本发明涉及匹伐他汀钙的改进的生产方法。
背景技术：
：匹伐他汀钙具有特异并拮抗性地抑制胆固醇合成的限速酶——hmg-coa还原酶的活性，并被用于治疗高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症等。匹伐他汀钙的化学名称为双[(3r,5s,6e)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]-3,5-二羟基-6-庚烯酸]钙，其由下式表示：已知匹伐他汀钙可以通过其前体化合物，即由下式(16)表示的2-[(4r,6s)-6-[(e)-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]乙烯基]-2,2-二甲基-1,3-二氧杂环己烷-4-基]乙酸酯的水解来生产：其中r7是具有1-4的碳数的烷基。由式(16)表示的所述化合物可以通过wittig反应来获得。专利文献1描述了上面提到的由式(16)表示的化合物，可以通过将稠合的吡啶衍生物与醛化合物在正丁基锂存在下，在-78℃反应来获得。专利文献1中描述的方法需要特殊设施进行工业生产，因为所述反应在-78℃的极低温度下进行，并且其产率低。另外，由于使用易于燃烧的正丁基锂作为碱，因此在工业规模生产中存在着安全性顾虑。此外，由于用于所述反应的正丁基锂和三溴化磷昂贵，因此成本变高。专利文献2描述了上面提到的由式(16)表示的化合物，通过将由下式(17)表示的化合物：其中r7如上所定义，与由下式(18)表示的化合物：其中r8是芳基、芳烷基或烷基，在碱金属盐存在下进行反应来获得。专利文献2中描述的方法对于工业生产来说产率不足。另外，由式(17)表示的化合物和由式(18)表示的化合物需要多步合成过程，这产生了对成本的担忧。[文献列表][专利文献]专利文献1：jp-a-5-310700专利文献2：jp-a-2014-1176技术实现要素：[本发明要解决的问题]需要开发在工业规模上以高产率、高选择性、低成本的方式安全地生产匹伐他汀钙的方法。本发明要解决的问题是提供一种在工业规模上生产高纯度匹伐他汀钙的方法，所述方法在安全性和成本方面优越并提供高产率和高选择性。[解决所述问题的方案]本发明人进行了深入研究，并发现上面提到的问题可以通过使用特定的中间体化合物来解决，这导致了本发明的完成。也就是说，本发明的要点如下。[1]一种生产匹伐他汀钙的方法，所述方法包括：(i)对由下式(1)表示的化合物：其中r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，并且x是酸，进行缩醛化，以给出由下式(3)表示的化合物的步骤，其中r3和r4各自独立地是具有1-4的碳数的烷基，并且r如上所定义；(ii)将上述由式(3)表示的化合物与酸反应，以给出由下式(4)表示的化合物的步骤：其中r如上所定义；以及(iii)对上述由式(4)表示的化合物进行水解，并将所述化合物与钙化合物反应，以给出匹伐他汀钙的步骤。[2][1]的生产方法，其还包括：(iv)将由下式(6)表示的化合物：其中r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，与酸进行反应，以给出由下式(1)表示的化合物的步骤，其中x是酸，并且r如上所定义。[3][2]的生产方法，其包括：(v)将由下式(7)表示的化合物：与由下式(8)表示的化合物：其中r5是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，前提是r5不同于上述式(1)中的r，在碱存在下进行缩合，以给出由下式(9)表示的化合物的步骤：其中r5如上所定义；(vi)将在步骤(v)中获得的由式(9)表示的上述化合物与由r-oh表示的醇进行反应，其中r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，以给出由下式(10)表示的化合物的步骤，其中r如上所定义；以及(vii)将在步骤(vi)中获得的由式(10)表示的上述化合物与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有生产所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理产物和/或通过培养所述微生物或细胞而获得的含有所述酶的培养溶液进行反应，以给出由下式(6)表示的化合物的步骤：其中r如上所定义。[4][2]的生产方法，其包括：(viii)将由下式(12)表示的化合物：与由下式(13)表示的化合物：其中r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，在钛催化剂存在下进行反应，以给出由下式(14)表示的化合物的步骤：其中r如上所定义；以及(ix)将在步骤(viii)中获得的由式(14)表示的上述化合物与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有生产所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理产物和/或通过培养所述微生物或细胞而获得的含有所述酶的培养溶液进行反应，以给出由下式(6)表示的化合物的步骤：其中r如上所定义。[5]一种由下式(1’)表示的化合物：其中r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，并且x1是甲磺酸。[6]一种生产由下式(1)表示的化合物的方法：其中x是酸，并且r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，所述方法包括(iv)将由下式(6)表示的化合物与酸进行反应，其中r如上所定义。此外，本发明的要点如下所述。[1a]一种生产由下式(5)表示的匹伐他汀钙的方法：所述方法包括：(i)对由下式(1)表示的化合物：其中r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，并且x是酸，进行缩醛化，以给出由下式(3)表示的化合物的步骤：其中r3和r4各自独立地是具有1-4的碳数的烷基，并且r如上所定义；(ii)将由下式(3)表示的化合物：其中r、r3和r4如上所定义，与酸催化剂进行反应，以给出由下式(4)表示的化合物的步骤，其中r如上所定义；以及(iii)对由下式(4)表示的化合物：其中r如上所定义，进行水解，并将所述化合物与钙化合物进行反应的步骤。[2a][1a]的生产方法，其包括：(iv)将由下式(6)表示的化合物：其中r如上所定义，与酸进行反应的步骤。[3a][2a]的方法，其包括：(v)将由下式(7)表示的化合物：与由下式(8)表示的化合物：其中r5是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，前提是r5不同于r，在碱存在下进行缩合，以给出由下式(9)表示的化合物的步骤：其中r5如上所定义；(vi)将在步骤(v)中获得的由式(9)表示的上述化合物与由r-oh表示的醇进行反应，其中r如上所定义，以给出由下式(10)表示的化合物的步骤：其中r如上所定义；以及(vii)将在步骤(vi)中获得的由式(10)表示的上述化合物与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有生产所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理产物和/或通过培养所述微生物或细胞而获得的含有所述酶的培养溶液进行反应，以给出由下式(6)表示的化合物的步骤：其中r如上所定义。[4a][2a]的生产方法，其包括：(viii)将由下式(12)表示的化合物：在ti催化剂存在下，与由下式(13)表示的化合物：进行反应，以给出由下式(14)表示的化合物的步骤，其中r如上所定义；以及(ix)将在步骤(viii)中获得的由式(14)表示的上述化合物与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有生产所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理产物和/或通过培养所述微生物或细胞而获得的含有所述酶的培养溶液进行反应，以给出由下式(6)表示的化合物的步骤：其中r如上所定义。[5a]一种由下式(1)表示的化合物：其中r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，并且x1是甲磺酸。[6a]一种生产由下式(1)表示的化合物的方法：其中x是酸，并且r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，上述方法包括：(iv)将由下式(6)表示的化合物与酸进行反应，其中r如上所定义。[发明效果]本发明的生产方法能够在工业规模上，以高产率、高选择性和低成本的方式安全生产匹伐他汀钙。附图说明图1是在实施例5中获得的dolemsoh的x射线衍射图。具体实施方式下面详细解释本说明书中使用的术语。r是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，优选为具有1-8的碳数的直链烷基，更优选为具有1-4的碳数的直链烷基，特别优选为甲基、乙基或正丙基。r1、r2、r3和r4各自独立地是具有1-4的碳数的烷基，优选为具有1-4的碳数的直链烷基，特别优选为甲基、乙基或正丙基。此外，r1和r2可能连接以形成环。r5是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-8的碳数的支链烷基，前提是r5不同于r。r5优选为具有3-8的碳数的支链烷基，更优选为异丙基、仲丁基、叔丁基、叔戊基，特别优选为叔丁基。ra是具有1-10的碳数的烷基。ra优选为具有1-4的碳数的短链烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等，并且在工业上异丙基是特别优选的。x是酸，优选为无机酸例如硫酸、盐酸等，有机酸例如甲酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等，更优选为硫酸、盐酸、甲磺酸或对甲苯磺酸，特别优选为甲磺酸。x1是甲磺酸。在本说明书中，“具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶”意味着具有将含羰基化合物中的羰基通过不对称还原转变成光学活性醇的活性的酶。“能够立体选择性还原羰基的活性”是否存在，可以通过用通用测定方法测量将含羰基化合物中的羰基通过不对称还原转变成光学活性醇的活性来确定。例如，将测量目标酶与由下式(19)表示的化合物反应：其中rb是具有1-8的碳数的直链烷基或具有3-6的碳数的支链烷基，-q1和-q2各自独立地是-oh或＝o，并且-q1和-q2中的至少一者是＝o，并直接测量从式(19)表示的所述化合物转化的由式(6)表示的化合物的量，由此可以确认所述酶活性。在本说明书中，“酶”包括纯化的酶(包括部分纯化的酶)、通过常规固定化技术固定在载体等上的酶，例如固定化在载体例如聚丙烯酰胺、卡拉胶(carageenan)等上的酶。在本说明书中，对“能够产生具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶的微生物或细胞”(在后文中有时被称为“本发明的微生物或细胞”)没有特别限制，只要它具有“能够立体选择性还原羰基的活性”即可，并且它可以是固有地具有上述活性的微生物或细胞，或通过育种(bleeding)而被赋予上述活性的微生物或细胞。作为通过育种赋予上述活性的手段，可以采取已知方法例如基因重组处理(转化)、突变处理等。作为转化方法，可以使用诸如引入目标基因、增强有机化合物的生物合成途径中的酶基因的表达、降低副产物生物合成途径中的酶基因的表达等方法。作为“本发明的微生物或细胞”的种类，可以提到在下述宿主生物体或宿主细胞中所描述的微生物或细胞。也可以使用处于冷冻状态下的“本发明的微生物或细胞”。在本说明书中“能够产生具有所述活性的酶的微生物或细胞”不限于活的微生物或细胞，而是也包括在生物学上死亡但具有酶活性的微生物或细胞。在本发明中，所述微生物或细胞可以例如通过wo2003/078634中描述的方法来生产。在本说明书中，对作为“宿主生物体”的生物体的种类没有特别限制，可以提到原核生物例如大肠埃希氏杆菌(escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、棒杆菌(corynebacterium)、假单胞菌属(pseudomonas)细菌、芽孢杆菌属(bacillus)细菌、根瘤菌属(rhizobium)细菌、乳杆菌属(lactobacillus)细菌、琥珀酸杆菌属(succinobacillus)细菌、厌氧螺菌属(anaerobiospirillum)细菌、放线杆菌属(actinobacillus)细菌等，真菌例如酵母、丝状真菌等，真核生物例如植物、动物等。其中，优选的是大肠埃希氏杆菌、酵母和棒杆菌，特别优选的是大肠埃希氏杆菌。在本说明书中，对作为“宿主细胞”的细胞的种类没有特别限制，并且可以使用动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。在本说明书中，“表达载体”是通过将编码具有所需功能的蛋白质的多核苷酸引入到宿主生物体中，用于在所述宿主生物体中复制并表达具有所需功能的蛋白质的遗传因子。其实例包括但不限于质粒、病毒、噬菌体、粘粒等。优选的表达载体是质粒。在本说明书中，“转化体”意味着已向其中引入上述表达载体，并且已获得显示出与具有所需功能的蛋白质相关的所需性状的能力的微生物或细胞。在本说明书中，“微生物或细胞的处理产物”意味着通过下述过程获得并含有具有所需功能的蛋白质等的产物：培养微生物或细胞，并且1)用有机溶剂等处理所述微生物或细胞，2)将其冷冻干燥，3)将其固定化在载体等上，4)物理或酶破坏。在本说明书中，“通过培养微生物或细胞而获得的含有酶的培养基”意味着1)微生物或细胞的培养基，2)通过用有机溶剂等处理微生物或细胞的培养基而获得的培养基，或3)其中微生物或细胞的细胞膜被物理或酶破坏的培养基。下面详细解释本发明的匹伐他汀钙生产方法。在下文中，w/v意味着重量/体积。如下所述，本发明的匹伐他汀钙生产方法包括：对由式(1)表示的化合物进行缩醛化以给出由式(3)表示的化合物的步骤(i)，将由式(3)表示的化合物与酸进行反应以给出由式(4)表示的化合物的步骤(ii)，以及对由式(4)表示的化合物进行水解并将其与钙化合物反应以给出由式(5)表示的匹伐他汀钙的步骤(iii)。此外，由式(1)表示的化合物也可以通过将由式(6)表示的化合物与酸进行反应来获得。下面详细解释本发明的生产方法的每个步骤。步骤(i)：在步骤(i)中，将由式(1)表示的化合物缩醛化，以给出由式(3)表示的化合物。具体来说，将由式(1)表示的化合物与由下式(2-1)或(2-2)表示的缩醛化试剂进行反应。对所使用的缩醛化试剂的量没有特别限制，并且相对于1mol由式(1)表示的化合物通常为1mol-10mol，优选为1mol-6mol。所述反应可以在酸催化剂存在下进行。作为酸催化剂，可以使用无机酸例如硫酸、盐酸等，有机酸例如甲酸、乙酸、对甲苯磺酸、对甲苯磺酸吡啶等，固体酸例如沸石等。可以使用其中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。其中，对甲苯磺酸、甲磺酸或对甲苯磺酸吡啶在工业上是优选的。当使用酸催化剂时，可以将它溶解在下面提到的溶剂中并使用。尽管对使用的酸催化剂的量没有特别限制，但相对于1mol由式(1)表示的化合物通常为0.001mol-2mol，优选为0.01mol-1.5mol。与缩醛化试剂的反应优选地使用溶剂来进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要所述反应可以进行即可，但优选地使用烃类溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等；醚类溶剂例如叔丁基甲基醚、四氢呋喃(thf)、环戊基甲基醚(cpme)等；酯类溶剂例如乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等；醇类溶剂例如甲醇、乙醇、正丙醇等；酮类溶剂例如丙酮、甲乙酮等；乙腈等。可以使用这些溶剂中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。对所使用的溶剂的量没有特别限制，并且它相对于1g由式(1)表示的化合物通常为1ml-100ml，优选为1ml-20ml。低于所使用的溶剂的沸点并高于所使用的溶剂的熔点的反应温度几乎不影响所述反应或目标产物的产率。因此，反应温度可以从这个温度范围适当地选择。在工业上，它优选为0℃-80℃，更优选为10℃-70℃。反应时间通常为0.5hr-24hr，优选为1hr-12hr。此外，也有可能通过将在步骤(i)中获得的含有由式(3)表示的化合物的反应产物进一步与酸进行反应以部分分解由式(3)表示的所述化合物的缩醛组成部分，来生产具有低的差向异构体含量百分数的由式(3)表示的化合物。作为所述酸，可以使用无机酸例如硫酸、盐酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、对甲苯磺酸吡啶等。可以使用其中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。其中，硫酸、盐酸或甲磺酸在工业上是优选的。所述酸可以作为水性溶液使用，或者可以溶解在下面提到的溶剂中并使用。对所使用的酸的量没有特别限制，并且它相对于1mol由式(3)表示的化合物通常为0.01mol-1mol，优选为0.05mol-0.5mol。与酸的反应优选地使用溶剂来进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要所述反应可以进行即可，但优选地使用烃类溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等；醚类溶剂例如叔丁基甲基醚、四氢呋喃(thf)、环戊基甲基醚(cpme)等；酯类溶剂例如乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等；醇类溶剂例如甲醇、乙醇、正丙醇等；酮类溶剂例如丙酮、甲乙酮等；乙腈等。可以使用这些溶剂中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。对所使用的溶剂的量没有特别限制，并且它相对于1g由式(1)表示的化合物通常为1ml-100ml，优选为1ml-20ml。低于所使用的溶剂的沸点并高于所使用的溶剂的熔点的反应温度几乎不影响所述反应或目标产物的产率。因此，反应温度可以从这个温度范围适当地选择。在工业上，它优选为0℃-60℃，更优选为10℃-50℃。差向异构体含量百分数可以通过反应的进展程度来控制，例如，通过进行反应以使转化率为5％-30％，可以将差向异构体含量百分数设定到0.3％或更低。在步骤(i)中获得的由式(3)表示的化合物可以直接用于步骤(ii)中，或者可以在如上所述降低差向异构体含量百分数后用于步骤(ii)中，或者可以在纯化后用于步骤(ii)中。作为纯化方法，可以将通过柱层析、结晶等的纯化适合地组合。在柱层析的情况下，例如，将非极性溶剂例如正庚烷、正己烷、甲苯等与极性溶剂例如乙酸乙酯、甲乙酮、thf、乙醇等组合以进行纯化。在结晶的情况下，例如，将非极性溶剂例如正庚烷、正己烷、甲苯等或水与极性溶剂例如乙酸乙酯、甲乙酮、thf、甲醇、乙醇、正丙醇等组合以进行纯化。此外，其中x是甲磺酸(甲磺酸根)的式(1)化合物是优选的，因为在步骤(i)完成后或在降低差向异构体含量百分数后通过仅仅向反应系统添加水就可以将由式(3)表示的化合物结晶，并且可以容易地获得由式(3)表示的化合物。当添加水时，可以使用单独获得的由式(3)表示的化合物作为种晶以促进结晶。在结晶期间，可以添加碱以中和系统。作为所述碱，可以提到无机盐例如碳酸氢钠、碳酸氢钾等，有机碱例如三乙胺等，并且优选的是碳酸氢钠和碳酸氢钾。步骤(ii)：在步骤(ii)中，将由式(3)表示的化合物与用于脱缩醛化的酸进行反应，以给出由式(4)表示的化合物。作为所述酸，可以使用无机酸例如硫酸、盐酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、对甲苯磺酸、对甲苯磺酸吡啶等。可以使用其中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。其中，硫酸或盐酸在工业上是优选的。所述酸可以作为水性溶液使用，或者可以溶解在下面提到的溶剂中并使用。对所使用的酸的量没有特别限制，但它相对于1mol由式(3)表示的化合物通常为1mol-5mol，优选为1mol-2mol。与酸的反应优选地使用溶剂来进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要所述反应可以进行即可，但优选地使用烃类溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等；醚类溶剂例如叔丁基甲基醚、四氢呋喃(thf)、环戊基甲基醚(cpme)等；酯类溶剂例如乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等；醇类溶剂例如甲醇、乙醇等；酮类溶剂例如丙酮、甲乙酮等。可以使用这些溶剂中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。对所使用的溶剂的量没有特别限制，并且它相对于1g由式(3)表示的化合物通常为1ml-100ml，优选为1ml-20ml。低于所使用的溶剂的沸点并高于所使用的溶剂的熔点的反应温度几乎不影响所述反应或目标产物的产率。因此，反应温度可以从这个温度范围适当地选择。在工业上，它优选为0℃-70℃，更优选为10℃-50℃。反应时间通常为1hr-10hr，优选为1hr-5hr。步骤(iii)：在步骤(iii)中，将由式(4)表示的化合物水解并与钙化合物反应，以给出由式(5)表示的匹伐他汀钙。优选地，由式(4)表示的化合物通过与碱催化剂进行反应来水解，并将获得的化合物与钙化合物反应以给出匹伐他汀钙。通常，匹伐他汀钙沉淀为晶体，因此将所述沉淀的匹伐他汀钙过滤并干燥。作为所述碱催化剂，可以使用无机碱，并且优选地可以使用碱金属氢氧化物例如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等。在工业上，氢氧化钠是特别优选的。对所使用的碱催化剂的量没有特别限制，并且它相对于1mol由式(4)表示的化合物通常为1mol-2mol，优选为1mol-1.5mol。水解优选地使用溶剂来进行。作为所述溶剂，水是优选的。在必要时，可以进一步添加醚类溶剂例如thf、1,4-二氧杂环己烷等；醇类溶剂例如甲醇、乙醇等；酮类溶剂例如丙酮等。可以使用这些溶剂中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。对所使用的溶剂的量没有特别限制，并且它相对于1g由式(4)表示的化合物通常为1ml-100ml，优选为1ml-50ml。低于所使用的溶剂的沸点并高于所使用的溶剂的熔点的水解温度几乎不影响所述水解或目标产物的产率。因此，水解温度可以从这个温度范围适当地选择。在工业上，它优选为0℃-70℃，更优选为10℃-50℃。水解的时间通常为1hr-24hr，优选为1hr-12hr。将所述通过水解获得的化合物与钙化合物进行反应以给出匹伐他汀钙。通过水解获得的所述化合物不必分离。在工业上，它优选被水解并连续地与钙化合物进行反应。作为所述钙化合物，可以使用钙的无机盐或有机盐，并且可以优选地使用氯化钙、乙酸钙等。低于所使用的溶剂的沸点并高于所使用的溶剂的熔点的与钙化合物的反应温度几乎不影响所述反应或目标产物的产率。因此，反应温度可以从这个温度范围适当地选择。在工业上，它优选为0℃-70℃，更优选为10℃-60℃。反应时间通常为0.1hr-10hr，优选为0.5hr-5hr。对匹伐他汀钙的过滤和干燥方法没有特别限制，并且可以使用已知方法。匹伐他汀钙的水含量通常为5wt％-15wt％，优选为7wt％-13wt％，特别优选为8wt％-12wt％。得到的匹伐他汀钙可以通过干燥调整到所需水含量，或在干燥后润湿以调整到所需水含量。步骤(iv):在步骤(iv)中，获得在步骤(i)中使用的由式(1)表示的化合物。具体来说，将由式(6)表示的化合物与酸进行反应以给出由式(1)表示的化合物。由式(1)表示的化合物是由式(6)表示的化合物的盐。优选的是与无机酸的盐例如硫酸盐、盐酸盐等；与有机酸的盐例如甲酸盐、乙酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等，更优选为硫酸盐、盐酸盐、甲磺酸盐或对甲苯磺酸盐。从结晶性的方面来说，由式(1)表示的化合物在工业上优选为甲磺酸盐，即由下式(1’)表示的化合物：其中x1是甲磺酸，并且r如上所定义。作为所述酸，可以使用无机酸例如硫酸、盐酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、甲磺酸、对甲苯磺酸等。可以使用其中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。其中，硫酸、盐酸、甲磺酸或对甲苯磺酸在工业上是优选的。对所使用的酸的量没有特别限制，并且它相对于1mol由式(6)表示的化合物通常为1mol-2mol，优选为1mol-1.5mol。所述反应优选地使用溶剂来进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要所述反应可以进行即可，但优选地使用烃类溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等；醚类溶剂例如叔丁基甲基醚、四氢呋喃(thf)、环戊基甲基醚(cpme)等；酯类溶剂例如乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等；醇类溶剂例如甲醇、乙醇等；酮类溶剂例如丙酮、甲乙酮等；乙腈等。可以使用这些溶剂中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。对所使用的溶剂的量没有特别限制，并且它相对于1g由式(6)表示的化合物通常为1ml-100ml，优选为1ml-50ml。低于所使用的溶剂的沸点并高于所使用的溶剂的熔点的反应温度几乎不影响所述反应或目标产物的产率。因此，反应温度可以从这个温度范围适当地选择。在工业上，它优选为0℃-70℃，更优选为10℃-50℃。反应时间通常为0.1hr-10hr，优选为0.5hr-5hr。由式(6)表示的化合物有时含有源自于获得所述化合物的步骤的杂质。例如，当由式(6)表示的化合物通过生物反应步骤例如下面提到的(a)或(b)的方法获得时，得到的反应产物除了由式(6)表示的化合物之外还含有杂质。因此，优选地通过纯化等除去所述杂质并将所述化合物用于步骤(i)中。通过本发明的步骤(iv)获得的由式(1)表示的化合物、特别是甲磺酸盐，在结晶性方面优越。因此，它容易作为晶体沉淀。因此，可以容易地分离由式(1)表示的化合物。具有步骤(iv)的本发明可以高效地除去来自于前一步骤的杂质。因此，在工业规模上的生产中，可以省略或简化纯化步骤。由式(6)表示的化合物可以通过有机合成步骤或生物反应步骤来获得。在本发明中，由式(6)表示的化合物优选地通过下述(a)或(b)的方法来生产。方法(a)：方法(a)特征性地包括步骤(v)、步骤(vi)和步骤(vii)。步骤(v)：在步骤(v)中，将由式(7)表示的化合物与由式(8)表示的化合物在碱存在下进行缩合，以给出由式(9)表示的化合物。作为所述碱，可以使用金属氢化物例如氢化钠、氢化钾、氢化钙等，氨基金属例如氨基钠等，有机锂例如丁基锂、二异丙基氨基锂等，grignard试剂例如叔丁基氯化镁等，醇盐例如乙醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾等。特别地，优选氨基钠、叔丁醇钠和氢化钠。对所使用的碱的量没有特别限制，并且它相对于1mol由式(7)表示的化合物通常为1mol-5mol，优选为1mol-4mol。所述缩合反应可以使用溶剂来进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要所述反应可以进行即可，但可以使用烃类溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等，卤代溶剂例如氯苯、二氯苯等，醚类溶剂例如叔丁基甲基醚、四氢呋喃(thf)、环戊基甲基醚(cpme)等，极性溶剂例如n-甲基-2-吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜等。可以使用其中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。尽管对所使用的溶剂的量没有特别限制，但它相对于1g由式(7)表示的化合物通常为5ml-100ml，优选为5ml-30ml。低于所使用的溶剂的沸点并高于所使用的溶剂的熔点的反应温度几乎不影响所述缩合反应或目标产物的产率。因此，反应温度可以从这个温度范围适当地选择。在工业上，它通常为0℃-100℃，优选为0℃-50℃。反应温度通常为0.1hr-200hr，优选为1hr-24hr。由式(7)表示的化合物可以通过例如在jp-b-2569746中描述的方法来生产，并且也可以使用可商购产品。由式(8)表示的化合物可以按照已知方法来获得。例如，它可以通过在syntheticcommunications,18(7),735‐739(1988)中描述的方法来获得。也可以使用可商购的化合物。由式(8)表示的化合物具有优选地不超过4、更优选地不超过3的ph。通过将由式(8)表示的化合物的ph设定到落于这一范围内，提高了由式(8)表示的化合物的保存稳定性，并且可以减少在反应期间杂质的形成。由式(8)表示的化合物的ph是通过将由式(8)表示的化合物与水以1:1(体积比)混合，并测量水性层的ph所获得的值。当所述ph值过高(例如高于4的ph)时，如有必要可以使用酸例如乙酸、盐酸、硫酸等来降低它。从结晶性的方面来说，式(9)中的r5优选为具有3-8的碳数的支链烷基，更优选为异丙基、仲丁基、叔丁基、叔戊基，特别优选为叔丁基。具有高结晶性的由式(9)表示的化合物在工业上是优选的，因为它不需复杂的纯化例如层析等即可以高纯度获得。步骤(vi)：在步骤(vi)中，将由式(9)表示的化合物与由r-oh表示的醇进行反应，以给出由式(10)表示的化合物。对所使用的由r-oh表示的醇的量没有特别限制，并且它相对于1g由式(9)表示的化合物通常为1ml-100ml，优选为1ml-10ml。所述反应可以使用溶剂来进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要所述反应可以进行即可，但可以使用酯类溶剂例如乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯等；非极性溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等；卤代溶剂例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳等；醚类溶剂例如叔丁基甲基醚(mtbe)、四氢呋喃(thf)、环戊基甲基醚(cpme)等；极性溶剂例如n-甲基-2-吡咯烷酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜等等。可以使用这些溶剂中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。此外，由r-oh表示的醇自身也可用作溶剂。尽管对所使用的溶剂的量没有特别限制，但它相对于1g由式(9)表示的化合物通常为1ml-100ml，优选为1ml-10ml。低于所使用的溶剂的沸点并高于所使用的溶剂的熔点的反应温度几乎不影响所述反应或目标产物的产率。因此，反应温度可以从这个温度范围适当地选择。在工业上，它通常为30℃-150℃，优选为40℃-110℃。反应时间通常为1hr-48hr，优选为2hr-24hr。从在生物反应步骤(vii)中的反应效率的方面来说，r-oh和式(10)中的r优选为具有1-8的碳数的直链烷基，更优选为具有1-4的碳数的直链烷基，特别优选为甲基、乙基或正丙基。这种由式(10)表示的化合物是优选的，因为羰基的立体选择性还原在生物反应步骤(vii)中高效地进行。步骤(vii)：生物反应步骤在步骤(vii)中，由式(10)表示的化合物通过与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有生产所述酶的能力的微生物或细胞(本发明的微生物或细胞)、所述微生物或细胞的处理产物和/或通过培养所述微生物或细胞而获得的含有所述酶的培养基(在后文中，它们有时被合称为“本发明的酶等”)的反应而被还原，以给出由式(6)表示的化合物。作为在步骤(vii)中使用的酶，可以使用具有seqidno:2中示出的氨基酸序列(在后文中有时被称为“ocr1”)或所述氨基酸序列的同源物的酶。具体来说，可以提到含有下述(a)、(b)或(c)的多肽或它们的同源物的酶。(a)在jp-b-4270918中描述的具有源自于甲醇诱导型酵母非发酵性变种(ogataeaminutavar.nonfermentans)nbrc1473的羰基还原酶(ocr1)(seqidno:2)的多肽，(b)由与seqidno:2中示出的氨基酸序列具有80％或更高同源性的氨基酸序列构成，并具有将由式(10)表示的化合物转变成由式(6)表示的化合物的活性的多肽，(c)包含在seqidno:2中示出的氨基酸序列中一个或几个氨基酸被替换、缺失或添加的氨基酸序列，并具有将由式(10)表示的化合物转变成由式(6)表示的化合物的活性的多肽。上述(b)的同源物是与seqidno:2中示出的全长氨基酸序列具有至少80％、优选地85％或更高、更优选地90％或更高、更加优选地95％或更高、特别优选地98％或更高的同源性的蛋白质，只要立体选择性还原羰基的活性不受损即可。上述(c)的同源物具有在seqidno:2中示出的氨基酸序列中一个或几个氨基酸被缺失、添加或替换的氨基酸序列，只要立体选择性还原羰基的活性不受损即可。当在本文中使用时，“一个或几个氨基酸”特别地是20个或更少、优选地10个或更少、更优选地5个或更少的氨基酸。编码上述酶的基因是包含下述(d)、(e)或(f)中示出的碱基序列或其同源物的dna：(d)seqidno:1中示出的碱基序列，(e)在严格条件下杂交到由与seqidno:1中示出的碱基序列互补的序列构成的dna，并编码具有作用于由式(10)表示的化合物并将其转变成由式(6)表示的化合物的活性的多肽的碱基序列，(f)具有在seqidno:1中示出的碱基序列中一个或几个碱基被替换、缺失或添加的碱基序列，并编码具有作用于由式(10)表示的化合物并将其转变成由式(6)表示的化合物的活性的多肽的碱基序列。在这里，在上述(e)中“在严格条件下杂交的碱基序列”意味着通过使用dna作为探针，在严格条件下通过集落杂交方法、噬斑杂交方法或southern印迹杂交方法等获得的dna的碱基序列。在集落杂交方法和噬斑杂交方法中，严格条件的实例包括使用固定有集落或噬斑来源的dna或dna片段的滤膜，在0.7mol/l-1.0mol/l氯化钠水溶液存在下和65℃下杂交，并用0.1-2×ssc溶液(1×ssc的组成：150mmol/l氯化钠水溶液，15mmol/l柠檬酸钠水溶液)在65℃下清洗所述滤膜的条件。每种杂交可以按照下述文献中描述的方法来进行：《分子克隆实验指南》(molecularcloning:alaboratorymannual)，第二版，coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny.,1989等。上述(f)的同源物具有在seqidno:1中示出的碱基序列中一个或几个碱基被缺失、添加或替换的碱基序列，只要立体选择性还原羰基的活性不受损即可。当在本文中使用时，“一个或几个碱基”特别地是60个或更少、优选地30个或更少、更优选地15个或更少、更优选地10个或更少、特别优选地5个或更少的碱基。在步骤(vii)中，由于本发明的酶等在操控性能方面优越并且容易向反应系统添加，因此它也可以冷冻状态使用。当使用冷冻的本发明的酶等时，对其形状没有特别限制，并且例如可以使用棱柱、圆柱、团块、球状形状等。在步骤(vii)中，作为反应物的由式(10)表示的化合物通常以0.01％w/v-20％w/v、优选地0.1％w/v-10％w/v的底物浓度使用。反应物可以事先存在于反应系统中，或者在反应开始时立即添加。当底物被酶抑制时，所述酶也可以从反应开始起连续或间歇地添加，以降低其影响或提高生成的产物的积累浓度。步骤(vii)优选地在辅酶nad(p)+或nad(p)h存在下进行。在这种情况下，上述辅酶优选地以通常0.001mmol/l-100mmol/l、优选0.01mmol/l-10mmol/l的浓度添加。当添加上述辅酶时，从反应效率的观点来看，将反应系统中从nad(p)h产生的nad(p)+再生成nad(p)h是优选的。再生方法的实例包括：1)利用本发明的微生物或细胞自身的从nad(p)+生成nad(p)h的能力、即nad(p)+还原能力的方法，2)包括向反应系统添加选自下述一者或多者的方法：具有从nad(p)+生成的nad(p)h的能力的微生物或其处理产物，或可用于nad(p)h再生的酶例如葡萄糖脱氢酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、有机酸脱氢酶(苹果酸脱氢酶等)等(在后文中被称为“再生酶”)，3)包括在生产本发明的微生物或细胞时将一种或多种上述再生酶基因同时引入到宿主生物体或宿主细胞中的方法，等等。在上述1)的方法中，从生产效率的方面来说，优选地向反应系统添加葡萄糖、乙醇、2-丙醇或甲酸等。在上述2)的方法中，可以使用具有生产上述再生酶的能力的微生物、微生物的处理产物例如用丙酮处理、戊二醛处理或冷冻干燥处理、物理或酶破坏等的微生物、作为粗产物或纯化产物获得的酶级分以及在载体例如聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶等上固定化之后的这些物质等，或者也可以使用可商购的酶。所使用的上述再生酶的量，优选为提供与具有立体选择性还原羰基的能力的本发明的酶的羰基还原活性相比，通常0.01倍至100倍、优选地0.5倍至20倍的酶活性的量。由于添加作为上述再生酶的底物的化合物例如利用葡萄糖脱氢酶时的葡萄糖、利用甲酸脱氢酶时的甲酸、利用醇脱氢酶时的乙醇或异丙醇等也是必须的，因此其添加量相对于1mol由式(10)表示的化合物通常为0.1mol-20mol，优选为1当量-10mol。在上述3)的方法中，可以使用将上述再生酶的dna与编码在步骤(i)中使用的酶的dna一起并入到染色体中的方法，将两种dna引入到单一表达载体中并转化宿主生物体或细胞的方法，或将两种dna引入分开的表达载体中并转化宿主生物体或细胞的方法等。在将两种dna引入分开的表达载体中并转化宿主生物体或细胞的方法中，需要考虑两种表达载体之间的不相容性来选择表达载体。当多个基因被引入到单一表达载体中时，将参与表达控制的区域例如启动子和终止子等连接到每个基因，并作为含有多个顺反子的操纵子例如乳糖操纵子来表达的方法，也是有可能的。步骤(vii)在水性介质或水性介质与有机溶剂的混合物中进行。所述水性介质或水性介质与有机溶剂的混合物含有由式(10)表示的化合物和上述酶、具有生产所述酶的能力的微生物或细胞、所述微生物或细胞的处理产物和/或通过培养所述微生物或细胞而获得的含有所述酶的培养基。此外，如有需要，可以含有各种不同辅酶。当含有辅酶时，其再生系统是更加优选的，即更优选地，所述辅酶可以被再生。由式(10)表示的化合物也可以通过下文提到的方法来生产。作为所述水性介质，可以提到水和ph缓冲液例如磷酸钾缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、tris-hcl缓冲液等。作为所述有机溶剂，可以使用由式(10)表示的化合物在其中显示出高溶解度的溶剂，例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷、正庚烷、二甲基亚砜、甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇等。其中，二甲基亚砜、甲醇、乙醇优选地作为有机溶剂，因为由式(10)表示的化合物在其中显示出高溶解度。此外，由于转化率高，二甲基亚砜是更优选的。步骤(vii)通常在4℃-70℃、优选地30℃-60℃的反应温度下，通常在ph3–11、优选地ph4–8下进行。反应时间通常为0.5hr-48hr，优选为0.5hr-24hr。在步骤(vii)中获得的由式(6)表示的化合物可以通过下述方法进行纯化：通过离心、过滤等分离细菌细胞、多肽等，调整到适合的ph，使用有机溶剂例如己烷、乙酸乙酯、甲苯等进行适合的萃取组合，以及通过柱层析、结晶等进行纯化。方法(b)：方法(b)特征性地包括步骤(viii)和步骤(ix)。步骤(viii)：在步骤(viii)中，将由式(12)表示的化合物与由式(13)表示的化合物在由下式(15)表示的钛催化剂(ti催化剂)存在下进行反应，以给出由式(14)表示的化合物。其中ra是具有1-10的碳数的烷基。对所使用的由式(13)表示的化合物的量没有特别限制，并且它相对于1mol由式(12)表示的化合物通常为1mol-10mol，优选为1mol-5mol。由式(15)表示的ti催化剂的联萘结构优选为s构象。作为ra，具有1-4的碳数的短链烷基例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基等是优选的，并且在工业上，异丙基是特别优选的。对所使用的ti催化剂的量没有特别限制，并且它相对于1mol由式(12)表示的化合物通常为0.001mol-1mol，优选为0.01mol-0.5mol。所述反应优选地使用溶剂来进行。尽管对所述溶剂没有特别限制，只要所述反应可以进行即可，但优选地使用烃类溶剂例如环己烷、正己烷、正庚烷、甲苯等；醚类溶剂例如叔丁基甲基醚、四氢呋喃(thf)、环戊基甲基醚(cpme)等；酯类溶剂例如乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯等；乙腈等。可以使用这些溶剂中的一种，或者也可以使用其中的两种或更多种的混合物。对所使用的溶剂的量没有特别限制，并且它相对于1g由式(12)表示的化合物通常为1ml-100ml，优选为1ml-50ml。也有可能向反应系统添加氯化锂和/或合成沸石。结果，可以获得具有高光学纯度的所需产物。对所使用的氯化锂的量没有特别限制，并且它相对于1mol由式(12)表示的化合物通常为0.001mol-2mol，优选为0.01mol-1mol。所述合成沸石的实例包括分子筛3a、4a、5a、13x等，优选为分子筛3a、4a。对所使用的合成沸石的量没有特别限制，并且它相对于1g由式(12)表示的化合物通常为0.01-1g，优选为0.1-0.5g。低于所使用的溶剂的沸点并高于所使用的溶剂的熔点的反应温度几乎不影响所述反应或目标产物的产率。因此，反应温度可以从这个温度范围适当地选择。在工业上，它优选为0℃-100℃，更优选为10℃-50℃。反应时间通常为1hr-24hr，优选为1hr-12hr。由式(12)表示的化合物可以按照已知方法来获得。例如，它可以通过在wo2000/42016中描述的方法来获得。此外，也可以使用可商购的产品。由式(13)表示的化合物也可以按照如下所示的已知方法来获得。例如，它可以通过wo2003/420180中描述的方法来获得。步骤(ix)：在步骤(ix)中，由式(14)表示的化合物通过与具有能够立体选择性还原羰基的活性的酶、具有生产所述酶的能力的微生物或细胞(本发明的微生物或细胞)、所述微生物或细胞的处理产物和/或通过培养所述微生物或细胞而获得的含有所述酶的培养基的反应而被还原，以给出由式(6)表示的化合物。步骤(ix)可以以与上述步骤(vii)中相同的方式来进行。[实施例]下面参考实施例对本发明进行进一步详细解释；然而，本发明不受所述实施例限制。实施例中的缩写示为下述化合物。pt-doxe：(6e)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]-3,5-二氧-6-庚烯酸乙酯pt-ald：[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]甲醛dhab：3,5-二氧庚烯酸叔丁酯pt-doxb：(6e)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]-3,5-二氧-6-庚烯酸叔丁酯pt-dole：(3r,5s,6e)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]-3,5-二羟基-6-庚烯酸乙酯dolemsoh：(3r,5s,6e)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]-3,5-二羟基-6-庚烯酸乙酯甲磺酸盐5s-mole：(e)-(5s)-7-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-喹啉-3-基]-5-羟基-3-氧-庚-6-烯酸乙酯acpt：(4r,6s,1e)-2-[2-环丙基-4-(4-氟苯基)-3-喹啉基]-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-乙酸乙酯me：甲基et：乙基t-bu：叔丁基etoh：乙醇thf：四氢呋喃dmf：n,n-二甲基甲酰胺实施例中的测定分析包括在下述条件下使用hplc(高效液相色谱)的测量。<pt-doxe的化学纯度>柱：capcellpakc18mg(4.6mm×75mm,3μm)，由shiseidoco.,ltd.制造流动相：a：水/乙酸/乙酸铵＝1000/100/7.7(ml/ml/g)b：thf梯度程序(b的浓度)：41vol％(0min)→41vol％(17min)→90vol％(27min)流速：1ml/min柱温：40℃检测波长：uv254nm<pt-dole的化学纯度>柱：l-columnods(4.6mm×250mm,5μm)，由ceri制造流动相：a：10mmol/l乙酸铵b：乙醇/thf＝15/1(体积比)梯度程序(b的浓度)：48vol％(0min)→48vol％(35min)→64vol％(55min)流速：1.0ml/min柱温：40℃检测波长：uv245nm<acpt的化学纯度>柱：unisonuk-c18(4.6mm×250mm,3μm)，由imtact制造流动相：a：30mmol/l乙酸铵水溶液/乙腈＝20/80(体积比)b：30mmol/l乙酸铵水溶液/乙腈＝5/95(体积比)梯度程序(b的浓度)：0vol％(0min)→0vol％(10min)→90vol％(30min)流速：1ml/min柱温：40℃检测波长：uv245nm<匹伐他汀钙的化学纯度>柱：unisonuk-c18(4.6mm×250mm,3μm)，由imtact制造流动相：a：0.1vol％甲酸b：乙腈梯度程序(b的浓度)：25vol％(0min)→35vol％(20min)→90vol％(30min)→90vol％(35min)流速：1ml/min柱温：40℃检测波长：uv331nm<粉末x-射线衍射的测量条件>测量装置：xrd6000型，由shimadzucorporation制造辐射源：cu波长：单色器：使用管电压：40.0kv管电流：40.0ma发散：1.00deg散射：1.00deg接收：0.15mm模式：连续扫描传动轴：θ–2θ数据范围：2–40deg步级：0.02deg扫描速度：2.0000deg/min旋转速度：60rpm实施例1(pt-doxe的生产)在氮气气氛下，将氢化钠(20.8g，纯度59.5％，515mmol)和thf(200ml)装入烧瓶中并冷却至17℃。向该混合物在2hr内逐滴添加dhab(53.9g，纯度91.9％，247.1mmol)在thf(200ml)中的溶液，并在所述逐滴添加完成后将溶液在25℃搅拌13hr。向搅拌后的所述溶液在4hr内逐滴添加pt-ald(40.0g，137.3mmol)在thf(400ml)中的溶液，并在所述逐滴添加完成后将溶液在25℃搅拌1hr。通过hplc对搅拌后的溶液进行分析，发现向pt-doxb的转化率为99.2％。在25℃下向搅拌后的所述溶液逐滴添加正庚烷(200ml)和水(400ml)并分液。随后，将有机层用4wt％氯化钠水溶液、10wt％柠檬酸水溶液和10wt％氯化钠水溶液洗涤。通过hplc对得到的有机层进行分析，发现pt-doxb的产率为88.2％。将所得有机层在减压下浓缩并添加乙醇(200ml)。将得到的溶液在压热釜(密封容器)中加热至内部温度为100℃-105℃并维持。在进行10hr后，通过hplc分析得到的溶液，发现向pt-doxe的转化率为99.0％。将得到的溶液冷却至64℃并搅拌1hr。将搅拌后的所述溶液逐渐冷却到0℃至-5℃，并通过过滤回收晶体。将得到的晶体和乙醇(200ml)装入烧瓶中并加热到乙醇回流的温度。随后，将混合物冷却至内部温度为70℃并搅拌1hr。将搅拌后的溶液逐渐冷却到0℃至-5℃，通过过滤回收所述晶体并在减压下干燥。通过hplc分析得到的晶体，发现pt-doxe的纯度为99.1面积％，并且量为39.7g(产率64.9％)。实施例2(pt-doxb的生产)在氮气气氛下，将氢化钠(15.6g，纯度59.5％，386mmol)、thf(150ml)和n,n-二甲基甲酰胺(75ml)装入烧瓶中并冷却到5℃。向这种混合物在2hr内逐滴添加dhab(40.4g，纯度91.9％，185.4mmol)在thf(150ml)中的溶液，并在所述逐滴添加完成后将混合的溶液在8至10℃下搅拌14hr。向搅拌后的混合溶液在3hr内逐滴添加pt-ald(30.0g，103.0mmol)在thf(225ml)中的溶液，并将所述逐滴添加完成后的溶液在8至10℃下搅拌6hr。通过hplc分析搅拌后的溶液，发现向pt-doxb的转化率为98.5％。在10℃下向搅拌后的所述溶液逐滴添加正庚烷(150ml)和水(150ml)并分液。随后，将有机层用4wt％氯化钠水溶液、10wt％柠檬酸水溶液和10wt％氯化钠水溶液洗涤。通过hplc分析得到的有机层，发现pt-doxb的产率为88.9％。参考例1(细菌细胞的制备)[共表达羰基还原酶(下文称为ocr1)和葡萄糖-1-脱氢酶(下文称为gdh)的重组大肠埃希氏杆菌jm109/pkv32ocr1-gdh的制备](1)基因的克隆在编码源自于甲醇诱导型酵母非发酵性变种(ogataeaminutavar.nonfermentans)nbrc(以前的ifo)1473的ocr1(jp-b-4270918中描述的seqidno:2)的基因序列(ocr1)的基础上，设计并合成用于扩增全长ocr1基因的引物ocr1_f(seqidno:3)和ocr1_r(seqidno:4)。然后，按照常规方法并使用甲醇诱导型酵母非发酵性变种(ogataeaminutavar.nonfermentans)的染色体dna作为模板进行pcr，给出约0.8kbpdna片段。然后，在编码gdh(seqidno:6)的基因序列(后文中的gdh(seqidno:5))的基础上设计并合成用于扩增全长gdh基因的引物gdh_f1(seqidno:7)和gdh_r1(seqidno:8)，所述gdh是由源自于枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的基因(genebank登记号al009126.3)编码的葡萄糖-1-脱氢酶，其中第96位氨基酸残基谷氨酸被丙氨酸替换。然后，按照常规方法进行pcr，给出约0.8kbpdna片段。(2)表达质粒的制备将在上述(1)中获得的ocr1的dna片段用限制性酶ecori和hindiii消化，并使用ligation-convenience试剂盒(由nippongeneco.,ltd.制造)将其引入到用muni和hindiii消化的质粒pkv32(在jp-a-2005-34025中描述)中trc启动子的下游中，给出pkv32ocr1。然后，将在上述(1)中获得的gdh的dna片段用限制性酶ecori和xbai消化，并使用ligation-convenience试剂盒(由nippongeneco.,ltd.制造)将其引入到用muni和xbai消化的质粒pkv32中trc启动子的下游中，给出pkv32gdh。使用pkv32gdh作为模板，并使用添加有限制性酶位点hindiii的引物gdh_f2(seqidno:9)和gdh_r2(seqidno:10)进行pcr，将得到的片段用限制性酶hindiii消化并插入到事先用限制性酶hindiii消化的质粒pkv32ocr1的下游中，给出pkv32ocr1-gdh。gdh基因在得到的质粒中的取向通过pcr确认。(3)表达菌株的制备使用在上述(2)中获得的pkv32ocr1-gdh，按照常规方法转化大肠埃希氏杆菌jm109(由takarabioinc.制造)，给出重组大肠埃希氏杆菌jm109/pkv32ocr1-gdh。实施例3(pt-dole的生产)将离子交换水(57ml)、单水合葡萄糖(30g，151.5mmol)、nadp+(30mg，0.04mmol)、磷酸二氢钾(2.76g，20.3mmol)和磷酸氢二钾(0.39g，2.3mmol)装入250ml发酵罐中并在其中溶解。向其添加通过参考例1的方法制备的重组大肠埃希氏杆菌jm109/pkv32ocr1-gdh的冷冻的细菌细胞(45g)和通过将以与实施例1类似的方法获得的pt-doxe(1.2g，2.69mmol)溶解在二甲基亚砜(dmso)(36.3g)中而制备的全部量的底物溶液，并通过在50℃的内部温度下搅拌4hr将所述混合物进行反应。在反应期间，逐滴添加25wt％氢氧化钠水溶液以维持ph6。将得到的反应混合物用乙腈稀释36倍，通过孔眼尺寸为0.2nm的滤膜过滤并得到滤液。通过hplc分析所述滤液，发现从pt-doxe向pt-dole的转化率为85.7％。实施例4(pt-dole的生产)将离子交换水(12l)、单水合葡萄糖(750g)、nadp+(2.9g)、磷酸氢二钾(20.85g，0.12mol)和磷酸二氢钾(147.0g，1.08mol)装入30l发酵罐中并在其中溶解。向其添加通过参考例1的方法制备的重组大肠埃希氏杆菌jm109/pkv32ocr1-gdh的冷冻的细菌细胞(2.1kg)和通过将5s-mole(按照国际专利申请号2005-516064的国家公开中所描述的方法生产)(0.3kg，0.67mol)溶解在二甲基亚砜(dmso)(3.3kg)中而制备的全部量的底物溶液，并通过在50℃的内部温度下搅拌3hr将所述混合物进行反应。在反应期间，逐滴添加25wt％氢氧化钠水溶液以维持ph6.5。将得到的反应混合物以10,000rpm离心10min，给出由细菌细胞和得到的反应产物构成的沉淀物。将所述沉淀物悬浮在5wt％硫酸钠水溶液中，并用乙酸乙酯萃取。将使用乙酸乙酯的萃取重复三次。将得到的萃取物合并以给出溶液。通过hplc分析得到的溶液，发现pt-dole的纯度为97.6面积％，并且产量为236g(产率78.7％)。实施例5(dolemsoh的生产)将通过与实施例4相似的方法获得的pt-dole在减压下浓缩，并获得被制备到浓度为11.6wt％的pt-dole溶液。在30℃下向得到的pt-dole溶液(377.6g，97.4mmol)添加甲磺酸(0.5g，5.2mmol)，并将所述混合物在相同温度下搅拌1.5hr。逐滴添加甲磺酸(8.9g，92.6mmol)溶解在乙酸乙酯(39.3g)中的溶液。在所述逐滴添加完成后，将反应混合物冷却至-3℃。在冷却后，将得到的悬液过滤，并将残留物在40℃的外部温度下在减压下干燥。通过hplc分析得到的固体，发现dolemsoh产量为52.4g(产率98％)。得到的固体的熔点、1h-nmr和粉末x-射线衍射(xrd)测量结果如下。熔点：132℃1h-nmr(400mhz,dmso)δ1.22-1.24(6h,m),1.46(2h,s),1.49(1h,m),2.22-2.33(2h,m),2.37(3h,s),2.61(1h,m),3.76(1h,m),4.08(2h,t,j＝8hz),4.14(1h,m),5.67(1h,dd,j＝4hz,16hz),6.53(1h,d,j＝16hz),7.35-7.40(5h,m),7.56(1h,m),7.82(1h,m),8.09(1h,m)xrd测量结果：表12θ相对强度2θ相对强度6.92026.2813.52826.9615.3927.8915.7528.2916.5629.6717.01429.8618.81330.1519.8930.6520.610030.9821.11633.0521.84233.6722.21634.2523.91134.6524.5734.8524.7835.6525.01039.05实施例6(acpt的生产)将通过与实施例5相似的方法获得的dolemsoh(15.0g，27.5mmol)和乙腈(58.5g)装入烧瓶中。在20℃的内部温度下向所述混合物添加丙酮二甲基缩醛(11.3g，109mmol)。在搅拌3hr后，添加碳酸氢钠(2.9g)和水(19.5g)。进一步添加水(13.0g)并将混合物搅拌12hr。随后，添加水(42.2g)，将内部温度冷却至-4℃，通过过滤收集得到的晶体并在减压下干燥，给出作为粗晶体的acpt(13.3g，产率99％)。将得到的acpt的粗晶体(10g)、乙醇(58.8g)和水(14.7g)装入烧瓶中，并通过将内部温度升高到60℃左右进行溶解。将得到的溶液冷却至内部温度为37℃左右并搅拌一会儿以沉淀晶体。随后，在6hr内将内部温度冷却至-3℃。通过过滤收集得到的晶体并在减压下干燥。通过hplc分析得到的晶体，发现acpt纯度为99.8面积％，并且产量为8.9g(产率89％)。实施例7(匹伐他汀钙的生产)将通过与实施例6相似的方法获得的acpt晶体(8g，16.3mmol)和乙醇(40ml)装入烧瓶中。在30℃左右的内部温度下，向所述混合物添加35wt％盐酸(2.4g)和水(21.6g)的混合溶液。在搅拌3.5hr后，添加乙酸乙酯(90ml)和7wt％碳酸氢钠水溶液(45g)。将得到的溶液分液，向水性层添加乙酸乙酯(45ml)并将混合物分液。将得到的有机层合并，用20wt％氯化钠水溶液(45g)洗涤并浓缩。在浓缩后，向得到的残留物添加乙醇(74ml)和水(74ml)。向所述混合物添加8wt％氢氧化钠水溶液(9.9g)。在搅拌3hr后，将得到的溶液在减压下浓缩。在减压下浓缩后，向得到的残留物添加叔丁基甲基醚(37ml)，并将混合物分液。这个操作进行两次。将水性层在减压下浓缩，并在32℃左右的内部温度下逐滴添加二水合氯化钙(2.6g)溶解在水(104g)中的溶液。随后，将得到的反应混合物冷却至2℃左右，通过过滤收集得到的晶体，并将湿晶体在减压下干燥。当所述晶体的水含量达到9.6wt％时，将干燥中止。通过hplc分析得到的晶体，发现匹伐他汀钙的纯度为99.93面积％，并且产量为9.7g(产率94％)。实施例8(匹伐他汀钙的生产)将通过与实施例6相似的方法获得的acpt晶体(70g，143mmol)和乙醇(350ml)装入烧瓶中。在30℃左右的内部温度下，向所述混合物添加35wt％盐酸(208g)。在搅拌2hr后，添加乙醇(210ml)并添加8wt％氢氧化钠水溶液(100g)。将所述混合物浓缩至630ml的体积。随后，添加3.5wt％盐酸(178g)，并将混合物在室温搅拌2hr。随后，添加8wt％氢氧化钠水溶液(178g)，并将混合物在室温搅拌2hr。向所述混合物添加210ml水，并将混合物浓缩至700ml的体积。向所述浓缩物添加水(350ml)和叔丁基甲基醚(350ml)，将混合物分液，并将水性层浓缩至980ml的体积。在30℃左右的温度下，向得到的浓缩物逐滴添加二水合氯化钙(22.9g)和水(173g)的混合溶液。将得到的悬液冷却至室温，通过过滤收集得到的晶体，并将湿晶体在减压下干燥。得到的晶体的水含量为7.8wt％。使加湿氮气流过得到的晶体，以将水含量调整到10.9wt％。通过hplc分析得到的晶体，发现匹伐他汀钙的纯度为99.96面积％，并且产量为66.0g(产率93％)。[工业实用性]根据本发明的方法，可以在工业规模上以高产率、高选择性和低成本安全地生产匹伐他汀钙。本申请基于在日本提交的专利申请号2015-154864，其全部内容涵盖在本文中。序列表<110>株式会社api<120>生产匹伐他汀钙的方法<130>092504<150>jp2015-154864<151>2015-08-05<160>10<170>patentin3.5版<210>1<211>753<212>dna<213>甲醇诱导型酵母非发酵性变种（ogataeaminutavar.nonfermentans）<220><221>cds<222>(1)..(753)<400>1atggctaaaactgtttacttcatcgcaggtgcttccagaggtatcggt48metalalysthrvaltyrpheilealaglyalaserargglyilegly151015ctcgaggttgcttcccagctgagtgcaaacccagacaattatgttatt96leugluvalalaserglnleuseralaasnproaspasntyrvalile202530gcatcctatagatctgaaaagtctgcttcaggacttttggagctggca144alasertyrargserglulysseralaserglyleuleugluleuala354045aagaaggataatgtcgacacaattgtgttggatattgcaagccaggaa192lyslysaspasnvalaspthrilevalleuaspilealaserglnglu505560tcgattgatgctgttccagcacagatttccaagctgactgatggaatc240serileaspalavalproalaglnileserlysleuthraspglyile65707580gatgttgccttgatcaacgctggaattgccaacgctatgtgtccgatt288aspvalalaleuileasnalaglyilealaasnalametcysproile859095ctcgaatgttctagagagtcctacactgatcactggacaaccaatgcc336leuglucysserargglusertyrthrasphistrpthrthrasnala100105110ttgggtccaatcatgctctaccaagctattcataagttcatgctccag384leuglyproilemetleutyrglnalailehislysphemetleugln115120125agagagaccagaaaagtgttctttaccacgagtgctggtggttccatt432arggluthrarglysvalphephethrthrseralaglyglyserile130135140caggctaagatacccgtgcctgtgagtggttacggtatgtccaaggct480glnalalysileprovalprovalserglytyrglymetserlysala145150155160gcgcttaattatgctgtgagaaaacttgctgacgagtgctacaaggac528alaleuasntyralavalarglysleualaaspglucystyrlysasp165170175aacttcactattgtgttgctgcatcctggttttgttaagacggacatg576asnphethrilevalleuleuhisproglyphevallysthraspmet180185190ggtcaaagcgccattcagaagatgtcaaatggaaatgctgagcttctt624glyglnseralaileglnlysmetserasnglyasnalagluleuleu195200205gcttacattgactcaatgactattgatgttcctaccagtgctggccaa672alatyrileaspsermetthrileaspvalprothrseralaglygln210215220atcgtcggtgccattatgaccttggacaagcagagcagcggtagattt720ilevalglyalailemetthrleuasplysglnserserglyargphe225230235240atcaacgctgctgaccagtttgacatgccattt753ileasnalaalaaspglnpheaspmetprophe245250<210>2<211>251<212>prt<213>甲醇诱导型酵母非发酵性变种（ogataeaminutavar.nonfermentans）<400>2metalalysthrvaltyrpheilealaglyalaserargglyilegly151015leugluvalalaserglnleuseralaasnproaspasntyrvalile202530alasertyrargserglulysseralaserglyleuleugluleuala354045lyslysaspasnvalaspthrilevalleuaspilealaserglnglu505560serileaspalavalproalaglnileserlysleuthraspglyile65707580aspvalalaleuileasnalaglyilealaasnalametcysproile859095leuglucysserargglusertyrthrasphistrpthrthrasnala100105110leuglyproilemetleutyrglnalailehislysphemetleugln115120125arggluthrarglysvalphephethrthrseralaglyglyserile130135140glnalalysileprovalprovalserglytyrglymetserlysala145150155160alaleuasntyralavalarglysleualaaspglucystyrlysasp165170175asnphethrilevalleuleuhisproglyphevallysthraspmet180185190glyglnseralaileglnlysmetserasnglyasnalagluleuleu195200205alatyrileaspsermetthrileaspvalprothrseralaglygln210215220ilevalglyalailemetthrleuasplysglnserserglyargphe225230235240ileasnalaalaaspglnpheaspmetprophe245250<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr引物<400>3cggaattcatggctaaaactgtttacttc29<210>4<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr引物<400>4gggaagcttattactaaaatggcatgtcaaactgg35<210>5<211>783<212>dna<213>枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）<220><221>cds<222>(1)..(783)<400>5atgtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgctattacaggagctgct48mettyrproaspleulysglylysvalvalalailethrglyalaala151015tcagggctcggaaaggcgatggccattcgcttcggcaaggagcaggca96serglyleuglylysalametalaileargpheglylysgluglnala202530aaagtggttatcaactattatagtaataaacaagatccgaacgaggta144lysvalvalileasntyrtyrserasnlysglnaspproasngluval354045aaagaagaggtcatcaaggcgggcggtgaagctgttgtcgtccaagga192lysglugluvalilelysalaglyglyglualavalvalvalglngly505560gatgtcacgaaagaggaagatgtaaaaaatatcgtgcaaacggcaatt240aspvalthrlysglugluaspvallysasnilevalglnthralaile65707580aaggagttcggcacactcgatattatgattaataatgccggtcttgca288lysglupheglythrleuaspilemetileasnasnalaglyleuala859095aatcctgtgccatctcacgaaatgccgctcaaggattgggataaagtc336asnprovalproserhisglumetproleulysasptrpasplysval100105110atcggcacgaacttaacgggtgcctttttaggaagccgtgaagcgatt384ileglythrasnleuthrglyalapheleuglyserargglualaile115120125aaatatttcgtagaaaacgatatcaagggaaatgtcattaacatgtcc432lystyrphevalgluasnaspilelysglyasnvalileasnmetser130135140agtgtgcacgaagtgattccttggccgttatttgtccactatgcggca480servalhisgluvalileprotrpproleuphevalhistyralaala145150155160agtaaaggcgggataaagctgatgacagaaacattagcgttggaatac528serlysglyglyilelysleumetthrgluthrleualaleuglutyr165170175gcgccgaagggcattcgcgtcaataatattgggccaggtgcgatcaac576alaprolysglyileargvalasnasnileglyproglyalaileasn180185190acgccaatcaatgctgaaaaattcgctgaccctaaacagaaagctgat624thrproileasnalaglulysphealaaspprolysglnlysalaasp195200205gtagaaagcatgattccaatgggatatatcggcgaaccggaggagatc672valglusermetileprometglytyrileglygluproglugluile210215220gccgcagtagcagcctggcttgcttcgaaggaagccagctacgtcaca720alaalavalalaalatrpleualaserlysglualasertyrvalthr225230235240ggcatcacgttattcgcggacggcggtatgacacaatatccttcattc768glyilethrleuphealaaspglyglymetthrglntyrproserphe245250255caggcaggccgcggt783glnalaglyarggly260<210>6<211>261<212>prt<213>枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）<400>6mettyrproaspleulysglylysvalvalalailethrglyalaala151015serglyleuglylysalametalaileargpheglylysgluglnala202530lysvalvalileasntyrtyrserasnlysglnaspproasngluval354045lysglugluvalilelysalaglyglyglualavalvalvalglngly505560aspvalthrlysglugluaspvallysasnilevalglnthralaile65707580lysglupheglythrleuaspilemetileasnasnalaglyleuala859095asnprovalproserhisglumetproleulysasptrpasplysval100105110ileglythrasnleuthrglyalapheleuglyserargglualaile115120125lystyrphevalgluasnaspilelysglyasnvalileasnmetser130135140servalhisgluvalileprotrpproleuphevalhistyralaala145150155160serlysglyglyilelysleumetthrgluthrleualaleuglutyr165170175alaprolysglyileargvalasnasnileglyproglyalaileasn180185190thrproileasnalaglulysphealaaspprolysglnlysalaasp195200205valglusermetileprometglytyrileglygluproglugluile210215220alaalavalalaalatrpleualaserlysglualasertyrvalthr225230235240glyilethrleuphealaaspglyglymetthrglntyrproserphe245250255glnalaglyarggly260<210>7<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr引物<400>7ggggaattcatgtatccggatttaaaaggaaaagtcg37<210>8<211>32<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr引物<400>8gggtctagattaaccgcggcctgcctggaatg32<210>9<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr引物<400>9cccaagcttagttaactttagaaggagacaattc34<210>10<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>pcr引物<400>10ctgccgcccgactatcac18当前第1页12