微小RNA‑328反义组合物与医疗用途的制作方法

本发明涉及寡脱氧核糖核苷酸或锁定核酸(lna)修饰的和硫代磷酸酯键修饰的寡核苷酸形式的反义微小rna-328，及其在治疗眼部疾病如近视等的治疗用途。
背景技术：
：近视导致眼睛增长，进而拉长及变薄眼睛的视网膜和巩膜。因此近视的眼睛比正常的眼睛具有较长的眼轴长度(axiallength)。值得注意的是，眼轴长度可在个体间变化。在动物研究中，一只眼睛被诱导为近视而另一只眼睛用作对照。被诱导的近视的眼睛与对照眼睛之间眼轴长度的差异可以用来表示近视的严重程度。此外，眼轴长度差异的改变也可用作读数来评估抗近视治疗的治疗效果。眼球的增长被认为是造成近视并发症如视网膜脱落、黄斑变性等的主要潜在机制。这也说明了屈光矫正而没有预防眼轴长度增长(例如配戴眼镜)无法预防近视并发症。配对框6(pax6)基因属于包含配对与同源异型框(homeobox)dna结合结构域的转录因子的高度保守家族。pax6涉及中枢神经系统与眼睛的发育。其在诱导晶状体与视网膜分化的过程中发挥重要的作用，且被视为眼睛发育的主导基因。在人类中，pax6的突变与多种眼部疾病有关，包含无虹膜(aniridia)、中央凹发育不良(fovealhypoplasia)、早老性白内障(presenilecataract)和无虹膜相关角膜病变(aniridia-relatedkeratopathy)(来自tsonis和fuentes的综述)。除了生物学合理性外，全基因组关联研究(genome-widelinkagestudy)揭露了屈光不正与pax6基因座有强烈的关联性。因此，pax6被建议为近视发展的候选基因。低水平的pax6可能是近视的危险因素。微小rna(mirna)为长度约21-23个核苷酸的非编码、单链rna分子。在动物中，成熟的mirna与一个或多个信使rna(mrna)的3’非翻译区(utr)互补。mirna对其靶mrna的退火(annealing)导致蛋白质翻译的抑制和/或mrna的切割。mirna可调节细胞生长、分化与凋亡。chen等人(invest.ophthalmol.vis.sci.，53：2732-2739，2012)报告微小rna-328(mir-328)可通过介导pax6基因影响近视的发展。附图简述图1显示rpe细胞在mir-328反义dna(15mer-30mer)及对照转染后mir-328的相对表达水平。显示平均值和标准偏差(n＝3)。图2显示rpe细胞在锁定核酸和硫代磷酸酯键(401-406)修饰的mir-328反义dna及对照转染后mir-328的相对表达水平。显示平均值和标准偏差(n＝3)。图3显示小鼠用盐水对照(ns)、dna16mer、dna17mer、lna403、lna404和lna405处理后的右眼(近视)和左眼之间的眼轴长度差(deltaaxiallength)。图4显示小鼠用盐水对照(盐水)、1％阿托品(阿托品)、dna16mer和lna403处理后的右眼(近视)和左眼之间的眼轴长度差。图5显示小鼠用盐水对照(盐水)、1％阿托品、10nm、100nm与1μmdna16mer处理后的右眼(近视)和左眼之间的眼轴长度差。图6显示兔子用盐水对照(盐水)、10μm和50μmdna16mer处理后的右眼(近视)和左眼之间的眼轴长度差。发明详述定义“锁定核酸(lockednucleicacid，lna)”通常是指难以接近的rna，是一种经修饰的rna核苷酸。lna核苷酸的核糖部分被连接2’氧与4’碳的额外桥所修饰。该桥将核糖“锁定”成3’内型(north)构型，这样的构型常见于a型双螺旋中。lna核苷酸当有需要时可在寡核苷酸中与dna或rna残基混合。本文所用的“寡脱氧核糖核苷酸”是指具有5-50个碱基、优选10-30个碱基或15-30个碱基长度的脱氧核糖核酸(dna)。任选地该dna的碱基或磷酸二酯键是修饰的。本文所用的“寡核糖核苷酸”是指具有5-50个碱基、优选10-30个碱基或15-30个碱基长度的核糖核酸(rna)。任选地该rna是修饰的。本文所用的“寡核苷酸”是指寡脱氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸，或两者的混合。“硫代磷酸酯”是正常dna的变体，其中至少一个磷酸二酯键的非桥连氧原子被硫原子所取代。核苷酸间键的硫化作用显著地减弱核酸内切酶和核酸外切酶的作用。在人类血清中，包含硫代磷酸酯(ps)键提高寡核苷酸半衰期，然而，ps键的引入可降低寡核苷酸的结合亲和力并可导致细胞毒性。本发明涉及对mir-328反义的寡核苷酸序列。在一个实施方案中，寡核苷酸为具有特定长度的寡脱氧核糖核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸具有lna修饰以及硫代磷酸酯修饰。本发明的寡核苷酸在预防或治疗眼部疾病(如近视)是有用的。人类成熟的mir-328具有cuggcccucucugcccuuccgu(seqidno：1)的序列。在本发明的第一方面，发明人根据成熟的人类mir-328设计出反义mir-328寡脱氧核糖核苷酸(长度为15-22mer)，并根据成熟前人类mir-328序列设计出反义mir-328寡脱氧核糖核苷酸(长度为23-30mer)。接着，发明人获得了具有15-30个碱基(15-30mer)的mirna-328反义dna并测试其活性。15mer-30merdna的序列示于表1中。表1反义dna序列发明人发现在体外测试的16组反义dna中，仅16mer和17mer抑制mir-328的表达。出人意料的是，反义dna(15mer和18-30mer)在体外并未显示任何抑制mir-328表达的活性。在动物实验中，16mer和17mer是安全的，并且它们通过减少经处理的老鼠的平均眼轴长度而展示了治疗近视的活性。本发明涉及5’-agggcagagagggcca-3’(seqidno：3)的dna16mer，及5’-aagggcagagagggcca-3’(seqidno：4)的dna17mer。本发明的第二方面，发明人根据成熟的人类mir-328序列和gapmer原则设计出lna修饰的及硫代磷酸酯(ps)键修饰的反义寡核苷酸，其范围为17-22mer(kurrecketal，nucleicacidsres.，30：1911-1918，2002)。lna修饰的反义寡核苷酸的15和16mer并不包括于其中，因为15和16mer的5’端末端序列显示连续的3个g以及自我互补模式，这会导致寡核苷酸形成二聚体。发明人后续获得具有17-22个碱基的lna修饰的mirna-328反义寡核苷酸并且测试其活性。被lna修饰的和ps键修饰的反义mir-328寡核苷酸序列显示于表2。它们各自的非修饰、天然的dna序列在序列表的计算机可读格式中显示为seqidno：18-23。表2lna修饰的及ps键修饰的反义寡核苷酸序列+：表示锁定核酸(lna)修饰；*：表示磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代；^：表示seqidno：18-23是在表中以“+”和“*”显示的lna修饰和ps修饰的对应物的天然(未修饰)寡核苷酸的序列。在表2中，dna序列的每一个磷酸二酯键皆被修饰成硫代磷酸酯键(ps)。在表2中，每一个dna序列的中央核心的5’和3’端两侧皆有4个lna修饰的核苷酸。发明人发现在体外测试的6组反义lna/ps键修饰的寡核苷酸，仅403、404和405抑制mir-328的表达。其他反义lna/ps键修饰的dna在体外没有显示任何抑制mir-328表达的活性。除了在体外的活性外，403通过减少经处理的老鼠的平均眼轴长度而展示了治疗近视的活性。本发明涉及反义lna/ps键修饰的寡核苷酸403、404、405；其中优选403。本发明的mirna-328反义组合物对mirna-328具有良好的杂交活性、在水中具有良好的溶解度，并且是稳定的(耐核酸外切酶)。pax6、fmod和col1a1是近视发病机制的重要基因，且他们为mir-328的直接靶基因。这些基因已显示出在近视发展中发挥作用。本发明的mirna-328反义组合物在体外提高了pax6、fmod和col1a1的表达水平。本发明的mirna-328反义组合物对预防或治疗眼部疾病是有用的。特别地，本发明的mirna-328反义组合物对预防或治疗近视是有用的。本发明涉及一种药物组合物，包含本发明的mirna-328反义寡核苷酸和药学上可接受的载体。治疗近视优选的形式是局部用溶液或局部用软膏。含有反义mirna-328的局部用溶液可含生理上相容性载体，如眼科领域中的技术人员可选择使用的常规性准则。眼用载体包含但不限于盐水溶液、水聚醚如聚乙二醇、聚乙烯如聚乙烯醇和聚维酮、纤维素衍生物如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、石油衍生物如矿物油和白色凡士林、动物性脂肪如羊毛脂、丙烯酸聚合物如羧基聚甲烯(carboxypolymethylene)凝胶、植物性脂肪如花生油和多糖如右旋糖酐、以及糖胺聚糖如透明质酸钠和盐类如氯化钠和氯化钾。制剂任选地包含防腐剂如氯化苯甲烃铵(benzalkoniumchloride)和其它非活性成分如edta。然而，对于长期使用(超过2周)，优选制剂是那些不含任何防腐剂的，这是由于长期、频繁暴露于防腐剂如氯化苯甲烃铵对角膜上皮有潜在的伤害。不含防腐剂的制剂以单位剂量制备并且储存在单次使用的容器内。通过加入任何生理上和眼科学上可接受的调节ph的酸、碱或缓冲剂调节该制剂的ph值，以使ph在约5至7.5的范围内，优选6至7。酸的实例包括醋酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸、盐酸等，碱的实例包括氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、醋酸钠、乳酸钠、氨基丁三醇(tromethamine)、tham(三羟甲基氨基甲烷)等。盐类和缓冲剂包括柠檬酸盐/右旋糖、碳酸氢钠、氯化铵及上述酸和碱的混合物。含水的眼用组合物的渗透压通常为约200至约400毫渗透摩尔(mosm)，更优选介于260至340mosm。渗透压可通过使用合适量的生理上和眼科上可接受的离子型或非离子型试剂进行调整。氯化钠是优选的离子型试剂，而氯化钠的用量范围为约0.01％至约1％(w/v)，优选约0.05％至约0.45％(w/v)。等当量的由阳离子如钾、铵等以及阴离子如氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、重碳酸根、硫酸根、硫代硫酸根、硫酸氢根、硫酸氢钠、硫酸铵等组成的一种或多种盐可以用来添加或取代氯化钠以达成上述范围的渗透压。此外，非离子型试剂如甘露醇、右旋糖、山梨醇、葡萄糖等也可以被用来调节重量摩尔渗透压浓度。本发明的mirna-328反义寡核苷酸可通过任何合适的形式施用于病人的眼睛，但优选以滴剂、喷雾剂、凝胶剂或软膏的形式施用。在一个实施方案中，该寡核苷酸是以滴剂形式滴到眼睛的表面。在另一实施方案中，该寡核苷酸包含于棉签或海绵中施用于眼睛的表面。在另一实施方案中，该寡核苷酸包含于液体喷雾剂或软膏中施用于眼睛的表面。在另一实施方案中，该寡核苷酸被直接注射到泪腺组织中或眼睛表面上。或者，该寡核苷酸可经由脂质体施用于眼睛。此外，该寡核苷酸可经由泵-导管系统注入泪膜中。在额外的实施方案中，该寡核苷酸可包含于、携带于或附着于置于眼睛上的隐形眼镜或其他相容性控制释放材料。在局部用溶液中的寡核苷酸的浓度是足以防止和/或治疗近视的量。该寡核苷酸浓度范围一般在约30nm-2.5mm，优选约100nm-10μm、约1μm-100μm，或约15μm-1.5mm。本文所用的“约”是指所述值的±10％。本发明进一步涉及一种预防或治疗对象近视的方法。该方法包括向对其有需要的对象施用有效量的本发明的反义微小rna-328寡核苷酸组合物的步骤。优选局部施用的途径。“有效量”是指能有效预防或治疗近视的量，即为了防止眼睛的轴长增加或减少近视眼睛的轴长。用来治疗或预防近视的日剂量可被分成一个或数个单位剂量施用。日剂量范围，例如可按照对象的年龄和状况从1滴(约30-50μl)，每日1次至4次。一种mir-328反义dna组合物的治疗方案为1滴局部用溶液，每日1次至2次。或者，可以每星期施用一次局部用溶液。当治疗或预防近视时，本发明的方法可结合本领域技术人员熟知的其他方法。本发明也提供根据本发明所述的脱氧核糖核苷酸序列用于制备预防或治疗近视的药物或药物组合物的用途。在优选实施方案中，该药物或药物组合物是局部用溶液或局部用软膏。本发明也提供根据本发明所述的锁定核酸修饰的和硫代磷酸酯键修饰的寡核苷酸序列用于制备预防或治疗近视的药物或药物组合物的用途。在优选实施方案中，该药物或药物组合物是局部用溶液或局部用软膏。以下实施例进一步说明本发明。这些实施例仅在说明本发明，而不应当被解释为限制。实施例实施例1反义寡核苷酸(dna)的合成和纯化反义mir-328寡核苷酸由根据成熟的人类mir-328和人类前mir-328序列设计的dna核苷酸组成。该dna反义寡核苷酸按照制造商说明书使用名为dr.oligo192(biolyticlabperformanceinc.)的dna/rna合成仪合成。制备包含所有脱氧核糖核苷酸的范围为15mer至30mer的反义寡核苷酸。产物通过hplc纯化。这些反义寡核苷酸的合成和纯化通过genomicsbiosci&tech.ltd.(台湾)进行。dna15mer-30mer的序列显示于表1。实施例2反义寡核苷酸(lna)的合成和纯化范围为17至22mer的lna修饰的和ps键修饰的反义寡核苷酸根据成熟的人类mir-328序列和gapmer原则设计；经修饰的序列和非修饰的版本显示于表2。根据此设计，17-22mer的lna修饰的和ps键修饰的反义序列由exiqon(丹麦)合成和纯化。实施例3反义寡核苷酸抑制mir-328表达的体外试验细胞培养、处理和转染名为“arpe-19”的rpe细胞系生长于dulbecco′smodifiedeagle′s培养基(dmem)/f12培养基中。该细胞系在具有1％青霉素/链霉素和10％热灭活的胎牛血清(fbs)中，于37℃、95％空气/5％二氧化碳(co2)的湿润环境中生长。为了进行转染实验，细胞以1×105细胞/孔的密度接种进12孔板中。在每孔生长达到70％汇合度后，使用lipofectamine2000(invitrogen)按照制造商说明书转染反义寡核苷酸(浓度为30、50和100nm)。经24小时孵育后，细胞被裂解以进一步研究。检测反义寡核苷酸对mir-328表达的抑制使用trizol按照制造商说明书从培养的细胞提取总rna。使用a260/a280读数来检查rna纯度。使用以下步骤先将mir-328反转录成mir-328cdna：使用mir-328的特异性引物和multiscribe逆转录酶试剂盒(appliedbiosystems)反转录5ng的rna。为了检测mir-328的表达，以abi7500real-timepcr仪(appliedbiosystems)按照制造商说明书(appliedbiosystems)用mir-328的特异性探针进行定量实时pcr。反义寡核苷酸的抑制效果通过定量实时pcr所测量的mir-328cdna的水平来评估。将mir-328的表达水平相对作为内部对照的小非编码核rnau6的表达水平进行标准化。反义寡核苷酸对mir-328表达抑制的体外测试结果a.dna反义寡核苷酸根据实施例1制备的16组长度介于15至30mer的dna反义寡核苷酸被用来测试在rep细胞内对mir-328表达的抑制效果。mir-328相对表达水平显示于图1。仅dna16mer和dna17mer抑制mir-328的表达。dna16mer在浓度为30、50和100nm的抑制效果分别为39％、35％和49％。而dna17mer在浓度为30、50和100nm的抑制效果分别为43％、41％和48％。其余的反义寡核苷酸(15mer和18-30mer)对mir-328表达不显示抑制效果。b.lna修饰的反义寡核苷酸检查命名为lna401至lna406的六组lna修饰的反义序列在rpe细胞内对mir-328表达的抑制效果。mir-328相对表达水平显示于图2。仅lna403、lna404和lna405抑制mir-328的表达。lna403在浓度为30、50和100nm的抑制效果分别为97％、97％和90％。lna404和lna405在浓度为30、50和100nm具有相同的抑制效果，分别为98％、98％和90％。其余的lna寡核苷酸对mir-328表达不显示抑制效果。实施例4通过体内试验评估反义寡核苷酸在近视治疗上的效力动物模型21日龄的c57bl/6j小鼠购自nationallaboratoryanimalcenter，taiwan。所有动物实验均遵循动物在眼科和视觉研究中的使用的arvo声明。近视诱导的过程简要描述如下：将23日龄的小鼠右眼覆盖以诱导近视(即近视眼)，而左眼没有被覆盖。然后，被近视诱导的小鼠的右眼在第30、第37和第44天时用30μl盐水(即对照组)、1μmdna16mer、1μmdna17mer、1μmlna403、1μmlna404或1μmlna405处理。在第51天牺牲小鼠并收集眼。分离的眼在解剖显微镜下被拍照，并使用imagej量测眼轴长度。近视(近视眼)导致眼轴长度增长，此为近视的主要病理改变。相同老鼠被覆盖的右眼和未被覆盖的左眼之间的眼轴长度差异(即眼轴长度差)表示近视的严重性。结果总结于表3和图3。使用mann-whitneyu检验完成统计评估。p值＜0.05被视为有显著差异。表3用反义寡核苷酸或盐水处理的小鼠的眼轴长度差动物数眼轴长度差，mm平均值(sd)盐水260.018(0.072)dna16mer25-0.059(0.061)*dna17mer26-0.047(0.073)*lna40327-0.036(0.079)*lna40417-0.007(0.100)lna40516-0.017(0.054)*表示当与盐水组比较时，p值＜0.05的显著差异dna16mer和dna17mer用dna16mer和dna17mer处理的小鼠的平均眼轴长度差在统计学上显著地小于对照组老鼠。dna16mer和dna17mer相较于对照组分别显著地减少眼轴长度差达0.077mm和0.065mm。该结果显示，dna16mer和dna17mer对于近视老鼠的治疗是有效的。lna修饰的反义寡核苷酸用lna403至405处理的小鼠的平均眼轴长度差小于对照组动物。相对于对照组，lna403减少眼轴长度差达0.054mm，lna404减少眼轴长度差达0.025mm，及lna405减少眼轴长度差达0.035mm。然而，仅lna403显示具有统计显著性(p值＜0.05)。该结果显示，lna403对于近视老鼠的治疗是有效的。实施例5dna16mer和lna403的验证动物模型21日龄的c57bl/6j小鼠购自nationallaboratoryanimalcenter，taiwan。所有动物实验均遵循动物在眼科和视觉研究中使用的arvo声明。近视诱导的过程简要描述如下：将23日龄的小鼠右眼覆盖4周以诱导近视(即近视眼)，而左眼没有被覆盖。然后，被近视诱导的小鼠的右眼在第30、第37和第44天时用30μl盐水(即阴性对照组)、1％阿托品(即阳性对照组)、1μmdna16mer或1μmlna403处理。在第51天牺牲小鼠并收集眼。分离的眼在解剖显微镜下被拍照，并使用imagej和专用软件进行眼轴的自动量测。近视(近视眼)导致眼轴长度增长，此为近视的主要病理改变。相同老鼠的被覆盖的右眼和未被覆盖的左眼之间的眼轴长度差异(即眼轴长度差)表示近视的严重性。结果总结于表4和图4。使用mann-whitneyu检验完成统计评估。p值＜0.05被视为有显著差异。表4用阿托品、反义寡核苷酸或盐水处理的小鼠的眼轴长度差n平均axl差sep盐水260.0080.0081％阿托品28-0.0370.010＜0.0001dna16mer38-0.0550.008＜0.0001lna40340-0.0520.0110.0024axl：眼球的眼轴长度为了进一步与证据充分的抗近视药物(阿托品)比较dan16mer和lna403的效果，我们测试这三种眼药水。需要注意的是，我们使用了1％阿托品，其为高于临床浓度的10倍浓度，且1％阿托品已显示比低浓度的阿托品更有效。由于dna16mer和lna403溶解于生理盐水，我们使用生理盐水作为阴性对照。上面的数据显示dna16mer和lna403比1％阿托品对于减少眼球的增长更有效。实施例6由独立的第三方对dna16mer的确认我们也使用了cro来证实我们dna16mer的结果。动物模型近视诱导的步骤：21日龄的c57bl/6j小鼠购自nationallaboratoryanimalcenter，taiwan。所有动物实验均遵循动物在眼科和视觉研究中使用的arvo声明。近视诱导的过程简要描述如下：将23日龄的小鼠右眼覆盖4周以诱导近视(即近视眼)，而左眼没有被覆盖。然后，被近视诱导的小鼠的右眼在第30、第37和第44天时用30μl盐水(即阴性对照组)、1％阿托品(即阳性对照组)和10nm、100nm和1μmdna16mer处理。在第51天牺牲小鼠并收集眼。采集的眼在解剖显微镜下被拍照，并使用imagej和专用软件进行眼轴长度的自动量测。近视(近视眼)导致眼轴长度增长，此为近视的主要病理改变。相同老鼠的被覆盖的右眼和未被覆盖的左眼之间眼轴长度差异(即眼轴长度差)表示近视的严重性。该cro实验结果显示于表5和图5。第三方的结果完全重复我们的数据。表5用阿托品、反义寡核苷酸或盐水处理的小鼠的眼轴长度差实施例7证实dna16mer在第二动物中的效果动物模型近视诱导的步骤：3日龄青紫蓝兔(pigmentedrabbit)购自da-zong家畜农场(台湾)。所有动物实验均遵循动物在眼科和视觉研究中使用的arvo声明。在7日龄时，兔子的右眼被覆盖8周以诱导近视，而左眼没有被覆盖。双眼眼轴长度(axl)自第21天开始通过a-scan(pacscan300a，usa)每周量测一次。当在第35天时，右眼axl长于左眼axl0.2mm或更长，我们即定义为近视。若是兔子达到此定义标准，自第35天到第63天，每隔一天对近视兔的右眼用20μl的盐水(即对照组)、或10μm或50μm的dna16mer(20μl)处理。使用在第61天测量的最终axl以获得用来计算右眼axl和左眼axl之间的差异(即axl差)。假如没有治疗效果，axl差将会是正值。结果指出减少近视眼睛的axl为剂量依赖性反应(见表6和图6)表6用反义寡核苷酸或盐水处理的兔子的眼轴长度差现在以完整、清楚、简洁和精确的术语描述本发明及其制备和使用的方式和过程，以使任何所属领域的技术人员制备和使用它们。应当理解的是前文描述本发明优选实施方案和在不背离如权利要求所述的本发明的范围时可做修改。为了特别指出并清楚地要求保护本发明的主题，以下权利要求总结该说明书。序列表<110>高雄医学大学<120>微小rna-328反义组合物与医疗用途<130>16548wo<150>us62/210,340<151>2015-08-26<160>23<170>patentinversion3.4<210>1<211>22<212>rna<213>homosapiens<400>1cuggcccucucugcccuuccgu22<210>2<211>15<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>2gggcagagagggcca15<210>3<211>16<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>3agggcagagagggcca16<210>4<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>4aagggcagagagggcca17<210>5<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>5gaagggcagagagggcca18<210>6<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>6ggaagggcagagagggcca19<210>7<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>7cggaagggcagagagggcca20<210>8<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>8acggaagggcagagagggcca21<210>9<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>9acggaagggcagagagggccag22<210>10<211>23<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtoprematurehumanmir-328<400>10acggaagggcagagagggccagg23<210>11<211>24<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtoprematurehumanmir-328<400>11acggaagggcagagagggccaggg24<210>12<211>25<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtoprematurehumanmir-328<400>12acggaagggcagagagggccagggg25<210>13<211>26<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtoprematurehumanmir-328<400>13acggaagggcagagagggccaggggc26<210>14<211>27<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtoprematurehumanmir-328<400>14acggaagggcagagagggccaggggct27<210>15<211>28<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtoprematurehumanmir-328<400>15acggaagggcagagagggccaggggctg28<210>16<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtoprematurehumanmir-328<400>16acggaagggcagagagggccaggggctgt29<210>17<211>30<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtoprematurehumanmir-328<400>17acggaagggcagagagggccaggggctgta30<210>18<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>18aagggcagagagggcca17<210>19<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>19gaagggcagagagggcca18<210>20<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>20ggaagggcagagagggcca19<210>21<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>21cggaagggcagagagggcca20<210>22<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>22acggaagggcagagagggcca21<210>23<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>designedanti-sensemir-328oligodeoxyribonucleotidesaccordingtomaturehumanmir-328<400>23acggaagggcagagagggccag22当前第1页12