本发明一般涉及多肽纯化领域。本发明特别涉及用于抗体纯化的多柱纯化方法的改进。
背景技术：
蛋白质，特别是免疫球蛋白在当今的医疗序列产品中起着重要的作用。对于人类应用，每种治疗蛋白质必须满足不同e的标准。为了确保生物制药剂对人体的安全性，在生产过程中积累的副产物必须特别去除。为了满足监管规范，制造过程后必须进行一个或多个纯化步骤。除此之外，纯度，生产能力和产量在确定合适的纯化过程中起着重要的作用。
不同的方法已被良好建立并广泛用于蛋白质纯化，例如亲和层析(例如蛋白a或蛋白g亲和层析，单链fv配体亲和层析)，离子交换层析(例如阳离子交换(磺丙基或羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式离子交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它sh配体)，疏水相互作用或芳香族吸附层析(例如，用苯基-琼脂糖，氮杂arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析(例如用ni(ii)-和cu(ii)-亲和材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)。
为了纯化重组产生的免疫球蛋白，通常使用不同柱层析步骤的组合。在纯化期间，非免疫球蛋白污染物如宿主细胞蛋白和宿主细胞dna以及内毒素和病毒被耗尽。因此，通常亲和层析步骤如蛋白a亲和层析之后是一个或多个额外的分离步骤。通常，高电导率缓冲液被描述为用于亲和层析法的洗涤步骤。由于例如高盐浓度，在从一个层析/分离步骤转换到另一个层析/分离步骤中可能需要进一步的方法步骤。来自一个层析步骤的洗脱液中的高电导率值可能对随后的层析步骤具有不利影响。
在us6,127,526中描述了一种通过蛋白a层析纯化蛋白质的方法，其包括以下步骤：(a)将蛋白质吸附到固定在包含二氧化硅或玻璃的固相上的蛋白a；(b)通过用疏水电解质溶剂洗涤固相来去除结合到固相上的污染物；和(c)从固相中回收蛋白质。
在wo2011/038894中报道了在从蛋白a层析材料中回收免疫球蛋白之前，通过特定洗涤步骤明显消耗宿主细胞蛋白质和dna的蛋白a层析法。
在wo2013/177118中报道了从样品基质中分离和纯化抗体的组合物和方法。
在wo2013/033517中报道了从病毒中分离目的多肽(如抗体)的方法。
在ep2583973中报道了一种纯化蛋白质的方法，包括一种或多种层析过程，其中在至少一个层析过程(平衡缓冲液，洗涤缓冲液和洗脱缓冲液)中使用的缓冲液中包含氨基酸；或者二肽，寡肽或其多聚氨基酸，由此纯化具有非常少量杂质的高纯度蛋白质(例如聚合物或宿主细胞蛋白质)。
在ep1561756中报道了纯化蛋白质的方法。
在wo2015/024896中报道了使用羟基磷灰石层析分离双特异性抗体和双特异性抗体生产副产物。
ritzen等人(jchromatogrbanalyttechnolbiomedlifesci，2007，第856卷，第343-347页)报道了使用精氨酸在单克隆抗体制剂中的内毒素减少。
发明概述
本文报道了通过用亲和层析步骤纯化双特异性抗体，然后进行一个或多个额外分离步骤来生产双特异性抗体的方法。
更详细地说，已经发现，在从层析材料中回收抗体之前，通过在亲和层析的洗涤步骤中使用低电导率水溶液的本发明的方法，抗体的纯化方法可以通过避免在将洗脱液加载到下一个柱/层析材料之前进一步处理步骤的需要而得到改进和/或可以减少特定的宿主细胞蛋白质的含量。例如，可以省略蛋白a亲和层析洗脱液的处理步骤如稀释或过滤。
如本文报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤
a)培养包含编码双特异性抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收双特异性抗体，
c)将双特异性抗体与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，
e)从亲和层析材料中回收双特异性抗体，
f)进行另外的层析步骤
从而产生双特异性抗体。
本文报道的一个方面是用于从样品纯化双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含双特异性抗体的样品，
b)将包含双特异性抗体的样品应用于亲和层析材料，
c)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，
d)从亲和层析材料中回收双特异性抗体，
e)进行另外的层析步骤
从而纯化双特异性抗体。
在所有方面的一个实施方案中，亲和层析步骤之后的另外的层析步骤是离子交换层析步骤或多元离子交换层析步骤。
在所有方面的一个实施方案中，亲和层析是蛋白a亲和层析或蛋白g亲和层析或单链fv配体亲和层析。在所有方面的一个优选实施方案中，亲和层析是蛋白a亲和层析。
在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液具有约0.5ms/cm或更小的电导率值。
在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.1mm至约8mmtris。
在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.05mm至约2mm磷酸钾。
在所有方面的一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7或更高的ph。
在所有方面的一个实施方案中，所述方法还包括在用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料之前或之后，用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
在一个实施方案中，高电导率水溶液具有约20ms/cm或更高的电导率值。在一个实施方案中，中等电导率水溶液具有大于0.5ms/cm至小于20ms/cm的电导率值。
在所有方面的一个实施方案中，高或中等电导率水溶液包含组氨酸。
在所有方面的一个实施方案中，双特异性抗体是包含以下的双特异性抗体，
a)与第一抗原特异性结合的第一全长抗体的重链和轻链；和
b)与第二抗原特异性结合的第二全长抗体的修饰的重链和修饰的轻链，其中恒定结构域cl和ch1被相互替换。
在所有方面的一个实施方案中，第一抗原是人vegf，第二抗原是人ang-2。
在所有方面的一个实施方案中，第一抗原是人ang-2，第二抗原是人vegf。
在所有方面的一个实施方案中，第一抗原是癌胚抗原(cea)，第二抗原是cd3。
在所有方面的一个实施方案中，第一抗原是cd3，第二抗原是癌胚抗原(cea)。
在所有方面的一个优选实施方案中，所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：1和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：2；并且所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：3和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：4。
发明详述
通常，高电导率缓冲液被描述为用于亲和层析法的洗涤步骤。由于例如高盐浓度，在从一个层析/分离步骤转换到另一个层析/分离步骤中可能需要进一步的方法步骤。来自一个层析步骤的洗脱液中的高电导率值可能对随后的层析步骤具有不利影响。
本文报道了使用亲和层析法的改进的纯化方法，其包括用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，接着进行另外的分离步骤。
如本文报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤
a)培养包含编码双特异性抗体的核酸的细胞，
b)从所述细胞或培养基中回收双特异性抗体，
c)使双特异性抗体(包含所述双特异性抗体的溶液)与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，而至少90％的双特异性抗体保持与亲和层析材料结合，
e)从亲和层析材料中回收双特异性抗体，
f)进行另外的层析步骤
从而产生双特异性抗体。
本文报道的一个方面是用于从样品纯化双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含双特异性抗体的(缓冲水性)样品，
b)将包含双特异性抗体的样品应用于亲和层析材料，
c)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，而至少90％的双特异性抗体保持与亲和层析材料结合，
d)从亲和层析材料中回收双特异性抗体,
e)进行另外的层析步骤
从而纯化双特异性抗体。
如本文报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤
a)培养包含编码双特异性抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收双特异性抗体，
c)使双特异性抗体(包含双特异性抗体的溶液)与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，而至少90％双特异性抗体保持与亲和层析材料结合，其中低电导率水溶液具有约0.5ms/cm或更小的电导率值，
e)从亲和层析材料中回收双特异性抗体，
f)进行另外的层析步骤
从而产生双特异性抗体。
本文报道的一个方面是用于从样品纯化双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含双特异性抗体的(缓冲水性)样品，
b)将包含双特异性抗体的样品应用于亲和层析材料，
c)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，而至少90％的双特异性抗体保持与亲和层析材料结合，其中低电导率水溶液具有约0.5ms/cm或更小的电导率值，
d)从亲和层析材料中回收双特异性抗体，
e)进行另外的层析步骤
从而纯化双特异性抗体。
在所有方面的一个实施方案中，亲和层析步骤之后的另外的层析步骤是离子交换层析步骤或多元离子交换层析步骤。在所有方面的一个优选实施方案中，亲和层析步骤之后的另外的层析步骤是多元阴离子交换层析步骤。在所有方面的一个实施方案中，亲和层析步骤后的另外的层析步骤是多元阳离子交换层析步骤。在所有方面的一个实施方案中，亲和层析步骤之后的另外的层析步骤是选自captoadhereimpres材料(多元阴离子交换层析介质，具有高流动性琼脂糖基质，多元强阴离子交换剂作为配体，平均粒度为36-44μm，离子容量为0.08-0.11mmolcl-/ml介质)的多元阴离子交换层析材料。
一般来说，必须在从一种柱材料到另一种柱材料的转化中执行某些额外的方法步骤，例如ph调节，缓冲液交换，稀释，渗滤或电导率调节。这例如是蛋白a层析洗脱液应用于随后的离子交换层析材料/树脂的情况。在此，如果层析树脂需要适当的功能，则上样的电导率值不能超过某个低水平。例如，某些杂质的去除会受到不利影响。已经发现如果在先前的亲和层析步骤中使用低电导率水溶液洗涤步骤，则可以在将洗脱液装载到下一个层析柱/层析材料之前避免进一步的方法步骤。该洗涤步骤能够对亲和层析(例如蛋白a)洗脱液中的最终电导率具有显著的影响。
表1
已经发现，如果在洗涤步骤中使用的水溶液的电导率低，即使用低电导率水溶液进行洗涤，则可以降低宿主细胞蛋白质的含量。在所有方面的一个优选实施方案中，低电导率水溶液具有约0.5ms/cm或更小的电导率值。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有从约0.03μs/cm至约0.5ms/cm的电导率值。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有从约0.05μs/cm至约0.35ms/cm的电导率值。在一个实施方案中，低电导率水溶液是高度纯化/去离子水。
已经发现蛋白a亲和层析可用于本文所报道的目的。在所有方面的一个优选实施方案中，亲和层析是蛋白a亲和层析。在一个实施方案中，蛋白a亲和层析选自mabselectsure亲和层析，prosepva亲和层析，mabcapturea亲和层析，prosepultraplus亲和层析。在一个实施方案中，亲和层析是蛋白g亲和层析。在一个实施方案中，亲和层析是使用重组蛋白作为配体的亲和层析，这意味着亲和层析是重组蛋白配体亲和层析。在一个实施方案中，亲和层析是使用单链fv作为配体的亲和层析，这意味着亲和层析是单链fv配体亲和层析。在一个实施方案中，亲和层析包含偶联至层析基质的突变蛋白a或偶联至层析基质的蛋白a的片段。
已经发现可以降低(特异性)宿主细胞蛋白质的含量。已经发现特别是磷脂酶b样2(plbl2)的含量可以降低。在一个实施方案中，(特定)宿主细胞蛋白是中国仓鼠卵巢(cho)宿主细胞蛋白。在所有方面的一个优选实施方案中，(特异性)宿主细胞蛋白质是磷脂酶b样2(plbl2)或簇蛋白。在一个实施方案中，(特定)宿主细胞蛋白质是磷脂酶b样2(plbl2)。
已经发现，低电导率水溶液可以包含少量的tris或磷酸钾。在一个实施方案中，低电导率水溶液含有三(羟甲基)氨基甲烷(tris)。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.1mm至约10mmtris。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.5mm至约6.5mmtris。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约2mmtris。在一个实施方案中，低电导率水溶液含有磷酸钾。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.05mm至约5mm磷酸钾。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.05mm至约2mm磷酸钾。在一个实施方案中，低电导率水溶液包含约0.5mm磷酸钾。
已经发现，如果低电导率水溶液具有一定的ph，则降低宿主细胞蛋白质含量的效果是显著的。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7或更高的ph。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7.5或更高的ph。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约7.5至约8.5的ph。在一个实施方案中，低电导率水溶液具有约8的ph。
已经发现，通过本文报道的方法，可以将宿主细胞蛋白如plbl2的含量降低到一定水平，例如，当与纯化步骤如亲和层析步骤之前的plbl2的上样量进行比较时。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少20倍。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少40倍。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少50倍。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少90倍。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少100倍。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少50％。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少66％。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少80％。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少90％。在一个实施方案中，plbl2的含量降低至少95％。在一些实施方案中，plbl2的含量降低至低于10ng/mg抗体。在一些实施方案中，plbl2的含量降低至低于5ng/mg抗体。在一些实施方案中，plbl2的含量降低至低于2ng/mg抗体。
在本文报道的方法中，可以使用中等和/或高电导率水溶液进行进一步的洗涤步骤。在一个实施方案中，低电导率水溶液洗涤步骤在高电导率水溶液洗涤步骤之前或之后进行。在一个实施方案中，高电导率水溶液具有约20ms/cm或更高的电导率值。在一个实施方案中，高电导率水溶液具有从约20ms/cm至约100ms/cm的电导率值。在一个实施方案中，在低电导率水溶液洗涤步骤和高电导率水溶液洗涤步骤之间用中等电导率水溶液进行中间洗涤步骤。在一个实施方案中，中等电导率水溶液具有大于0.5ms/cm至小于20ms/cm的电导率值。
已经发现，当高或中等电导率水溶液进一步包含氨基酸时，可以改善宿主细胞蛋白质减少效果。在一个实施方案中，高或中等电导率水溶液包含氨基酸。在一个实施方案中，高或中等电导率水溶液包含组氨酸。在一个实施方案中，高或中等电导率水溶液包含组氨酸和tris。
已经发现可以省略疏水作用层析步骤的使用。在一个实施方案中，所述用途或方法不具有疏水性相互作用层析法/步骤。
如本文报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括
a)培养包含编码双特异性抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收双特异性抗体，
c)将双特异性抗体与蛋白a亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤蛋白a亲和层析材料，
e)从蛋白a亲和层析材料中回收双特异性抗体，
f)进行另外的层析步骤
从而产生双特异性抗体，
其中所述亲和层析步骤之后的所述另外的层析步骤是多元阴离子交换层析步骤，并且其中所述低电导率水溶液是水，并且其中所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：1，和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：2；并且所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：3和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：4。
本文报道的一个方面是用于从样品纯化双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含双特异性抗体的样品，
b)将包含双特异性抗体的样品应用于蛋白a亲和层析材料，
c)用低电导率水溶液洗涤蛋白a亲和层析材料，
d)从蛋白a亲和层析材料中回收双特异性抗体,
e)进行另外的层析步骤，
从而纯化双特异性抗体，
其中所述亲和层析步骤之后所述另外的层析步骤是多元阴离子交换层析步骤，并且其中所述低电导率水溶液是水，并且其中所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：1，和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：2；并且所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：3和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：4。
如本文报道的一个方面是用于产生双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤
a)培养包含编码双特异性抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收双特异性抗体，
c)将双特异性抗体与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，其中低电导率水溶液具有约0.5ms/cm或更小的电导率值，
e)从亲和层析材料中回收双特异性抗体，
f)进行另外的层析步骤，
从而产生双特异性抗体。
本文报道的一个方面是用于纯化双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤
a)培养包含编码双特异性抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收双特异性抗体，
c)将双特异性抗体与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，其中低电导率水溶液具有约0.5ms/cm或更小的电导率值，
e)从亲和层析材料中回收双特异性抗体，
f)进行另外的层析步骤，
从而产生双特异性抗体。
本文使用的术语“方法”还包括各个方法步骤的用途，用于(直接)在后面的另外的层析步骤之前避免电导率调节步骤。尤其是，避免电导率调整是在病毒灭活步骤之后和之后(直接)进行的离子交换层析步骤之前。
如本文报道的一个方面是使用本文报道的方法的步骤在从亲和层析材料回收双特异性抗体之后且在进行另外的层析步骤之前避免电导率调节步骤。
术语“抗ang2/vegf抗体”和“结合ang2和vegf的双特异性抗体”或“针对ang2和vegf的双特异性抗体”是指能够以足够的亲和力结合ang2和vegf的抗体，使得抗体用作靶向ang2和vegf的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗-ang2/vegf抗体与无关的非-ang2或vegf蛋白的结合程度小于抗体与ang2和vegf的结合的约10％，例如通过elisa或表面等离振子共振测量。在某些实施方案中，抗ang2/vegf抗体结合ang2的表位和vegf的表位，其在来自不同物种的ang2或vegf中是保守的。上述也适用于术语“针对因子ixa和因子x的双特异性抗体”或“针对her3和egfr的双特异性抗体”等。
在本文报道的方法中使用的特异性抗体是如wo2012/067176中所述的针对因子ixa和因子x的双特异性抗体(抗-fixa/x抗体；igg4同种型)，如wo2011/117329或seqidno：01至04中所述的针对血管生成素2(ang2)和血管内皮生长因子a(vegf-a)的双特异性抗体(抗ang2/vegf-a抗体；vanucizumab；igg1同种型)，或针对her3和egfr的双特异性抗体(抗her3/egfr抗体；igg1同种型)。术语vegf或vegf-a可以在本文中互换使用。
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”是指在体外测定，优选在表面等离振子共振测定(spr，biacore，ge-healthcareuppsala，瑞典)中抗体与抗原表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体结合的速率常数)，kd(解离常数)和kd(kd/ka)定义。结合或特异性结合是指10-7mol/l或更小的结合亲和力(kd)。
本文中的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原-结合活性。
“抗体片段”是指完整抗体以外的分子，其包含与完整抗体结合的抗原结合的完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于fv,fab,fab',fab’-sh,f(ab')2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。fab片段是通过木瓜蛋白酶消化(全长/完整)抗体获得的抗体片段。
“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。如本文所用的术语“双特异性”抗体表示具有至少两个结合位点的抗体，每个结合位点结合不同的表位。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来自不同来源或物种。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类别。有五种主要类别的抗体：iga，igd，ige，igg和igm，其中这些的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如igg1,igg2,igg3,igg4,iga1,和iga2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α,δ,ε,γ,和μ。
本文的术语“fc-区”用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的c末端区。该术语包括天然序列fc区和变体fc区。在一个实施方案中，人igg重链fc区从cys226或从pro230延伸至重链的羧基末端。然而，fc区的c-末端赖氨酸(lys447)或c-末端甘氨酰-赖氨酸二肽(gly446lys447)可能存在或可能不存在。除非本文另外指明，否则fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据eu编号系统(也称为eu索引)，如kabat,e.a.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991),nihpublication91-3242所述。
“构架”或“fr”是指除高变区(hvr)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的fr通常由四个fr结构域组成：fr1，fr2，fr3和fr4。因此，hvr和fr序列通常在vh(或vl)中以以下顺序出现：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指的是已经导入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。子代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变子代。术语“细胞”包括用于表达核酸的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是cho细胞(例如chok1，chodg44)或bhk细胞或ns0细胞或sp2/0细胞或hek293细胞或hek293ebna细胞或per.
术语“洗涤”表示将溶液应用于亲和层析材料以从层析材料中除去非特异性结合的多肽和非多肽化合物，尤其是除去宿主细胞蛋白和宿主细胞dna。术语“洗涤”不包括从亲和层析材料洗脱结合的材料。
用于蛋白质回收和纯化的不同方法已经被很好地确立和广泛使用，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白a或蛋白g亲和层析)，使用重组蛋白质作为配体(例如单链fv作为配体，例如kappa选择)的亲和层析，离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他sh配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析(例如用苯基-琼脂糖，氮杂-arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸)，金属螯合物亲和层析(例如用ni(ii)-和cu(ii)-亲和材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)。这些方法可以在本文中报道的不同实施方式中独立地组合。
术语“蛋白a”表示从天然来源获得或合成产生的蛋白a多肽。
术语“蛋白a层析材料”表示蛋白a共价连接的惰性固相。
在一个实施方案中，蛋白a层析材料选自mabselectsure,prosepva,mabcapturea,prosepultraplus,mabselect,mabselectxtra,porosa,或prosepa。
术语“高电导率水溶液”是指具有高电导率值的水溶液。电导率值可以是约20ms/cm或更高。
术语“中等电导率水溶液”是指具有中等电导率值的水溶液。电导率值可以大于0.5ms/cm至小于20ms/cm。
术语“低电导率水溶液”是指具有低电导率值的水溶液。电导率值可以是大约0.5ms/cm或更小。如果ph约为8.5或更高，则电导率值可以是约1.2ms/cm或更小。
本发明的具体实施方案
1.生产双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤
a)培养包含编码双特异性抗体的核酸的细胞，
b)从细胞或培养基中回收双特异性抗体，
c)将双特异性抗体与亲和层析材料接触，
d)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，
e)从亲和层析材料中回收双特异性抗体，
f)进行另外的层析步骤，
从而产生双特异性抗体。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述亲和层析步骤之后的所述另外的层析步骤是离子交换层析步骤或多元离子交换层析步骤。
3.根据实施方案1至2中任一项的方法，其中亲和层析步骤之后的另外的层析步骤是多元阴离子交换层析步骤。
4.根据实施方案1至3中任一项的方法，其中所述多元阴离子交换层析材料选自captoadhereimpres材料(具有高流动的琼脂糖的基质的多元阴离子交换层析介质，多元强阴离子交换剂作为配体，平均粒径为36-44μm，离子容量为0.08-0.11mmolcl-/ml培养基)。
5.根据实施方案1至4中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约0.5ms/cm或更小的电导率值。
6.根据实施方案1至5中任一项的方法，其中低电导率水溶液具有从约0.03μs/cm至约0.5ms/cm的电导率值。
7.根据实施方案1至6中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有从约0.05μs/cm至约0.35ms/cm的电导率值。
8.根据实施方案1至5中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液是高度纯化的/去离子水。
9.根据实施方案1至8中任一项的方法，其中亲和层析是蛋白a亲和层析或蛋白g亲和层析或单链fv配体(kappaselect)亲和层析。
10.根据实施方案1至9中任一项的方法，其中亲和层析是蛋白a亲和层析。
11.根据实施方案1至10中任一项的方法，其中蛋白a亲和层析选自mabselectsure亲和层析，prosepva亲和层析，mabcapturea亲和层析，prosepultraplus亲和层析。
12.根据实施方案1至11中任一项的方法，其中(特异性)宿主细胞蛋白质的含量降低。
13.根据实施方案1至12中任一项的方法，其中所述(特异性)宿主细胞蛋白是中国仓鼠卵巢(cho)宿主细胞蛋白。
14.根据实施方案1至13中任一项的方法，其中所述(特异性)宿主细胞蛋白是磷脂酶。
15.根据实施方案1至14中任一项的方法，其中所述(特异性)宿主细胞蛋白是磷脂酶a，磷脂酶b，磷脂酶c或磷脂酶d。
16.根据实施方案1至15中任一项的方法，其中所述(特异性)宿主细胞蛋白是磷脂酶b样2(plbl2)。
17.根据实施方案1至16中任一项的方法，其中所述(特异性)宿主细胞蛋白是磷脂酶b样2(plbl2)或簇蛋白。
18.根据实施方案1至17中任一项的方法，其中低电导率水溶液含有三(羟甲基)氨基甲烷(tris)。
19.根据实施方案1至18中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mm至约10mmtris。
20.根据实施方案1至19中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mm至约8mmtris。
21.根据实施方案1至20中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mm至约6.5mmtris。
22.根据实施方案1至21中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约2mmtris。
23.根据实施方案1至17中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液含有磷酸钾。
24.根据实施方案1至17中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.2mm至约5mm磷酸钾。
25.根据实施方案1至17中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.05mm至约2mm磷酸钾。
26.根据实施方案1至17中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mm磷酸钾。
27.根据实施方案1至26中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7或更高的ph。
28.根据实施方案27中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7.5或更高的ph。
29.根据实施方案1至26中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7至约9.5的ph。
30.根据实施方案1至27中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7.5至约8.5的ph。
31.根据实施方案1至27中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约8的ph。
32.根据实施方案1至31中任一项的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前或之后，用高电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
33.根据实施方案1至32中任一项的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料之前用高电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
34.根据实施方案1至33中任一项的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前或之后用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
35.根据实施方案1至34中任一项的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料之前用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
36.根据实施方案32至35中任一项的方法，其中所述高电导率水溶液具有约20ms/cm或更高的电导率值。
37.根据实施方案32至36中任一项的方法，其中所述高电导率水溶液具有从约20ms/cm至约100ms/cm的电导率值。
38.根据实施方案32至37中任一项的方法，其中所述中等电导率水溶液具有大于0.5ms/cm至小于20ms/cm的电导率值。
39.根据实施方案32至38中任一项的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含氨基酸。
40.根据实施方案32至39中任一项的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸。
41.根据实施方案32至40中任一项的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸和tris。
42.根据实施方案1至41中任一项的方法，其中所述方法不具有疏水相互作用层析方法/步骤。
43.根据实施方案1至42中任一项的方法，其中所述双特异性抗体是这样的双特异性抗体，其包含a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链；和b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的修饰的重链和修饰的轻链，其中所述恒定结构域cl和ch1被相互替换。
44.根据实施方案1至43中任一项的方法，其中所述双特异性抗体是针对因子ixa和因子x的双特异性抗体或针对her3和egfr的双特异性抗体或针对ang2和vegf的双特异性抗体。
45.根据实施方案1至44中任一项的方法，其中第一抗原是人vegf，第二抗原是人ang-2或第一抗原是人ang-2并且第二抗原是人vegf。
46.根据实施方案44至45中任一项的方法，其中所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：1，和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：2；并且所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：3和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：4。
47.从样品纯化双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包含特异性结合第一抗原的第一抗原结合位点和特异性结合第二抗原的第二抗原结合位点，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含双特异性抗体的样品，
b)将包含双特异性抗体的样品应用于亲和层析材料，
c)用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料，
d)从亲和层析材料中回收双特异性抗体，
e)进行另外的层析步骤
从而纯化双特异性抗体。
48.根据实施方案47的方法，其中亲和层析步骤之后的另外的层析步骤是离子交换层析步骤或多元离子交换层析步骤。
49.根据实施方案47至48中任一项的方法，其中所述亲和层析步骤之后的所述另外的层析步骤是多元阴离子交换层析步骤。
50.根据实施方案49的方法，其中所述多元阴离子交换层析材料选自captoadhereimpres材料(具有高流动性琼脂糖基质的多元阴离子交换层析，多元强阴离子交换剂作为配体，平均粒度为36-44μm，离子容量为0.08-0.11mmolcl-/ml介质)。
51.根据实施方案47至50中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约0.5ms/cm或更小的电导率值。
52.根据实施方案47至51中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有从约0.03μs/cm至约0.5ms/cm的电导率值。
53.根据实施方案47至52中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有从约0.05μs/cm至约0.35ms/cm的电导率值。
54.根据实施方案47至51中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液是高度纯化的/去离子水。
55.根据实施方案47至54中任一项的方法，其中所述亲和层析是蛋白a亲和层析或蛋白g亲和层析或单链fv配体(kappaselect)亲和层析。
56.根据实施方案47至55中任一项的方法，其中所述亲和层析是蛋白a亲和层析。
57.根据实施方案47至56中任一项的方法，其中蛋白a亲和层析选自包含mabselectsure亲和层析，prosepva亲和层析，mabcapturea亲和层析，prosepultraplus亲和层析的组。
58.根据实施方案47至57中任一项的方法，其中(特定)宿主细胞蛋白质的含量降低。
59.根据实施方案47至58中任一项的方法，其中所述(特定)宿主细胞蛋白是中国仓鼠卵巢(cho)宿主细胞蛋白。
60.根据实施方案47至59中任一项的方法，其中(特定)宿主细胞蛋白是磷脂酶。
61.根据实施方案47至60中任一项的方法，其中所述(特异性)宿主细胞蛋白质是磷脂酶a，磷脂酶b，磷脂酶c或磷脂酶d。
62.根据实施方案47至61中任一项的方法，其中所述(特异性)宿主细胞蛋白质是磷脂酶b样2(plbl2)。
63.根据实施方案47至62中任一项的方法，其中所述(特异性)宿主细胞蛋白质是磷脂酶b样2(plbl2)或簇蛋白。
64.根据实施方案47至63中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液含有三(羟甲基)氨基甲烷(tris)。
65.根据实施方案47至64中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mm至约10mmtris。
66.根据实施方案47至65中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.1mm至约8mmtris。
67.根据实施方案47至66中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mm至约6.5mmtris。
68.根据实施方案47至67中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约2mmtris。
69.根据实施方案47至68中任一项的方法，其中低电导率水溶液含有磷酸钾。
70.根据实施方案47至69中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.2mm至约5mm磷酸钾。
71.根据实施方案47至69中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.05mm至约2mm磷酸钾。
72.根据实施方案47至71中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液包含约0.5mm磷酸钾。
73.根据实施方案47至72中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7或更高的ph。
74.根据实施方案47至73中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7.5或更高的ph。
75.根据实施方案47至73中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7至约9.5的ph。
76.根据实施方案47至74中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约7.5至约8.5的ph。
77.根据实施方案47至54中任一项的方法，其中所述低电导率水溶液具有约8的ph。
78.根据实施方案47至77中任一项的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前或之后，用高电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
79.根据实施方案47至77中任一项的方法，其中所述方法还包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前用高电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
80.根据实施方案47至77中任一项的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料之前或之后用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤所述亲和层析材料。
81.根据实施方案47至77中任一项的方法，其中所述方法另外包括在用低电导率水溶液洗涤亲和层析材料之前用高电导率水溶液和/或用中等电导率水溶液洗涤亲和层析材料。
82.根据实施方案78至81中任一项的方法，其中所述高电导率水溶液具有约20ms/cm或更高的电导率值。
83.根据实施方案78至82中任一项的方法，其中所述高电导率水溶液具有从约20ms/cm至约100ms/cm的电导率值。
84.根据实施方案78至83中任一项的方法，其中所述中等电导率水溶液具有从大于0.5ms/cm到小于20ms/cm的电导率值。
85.根据实施方案78至84中任一项的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含氨基酸。
86.根据实施方案78至85中任一项的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸。
87.根据实施方案78至86中任一项的方法，其中所述高或中等电导率水溶液包含组氨酸和tris。
88.根据实施方案47至87中任一项的方法，其中所述方法没有疏水相互作用层析方法/步骤。
89.根据实施方案47至88的方法，其中所述双特异性抗体是这样的双特异性抗体，其包含a)特异性结合第一抗原的第一全长抗体的重链和轻链；和b)特异性结合第二抗原的第二全长抗体的修饰的重链和修饰的轻链，其中恒定结构域cl和ch1被相互替换。
90.根据实施方案47至89中任一项的方法，其中所述双特异性抗体是针对因子ixa和因子x的双特异性抗体或针对her3和egfr的双特异性抗体或针对ang2和vegf的双特异性抗体。
91.根据实施方案47至54的方法，其中第一抗原是人vegf，第二抗原是人ang-2或第一抗原是人ang-2，第二抗原是人vegf。
92.根据实施方案90至91的方法，其中所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：1和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：2；并且所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域(vh)的seqidno：3和作为轻链可变结构域(vl)的seqidno：4。
提供以下实施例和序列以帮助理解本发明，其真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解的是，在不背离本发明的精神的情况下，可以对所述过程进行修改。
序列表描述
实施例1
材料与方法
抗体
本发明以如wo2012/067176中所述的针对因子ixa和因子x(抗-fixa/x抗体；igg4同种型)的双特异性抗体，如wo2011/117329或seqidno：01至04中所述的针对ang2和vegf-a的双特异性抗体(抗-ang2/vegf-a抗体；vanucizumab；igg1同种型)，或针对her3和egfr的双特异性抗体(抗her3/egfr抗体；igg1同种型)举例说明。
总体宿主细胞蛋白(hcp)，磷脂酶b样蛋白2(plbl2)和簇蛋白的检测方法
a)chohcp测定
方法样品中残余的chohcp含量通过在cobase411免疫测定分析仪(rochediagnostics)上的电化学发光免疫测定法(eclia)测定。
该测定基于夹心原理，使用来自绵羊的多克隆抗chohcp抗体。
第一次温育：来自15μl样品(纯净的和/或稀释的)的中国仓鼠卵巢宿主细胞蛋白(chohcp)和生物素缀合的多克隆chohcp特异性抗体形成夹心复合物，其通过生物素与链霉抗生物素蛋白的相互作用变得结合到链霉抗生物素蛋白包被的微粒。
第二次温育：加入用钌络合物(三(2,2'-联吡啶)钌(ii)络合物)标记的多克隆chohcp特异性抗体后，在微粒上形成三元夹心复合物。
将反应混合物吸入测量室中，在其中将微粒通过磁力捕获到电极表面上。然后在洗涤步骤中除去未结合的物质。然后施加电压到电极，诱导化学发光发射，其由光电倍增管测量。
最终从已知浓度的chohcp标准曲线计算出测试样品中chohcp的浓度。
b)choplbl2测定
方法样品中残余的中国仓鼠卵巢(cho)磷脂酶b样2蛋白(plbl2)含量通过cobase411免疫测定分析仪(rochediagnostics)上的电化学发光免疫测定法(eclia)测定。
该测定基于夹心原理，使用来自小鼠的单克隆抗choplbl2抗体。
在第一个温育步骤中，来自30μl样品(纯的和/或稀释的)的choplbl2，生物素标记的单克隆choplbl2特异性抗体和钌络合物(三(2,2'-联吡啶)钌(ii)-络合物)标记的单克隆choplbl2特异性抗体形成夹心复合物。
在加入链霉抗生物素蛋白包被的微粒后的第二步中，三元复合物通过生物素和链霉抗生物素蛋白的相互作用而结合到固相上。
将反应混合物吸入测量室中，在其中将微粒通过磁力捕获到电极表面上。然后在洗涤步骤中除去未结合的物质。向电极施加电压然后诱导化学发光，其由光电倍增管测量。
最终从已知浓度的choplbl2标准曲线计算测试样品中choplbl2的浓度。
c)簇蛋白测定
方法样品中残留的簇蛋白含量是根据制造商的说明书通过merckmillipore(gyromarkhtkitgyrclu-37k)的商业测定法来确定的。
简言之，该测定法是基于夹心elisa的，依次为：
1)将大鼠簇蛋白生物素化捕获抗体结合到bioaffy1000nlcd的链霉抗生物素蛋白包被的亲和柱上，
2)从样品捕获大鼠簇蛋白分子到抗簇蛋白抗体，
3)第二种染料标记的抗簇蛋白检测抗体与捕获的分子的结合，
4)使用gyrolabevaluator对大鼠簇蛋白进行定量。
实施例2
在蛋白a层析中纯化双特异性抗-ang2/vegf-a抗体(igg1同种型)
抗体：抗ang2/vegf-a抗体
通用层析条件：
柱树脂：蛋白a材料“mabselectsure”(ge-healthcare)
装备：
流速：所有步骤中均为300cm/h
平衡柱(步骤1)后，将含有抗-ang2/vegf-a抗体的溶液应用于蛋白a亲和柱。在含有抗ang2/vegf-a抗体的溶液中测定的plbl2的初始上样量：919.7ngplbl2/mg抗体。在含有抗ang2/vegf-a抗体的溶液中测定的chop的初始上样量：682304ngchop/mg抗体。
层析步骤按照以下一般方案进行：
步骤1：平衡：
步骤2：加载含有抗体的溶液
步骤3：洗涤i
步骤4：洗涤ii
步骤5：洗涤iii
步骤6：洗涤iv(额外洗涤)
步骤7：洗脱
从蛋白a亲和柱洗脱后，通过大小排阻层析法(sec)和分光光度法(od)分析测定蛋白质。
sec:
od：
比系数：1,54
波长：280nm减去320nm
蛋白a层析的特定缓冲液条件
a)对照(只用平衡缓冲液洗涤)
c)高电导率洗涤(仅使用tris缓冲液)
d)低电导率tris+高电导率组氨酸(his)/tris
实施例3
在蛋白a层析中纯化双特异性抗fixa/x抗体(igg4同种型)
在两种不同的层析设置中测试抗fixa/x抗体的纯化：
设置1
一般条件是根据实施例2中描述的条件。
抗体：抗fixa/x
在含有抗fixa/x抗体的溶液中确定的plbl2的初始上样量：557ngplbl2/mg抗体。在含有抗fixa/x的溶液中测定chop的初始上样量：387377ngchop/mg抗体。
蛋白a层析的特定缓冲条件
a)高电导率洗涤(只用tris缓冲液)
b)低电导率tris+高电导率组氨酸(his)/tris
设置2
通用层析条件
柱树脂：蛋白a材料“mabselectsure”(ge-healthcare)
设备：
流速：所有步骤中均为300cm/h
柱的平衡(步骤1)后，将含有抗fixa/x抗体的溶液施加到蛋白a亲和柱上。
在含有抗fixa/x抗体的溶液中确定的plbl2的初始上样量：557ngplbl2/mg抗体。在含有抗fixa/x抗体的溶液中确定的chop的初始上样量：387377ngchop/mg抗体。
层析步骤按照以下一般方案进行：
步骤1:平衡:
步骤2:含有抗体的溶液的上样
步骤3:洗涤i
步骤4:洗涤ii
步骤5:洗涤iii(额外洗涤)
步骤6:洗脱
蛋白a层析的特定缓冲条件
a)高电导率洗涤(仅使用naso4缓冲液)
b)低电导率洗涤(tris1mm)+高电导率洗涤(用naso4)
c)低电导率洗涤(tris2mm)+高电导率洗涤(用naso4)
d)低电导率洗涤(tris4mm)+高电导率洗涤(用naso4)
e)低电导率洗涤(tris6mm)+高电导率洗涤(用naso4)
f)低电导率洗涤(tris4mm,ph7.8)+高电导率洗涤(用naso4)
g)低电导率洗涤(tris4mm,ph8.2)+高电导率洗涤(用naso4)
h)低电导率洗涤(tris2mm)+高电导率洗涤(用组氨酸(his)/tris1m)
i)低电导率洗涤(tris2mm)+高电导率洗涤(组氨酸(his)/tris0.85m)
j)低电导率洗涤(tris2mm)+高电导率洗涤(组氨酸(his)/tris0.7m)
k)低电导率洗涤(tris2mm)+高电导率洗涤(组氨酸(his)/tris0.55m)
实施例4
一般程序/条件：
模拟细胞培养液
使用在无血清培养基中培养的未转染的cho-dp12细胞产生空白的收获的细胞培养液。使用代表性细胞培养方法以2l规模进行发酵。在发酵14天结束时，通过离心和无菌过滤收获细胞培养液。然后将收获的细胞培养液(hccf)储存在-70℃直到实验。
纯化的plbl2
具有c-末端六组氨酸标签的重组choplbl2在35l规模的瞬时转染中表达，并如之前所述从收获的细胞培养液中纯化(vanderlaan等，2015)。然后将纯化的plbl2配制在pbs溶液中并保存在-70℃直到实验。
纯化的抗体
在cho细胞中表达重组人源化抗体(针对her3和egfr的双特异性抗体(抗her3/egfr抗体；igg1同种型))，并使用柱层析纯化以确保plbl2浓度低于20ng/mg。在开始每个研究之前，使用pd-10脱盐柱(gehealthcare)将每种抗体缓冲液交换到pbs中。
蛋白a层析的上样材料的制备
对于填充床柱层析，为了使蛋白a上样中的宿主细胞蛋白质的群体和丰度在抗体之间归一化，使用pbs将纯化的抗体稀释至相同浓度，并掺入来自非生产细胞系的hccf中以产生最终抗体滴度为5g/l。还制备了对照，其中加入pbs代替纯化的抗体以评估在不存在抗体的情况下与蛋白a树脂结合的非特异性宿主细胞蛋白。
对于每个高通量蛋白a批次纯化实验，上样在96孔板中制备。在每孔中，将纯化的抗体与不同比例的plbl2和pbs混合以达到靶标相对plbl2浓度：0-20,000ng/mg，和5g/l抗体滴度。
填充床柱层析
所有填充床柱层析实验使用0.66cm内径×20cm床高mabselectsure(gehealthcare)蛋白a树脂柱进行。对于每次纯化，首先将柱用25mmtris，25mmnacl，ph7.7(平衡缓冲液)平衡3个柱体积(cv)。然后将蛋白a上样应用于30μg抗体/树脂的目标上样密度，之后用平衡缓冲液洗涤柱3个cv，不同类型洗涤缓冲液洗涤3个cv，再用平衡缓冲液洗涤3个cv。随后，用0.1m乙酸(ph2.8)在低ph下洗脱抗体，从洗脱峰开始时以0.5od开始收集洗脱液合并液；在2.8个cv之后终止合并。为了用pbs掺杂的空hccf控制运行，在洗脱阶段开始之后，从1cv到3.8cv开始产生2.8cv模拟洗脱合并液。在每次运行结束时，使用1.5mtris碱将每种蛋白a洗脱液滴定至ph5.0。然后用0.1m氢氧化钠溶液清洁柱子。除了上样，第一次平衡洗涤和洗脱阶段(流速为15cv/h)外，所有阶段的体积流速为20cv/h。
a)在蛋白a层析中纯化抗-her3/egfr抗体(igg1同种型)
用于使用实施例4的一般程序纯化抗-her3/egfr抗体(igg1同种型)的特定洗涤缓冲液条件：
a)去离子水
实施例5
在蛋白a层析中纯化双特异性抗-ang2/vegf-a抗体，另外用高纯去离子水洗涤
通过mabselectsure亲和层析以结合洗脱模式处理来自cho表达培养物的收获的细胞培养液(hccf)。将hccf加载到柱上以达到38gmab/lresin的最大上样密度后，将柱用25mmtris，25mmnacl，ph7.2洗涤5个柱体积。然后，用0.7mtris/hcl，ph7.2进行5个柱体积的额外洗涤。第三次洗涤步骤使用高度纯化的水进行五个柱体积。用50mm乙酸盐，ph3.4洗脱柱结合的抗体。基于500到250mau(路径长度1cm)的od280在最多三个柱体积内收集洗脱合并液。
用乙酸将亲和洗脱合并液调节至ph3.5并保持30分钟。然后将合并液用1.5mtris碱调节至ph5.0，并通过深度过滤澄清。深度过滤合并液用1.5mtris碱调节至ph7.0。经调节的合并液的电导率值被确定为低于6ms/cm。在将材料装载到下一个层析柱，即captoadhereimpres之前，不需要用水稀释步骤。
结果：
实施例6
在蛋白a层析中纯化双特异性抗-ang2/vegf-a抗体，而不用高纯度去离子水另外洗涤(比较实施例)
通过mabselectsure亲和层析以结合洗脱模式处理来自cho表达培养物的收获的细胞培养液(hccf)。将hccf装载到柱上以达到38gmab/lresin的最大装载密度后，将柱用25mmtris，25mmnacl，ph7.2洗涤5个柱体积。然后，用0.7mtris/hcl，ph7.2进行5次柱体积的额外洗涤。再次使用25mmtris，25mmnacl，ph7.2进行第三次洗涤步骤。用50mm乙酸盐，ph3.4洗脱柱结合的抗体。基于500到250mau(路径长度1cm)的od280在最多三个柱体积内收集洗脱合并液。
用乙酸将亲和洗脱合并液调节至ph3.5并保持30分钟。然后将合并液用1.5mtris碱调节至ph5.0，并通过深度过滤澄清。深度过滤合并液用1.5mtris碱调节至ph7.0。调节的合并液的电导率值被确定为6ms/cm。在将材料装载到下一个层析柱即captoadhereimpres之前，需要用水另外进行稀释步骤。
结果：