CD154结合多肽及其用途的制作方法

本公开涉及与cd154特异性结合的多肽、含有该多肽的药物组合物，以及使用该多肽治疗疾病的方法。

背景技术：

通过活化的t细胞与抗原呈递细胞的相互作用产生细胞介导的免疫应答和体液免疫应答。t细胞活化不仅依赖于抗原特异性t细胞受体(tcr)与其同源肽-mhc复合物的相互作用，而且还需要许多细胞粘附分子和共刺激分子的协同结合和活化。

cd154是这样的共刺激分子之一，并且经由这样的cd154的共刺激信号传导对于t细胞活化是必需的。另外，经由与cd154结合的cd40的信号传导也是b细胞活化后抗体产生所需要的。因此，抑制cd154-cd40相互作用可抑制t细胞活化和抗体产生，从而抑制细胞介导的免疫应答和体液免疫应答。尤其，在b细胞活化和抗体产生期间，抗cd154抗体可以在以下三个阶段抑制应答(j.clin.invest.2003；112：1480-2)：通过活化的t细胞的b细胞帮助；生发中心产生；和在生发中心中t细胞-b细胞的相互作用。

此外，所报道的抑制cd154-cd40相互作用的抗cd154抗体对疾病的作用包括：治疗和预防自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮(boumpas等，arthritisrheum.2003；48：719-727，kelsoeg.j.clin.invest.2003；112：1480-1482)、免疫性血小板减少性紫癜(kuwana等blood2004；103：1229-1236)、类风湿性关节炎(durie等science1993；261：1328-1330)、多发性硬化症(nagelkerken等j.immunol.2004；173：993-999)，以及对肾脏(kirk等nat.med.1999；5：686-689，schuler等，transplantation2004；77：717-726)、皮肤、心脏和胰岛移植受体中移植物排斥的抑制(kirk等，philos.trans.r.soc.lond.bbiol.sci.2001；356：691-702)。该抗体也能够抑制移植物抗宿主反应(seung等，blood2000；95：2175)。尤其，系统性红斑狼疮(boumpas等arthritisrheum.2003；48：719-727，kelsoeg.j.clin.invest.2003；112：1480-1482)和免疫性血小板减少性紫癜(kuwana等blood2004；103：1229-1236)是代表性的抗体介导的自身免疫性疾病，并且证实了抗cd154抗体对这些自身免疫性疾病的治疗效果。此外，证实了抗-cd154抗体在恒河猴和食蟹猴肾移植受体中的移植物排斥的抑制作用(kirk等，nat.med.1999；5：686-689，schuler等transplantation2004；77：717-726)。因此，基于该发现，已被开发了抗cd154抗体。美国专利公开号2004-0038293公开了针对人cd154的抗体。

然而，事实上，由于血小板活化引起的血栓形成的副作用，开发的抗体不用于临床实践。换句话说，先前开发的抗体的fc部分具有通过与血小板中的fcγ受体(fcγr)结合而活化血小板，导致血栓形成的问题。

因此，需要开发能够有效抑制cd154-cd40相互作用而没有活化血小板的副作用的物质。

技术实现要素：

本公开是为了解决上述问题而提出的，并且旨在提供具有对fcγ受体降低的亲和力以免引起比如血小板活化和血栓形成的副作用的新型cd154结合蛋白。

一方面，本公开提供包括以下的cd154结合蛋白：来自免疫球蛋白重链可变区(vh)的重链互补决定区(hcdr)序列的seqidno：1的hcdr1氨基酸序列、seqidno：2的hcdr2氨基酸序列和seqidno：3的hcdr3氨基酸序列；以及来自免疫球蛋白轻链可变区(vl)的轻链互补决定区(lcdr)序列的seqidno：4的lcdr1氨基酸序列、seqidno：5的lcdr2氨基酸序列和seqidno：6的lcdr3氨基酸序列。

本文公开的多肽可以特异性识别cd154蛋白，并且可以有效抑制cd154与cd40的相互作用。

在一个实施方式中，本文公开的多肽特异性识别由seqidno：12或13表示的cd154的氨基酸序列。

就此而言，根据本公开的cd154结合多肽是抗cd154抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方式中，根据本公开的抗cd154抗体包括具有由seqidno：7表示的氨基酸序列的重链可变区和具有由seqidno：8表示的氨基酸序列的轻链可变区。在一个实施方式中，除了这些可变区之外，根据本公开的抗体包括seqidno：9或10的重链恒定区和seqidno：11的轻链恒定区。

在一个实施方式中，本公开还提供了编码特异性识别cd154的根据本公开的多肽的多核苷酸，以及包括该多核苷酸的载体。

本文公开的抗cd154抗体可以以各种形式提供，并且包括例如单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

在一个实施方式中，根据本公开的抗cd154抗体是嵌合抗体，其中嵌合抗体包括非人来源的可变区和人来源的fc区，其中人来源的fc区选自igg1fc、igg2fc、igg3fc和igg4fc。另外，嵌合抗体具有对fcγ受体(fcγr)降低的结合亲和力，并且因此减少了嵌合抗体引起的血小板活化。

在一个实施方式中，根据本公开的嵌合抗体中包括的fc区是igg4fc，其中igg4fc包括氨基酸替换突变，其中该突变是在seqidno：9的氨基残基115处亮氨酸到谷氨酸的替换(l115e)。由于该替换，降低了嵌合抗体对fcγ受体(fcγr)的结合亲和力，并且由于此原因，减少了嵌合抗体引起的血小板活化。

取决于其具体的目的，根据本公开的抗体可以提供为与选自由以下组成的组的物质的缀合物：治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物调节剂、药物和peg。

根据本公开的抗体能够有效地阻断cd154-cd40相互作用以抑制t细胞活化和抗体产生，从而抑制细胞介导的免疫应答和体液免疫应答。因此，特异性识别cd154以抑制cd154-cd40相互作用的根据本公开的多肽可有效地用于治疗、预防或控制抗体介导的症状或疾病。

因此，一方面，本公开提供了用于治疗或预防t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病或症状的药物组合物。

另一方面，本公开提供了用于抑制抗药物抗体产生的组合物，其包括根据本公开的cd154结合多肽。该组合物可有效地用于抑制由施用例如enbrel、humira等的基于抗体的药物而引起的抗体产生。

在用于治疗或预防t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病或症状的药物组合物中，t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病或症状代表抗药物抗体，包括系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎和多发性硬化症的自身免疫性疾病，以及对包括胰岛、肾脏、心脏和皮肤的器官或组织的移植的排斥或移植物抗宿主疾病。

另一方面，本公开提供了抗cd154抗体或其抗原结合片段，抗cd154抗体或其抗原结合片段识别包括由5至50个氨基酸组成的cd40配体部分的表位，该cd40配体部分包括由seqidno：22所表示的cd40配体的残基199处的gly、残基200处的arg和残基203处的arg，其是cd154蛋白的cd40相互作用区，其中抗cd154抗体或抗原结合片段也干扰cd154-cd40相互作用。

表位可以是由5至50个氨基酸组成的多肽，其还包括残基207和230处的glu和残基232处的gln中的一个或多个。

根据本公开的表位可以由本领域技术人员参考上述条件容易地确定，并且可以出现在残基191和残基240之间。在一个实施方式中，表位包括grfer、pgrfer、spgrfer、grferillra、pgrferillr、spgrferillr、spgrferillra、grferillraanthssakpcgqqsihlggvfe、grferillraanthssakpcgqqsihlggvfelq、grferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvn或spgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvn，其出现在残基197和残基240之间，尤其是残基197和残基232之间，但是本公开的范围不限于此，只要满足上述条件即可。

特异性识别cd154的根据本公开的多肽，特异性识别与cd40相互作用的cd154的一部分，并且因此干扰cd154-cd40相互作用。就此而言，本公开还提供了抗cd154抗体或其抗原结合片段，该抗cd154抗体或其抗原结合片段特异性识别作为cd154蛋白的cd40相互作用区的第二亲水性接触区和/或电荷相互作用区。

如上所述，特异性识别cd154的根据本公开的多肽可以抑制t细胞活化和抗体产生，并且因此抑制细胞介导的免疫应答和体液免疫应答。

就此而言，本公开提供了包括特异性识别cd154的根据本公开的多肽、抗体或其抗原结合片段或嵌合抗体的试剂盒，其用于抑制抗药物抗体产生或cd154依赖性t细胞介导的免疫应答。

本公开还提供了根据本公开的cd154结合多肽、抗体或其抗原结合片段或嵌合抗体的用途。

本公开还提供了根据本公开的cd154结合多肽、抗体或其抗原结合片段或嵌合抗体用于抑制抗药物抗体产生、抑制抗体介导的免疫应答、抑制cd154依赖性t细胞介导的免疫应答或者预防或治疗与上述有关的疾病的用途。

本公开还提供了用于抑制抗药物抗体产生的方法、用于抑制抗体介导的免疫应答的方法或用于抑制cd154依赖性t细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括以下步骤：用根据本公开的cd154结合多肽、抗体或其抗原结合片段或嵌合抗体处理细胞，其中该方法可以在体外、体内或离体进行。

本公开还提供了用于抑制抗药物抗体产生的方法、用于抑制抗体介导的免疫应答的方法、用于抑制cd154依赖性t细胞介导的免疫应答的方法或用于预防或治疗与上述相关的疾病，该方法包括以下步骤：施用治疗有效量的根据本公开的cd154结合多肽、抗体或其抗原结合片段或嵌合抗体。

根据本公开的特异性识别cd154的抗体可有效抑制cd154-cd40相互作用而不活化血小板，并且因此可有效地用于预防或治疗需要抑制相互作用的各种疾病或症状。例如，根据本公开的抗体可有效抑制抗药物抗体的形成，也可有效地用于治疗自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎或多发性硬化症，并且使能够同种异体和异种器官移植、细胞移植、骨髓移植或干细胞移植而没有免疫排斥，以便不需要使用免疫抑制剂或者使联合治疗中使用的免疫抑制剂的种类和量最小化。

附图说明

图1示出了为分析根据本公开的一个实施方式的抗人cd154抗体与抗原的结合而进行的流式细胞术的结果。

图2示出了检测本发明的抗cd154抗体识别的抗原表位的免疫印迹的结果。

图3示出了分析根据本公开的一个实施方式的人igg4和igg4(l115e)抗人cd154嵌合抗体对cd154-cd40相互作用的抑制作用的结果。

图4是用于生产根据本公开的一个实施方式的人igg4嵌合抗cd154抗体的载体的限制性图谱。

图5示出了为分析根据本公开的一个实施方式的人igg4和igg4(l115e)抗人cd154嵌合抗体与抗原的结合而进行的流式细胞术的结果。

图6示出了分析根据本公开的一个实施方式的igg4(l115e)抗人cd154嵌合抗体对t细胞依赖性免疫应答的抑制作用的结果，并且表明本发明的抗体可有效抑制针对humira的抗药物抗体的形成。

图7示出了分析根据本公开的一个实施方式的人igg4和igg4(l115e)抗人cd154嵌合抗体对cd32a转基因小鼠中血小板活化的作用的结果，并且表明了与正常对照组相比，本发明的igg4嵌合抗体减少了血小板的数目，但是igg4(l115e)嵌合抗体没有减少血小板的数目。

具体实施方式

本公开涉及特异性识别cd154分子的多肽。

在一个实施方式中，本公开涉及cd154结合多肽，其包括：作为免疫球蛋白重链可变区(vh)的重链互补决定区(hcdr)序列的seqidno：1的hcdr1氨基酸序列、seqidno：2的hcdr2氨基酸序列和seqidno：3的hcdr3氨基酸序列；以及作为免疫球蛋白轻链可变区(vl)的轻链互补决定区(lcdr)序列的seqidno：4的lcdr1氨基酸序列、seqidno：5的lcdr2氨基酸序列和seqidno：6的lcdr3氨基酸序列。

根据本公开的多肽特异性识别的cd154分子是主要在活化的t细胞中表达的被称为cd40配体、cd40l或gp39的约32kda-39kda的蛋白质。它是tnf分子家族的成员，已知其也在血小板和其他类型的细胞，包括肥大细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、自然杀伤细胞、b淋巴细胞和非造血细胞(例如平滑肌细胞、上皮细胞和内皮细胞)中表达。它是由从n端顺序定位的胞质区、跨膜区和胞外区构成的ii型跨膜蛋白，但也作为14kda、18kda和29kda的可溶性分子被发现。它通过与抗原呈递细胞(apc)中表达的cd40结合而显示其作用，并且是诱导t细胞活化连同mhc分子对t细胞受体的刺激的共刺激分子，并且还参与apc活化。

本公开的多肽识别的cd154是哺乳动物来源的。尤其，本公开的多肽识别人来源或非人灵长类来源的cd154，例如，恒河猴、食蟹猴或黑猩猩来源的cd154。cd154的基因序列和蛋白质序列是已知的，并且例如，已知为人类的genbank登录号nm-000074.2和np-000065.1。在一个实施方式中，本公开的多肽特异性识别人或非人灵长类来源的cd154。

本公开的多肽可以识别全长cd154及其片段，例如可溶性cd154。

根据本公开的多肽特异性识别cd154。尤其，它特异性识别与cd40相互作用的cd154的一部分。更尤其，它特异性识别cd40配体(例如seqidno：22)。先前通过3d晶体结构分析鉴定了cd40配体中与cd40相互作用的残基，并且对于这些残基，可以参考an等(j.biol.chem.2011；286：11226-11235)。

因此，就此而言，根据本公开的多肽提供了抗cd154抗体或其抗原结合片段，其识别包括由5至50个氨基酸组成的cd40配体部分的表位，该cd40配体部分包括由seqidno：22所表示的cd40配体的残基199处的gly、残基200处的arg和残基203处的arg，其为cd154蛋白的cd40相互作用区，其中抗cd154抗体或抗原结合片段也干扰cd154-cd40相互作用。表位可以是由5至50个氨基酸组成的多肽，其进一步包括残基207和230处的glu和残基232处的gln中的一个或多个。

根据本公开的表位可由本领域技术人员参考上述条件容易确定，并且可以出现在seqidno：22的序列中的残基191和残基240之间。在一个实施方式中，表位包括grfer、pgrfer、spgrfer、grferillra、pgrferillr、spgrferillr、spgrferillra、grferillraanthssakpcgqqsihlggvfe、grferillraanthssakpcgqqsihlggvfelq、grferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvn或spgrferillraanthssakpcgqqsihlggvfelqpgasvfvn，其出现在残基197和残基240之间，尤其是残基197和残基232之间，但本公开的范围不限于此，只要满足上述条件即可。

上述特异性识别cd154的根据本公开的多肽，特异性识别cd154的cd40相互作用部分，尤其是第二亲水性接触区和电荷相互作用区(an等j.bio.chem.2011；286：11226-11235)，并干扰cd154-cd40相互作用。根据文献，cd154包括与cd40相互作用的三个接触区，包括疏水性接触区、第一亲水性接触区和第二亲水性接触区(包括seqidno：22的g199、r200、r203和q232残基)以及电荷相互作用区(包括r200、r203、r207和e230)。特异性识别cd154的根据本公开的多肽，特异性识别该第二接触区和/或该电荷相互作用区。

就此而言，本公开还提供了抗cd154抗体或其抗原结合片段，该抗cd154抗体或其抗原结合片段特异性识别作为cd154蛋白的cd40相互作用区的第二亲水性接触区和/或电荷相互作用区。

由特异性识别cd154的根据本公开的多肽识别的表位由包括上述残基的约5至71个氨基酸组成，并且其实例可以参考以上描述。

在一个实施方式中，根据本公开的cd154结合多肽可以以各种形式提供，只要其具有本文所述的特征即可。尤其，cd154结合多肽可以作为抗cd154抗体或其抗原结合片段提供。

如本文所使用的，术语“抗体”是指通过它们的轻链可变区和重链可变区与其他分子(抗原)结合的蛋白质，并且包括igg、igd、iga和ige类型。抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体和多特异性抗体。另外，本公开的抗体包括具有各种类型的结构的单克隆抗体，例如，包括两条全长重链和两条全长轻链的完整抗体(ab)，以及包括或不包括恒定区的它们的片段、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体或其他具有本文所述特征的基因工程抗体。

如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指上述完整抗体的一部分、长度比完整抗体的氨基酸序列短的一条或多条序列。在功能方面，抗原结合片段包括完整抗体或亲本抗体的至少一部分的活性或功能，并且其实例包括但不限于fab(用于抗原结合的片段)、fab’、f(ab’)2、fv或单链抗体(sca)(例如scfv或dsfv)、双特异性scfv和双价抗体(diabody)。

如本文所使用的，术语“可变区”是指由重链和轻链中的每个的一部分形成的抗原结合区域。每个可变区包括具有保守序列的4个框架区(fr)和具有明显序列变异的3个互补决定区(cdr)。免疫球蛋白重链可变区(vh)的cdr称为hcdr1至hcdr3，并且免疫球蛋白轻链可变区(vl)的cdr称为lcdr1至lcdr3。

如本文所使用的，术语“互补决定区”是指决定抗体对抗原的特异性和结合亲和力的区域。抗体间的序列变异最常出现在互补决定区中。在这些互补决定区中，cdr3区显示出最明显的变异，并且由至少2个至最多26个氨基酸残基组成。vh和vl中除了cdr之外的区被称为框架区。根据本公开的抗原结合多肽的骨架可以包括在天然存在的人抗体中发现的序列或在各种抗体中发现的序列作为共有序列。

本领域技术人员将理解，可以使用具有上述seqidno：1至6的序列的可变区构建包括构成要素(包括可变区)的抗体。在本公开的一个实施方式中，根据本公开的抗体的重链可变区具有seqidno：7的氨基酸序列，并且抗体的轻链可变区具有seqidno：8的氨基酸序列。在其他实施方式中，根据本公开的抗体的重链恒定区由seqidno：9或10的氨基酸序列表示，并且抗体的轻链恒定区由seqidno：11的氨基酸序列表示。

本公开还包括其中在seqidno：1至11中的氨基酸残基处发生了保守替换的那些。在本公开的一个实施方式中，该序列是其中在小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3、小于2或1个氨基酸残基处发生保守替换的那些序列。如本文所使用的，术语“保守替换”是本领域广泛使用的术语，其表明一个氨基酸被另一个具有类似特性的氨基酸替换。类似特性包括例如尺寸、疏水性或电荷。氨基酸一般根据它们侧链的电特性分为具有带正电荷侧链、带负电荷侧链、不带电荷侧链或疏水侧链的氨基酸。例如，保守替换包括亮氨酸(leu)到异亮氨酸(ile)的替换、精氨酸(arg)到赖氨酸(lys)的替换、苯丙氨酸(phe)到色氨酸(trp)的替换、天冬氨酸(asp)到谷氨酸(glu)的替换或丝氨酸(ser)到苏氨酸(thr)的替换，反之亦然。一般地，cdr序列的保守替换不影响cdr的功能。

用于这样的序列替换的方法是本领域已知的，并且对于该方法，可以参考例如sambrook，molecularcloningalaboratorymanual(第四版)，coldspringharborlaboratory(2012)n.y.。

根据本公开的抗体包括其抗原结合片段、其变体或衍生物，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、灵长类化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如fab、fab’、f(ab’)2、f(ab)2、fd、fvs、单链fv(scfv)、二硫键连接的fv(sdfv)以及包括vl或vh结构域的片段。根据本公开的抗体可以是任何类型(例如igg、ige、igm、igd、iga或igy)、任何类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1或iga2)或免疫球蛋白分子的亚类。

根据本公开的抗体或抗体片段可以是嵌合抗体。如本文所使用的，术语“嵌合抗体”意为至少一部分可变区(即抗原结合区)和至少一部分抗体恒定区(包括轻链的cl1且包括重链的ch1、ch2和ch3区)具有不同的物种来源。例如，可变区可以是小鼠来源的，并且恒定区可以是人来源的。可替换地，术语“嵌合抗体”意为类别转换抗体，例如通过igg向ige的类别转换获得的抗体。嵌合抗体一般通过重组dna技术产生，并且可以参考例如morrison等proc.nat’l.acad.sci.usa1984；81：6851-6885以及美国专利号5202238的公开内容。

在本公开的一个实施方式中，本公开的抗体是嵌合抗体。例如，本公开的抗体可以是具有来源于本文产生的小鼠抗体，例如，通过将小鼠重链可变区和κ轻链可变区移植到人igg4重链恒定区和人κ轻链恒定区中而产生的抗体的轻链可变区和重链可变区的人抗体。

在本公开的一个实施方式中，嵌合抗体包括选自人igg1fc、igg2fc、igg3fc和igg4fc，尤其是igg4fc的fc区，更尤其，其中引入了突变的fc区。该突变包括这样的一个突变：其中seqidno：9所表示的氨基酸序列(其是根据本公开的一个实施方式的igg4抗体的重链恒定区的序列)中的残基115处的疏水性氨基酸被酸性氨基酸替换。尤其，突变包括如seqidno：10所示的亮氨酸到谷氨酸的替换。术语“fc(可结晶片段)”是指重链的ch2区和ch3区。与其fc未被替换的抗体相比，根据本公开的嵌合抗体，尤其是包括人igg4fc的抗体，对fcγ受体(fcγr)具有降低的结合亲和力，并且因此显著降低了由抗体引起的血小板活化。

在一个实施方式中，根据本公开的嵌合抗体包括：包括重链可变区序列(seqidno：7)和重链恒定区序列(seqidno：9或seqidno：10)的重链；以及包括κ轻链可变区序列(seqidno：8)和κ轻链恒定区序列(seqidno：11)的轻链。

根据本公开的抗体或抗体片段可以是人源化抗体。如本文所使用的，术语“人源化抗体”是指由人抗体框架构成的抗体，并且其中一部分cdr区已经被修饰以仅包括抗体分子最初所源自的物种的cdr的一部分，其中所包括的部分对于特异性结合抗原是必需的。例如，在猴或小鼠来源的抗体的cdr中，除了与抗原特异性结合所必需的部分以外的cdr部分以及轻链框架和重链框架被人抗体替换。对于产生人源化抗体的方法，可以参考例如riechmann等nature1988；332：323-327。

根据本公开的抗体或抗体片段可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以通过本领域已知的，基于骨髓瘤细胞与哺乳动物来源的免疫的脾细胞的融合的各种方法而产生。在其他实施方式中，本公开的抗体包括抗体片段，其包括：衍生自上述杂交瘤中产生的抗体的轻链的一个或多个cdr；和/或衍生自抗体的重链的一个或多个cdr。

此外，可以为了各种目的，根据本公开的抗体、其抗原结合片段、变体或衍生物与功能性物质，比如治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂或peg(聚乙二醇)缀合。这些可以根据与其缀合的物质的种类使用各种方法来产生。例如，可以参考amon等“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”，monoclonalantibodiesandcancertherapy，reisfeld等(主编)，第243-256页(alanr.liss，inc.(1985)；hellstrom等″antibodiesfordrugdelivery″，controlleddrugdelivery(第二版)，robinson等(主编)，marceldekker，inc.，第623-653页(1987)。

抗体片段可以通过用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理来获得。可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体来获得f(ab’)2片段，并且随后用硫醇还原剂处理f(ab’)2片段可以提供包括一部分轻链和一部分重链的fab片段。fab片段也可以通过用木瓜蛋白酶处理完整抗体来获得。例如，可以通过胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理本公开的杂交瘤中产生的抗体来产生特异性识别cd154的抗体片段，比如f(ab’)2或fab。

fv片段是仅由重链可变区和轻链可变区构成的抗体片段，其中两个可变区可以通过化学交联剂或非共价键或共价键，比如分子间二硫键键彼此连接(inbar等，proc.nat’l.acad.sci.usa1972；69：2659-2662)。例如，特异性识别cd154的抗体可以通过经由对本公开的杂交瘤中产生的抗体进行酶处理而仅分离重链可变区和轻链可变区来构建，或通过使用重组dna技术来构建。

sca片段可以通过酶处理或基因工程技术产生，并且是其中通过比如多肽的连接结构将轻链可变区和重链可变区彼此连接的抗体片段。对于产生scfv的方法，可以参考例如美国专利号4,936,778或美国专利号5,892,019的公开内容。特异性识别cd154的抗体可以通过对本公开的杂交瘤中产生的抗体进行酶处理或通过重组dna技术来构建，例如，通过包括构建编码抗体的重链可变区和/或轻链可变区的核酸序列和在合适的细胞中表达载体的技术来构建。

如本文所使用的，术语“结合”或“特异性结合”是指本公开的抗体或抗体组合物对抗原的亲和力。通常可以将抗原-抗体结合中的“特异性结合”与当解离常数(kd)小于1×10^-5m或小于1×10^-6m或小于1×10^-7m时的非特异性背景结合区分开。可通过包括使特异性结合与非特异性结合能够区分开的合适对照的本领域已知的方法检测特异性结合，例如，通过elisa、spr(表面等离子体共振)、免疫沉淀、共沉淀等。

包括上述完整抗体或其片段的本公开的抗体可以以包括单体抗原结合区的至少一部分的多聚体存在，该多聚体比如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等。这样的多聚体还包括同多聚体或异多聚体。与单体相比，抗体多聚体包括许多抗原结合区，并且因此对抗原具有优异的结合亲和力。抗体多聚体也用于构建多功能(双功能、三功能或四功能)抗体。

如本文所使用的，术语“多功能”是指具有两种或更多种活性或功能(例如抗原结合亲和力、酶活性、配体或受体结合亲和力等)的抗体或抗体组合物。例如，本公开的抗体可以与具有酶活性的多肽，例如荧光素酶、乙酰转移酶、半乳糖苷酶等结合。

多功能抗体还包括多价或多特异性(双特异性、三特异性等)抗体。术语“多特异性”包括能够与两个或更多个不同表位结合的可变区。两个或更多个表位可以出现在单个抗原或不同的抗原中。

另一方面，本公开还涉及编码根据本公开的多肽的全部或一部分的多核苷酸或核酸分子、包括该多核苷酸的载体或包括该载体的转化体。

核酸包括，例如dna、cdna、rna或重组或合成的dna或rna。在一个实施方式中，核酸分子是cdna。核酸也可以是相应的基因组dna或其片段。由于编码氨基酸序列的核酸序列的冗余性，编码根据本公开的抗体或其部分或其片段的核酸序列可以是不同的，并且该序列也包括在本公开的范围内。在本公开的一个实施方式中，根据本公开的抗体的重链的hcdr1、hcdr2和hcdr3的多核苷酸序列分别由seqidno：14、15和16表示，并且编码抗体的重链可变区的多核苷酸序列由seqidno：17表示。另外，根据本公开的抗体的轻链的lcdr1、lcdr2和lcdr3的多核苷酸序列由seqidno：18、19和20表示，并且编码抗体的轻链可变区的多核苷酸序列由seqidno：21表示。

另一方面，本公开还涉及可以表达核酸分子的包括核酸分子的载体。可用于本公开的载体包括例如噬菌体、质粒、可复制或不可复制的病毒载体或逆转录病毒载体。根据本公开的核酸分子可以被引入各种已知的载体中。例如，载体包括但不限于用于原核细胞的载体，包括puc类载体、(stratagene，美国加利福尼亚州拉荷亚市)、pet类载体(novagen，美国威斯康星洲麦迪逊市)或topo(invitrogen，美国马里兰州盖瑟斯堡市)载体，以及真核细胞载体，包括prep(invitrogen)、pcdna3(invitrogen)、pcep4(invitrogen)、pmcineo(stratagene)、pxt1(stratagene)、psg5(stratagene)、ebo-psv2neo、pbpv-1、pdbpvmmtneo、prsvgpt、prsvneo、psv2-dhfr、p1zd35、plxin、psir(clontech，美国加利福尼亚州帕罗奥多市)、pires-egfp(clontech)、peak-10(edgebiosystems)、ptriex^tm-hygro(novagen)载体和pcineo(promega，美国威斯康星洲麦迪逊市)载体。

根据本公开的载体可以通过已知的转化或转染技术引入各种已知的原核细胞或真核细胞中。对于细胞内引入，载体可以插入到宿主细胞的基因组中或可以作为额外的染色体存在。

可用于本公开的原核细胞包括属于埃希氏菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属和沙门氏菌属种的细胞，并且可用于本公开的真核细胞包括但不限于例如哺乳动物细胞，例如，hela、hek293、h9、jurkat、小鼠nih3t3、c127、cos1、cos7和cv1、小鼠c2c12、bhk或cho细胞；真菌细胞比如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)以及昆虫细胞比如蝇s2和夜蛾sf9。

本公开的抗体可以根据使用重组技术的已知方法来产生。在重组技术中，本发明的抗体可通过以下获得：将编码抗体的重链的核酸序列和编码抗体的轻链的序列克隆到一个或两个表达载体中，将载体引入真核宿主细胞以表达抗体，然后将抗体从宿主细胞或培养基中分离。包括构建载体、从细胞中构建的载体表达蛋白质以及分离蛋白质的这种重组技术是本领域已知的，且对于这种技术，可以参考例如kaufinanr.j.mol.biotechnol.2000；16：151-160的公开内容。编码本公开的抗体的载体可以在合适的宿主细胞，例如cho细胞、ns0细胞、sp2/0细胞、hek293细胞、cos细胞或酵母或大肠杆菌细胞中表达，并且抗体可以从细胞裂解物或培养基中收集。

编码整个本公开的抗体或其片段的核酸序列可以根据常规方法从本文公开的杂交瘤细胞分离，然后测序。然后，分离的核酸序列可以被克隆到上述合适的表达载体中，然后引入不产生抗体的hek293细胞、cho细胞或ns0细胞中，并且可以在宿主细胞中产生重组抗体。将编码本公开的抗体或其片段的核酸引入包括启动子、翻译起始区、3’非翻译区、聚腺苷酸化信号和转录终止信号的表达载体中。轻链和重链可以被引入单个载体或单独的载体中。

为了在ns0细胞中表达抗体，可以参考例如barnes等cytotechnology2000；32：109-123、norderhaug等j.immunol.methods1997；204：77-87等的公开内容。对于在hek细胞中表达抗体，可以参考schlaegere.j.j.immunol.methods1996；194：191-199等的公开内容。

本公开的抗体可以出现在完整细胞(包括杂交瘤)、细胞的裂解物或培养基中，并且可以以部分或基本上纯的形式从其中纯化和分离。为了除去抗体以外的其他细胞副产物，例如细胞组分、核酸、蛋白质等，可以使用比如碱/sds处理、cscl条带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳的已知技术进行抗体的纯化。对于纯化抗体，可以参考例如ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，greenepublishingandwileyinterscience纽约的最新版本。

在培养杂交瘤细胞后，通过使用比如蛋白a-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、透析或亲和层析的常规方法，可以从用于培养本文公开的杂交瘤细胞的培养基中分离单克隆抗体。

另一方面，本公开涉及含有本文公开的多肽作为活性成分的药物组合物，其与药学上可接受的载体和可选地赋形剂或稳定剂一起配制。

如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”包括生理上可接受的物质，例如任何溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗溶液、吸收/再吸收阻滞剂等。在一个实施方式中，使用的载体尤其是适用于注射和输注的物质。例如，药学上可接受的载体可以包括用于制备分散体或无菌可注射溶液的无菌水溶液、等渗缓冲盐水或无菌粉末。本领域技术人员可以根据组合物中所含的活性成分的种类来选择合适的制剂。

对于本领域技术人员来说明显的是，本公开的组合物可以通过本领域已知的各种途径施用，并且施用的方式和途径可以根据期望的效果而变化。根据本公开的抗体或其片段或包括该抗体或其片段的组合物可以肠道外施用，例如通过静脉注射、快速浓注或肌肉注射或皮下注射。另外，不管施用途径如何，本公开的组合物可以作为药学上可接受的剂型，例如水合形式，比如水溶液，或冻干形式施用。

特异性识别cd154的本文公开的多肽有效抑制cd154与cd40的相互作用。阻断cd154-cd40相互作用可抑制t细胞活化和抗体产生，从而抑制细胞介导的免疫应答和体液免疫应答。对于t细胞活化，通过cd154的共刺激信号传导是必然需要的，并且对于b细胞活化，需要通过cd40的信号传导。

尤其，在b细胞活化和抗体产生期间，抗cd154抗体可以在以下三个阶段中抑制应答(j.clin.invest.2003；112：1480-1482)：通过活化的t细胞的b细胞帮助；生发中心产生；和在生发中心中t细胞-b细胞的相互作用。

此外，所报道的抑制cd154-cd40相互作用的抗cd154抗体对疾病的作用包括：治疗和预防自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮(boumpas等，arthritisrheum.2003；48：719-727，kelsoeg.j.clin.invest.2003；112：1480-1482)、免疫性血小板减少性紫癜(kuwana等blood2004；103：1229-1236)、类风湿性关节炎(durie等science1993；261：1328-1330)、多发性硬化症(nagelkerken等j.immunol.2004；173：993-999)，以及对肾脏(kirk等nat.med.1999；5：686-689，schuler等，transplantation2004；77：717-726)、皮肤、心脏和胰岛移植受体中移植物的排斥(kirk等，philos.trans.r.soc.lond.bbiol.sci.2001；356：691-702)和移植物抗宿主反应(seung等，blood2000；95：2175)的抑制。尤其，系统性红斑狼疮(boumpas等arthritisrheum.2003；48：719-727，kelsoegj.clin.invest.2003；112：1480-1482)和免疫性血小板减少性紫癜(kuwana等blood2004；103：1229-1236)是代表性的抗体介导的自身免疫性疾病，并且证实了抗cd154抗体对这些自身免疫性疾病的治疗效果。此外，证实了抗-cd154抗体在恒河猴和食蟹猴肾移植受体中的移植物排斥的抑制作用(kirk等，nat.med.1999；5：686-689，schuler等transplantation2004；77：717-726)。此外，证实了根据本公开的抗-cd154抗体也可以抑制针对humira的抗药物抗体的产生。

因此，根据本公开的抗体可以有效抑制cd154-cd40相互作用来抑制t细胞活化和抗体产生，并且因此可以有效地用于抑制上述抗药物抗体产生、自身免疫性疾病、移植物排斥和移植物抗宿主疾病。

此外，与归因于由血小板活化引起的血栓形成的副作用而不能在临床实践中应用的常规抗体不同，特异性识别cd154的根据本公开的多肽或抗cd154抗体由于替换fc部分中的某些残基而具有对于fcγr的降低的亲和力，因此具有不引起血小板活化和血栓形成的副作用的优点。因此，本公开的多肽对于临床应用是非常有利的。

因此，本文所述的多肽抗体或抗原结合片段或含有该多肽抗体或抗原结合片段的药物组合物可有效用于治疗或预防t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病。

就此而言，如本文所使用的，短语“t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病或症状”包括自身免疫性疾病(包括系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎和多发性硬化症)、针对同种异体或异种的器官、组织或细胞(包括自体或同种异体移植)的排斥、移植物抗宿主疾病和抗药物抗体应答。

在其他实施方式中，本公开的抗体抑制抗药物抗体形成。“抗药物抗体(ada)应答”是指这样的现象，其中当将特定药物，例如治疗性抗体(比如humira(abbott))，施用于受试者时，受试者中产生针对该药物的抗体并削弱或破坏了治疗性抗体的功效。已经显示当向患者施用humira时，在约28％的患者中产生ada，并且在34％的ada阴性患者中出现humira的治疗效果，而仅在4％的ada阳性患者中出现humira的治疗效果(bartelds等jama2011；305：1460-1468)。

因此，当与本治疗性抗体组合使用时，根据本公开的抗cd154抗体可以抑制抗药物抗体的产生，由此增强治疗性抗体的治疗效果。另外，在比如darbepoetinα、interferons、anakinra、recombinantfviii或ix、alglucosidaseα等的生物药物的情况下，ada的发生率达到3％-89％(chirmule等，aapsj.2012；14：296-302)，并且本公开的抗cd154抗体也可有效用于增强这样的药物的治疗效果。

在本公开的一个实施方式中，本公开的抗体尤其有效治疗高度依赖于抗体介导的免疫应答的症状或疾病。本公开的抗体可以有效地用于抑制针对比如enbrel或humira的抗体药物的抗体的产生，已知该抗体药物高度依赖于这样的抗体介导的免疫应答。

在另一个实施方式中，本公开的抗体可以有效地用于控制、治疗或预防自身免疫性疾病，比如系统性红斑狼疮，免疫性血小板减少性紫癜等，其已知为高度依赖于抗体介导的免疫应答的疾病。

如本文所使用的，术语“治疗”意思是通过将本公开的抗体或组合物施用至哺乳动物来延迟t细胞介导的或抗体介导的免疫紊乱或疾病的进展，或者抑制、缓解或消除由疾病引起的生理变化或症状。

如本文所使用的，术语“预防”意思是与当未施用本公开的抗体或组合物时相比，通过将本公开的抗体或组合物施用至哺乳动物来预防t细胞介导的或抗体介导的免疫紊乱或疾病的发作，或延迟疾病的发作。

因此，根据本公开的抗体或其片段或含有该抗体或其片段的组合物可以施用至患有该疾病的受试者，或处在患有该疾病高风险的受试者，或需要预防该疾病的受试者。

如本文所使用的，术语“受试者”包括人、非人灵长类动物和其他哺乳动物，并且尤其是指需要治疗或预防t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病的受试者或患者。

根据本公开的多肽或其片段或包括该多肽或其片段的药物组合物的有效剂量和施用时间段可以根据考虑特定患者的期望的治疗效果、包含在组合物中的抗体的种类、施用方式等来变化，且不应对患者是有毒的。每个患者的组合物的实际剂量应根据各种因素来选择，该因素包括使用的组合物的活性、施用途径、施用时间、分泌速率、同时使用的其他药物、患者的性别、年龄、体重、一般健康状况、基础疾病等。在一个实施方式中，本公开的抗体可以以约1mg/kg体重至100mg/kg体重，例如约10mg/kg体重、20mg/kg体重、30mg/kg体重、40mg/kg体重或50mg/kg体重，并且在一些情况下以至多约100mg/kg的量施用，用于治疗或预防疾病。

根据本公开的抗体或其片段或含有该抗体或其片段的药物组合物可以根据所施用的抗体的半衰期以合适的间隔(每日、每周或每月间隔)进行施用。

本公开的抗体可以与本领域已知的常规免疫调节剂组合使用以便控制t细胞调节的或抗体介导的免疫疾病。例如，在胰岛移植或器官移植的情况下，本公开的抗体可与md-3(针对icam-1的抗体；参见韩国专利号1434029的公开内容)、tacrolimus、rapamycin、mycophenolatemofetil等组合使用。

就此而言，本公开还涉及治疗或预防t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病或症状，包括自身免疫性疾病(包括系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少性紫癜、类风湿性关节炎和多发性硬化症)、对包括胰岛、肾脏、心脏和皮肤的器官或组织的移植的排斥或移植物抗宿主疾病，该方法包括以下步骤：向需要治疗或预防t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病或症状的受试者施用根据本公开的抗体或其片段或含有该抗体或其片段的组合物。

另一方面，本公开还涉及用于抑制抗药物抗体产生的方法，或用于控制或抑制抗体介导的免疫应答的方法，或用于抑制cd154依赖性t细胞介导的免疫应答的方法，或包括以下步骤的方法：向受试者、细胞或组织施用治疗有效量的特异性识别cd154的根据本公开的多肽、抗体或其抗原结合片段或嵌合抗体。

在根据本公开的方法中，使用的抗体或组合物、t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病、施用方法、抗体或组合物的剂量以及受试者如上所述。

在根据本公开的方法中，为了治疗或预防t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病，抗体可以与免疫抑制剂组合使用。

换句话说，除了根据本公开的抗体或其片段之外，根据本公开的方法可以进一步含有治疗或预防t细胞介导的或抗体介导的免疫疾病所需的组分。

然而，即使免疫调节剂与本公开的抗体组合使用，所使用的免疫调节剂的种类和量可以减少，或者可以在某段时间后不需要使用免疫调节剂。

如上所述，特异性识别cd154的根据本公开的多肽可以有效抑制cd154与cd40的相互作用，由此抑制t细胞活化和抗体产生。

因此，另一方面，本公开还提供了用于抑制抗药物抗体产生的试剂盒或用于抑制抗体介导的免疫应答的试剂盒或用于抑制cd154依赖性t细胞介导的免疫应答的试剂盒，该试剂盒包括特异性识别cd154的根据本公开的多肽、抗体或其抗原结合片段或嵌合抗体。对于包括在根据本公开的试剂盒中的组分，可以参考以上描述。根据本公开的试剂盒可用于需要抑制抗体介导的免疫应答(比如抗药物抗体产生)或抑制cd154依赖性t细胞介导的免疫应答的各种应用。

对于在本公开的方法中使用的cd154结合多肽，施用模式等，可以参考以上描述。

在下文中，将参照实施例更详细地描述本公开。对于本领域技术人员来说明显的是，这些实施例仅用于说明的目的，并不意图限制本公开的范围。

实施例

实施例1：动物试验

在首尔大学医院(韩国首尔)的非人灵长类中心或韩国毒理学研究所(韩国全罗北道井邑市)保存食蟹猕猴(成束猴(macacafascicularis))。试验中使用的猴子为30至40个月龄，体重为2.5至3.5千克。该研究的一部分根据首尔大学医院的动物管理和使用委员会(iacuc)批准的国立卫生研究院的指南进行，并且该研究的一部分根据由韩国毒理学研究所根据首尔大学的要求提出的国立卫生研究院的指南进行。

实施例2：产生抗人cd154抗体

为了产生抗人cd154抗体，将重组人可溶性cd154蛋白(scd40l，目录号：310-02，美国新泽西州peprotech)免疫接种到balab/c小鼠中。将佐剂(完全弗氏佐剂用于第一次剂量，且不完全弗氏佐剂用于第二次和第三次剂量)中乳化的100μg蛋白质向雌性balb/c小鼠(6-8周龄，17-25g；韩国京畿道平泽市koatech)，以2周间隔，腹膜内施用3次。最终免疫后两周，将100μgcd154蛋白腹膜内注射到该免疫的小鼠，并且3天后，从小鼠中提取脾脏，并从中分离脾细胞。

为了产生单克隆抗体，使用50％聚乙二醇4000(瑞士巴塞尔市roche)将10⁸个脾细胞与对9-氮杂鸟嘌呤具有抗性的10⁷个sp2/0-ag14小鼠骨髓瘤细胞(crl-1581；美国维吉尼亚州马纳萨斯市美国模式培养物保藏所)融合(koeler和milstein，nature1975；256：495-497)。

融合后，用pbs洗涤细胞一次，然后重悬于含有20％胎牛血清、100μm次黄嘌呤、0.44μm氨基蝶呤和16μm胸苷的dmem(达尔伯克改良伊格尔培养基)(hat培养基，sigma)中。接下来，将细胞接种到四个96孔板中，并在37℃和5％co2的条件下培养2周，直至形成集落。接下来，从每个孔收集培养基，并使用转染了人cd154基因的jurkatd1.1细胞(crl-10915)筛选细胞是否产生抗体。将收集的培养基与jurkatd1.1细胞在4℃下温育30分钟，然后用含有0.05％的pbs洗涤，之后将其与fitc缀合的抗小鼠igg抗体(美国加利福尼亚州圣何塞市bdbioscience)在4℃下温育30分钟，并且选择显示出jurkatd1.1阳性染色的集落。

同时，阴性对照组仅用fitc缀合的抗小鼠igg抗体染色。将选择的集落以每孔0.5个细胞的密度分配到96孔板的每个孔中，并使用有限稀释度亚克隆，由此获得产生抗体的杂交瘤克隆。在获得的杂交瘤中，选择产生与人cd154结合的小鼠抗体的克隆，命名为“rd-05”(见图1)。

使用cd154转染的jurkatd1.1细胞，通过使用facsaria^tm(美国加利福尼亚州圣何塞市bectondickinson)根据制造商的说明书通过流式细胞术测量上述产生的抗体的结合亲和力。从图1中可以看出，不同于仅用第二抗体染色的阴性对照组，与rd-05小鼠抗体温育后，用fitc缀合的抗小鼠igg第二抗体染色的jurkatd1.1细胞显示出阳性应答。

实施例3：抗人cd154抗体可变区的测序

为了确定上述rd-05抗体的重链和轻链(分别包括重链可变区(vh)和轻链可变区(vl))的cdr的序列，如下克隆基因。

为了克隆基因，使用rnaminiprep试剂盒(德国希尔登市qiagen)根据制造商的说明书从rd-05杂交瘤细胞中提取rna，并进行pcr(novagen小鼠ig引物组#69831，muigvh5’-f、muiggvh3’-2和muigκvls’-b、muigκvl3’-1)，从而合成cdna。

用于合成所用的重链cdna的引物和pcr条件如下：正向引物muigvh5’-f：5’-actagtcgacatgaacttygggytsagmttgrttt-3’(y：c或t；s：c或g；m：a或c；和r：a或g)；反向引物muiggvh3’-2：5’-cccaagcttccagggrccarkggataracigrtgg-3’(r：a或g；k：g或t；和i：肌苷)；pcr条件：94℃，4分钟；35次循环，每次循环由94℃，45秒、52℃，45秒和72℃，1分钟组成；72℃，7分钟；在4℃停止。

接下来，使用ta克隆试剂盒(promega)根据制造商的说明书将pcr产物克隆到-teasy载体中。接下来，为了找到小鼠重链可变区，使用imgt(国际免疫遗传学信息系统http//：imgt.cines.fr)的imgt库(ig和tr)进行蛋白质展示，从而找到rd-05的重链可变区从其开始的框架1。接下来，在以下条件下进行用于确定rd-05的全长重链的基因序列的标准pcr：在55℃退火1分钟；95℃退火5分钟；37次循环，每次循环由95℃，1分钟、55℃，1分钟和72℃，1分钟组成；72℃退火5分钟；并在4℃停止。

用于pcr的引物如下：正向引物5’-ctcgagatgagggtgttaattctittgtggctgtttaca-3’；和反向引物5’-gcccttggtggaagcagatgagacggtaaccgtggtccc-3’。接下来，使用ta克隆试剂盒将pcr产物克隆到-teasy载体中，并使用imgt/v-quest确定所识别的cdr区的序列。结果发现，重链可变区hcdr1、hcdr2和hcdr3的序列分别由seqidno：1至3表示：seqidno：1：gysitsdya；seqidno：2：itysgti；和seqidno：3：arspyygpwyfdv。重链可变区的氨基酸序列和核酸序列分别由seqidno：7和17表示。

用于合成轻链cdna的引物和pcr条件如下：正向引物muigκvl5’-b：5’-gggaattcatggagacagacacactcctgctat-3’；反向引物muigκvl3’-1：5’-cccaagcttactggatggtgggaagatgga-3’；pcr条件：94℃，4分钟；35次循环，每次循环由94℃，45秒、52℃，45秒和72℃，1分钟组成；72℃，7分钟；并在4℃停止。

将rd-05的轻链基因克隆到-teasy载体中。接下来，为了找到小鼠免疫球蛋白可变区，进行imgt库(ig和tr)中的蛋白质展示，从而找到rd-05的轻链可变区从其开始的框架1。接下来，在以下条件下进行用于确定rd-05的全长轻链的基因序列的标准pcr：95℃，5分钟；37次循环，每次循环由95℃，1分钟、55℃，1分钟和72℃，1分钟组成；72℃，5分钟；在4℃停止。用于pcr的引物如下：正向引物5’-ctcgagatggagacagatacacttttgctatgggttctg-3’；和反向引物5’-ctggtgccgccacagtccgtttaatttccagcttagtccc-3’。接下来，使用ta克隆试剂盒将pcr产物克隆到-teasy载体中，然后使用imgt/v-quest确定所识别的cdr区的序列。结果，轻链可变区lcdr1、lcdr2和lcdr3的序列分别由seqidno：4至6表示：seqidno：4：qsvdydgdsy；seqidno：5：aas；和seqidno：6：qqsnedp。轻链可变区的氨基酸序列和核酸序列分别由seqidno：8和21表示。

实施例4：抗人cd154抗体识别的cd154抗原表位的确定

总共三种cd154抗原肽部分和卵清蛋白的缀合物由peptron(韩国大田市)构建。作为阳性对照，使用重组人cd154-fc融合蛋白(韩国仁川市adipogen)。将每种肽-卵清蛋白缀合物和cd154抗原进行10％sds-page，然后用小鼠rd-05抗体进行免疫印迹。图2示出了免疫印迹的结果。在图2中，泳道1是重组cd154蛋白；泳道2是卵清蛋白-spgrferillra；泳道3是卵清蛋白-grferillra；并且泳道4是卵清蛋白spgrferillr。本实施例中确定的表位是由seqidno：22的残基197至208的氨基酸构成的cd40配体部分。如上所述，所确定的表位被包括在与cd40接触的第二亲水区中以及与cd40相互作用的电荷相互作用区中。因此，可以认为由本文构建的抗体识别的表位包括第二亲水区和电荷相互作用区的全部或一部分。就此而言，根据本公开的表位可以包括本文识别的第二亲水区的g199、r200和r203，并且可以进一步包括第二亲水区的q232和电荷相互作用区的r207或e230中的任何一个或多个。

实施例5：人igg4嵌合抗-抗cd154抗体的构建

为了克隆上述产生的抗体的可变区基因，使用rnaminiprep试剂盒(qiagen)根据制造商的说明书从rd-05杂交瘤细胞中提取rna，然后进行pcr(novagen小鼠ig引物组#69831，muigvh5’-f、muiggvh3’-2和muigκvl5’-b、muigκvl3’-1)，由此合成可变区cdna。用于合成重链可变区cdna的引物和pcr条件如下：正向引物muigvh5’-f：5’-actagtcgacatgaacttygggytsagmttgrttt-3’(y：c或t；s：c或g；m：a或c；和r：a或g)；反向引物muiggvh3’-2：5’-cccaagcttccagggrccarkggataracigrtgg-3’；(r：a或g；k：g或t；和i：肌苷)；pcr条件：94℃，4分钟；35次循环，每次循环由94℃，45秒、52℃，45秒和72℃，1分钟组成；72℃，7分钟；在4℃停止。用于合成轻链可变区cdna的引物和pcr条件如下：正向引物muigκvl5’-b：5’-gggaattcatggagacagacacactcctgctat-3’；反向引物muigκvl3’-1：5’-cccaagcttactggatggtgggaagatgga-3’；pcr条件：94℃，4分钟；35次循环，每次循环由94℃，45秒、52℃，45秒和72℃，1分钟组成；72℃，7分钟；在4℃停止。

如上所述通过第一次pcr合成cdna后，在imgt中发现vh区从其开始的序列。接下来，使用以下引物扩增rd-05的可变区：

rd-05vh区正向引物：5’-ctcgagatgagggtgttaattcttttgtggctgtttaca-3’；rd-05vh区反向引物：5’-gcccttggtggaagcagatgagacggtaaccgtggtccc-3’；rd-05vl区正向引物：5’-ctcgagatggagacagatacacttttgctatgggttctg-3’，rd-05vl区反向引物：ctggtgccgccacagtccgtttaatttccagcttagtccc-3’。pcr在以下条件下进行：94℃，4分钟；35次循环，每次循环由94℃，45秒、52℃，45秒和72℃，1分钟组成；72℃，7分钟；在4℃停止。

为了克隆人igg4基因，首先使用rneasy哺乳动物总rnaminiprep试剂盒(qiagen)根据制造商的说明书从人外周血单核细胞提取总rna，然后使用核苷酸序列特异性引物和逆转录酶将其进行逆转录pcr，从而合成cdna。作为cdna合成的引物，使用人igg4重链核苷酸序列特异性引物(正向引物：5’-gttaccgtctcatctgcttccaccaagggcccctccgtg-3’；和反向引物：5’-gaattctcatttgcccaggctcagggacagggacttctg-3’)或人κ轻链核苷酸序列特异性引物(正向引物：5’-ctggaaattaaacggactgtggcggcaccatccgttttt-3’；和反向引物：5’-gaattctcaacattcgcccctgttaaagctttttgtgac-3’)。pcr在以下条件下进行：94℃，4分钟，35次循环，每次由94℃，45秒、52℃，45秒、72℃，1分钟组成；72℃，7分钟；在4℃停止。

用于融合重链可变区和人igg4恒定区的重叠pcr以及用于融合轻链可变区和人轻链κ区的重叠pcr使用以下引物进行：

rd-05vh区正向引物：5’-ctcgagatgagggtgttaattcttttgtggctgtttaca-3’；人igg4恒定区ch区反向引物：5’-gaattctcatttgcccaggctcagggacagggacttctg-3’；rd-05vl区正向引物：5’-ctcgagatggagacagatacacttttgctatgggttctg-3’；人轻链κcl区反向引物：5’-gaattctcaacattcgcccctgttaaagctttttgtgac-3’。重叠pcr在以下条件下进行：94℃，4分钟；35次循环，每次循环由94℃，1分钟、61℃，1分钟和72℃，1分钟组成；72℃，5分钟；在4℃停止。

另外，用以下方式产生其中人igg4的重链恒定区的残基115处的亮氨酸被谷氨酸替换(l115e)的rd-05突变抗体[rd-05(l115e)]。具体地，通过pcr扩增包括重链可变区和近端重链恒定区(包括重叠的11个氨基酸，该重叠的11个氨基酸包含人igg4恒定区的残基115)的基因，并且通过pcr扩增剩余的远端重链恒定区(包括重叠的11个氨基酸，该重叠的11个氨基酸包含残基115)，然后进行重叠pcr。使用以下引物进行pcr扩增反应：rd-05vh区正向引物：5’-ctcgagatgagggtgttaattcttttgtggctgtttaca-3’；人igg4恒定区115ch反向引物：5’-caggaacacggaaggtccgccttcaaattcaggggcagg-3’；人igg4恒定115区ch正向引物：5’-ccctgccctgcccctgaatttgaaggcggaccttccgtg-3’；和人igg4恒定区ch反向引物：5’-gaattctcatttgcccaggctcagggacagggacttctg-3’。在以下反应中进行pcr扩增反应：94℃，4分钟；35次循环，每次循环由94℃，1分钟、61℃，1分钟和72℃，1分钟组成；72℃，5分钟；在4℃停止。

重叠pcr使用以下引物进行：rd-05vh区正向引物：5’-ctcgagatgagggtgttaattcttttgtggctgtttaca-3’；人igg4恒定区ch反向引物：5’-gaattctcatttgcccaggctcagggacagggacttctg-3’。重叠pcr在与pcr扩增中使用的相同的条件下进行。

使用ta克隆试剂盒将重链和轻链嵌合基因克隆到-teasy载体中，然后测序。

在重链嵌合基因的情况下，将其插入到pcdna3.3^tm哺乳动物表达载体(invitrogen)中，并且克隆产物用xhoi/ecori消化，同时将轻链嵌合基因克隆到poptivec^tm(美国马里兰州盖瑟斯堡市lifetechnologies)载体中，并且克隆产物用xhoi/ecori消化(图4)。然后，载体构建体被测序)。

为了转染，使用dhfr阴性cho-dg44细胞(invitrogen)。将细胞在含有7％胎牛血清(美国纽约州格兰德岛gibco)、核糖核苷和脱氧核糖核苷的α-mem培养基中培养。使用effectene^tm(qiagen)转染试剂，用pcdna3.3^tm和poptivec^tm载体转染cho-dg44细胞。在转染前一天，将cho-dg44细胞接种到含有2ml的培养基的6孔板中，浓度为2×10⁵个细胞/ml。为了转染，将10μl的effectene^tm转染试剂加入dna增强剂混合物(在100μlec缓冲液中的0.4μg质粒和3.2μl增强剂)。将质粒dna和effectene^tm转染试剂溶液的混合物加入到上述培养过夜的cho-dg44细胞中，然后在37℃温育。培养3天后，通过elisa分析上清液。

在不含核糖核苷和脱氧核糖核苷的补充胎牛血清(fbs)的α-mem培养基中选择稳定转染的细胞。不含核糖核苷和脱氧核糖核苷的培养基阻断dhfr缺陷细胞的生长。所选细胞适应于存在400μg/ml的用于支持表达重链的细胞的生长的g418和存在1,000nm用于支持表达轻链的细胞的生长的甲氨蝶呤(mtx)的不含fbs的powercho2培养基(美国马里兰州沃克斯维尔lonza)。接下来，将细胞在100mm的培养皿中培养10天或以上，然后收集单集落并转移到包括不含fbs的powercho2培养基的96孔板中。筛选产生抗体的细胞，然后将其亚克隆三次，并且在erlenmeyer烧瓶中的powercho2^tm培养基中以4×10⁵个活细胞/ml的浓度培养产生高浓度抗体的细胞。适应后，使用蛋白g柱从上清液中分离和纯化抗体。

使用cd154转染的jurkatd1.1细胞，使用facsaria(bectondickinson)根据制造商的说明书通过流式细胞术，比较上述产生的igg4和igg4(l115e)rd-05嵌合抗体的结合亲和力。从图5中可以看出，不同于仅用第二抗体染色的阴性对照，与igg4或igg4(l115e)rd-05嵌合抗体温育后，用fitc缀合的抗人免疫球蛋白第二抗体染色的jurkatd1.1细胞显示出阳性应答。

实施例6：确定抗原的抗人cd154抗体的亲和力

使用woojungbsc公司(韩国京畿道水原市)的spr方法测量上述产生的rd-05小鼠抗体和igg4和igg4(l115e)rd-05嵌合抗体中的每个对人cd154抗原的结合亲和力kd。具体地，将17.5μg/ml的在固定缓冲液(10mm乙酸钠，ph6.0)中的重组人cd154蛋白以2300ru(共振单位；1ru＝1pg/mm²表面积)的密度附着到cmdh金芯片(目录号13206066，美国纽约州迪皮尤市reicherttechnologies)，之后将3.125μg/ml的牛血清白蛋白以650ru的密度附着。将rd-05抗体在0.3125、0.65、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320、2560和5120nm的pbs中稀释。每种抗体稀释液以30μl/分钟的流速流动，关联时间为5分钟，且解离时间为5分钟，同时用reichert’ssr7500dc系统读取数据，并通过scrubber2软件来确定ka和kd值。基于确定的值，计算kd值。rd-05小鼠抗体和igg4和igg4(l115e)rd-05嵌合抗体的kd值分别显示为3.7×10^-8m、4.5×10^-8m和3.3×10^-8m，这是与传统的5c8克隆(schuler等，transplantation2004；77：717-726)测量的值(1.0×10^-8m)差别不大的较好值。

实施例7：抗人cd154抗体抑制cd40-cd154相互作用的能力

在4℃下在elisa板(nunc-immunoplate，#439454)的每个孔上包被500ng的用于elisa捕获的cd40片段(abcamab155710，英国)过夜，然后将100μl的lx封闭缓冲液(sigmab6429)加入到每个孔中，然后在培养箱中在37℃下温育1小时。在以上实施例中产生的rd-05小鼠抗体和igg4和igg4(l115e)rd-05嵌合抗体中的每个从1,000ng/ml的浓度连续稀释至2.43ng/ml的浓度。将500ng的cd154-生物素(abcamab24966)与相同量的每个抗体稀释液在室温下预温育20分钟，并在培养箱中在37℃下将预温育的材料在上封闭的elisa板中以100μl/孔的量温育1小时。然后，在自动带式洗涤机上洗涤培养板3次，并在培养箱中在37℃下与100μl/孔的链霉亲和素-辣根过氧化物酶(thermo，#21126)的5000倍稀释物一起温育40分钟，然后在自动带式洗涤机上洗涤三次。接下来，将培养板的每个孔与100μl的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tmb)elisa底物一起温育20分钟，并且通过加入100μl的2nh2so4停止液停止反应。使用酶标仪读取450nm处的吸光度。结果，如图3所示，可以看出rd-05抗体能够以浓度依赖性方式特异性抑制cd154-cd40相互作用。

实施例8：人igg4rd-05嵌合抗体对抗药物抗体形成的抑制作用

为了评价人igg4(l115e)rd-05嵌合抗体对抑制抗药物抗体形成的作用，将humira注射到食蟹猴中。具体地，以2周的间隔对猴子皮下施用5mg/kg的humira，并且每周收集血清，并且使用k9651/tnfα阻断剂ada试剂盒(immunediagnosfik)所收集的血清中的抗humira抗体浓度。试验组在相对于施用humira的第一天的第-1天和第6天施用igg4(l115e)rd-05嵌合抗体(20mg/kg)。结果，在仅施用了humira的对照组中，产生了高浓度的抗humira抗体，但在施用了igg4(l115e)rd-05嵌合抗体的试验组中，未产生抗药物抗体(图6；截取10au/ml)。这表明根据本公开的igg4(l115e)rd-05嵌合抗体可有效抑制抗药物抗体的形成。

实施例9：人igg4rd-05嵌合抗体对血小板活化的影响

为了检查人igg4rd-05嵌合抗体对血小板活化的影响，使用人类cd32a-转基因小鼠(美国缅因州巴尔港jacksonlab.)。当这样的小鼠被注射人cd154抗原和抗人cd154抗体的复合物时，血小板数量在10分钟内大大减少，因此可以评价由抗cd154抗体引起的血栓形成的副作用(robles-carrillo等，jimmunol.2010；185：1577-1583)。将50μm重组人可溶性cd154蛋白和人igg4或igg4(l115e)rd-05嵌合抗体的混合物注射到人cd32a-转基因小鼠的尾静脉中，并且10分钟后，从心脏收集血液，测量血液中的血小板数量。结果，如图7所示，施用igg4rd-05抗体的小鼠的血小板数量与正常对照组相比下降。然而，施用igg4(l115e)rd-05嵌合抗体的小鼠中的血小板数量与正常对照组没有差异。这表明人igg4(l115e)rd-05嵌合抗体不引起血小板活化的副作用。

总之，在本公开中，开发了能够通过与人cd154蛋白结合来抑制cd154-cd40相互作用的抗体(rd-05)，并且发现抗体(rd-05)对人cd154抗原的亲和力与常规抗cd154抗体(5c8克隆)没有显著差异。

此外，当给食蟹猴施用igg4(l115e)rd-05嵌合抗体时，它非常有效抑制了针对humira的抗药物抗体的形成，表明嵌合抗体可以抑制抗体介导的免疫应答。

另外，将cd154蛋白和抗cd154抗体的免疫复合物静脉内注射到cd32a转基因小鼠中，且10分钟后从心脏收集血液，并且测量血液中的血小板数量。结果，施用了igg4rd-05嵌合抗体的小鼠中的血小板数量减少。然而，施用了igg4(l115e)rd-05嵌合抗体的小鼠中的血小板数量与正常对照组没有差异。这表明根据本公开的人igg4(l115e)rd-05嵌合抗体不引起血小板活化的副作用。

尽管以上已经详细描述了本公开的示例性实施方式，但是本领域技术人员将理解，本公开的范围不限于这些实施方式，并且各种修改和改进也落入如所附权利要求书中所限定的本公开的范围内。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文引用的所有出版物的内容通过引用并入本文。