包括吲哚美辛、罗格列酮、胰岛素和地塞米松。
在该实施方式中，成脂混合物可以包括
-0.05至约1mm的非选择性pde抑制剂，优选吲哚美辛；
-0.1至约10μm的噻唑烷二酮，优选罗格列酮；
-0.1至约10μg/ml的胰岛素或其类似物，优选胰岛素；和
-0.1至约10μm的糖皮质激素，优选地塞米松。
在另一个具体实施方式中，将成脂祖细胞与一种或多种bmp接触，优选bmp4和/或bmp7，更优选为bmp7。特别地，成脂混合物可以包括以下物质或基本上由以下物质组成：一种或多种bmp、优选bmp4和/或bmp7，更优选为bmp7。正如在本文中使用的，术语“基本上由……组成”指的是成脂混合物不包括对成脂祖细胞向褐色/米色脂肪细胞分化有影响的任何其他活性物质。
在另一个具体实施方式中，将成脂祖细胞与一种或多种bmp、优选bmp4和/或bmp7、更优选bmp7、以及胰岛素接触。特别地，成脂混合物可以包括以下物质或基本上由以下物质组成：一种或多种bmp，优选bmp4和/或bmp7，更优选bmp7，以及胰岛素。
在该实施方式中，成脂混合物可以包括1至约500ng/ml的bmp、尤其是1至约500ng/ml的bmp4和/或1至约500ng/ml的bmp7。
任选地，成脂混合物还可包括腺苷酸环化酶活化剂，即诱导camp细胞内水平增加的分子。腺苷酸环化酶活化剂的实例包括但不限于毛喉素、胰高血糖素、前列腺素d2、e1和i2、卡巴环素、多巴胺、内皮素1、l-肾上腺素和甲状旁腺激素。优选地，腺苷酸环化酶活化剂为毛喉素。可以在开始时或几天后将腺苷酸环化酶活化剂添加到成脂混合物中。
可以通过将培养基替换为含有所需浓度的成脂剂的新鲜培养基而将成脂祖细胞与成脂混合物接触。可选地，向培养基中连续添加成脂剂(即bmp，然后是成脂混合物)或仅添加bmp。
可以在2d培养体系中或3d培养体系中将成脂祖细胞与成脂混合物接触。在优选实施方式中，在3d体系中进行细胞向成脂祖细胞的分化以及成脂祖细胞与成脂混合物的接触。优选地，在与成脂混合物接触之前，将成脂祖细胞的球体转移到模拟细胞外基质和允许三维生长的3d培养基质中。这些基质对于本领域技术人员来说是公知的，且包括但不限于
将成脂祖细胞与成脂剂接触至少3天，优选3至21天，更优选3至7天。本领域技术人员能够通过评估褐色/米色脂肪细胞特异性标志物即ucp1、pparγ2、cidea、lpl、adipoq、pgc1α、cebpa和ap2的表达而容易地确定这一步骤的持续时间。培养基可以定期更换，优选每天更换，并且可以对细胞进行传代以防止汇合。这些程序对于本领域技术人员来说是公知的。
任选地，所述方法还可包括在成脂祖细胞分化成褐色/米色脂肪细胞之前使其增殖的步骤和/或使通过所述方法生产的褐色/米色脂肪细胞增殖的步骤。因此，可以允许成脂祖细胞和/或褐色/米色脂肪细胞经历数轮的倍增，尤其是为了提供给药到需要的受试者的足够数量或建立稳定的细胞系。
任选地，本发明的方法还可包括测试所获得的褐色/米色脂肪细胞的特性和功能性。可以通过测定特异性褐色/米色脂肪细胞标志物例如ucp1、pparγ2、cidea、lpl、adipoq、pgc1α、cebpa和ap2的表达而评估所述特性。正如在实验部分中详细描述的，可以通过评价线粒体含量、氧消耗或解偶联依赖性呼吸来评估所述功能性。
在第二方面，本发明还涉及通过如上所述的本发明的方法可获得或获得的褐色/米色脂肪细胞群体。优选地，所述群体为人类褐色/米色脂肪细胞群体，更优选为成年人类褐色/米色脂肪细胞群体。优选地，该群体为基本上纯的同源群体，优选包含至少70、75、80、85、90、9、98或99％的褐色/米色脂肪细胞。
本发明还涉及本发明的褐色/米色脂肪细胞群体，其用于基于细胞的疗法，尤其是用于治疗肥胖和/或肥胖相关疾病。
特别地，褐色/米色脂肪细胞群体可以被包含在3d培养基质中和/或可以为如上所述的类器官的形式。
优选地，本发明的褐色/米色脂肪细胞群体包括单室脂肪细胞。
对于生产褐色/米色脂肪细胞的方法所描述的所有实施方式也被包括在这一方面中。
在另一方面，本发明还涉及生产成脂祖细胞的方法，其包括：将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素、以及包含vegf家族的生长因子、egf家族的生长因子、胰岛素样生长因子和fgf家族的生长因子的生长因子混合物、以及任选的自由基清除剂或抗氧化剂；以及任选地回收所述成脂祖细胞。因此，成脂祖细胞可以用在筛选方法中，用于治疗目的，或可以如上所述进一步分化成褐色/米色脂肪细胞。对于生产褐色/米色脂肪细胞的方法描述的所有实施方式也被包括在这一方面中。特别地，成脂祖细胞可以在3d培养体系中生产，并且可以为球体的形式。
在另一方面，本发明还涉及通过如上所述的本发明的方法可获得或获得的成脂祖细胞群体。优选地，所述群体为人类成脂祖细胞群体，更优选为成年人类成脂祖细胞群体。优选地，该群体为基本上纯的同源群体，优选包含至少70、75、80、85、90、9、98或99％的成脂祖细胞。特别地，成脂祖细胞可以在3d培养体系中生产，并且可以为球体的形式。
本发明还涉及本发明的成脂祖细胞群体，其用于基于细胞的疗法，尤其是用于治疗肥胖和/或肥胖相关疾病。
对于生产褐色/米色脂肪细胞的方法或生产成脂祖细胞的方法描述的所有实施方式也被包括在这一方面中。
在又一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的褐色/米色脂肪细胞群体和/或本发明的成脂祖细胞群体。
所述药物组合物根据给药途径被配制在可药用载体中。
优选地，所述药物组合物被配制成使得适合用于有需要的受试者中的基于细胞的疗法。
所述药物组合物可以根据本领域技术人员已知的标准制药实践(参见例如《雷明顿：药学科学与实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)》(第20版),a.r.gennaro编辑,lippincottwilliams&wilkins,2000和《制药技术百科全书(encyclopediaofpharmaceuticaltechnology)》,j.swarbrick和j.c.boylan编辑,1988-1999,marceldekker,newyork)进行配制。
优选地，所述药物组合物适合用于肠胃外给药，特别是用于真皮内给药或直接给药到脂肪组织中。
适合用于这种给药的药物组合物可以包括褐色/米色脂肪细胞和/或成脂祖细胞，以及一种或多种可药用无菌等渗水性或非水性溶液(例如平衡盐溶液(bss))、分散液、悬液或乳液，或可以在即将使用前被重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、溶质或悬浮剂或增稠剂。
任选地，包含细胞的组合物可以被冷冻用于储存在适合细胞储存的任何温度下。例如，所述细胞可以被冷冻在约-20℃、-80℃或任何其他合适的温度下。低温冷冻细胞可以被储存在合适的容器中，并且为储存做好准备以降低细胞损坏的风险并将细胞在解冻时存活的可能性最大化。可选地，细胞也可以维持在冷藏的室温下，例如约4℃下。
可以通过本领域技术人员公知的标准程序确定待给药的细胞的量。必须考虑患者的生理数据(例如年龄、尺寸和体重)以及正在治疗的疾病的类型和严重程度，以确定合适的剂量。
本发明的药物组合物可以以单剂或以多剂给药。每个单元剂量可以包含例如0.1至5个/ml的褐色/米色脂肪细胞和/或0.1至5个/ml的成脂祖细胞。
本发明的药物组合物还可包括另外的活性化合物例如抗炎剂、抗凋亡剂、免疫抑制剂或免疫调节剂、抗氧化剂、生长因子和/或药物。
优选地，在本发明的药物组合物中，成脂祖细胞为如上所述的球体的形式。优选地，在本发明的药物组合物中，褐色/米色脂肪细胞被包含在3d培养基质中和/或为如上所述的类器官的形式。
本发明还涉及本发明的药物组合物，其在有需要的受试者中用于基于细胞的疗法。本发明还涉及治疗患有肥胖和/或肥胖相关疾病的受试者的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的本发明的药物组合物，优选包含褐色/米色脂肪细胞的药物组合物。
正如在本文中使用的，术语“受试者”指的是动物，优选哺乳动物，甚至更优选人类，包括成年人、儿童和产前阶段的人类。
术语“肥胖”指的是其中过量体脂肪已积聚到可能对健康有负面影响、导致预期寿命降低和/或健康问题增加的程度的医学状况。当受试者的体重指数(bmi)、即人的体重除以该人身高的平方所获得的测量值超过30kg/m2时，则该受试者被视为肥胖。
正如在本文中使用的，术语“肥胖相关疾病”指的是在肥胖受试者中出现的可能性增加或直接由肥胖引起的疾病或障碍。特别地，该术语可以指的是2型糖尿病、糖耐量受损、胰岛素抵抗、血脂异常、高血压和心血管疾病。
正如在本文中使用的，术语“治疗”指的是意图改善患者的健康状态的任何动作，例如疾病的治疗、防止、预防和阻滞。在有些实施方式中，这一术语指的是改善或根除疾病或与疾病相关的症状。在其他实施方式中，这一术语指的是由于向患有疾病的受试者给药一种或多种治疗剂而使所述疾病的传播或恶化最小化。
特别地，术语“肥胖或肥胖相关疾病的治疗”可以指的是增加脂肪消耗、减重、降低胰岛素抵抗和改善血糖。
“治疗有效量”指的是足以构成如上所限定的治疗的被给药到受试者的褐色/米色脂肪细胞和/或成脂祖细胞的量。
在本发明的方法中，本发明的药物组合物或细胞优选肠胃外给药，更优选皮下给药或直接给药到脂肪组织中。
可以在植入之前将细胞洗涤(例如在等渗pbs中)以在植入前除去任何污染物，包括成脂剂或生长培养基的组分。所需要的细胞数量可变，并取决于多种因素，包括但不限于植入位点、受试者的年龄、表面积和临床状况。在一个特定实施方式中，所述方法包括给药至少1x106个褐色/米色脂肪细胞或成脂祖细胞。可以重复给药直至获得足够量的褐色/米色脂肪细胞或成脂祖细胞以提供治疗效果。
在优选实施方式中，通过本发明的方法从待治疗的受试者的wat细胞或msc的样品获得了褐色/米色脂肪细胞或成脂祖细胞。因此，在该实施方式中，所述方法可以包括提供来自待治疗的受试者的wat细胞或msc，根据本发明的方法获得米色/褐色脂肪细胞或成脂祖细胞，回收所述米色/褐色脂肪细胞或成脂祖细胞，以及向所述受试者给药米色/褐色脂肪细胞或成脂祖细胞。可选地，可以从另一个受试者、优选从同一物种的另一个受试者即同种异体的受试者获得wat细胞或msc。在这一情况下，可以给药免疫抑制剂以防止对细胞的排斥。
本发明还涉及一种在受试者中促进褐色脂肪生成和/或降低脂肪储量或重量的方法，所述方法包括向所述受试者给药本发明的褐色/米色脂肪细胞群体或包含褐色/米色脂肪细胞的本发明的药物组合物。
本发明还涉及用于生成褐色/米色脂肪细胞的试剂盒。所述试剂盒可以包括如上所限定的分化培养基和一种或多种成脂剂，以及任选的一个或多个培养瓶。所述试剂盒还可包括本发明的成脂祖细胞群体，优选人类成脂祖细胞群体。任选地，所述试剂盒还可包括3d培养体系，例如超低附着板、琼脂糖包被的孔板和/或3d培养基质。优选地，所述试剂盒包括一个或多个超低附着板和3d培养基质。所述试剂盒还可包括用于将细胞给药到受试者的装置例如注射器，和/或给药说明书。
本发明还涉及本发明的试剂盒用于根据本发明的方法生产褐色/米色脂肪细胞的用途。
本发明还涉及筛选刺激或抑制白色脂肪细胞向褐色/米色脂肪细胞转变的化合物的方法，其包括
-将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触直至获得成脂祖细胞，所述分化培养基包含以下物质或基本上由以下物质组成：血清、糖皮质激素以及包含vegf家族的生长因子、egf家族的生长因子、胰岛素样生长因子和fgf家族的生长因子的生长因子混合物、以及任选的自由基清除剂或抗氧化剂，
-将所述成脂祖细胞与候选化合物接触，以及
-评价褐色/米色脂肪细胞的获得情况，
其中如果获得褐色/米色脂肪细胞，则所述候选化合物刺激白色脂肪细胞向褐色/米色脂肪细胞转变，并且可选地，其中如果预期褐色/米色脂肪细胞的数量降低，则所述候选化合物抑制白色脂肪细胞向褐色/米色脂肪细胞转变。
褐色/米色脂肪细胞的存在可以通过本领域技术人员已知的任何方法、尤其是通过上文公开的任何方法进行评估。
在一个特定实施方式中，将选自白色脂肪组织细胞和间充质干细胞的细胞与分化培养基接触和将成脂祖细胞与候选化合物接触的步骤在如上所述的3d培养体系中进行。
所述候选化合物可以是任何化学或生物学化合物。
刺激白色脂肪细胞向褐色/米色脂肪细胞转变的候选化合物可以被选择为对治疗肥胖或肥胖相关疾病有用的药物。
抑制白色脂肪细胞向褐色/米色脂肪细胞转变的候选化合物可以被选择为对治疗肥胖或肥胖相关疾病有抑制作用。
本发明还涉及鉴定能够增加褐色/米色脂肪细胞的活性、尤其是调节所述脂肪细胞的产热程序的化合物的方法，其包括：
-将本发明的褐色/米色脂肪细胞群体与候选化合物接触；和
-监测所述候选化合物对褐色/米色脂肪细胞的活性的影响。
褐色/米色脂肪细胞的活性可以通过如下方式进行评估：对一种或多种分子标志物进行定量，评估线粒体生物发生、氧消耗、解偶联呼吸、葡萄糖摄取、脂肪分解、燃料代谢或指示从褐色/米色脂肪细胞获得的代谢活性和/或从的产热增加的任何其它参数。
选择能够增加或降低褐色/米色脂肪细胞活性、例如调节褐色/米色脂肪细胞的产热程序的候选化合物。这些所选化合物可能对治疗肥胖和/或肥胖相关疾病有用。
在本文中引用的所有文献，包括杂志文章或摘要、公布的专利申请、授权专利或任何其他文献，均通过参考整体并入本文，包括所引用文献中给出的所有数据、表格、图和文字。
尽管具有不同的含义，但术语“包含”、“具有”、“包括”和“由……组成”在本发明的整个上述说明书中均可彼此替换。
在本说明书的框架中，所有分子和细胞可以任选地分离和/或纯化。
在下面的实施例中将对本发明的其他方面和优势进行描述，其应该被视为说明性的而不是限制。
实施例
实施例1
材料和方法
asc分离和扩增
在知情同意后，从23个在rangueil医院(toulouse，france)的整形外科部门中进行腹壁皮肤脂肪切除术的选择性程序的健康供体男性和女性(年龄中位数：42，范围：34-63；中位bmi：26.95，范围：23.3-32.7；性别分布95.5％女性，4.5％男性)获得了人类脂肪组织来源的细胞。在33ml消化缓冲液：混合有1.36u/ml胶原酶nb4(servanordmark)的αmem(invitrogen，france)中，将10g新鲜组织用剪刀剁碎。在温浴(37℃，45分钟，120rpm)中振摇后，通过添加αmem+人类白蛋白(hsa)0.1％(v/v)(lffb，france)来终止胶原酶的活性，将组织通过细胞过滤器100μm(bdfalcon，france)，然后在600g下离心。弃去包含成熟脂肪细胞的上清液。将被鉴定为基质血管级分(svf)的团块重悬在10mlαmem+hsa0.1％中，用malassez血细胞计数器对细胞计数。在过夜温育后除去非粘附细胞，每3天更换一次培养基。然后在培养8天后，通过胰蛋白酶(0.05％)(invitrogen)/edta(乙二胺四乙酸)法收获细胞。原代细胞培养物的这一首次传代被称为传代0(p0)。将细胞铺板进行细胞培养，或分别在2000和20000个细胞/cm2的细胞密度下进行多向分化潜能分析。通过使用下列公式计算群体倍增水平：pdl＝ln(细胞的最终数量/细胞的最初数量)/ln2。用于细胞培养的培养基为1)egm2培养基(promocellgmbh，heidelberg，germany)，2)最小必需培养基(mem)，增补有10％胎牛血清(fbs)(stem-celltechnologies，vancouver，bc，canada)和1％青霉素/链霉素(invitrogen，paisley，uk)加或减1ng/ml重组人类成纤维细胞生长因子2(rhfgf2)或3)αmem，增补有2％血小板裂解物-富集的血浆(plp)、可注射肝素(1u/ml)和环丙沙星(10μg/ml)。
集落形成单位-成纤维细胞(cfu-f)分析
为了精确地确定cfu-f的频率，使用的方法是有限稀释分析，假设了祖细胞的数量遵循泊松分布。将来自svf的细胞连续稀释，从128到1个细胞/孔，每份稀释为96孔板中的12个孔。然后在37℃、5％co2下温育96孔板10天。在那时，将培养板用pbs漂洗，在无水甲醇中固定，用吉姆萨10％染色(10分钟)，然后用水漂洗。对每个细胞浓度测定阴性孔(即不含<10吉姆萨-阳性细胞的集落的那些)的数量。使用这些数据，根据等式f0＝e-u和u＝-lnf0确定基于泊松分布的cfu-f的数量，其中f0为无集落的孔(阴性染色的孔)的分数，u为每孔的前体或cfu-f的平均数。通过解答u的值＝1(或每个孔的单个cfu-f单位)的情况的等式，负染孔的分数被确定为f0＝37％。因此，在有限稀释浓度条件下，当基于组化染色八分之三或37％的孔不包含集落时，确定了获得单个集落所必须的svf细胞的数量。cfu-f频率为这一数字的倒数。
流式细胞术
培养8天后对asc在p0下进行流式细胞术。分析细胞中表征下列特定种类的细胞的特定表面标志物的表达：造血干细胞、本原和培养的间充质干细胞、培养的asc和成骨细胞。简要来说，使用了大约5*104-2*105个asc用于cd45-pe；-vioblue，cd31-pe；-fitc，cd90-pe，cd73-pe；-efluor710，cd34-pe；-ecd，cd13-pe，cd271-pe；-apc，ssea3-fitc，ssea4-pe，cd146-fitc；-pe，cd235a-apc750标志物和alpl-pe(碱性磷酸酶肝脏)抗体。通过流式细胞术溶液(0.1％hsa+pbs；磷酸盐缓冲溶液)封闭这些细胞，并用偶联到不同荧光染料的不同抗体温育，然后通过流式细胞仪(beckman，adpcyan细胞仪)。通过dapi染色排除用于分析的死细胞。通过kaluza1.2版本软件(beckman
dna芯片分析
扩增mrna进行基因表达分析
通过已知是仅利用了原始转录本的线性等温扩增的稳健且灵敏的方法的
杂交和数据处理
根据制造商的方案，使用用于wt阵列条带的geneatlas杂交、洗涤和染色试剂盒以及genechip杂交对照试剂盒(20x真核杂交对照和对照寡核苷酸b2)制备扩增、碎片化和生物素标记的cdna靶。将溶液杂交(48℃，20小时)到
功能注释和数据挖掘
通过
使用通过来自qiagen的rt2分析器(profiler)的国产体外分化gep和策划基因集所获得的基因集，在中位“信噪比”的egm2-asc组到标准条件-asc组上执行基因集富集分析(genesetenrichmentanalysis)(gsea)(subramanianaa.,pnas,2005)软件。
定量rt-pcr
从asc提取总rna，并通过allprepdna/rna/蛋白质试剂盒(qiagen，courtaboeuf，france)纯化，并通过超微量分光光度计(nanodrop)(thermofischer，courtaboeuf，france)确定含量。在experion自动化系统(biorad)上使用experiontmrnastdsens试剂检验rna纯度和完整性。所有用于cdna合成的样品均显示rna完整数(rin)高于9.8。通过使用大容量cdna反转录试剂盒(appliedbiosystemtm)和随机六聚体在20μl的最终体积中对1μgrna进行反转录(rt)。使用了通过利用primerexpress软件(perkinelmerlifesciences，waltham，ma)设计的针对每个感兴趣的靶标的寡核苷酸，并在表1中列出。使用在20μl总体积中含500nm正向和反向引物的ssofastevagreensupermix(biorad，marnes-la-coquette，france)，在cfxtm实时系统(biorad)上按照下列条件对稀释的cdna(等于25ng的起始纯化的rna)进行定量pcr：95℃，3分钟以及包含变性(95℃，10秒)和引物杂交和扩增(60℃，30秒)的40个循环。每个引物对表现出了可解释的pcr效率(95％-105％)。使用了熔融曲线和合适的无rt对照以验证扩增的特异性。在bio-bio-radcfx管理器上分析数据(阈值＝0.2)，输出到dataassist软件v3.0(appliedbiosystems)。使用2-δct(或2-δδct)法计算基因表达，根据情况将ppia用作具有较低m得分的参比基因。各个样品的所有实时pcr反应均一式两份进行。
western印迹分析
将通过allprepdna/rna/蛋白质试剂盒(qiagen，courtaboeuf，france)提取的蛋白质进行western印迹分析。简要来说，将来自dna和rna保留柱的洗脱物用app缓冲液(v/v)沉淀，离心(10,000g，10分钟)，用70％乙醇洗涤，风干。将团块溶于alo缓冲液(qiagen，courtaboeuf，france)，超声，通过二辛可宁酸法(pierce)测定蛋白质含量。变性(95℃，5分钟)后，通过12％tris-甘氨酸-sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，随后转移到聚偏二氟乙烯膜(pvdf)上。用兔多克隆抗体抗-人sox2抗体(ab97959；abcam，cambridge，uk)、抗-人oct4抗体(ab19857，abcam)、抗-人nanog抗体(sc33759；santacruz，dallas，tx)、抗-人prdm16抗体、抗-人ucp1抗体，或用小鼠单克隆抗体抗-人pparg抗体、抗-β肌动蛋白抗体和抗-runx2抗体(abcam)检测蛋白质。通过偶联到辣根过氧化物酶的第二抗体显示免疫复合物，并通过分子成像仪(biorad，chemidoctm)可视化。将β肌动蛋白用作内部阳性对照(sigma)。
电泳迁移率变动分析(emsa)
通过胰蛋白酶/edta法分离每个培养基中生长的细胞，在血细胞计数器上计数，用冰冷的pbs洗涤，并按照制造商的说明书，利用ne-per核和细胞质提取试剂(pierce-thermoscientific)进行处理以分离核及细胞质蛋白级分。通过bca法确定蛋白含量。使用lightshift化学发光试剂盒(pierce-thermoscientific)进行emsa。对来自roddadavidj等,jbc2005的条件和探针序列进行调整。简要来说，在反应缓冲液(1x结合缓冲液，10ng/mlpolydidc，6％甘油，60mmkcl，1mmedta)中将核提取物(5μg)与同义寡核苷酸的5'末端被生物素化的1飞摩尔的双链dna寡核苷酸(eurogentec，liege，belgium)温育(室温，20分钟)。通过添加2皮摩尔的未标记的双链来进行竞争。使用5x装载缓冲液将dna/蛋白质混合物装载到未变性的聚丙烯酰胺凝胶(6％，在tbe中，0.5x)上。按照制造商的说明书进行程序的终止，并通过分子成像仪(biorad，chemidoctm)对化学发光可视化。
多向分化潜能能力试验
脂肪细胞分化
对于脂肪细胞的诱导，使用了两种不同的培养基，第一种由含10％fbs、1μm地塞米松、0.45mm异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)、60μm吲哚美辛和1％青霉素/链霉素(sigma)的αmem组成，用于表型分析，第二种由含10％fbs、5μg/ml胰岛素(sigma)、60μm吲哚美辛、1μm地塞米松和1μm罗格列酮的αmem组成。将细胞在培养物中维持高达7或10天，培养基每3天更换一次。将培养物用pbs洗涤并在3％戊二醛中固定(室温，45分钟)，通过用油红o染色中性脂质而测定脂肪细胞的分化情况。通过将油红溶解在异丙醇中并在510nm分光光度计(variosskan，thermo)中测量其剂量而计算每个培养基中被吸收的油红的百分率。在一些实验中，通过含50ng/ml的rhbmp4(骨形态生成蛋白4，miltenyi，bergengladbach，germany)或rhbmp7(rndsystem)的αmem、2％fbs刺激汇合的asc3天。
成骨细胞分化
通过在由αmem、2％fbs、1％l-谷氨酰胺组成的基础培养基中添加50μm抗坏血酸、10mmβ-磷酸甘油(sigmaaldrich，lyon，france)，将汇合的细胞培养物诱导经历成骨细胞的命运。培养物每3天用新鲜成骨培养基更换一次。在第11和第17天，在pbs中漂洗培养物，用4％甲醛固定，通过用茜素红对磷酸钙沉淀显色来测定成骨分化。通过将茜素红溶解在10％乙酸中并在分光光度计(variosskan，thermo，france)中测量405nm下的剂量及在600nm下校正而计算每个培养基中被吸收的茜素红的百分率。
成软骨分化
通过将基质培养基替换为由以下物质组成的成软骨诱导培养基而将p1的asc的汇合培养物诱导经历软骨形成：dmem高葡萄糖，补充有1mm丙酮酸钠、0.1μm地塞米松、0.17mm抗坏血-2-磷酸、0.35mml-脯氨酸、1％its+1(胰岛素传递蛋白硒)(sigma-aldrich)。以10ng/ml的浓度添加tgfβ3(转化生长因子3)。在直至3周的时间段内，培养物每3天更换新鲜成软骨诱导培养基。将培养物用pbs洗涤，10％多聚甲醛固定，并通过阿尔新蓝染色糖胺聚糖。
o2消耗
收获分化的脂肪细胞的整个细胞层，并在恒温至37℃的磁性搅拌的氧电极室中在无血清且增补有4％游离脂肪酸bsa的培养基中温育。使用clark氧电极(oxygraph-2koroboros)通过极谱法测量氧消耗。将所述室闭合，温育细胞以确定基础呼吸率。然后加入寡霉素(2μg/ml)以测量偶联呼吸率，加入抗霉素(20μm)以测量线粒体来源的氧消耗。从氧气浓度对时间的图的斜率确定耗氧率。
免疫荧光
在扩增后，还将asc-或egm-2-来源的细胞培养在室玻片中，并在变得汇合后，将细胞诱导分化成褐色/米色脂肪细胞。7天后，用抗-ucp1抗体(alphadiagnostic，san-antonio，tx)，然后用alexa488-标记的山羊抗小鼠第二抗体(invitrogen)对细胞进行染色。通过使用共聚焦显微镜(zeiss510，zeiss，oberkochen，germany)对染色进行读数。
统计分析
利用非参数wilcoxon匹配配对检验，在graphpadprism5软件上进行统计分析。星号指示了2个条件之间的统计学显著性(*:p<.05；**:p<.01；***:p<.001)。
结果
将成年人类白色脂肪组织细胞培养在egm2培养基中，该培养基之前已被设计为保留了血管周围干细胞/祖细胞。同时，作为对照，还将成年人类白色脂肪组织细胞培养在标准条件下，即含有10％(v/v)fbs和1ng/mlfgf2的培养基或含有2％血浆来源的血小板裂解物(plp)的培养基。
培养在egm2培养基中的粘附细胞产生了高度增殖的集落，其包含能够生成几种类型的分化细胞的高度不成熟的血管周围干细胞/祖细胞(图1)。在一些方面中，这些egm2来源的细胞的表型类似于来自标准对照(之后称为标准asc)的脂肪来源的基质细胞(图1a)。然而，出人意料地，与标准asc相比，egm2来源的细胞被显示为非常不成熟。实际上，据发现，egm2来源的细胞对干细胞性因子nanog、oct4和sox2(图1b)强烈阳性，表达非常低水平的几种谱系标志物，尤其是成骨细胞(runx2、dlx5、alpl)、成软骨细胞(未示出)和平滑肌细胞(acta2、cnn1、cnn3、tagln)谱系的那些标志物(图1c)。与之相反，标准asc在更高的程度上表达成骨细胞、成软骨细胞和血管平滑肌谱系标志物，勉强对干细胞性因子阳性(图1b和c)。取决于分子诱导物，这些egm2来源的细胞能够分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞(图1d)。有趣的是，asc更强效地产生成骨细胞和成软骨细胞，而egm2来源的细胞(之后称为成脂祖细胞)更易于形成脂肪细胞(图1d)。因此，在用不同成脂剂(胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、罗格列酮)处理后，与标准asc相比，成脂祖细胞表达更高水平的成脂基因例如pparγ2、cebpa、lpl、adipoq、和ap2(图2)。
这些结果表明，尽管在标准asc和成脂祖细胞之间有相对类似的表型，但一些功能特性和表型特征明显不同。这些数据提示发明人通过进行高通量研究来更为深入地进行表征。通过主成分分析确定的非监督分析(图3)显示，成脂祖细胞组明显与保持闭合的不同类型的标准asc分开。基因表达的这一第一步的生物信息学分析显示成脂祖细胞明显不同于标准asc。确定每个组之间的基因表达特征的监督分析(变化倍数>|2|；配对的样品t检验<0.05)显示了与标准asc例如plp-asc(1292探针集[ps])以及与10％fbs+fgf2-asc(982ps)相比成脂祖细胞的高度发散性，同时在plp-asc和10％fbs+fgf2-asc(202ps)之间注意到较低的变化(图3b)。为了生成“标准asc相对于成脂祖细胞”基因表达特征，对标准asc的常见基因、包括plp-asc和10％fbs+fgf2-asc发现的那些基因与成脂祖细胞的特征进行比较(数据未示出)。因此，成脂祖细胞明显不同于标准asc，并且可被认为是特殊群体。
发明人然后寻找了在与标准asc相比时可能是成脂祖细胞特征性的主要的生物通路和分子机制。对它们的特征进行了分析，结果显示成脂祖细胞特征在细胞增殖细胞运动发育系统和脂类代谢中涉及到的基因中高度富集(数据未示出)。这些数据与上面描述的那些、即成脂祖细胞的增殖性质和它们更易于进入脂肪细胞谱系中的分化潜力和证据匹配良好。相反，据显示，标准asc表现出了在成骨细胞基因中富集的特征，正如我们的基因集富集分析数据所证实的(图4)。后面这一观察结果提示我们使用其他类型的分化诱导物尤其是骨形态生成蛋白。实际上，众所周知，bmp4或bmp7是成骨祖细胞的骨诱导物，而它们诱导了成脂干细胞/祖细胞的脂肪细胞分化。因此，根据所测试的细胞即成脂祖细胞或标准asc的来源，bmp在它们的承诺上可以有相反的影响。
正如所预期的，与标准asc相比，用bmp4或bmp7处理在成脂祖细胞中诱导了非常不同的响应。实际上，与在用bmp4/7处理时表达高水平的成骨细胞标志物的标准asc相反，成脂祖细胞生成了清楚确定的脂肪细胞(图5)。
由于已知bmp4及更特别地bmp7为褐化剂，发明人研究了这些脂肪细胞是否具有褐色/米色表型。图6中示出的数据显示，源自本发明的成脂祖细胞的脂肪细胞在用成脂剂处理后为真正的褐色/米色脂肪细胞。源自成脂祖细胞的褐色/米色脂肪细胞表达高水平的pparγ2、ucp1、cidea、lpl、adipoq和ap2mrna。正如western印迹和免疫荧光研究所示的，在蛋白水平上ucp1被强烈诱导。与bmp4相比，在用bmp7处理后，这一诱导更强效和可靠。与之相对的，据发现，白色脂肪细胞标志物retn在证实了其褐化状态的细胞中被下调。有趣的是，通过使用bmp4或bmp7，标准asc优先表达成骨细胞标志物(runx2和osterix)(图5)。
功能上来说，通过较高的线粒体含量和活性来表征褐色/米色脂肪细胞。o2消耗试验证实了这些结果(图6b)。实际上，在基础状态下，与分化的标准asc相比，分化的成脂祖细胞表现出接近两倍高的氧消耗。在分化的成脂祖细胞中，解偶联依赖的呼吸(在寡霉素处理后获得)也显著更高。最后，在用cccp处理后获得的最大呼吸在那些分化的细胞中高了超过3倍。这些数据与仅用成脂祖细胞获得的真正和功能性褐色/米色脂肪细胞状态一致。
本发明方法的效果并不限制到源自白色脂肪组织的细胞，因为当这一方法应用到来自骨髓的msc时，获得了相似的结果。实际上，bmp7处理触发了egm2来源的骨髓-msc中成脂基因和ucp1、cidea基因的表达。与之相对的，在标准条件下培养的msc仅能够分化成成骨细胞(图7)。
实施例2
材料和方法
球体生成和分析
将来自成年人类脂肪组织的基质血管级分(svf)以25000个细胞/孔在egm2培养基中接种在96孔超低附着(ula)板中。在5-6天内细胞自发聚集成球体。然后将球体转移到基质胶液滴中。为此，在空的tiptrail上铺一层封口膜，并通过在封口膜上按压小刮刀而生成小凹窝。每个凹窝填充40μl基质胶，使用切口的移液管头将球体转移到基质胶液滴中。将基质胶液滴在37℃下温育45分钟直至它们固化，使用刮刀将其转移到24孔ula板上，并在egm2培养基中在振摇(70rpm)下培养4天以使其生长。在振摇下，利用在增补有2％胎牛血清的α-mem培养基中含有bmp7(50ng/ml)、胰岛素(5μg/ml)、脱铁转铁蛋白(apotransferrin)(10μg/ml)和脂肪乳(intralipid)(0.2％v/v)的成脂混合物诱导脂肪细胞分化10天。为增加脂肪细胞的褐化，添加50μm的毛喉素4小时。
为了比较在脂肪细胞液滴中二维(2d)上的脂质积聚，将svf以75000个细胞/cm2接种在标准24孔板中并在egm2培养基中培养5天。然后通过与球体所用相同的成脂混合物诱导脂肪细胞分化10天。将2d上的球体或细胞分别固定在4％多聚甲醛中2小时或20分钟，接着用dapi(1/10000)核染10分钟。使用nikonte2000-s荧光显微镜进行图像采集。
对于qrt-pcr分析，收集8个球体并在冷pbs中温育两次，每次15分钟，以除去基质胶，然后在qiazol中裂解。按照制造商的说明书，使用rneasy微试剂盒(qiagen)进行rna提取。使用高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)进行逆转录。对于qpcr，我们使用了qpcrfast
球体移植和外植体分析
每次注射，收集30个分化球体并在冷pbs中温育两次，每次15分钟，以除去基质胶。同时，制备含有以下物质的混合物：三分之一的1.2％甲基纤维素(w/v)(sigma-aldrich)、三分之一的10mg/ml纤维蛋白原，和三分之一的增补有1μg/mlvegf和fgf-2的egm2培养基(promocell)。然后将球体重悬在200μl的甲基纤维素/纤维蛋白原/egm2混合物中。在即将注射前，添加3u的凝血酶和200μl的冷基质胶，使用19g针将球体皮下注射到裸鼠的侧部。移植后一周，通过后眼窝注射人类特异性凝集素(生物素化欧洲荆豆(ulexeuropaeus)凝集素i)和小鼠特异性凝集素(罗丹明加纳籽(griffoniasimplicifolia)i)，对人类和小鼠脉管系统进行标记。在注射后20分钟将小鼠处死，分割出管塞，在4℃下4％多聚甲醛中固定过夜。为了将人类的脉管系统可视化，利用alexafluor488链亲和素进行整装染色，接着用draq5进行核染。
结果
为了更接近生理相关条件，发明人开发了一种脂肪类器官，其模拟了体内发生的细胞相互作用。为了生成这种3d模型，将源自脂肪组织的svf接种到ula板中的egm2培养基中以允许形成球体。然后将球体转移到基质胶液滴中，使用含有bmp7、胰岛素、脱铁转铁蛋白和脂肪乳的生理成脂混合物进行分化。
与2d培养相反，这种3d方法导致形成了类似于体内发现的成熟脂肪细胞的形态的单室脂肪细胞(图8a、8b)。此外，发明人观察到内皮细胞能够自组织成具有管状形态的网络，并似乎形成了腔，这在2d培养中并不是这样。分化的球体在基础条件下表达脂肪细胞标志物，包括pparg2，以及米色/褐色标志物ucp1和pgc1a(图8c)。值得注意的是，ucp1和pgc1a的水平被褐化诱导剂毛喉素进一步增加。
为了测试类器官是否能移植且在体内有功能，发明人将球体皮下移植到裸鼠中。他们在移植7天后观察到植入物引起的血管并变得高度血管化(图9a、9b)。为了证实类器官连接到接受者的循环系统，他们进行了对人类或小鼠脉管系统特异性的不同凝集素的静脉注射。结果显示，球体被功能性微脉管网络灌注，出现了嵌合的人类-小鼠血管(图9c、9d)。此外，在外植体中可看到大的单室脂肪细胞(图9e)。