本申请要求2015年11月2日提交的美国临时申请序列号62/249,463的优先权，该临时申请的整个公开内容以引用的方式并入本文。
本公开整体涉及对由鞘翅目和/或半翅目害虫引起的植物损害的遗传控制。在特定的实施方案中，本公开涉及鉴定靶标编码序列和非编码序列，以及使用重组dna技术转录后阻遏或抑制靶标编码序列和非编码序列在鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中的表达，从而提供植物保护效果。
背景技术：
西方玉米根虫(wcr)(玉米根萤叶甲(diabroticavirgiferavirgiferaleconte))是北美最具破坏性的玉米根虫物种之一，在美国中西部玉米种植区备受关注。北方玉米根虫(ncr)(巴氏根萤叶甲(diabroticabarberismithandlawrence))是与wcr在几乎相同的范围内共栖的近缘物种。还有另外几种叶甲属(diabrotica)的相关亚种是美洲的严重害虫：墨西哥玉米根虫(mcr)(墨西哥玉米根萤叶甲(d.virgiferazeaekrysanandsmith))；南方玉米根虫(scr)(十一星根萤叶甲(d.undecimpunctatahowardibarber))；黄瓜条根萤叶甲(d.balteataleconte)；黄瓜十一星叶甲(d.undecimpunctatatenella)；南美叶甲(d.speciosagermar)；以及d.u.undecimpunctatamannerheim。美国农业部目前估计玉米根虫每年造成10亿美元收益损失，包括8亿美元的产量损失和2亿美元的治理成本。
wcr卵和ncr卵均在夏季期间沉积于土壤中。这些昆虫在整个冬季都停留在卵期。卵为椭圆形、白色，且长度小于0.004英寸(0.010cm)。幼虫在五月底或六月初孵出，卵孵出的精确时间由于温度差异和位置不同而每年都有所变化。新孵出的幼虫是白色蠕虫，长度小于0.125英寸(0.3175cm)。一旦孵出，幼虫便开始以玉米根为食。玉米根虫历经三个幼虫龄期。进食几周后，幼虫蜕皮，进入蛹期。它们在土壤中化蛹，然后在7月和8月以成虫形式从土壤中出现。成体根虫的长度为约0.25英寸(0.635cm)。
玉米根虫幼虫在玉米和另外几种禾本科物种上完成发育。在黄色狐尾草上饲养的幼虫较晚出现，并且比起在玉米上饲养的幼虫，成虫的头壳尺寸较小。ellsbury等人，(2005)environ.entomol.34:627-634。wcr成虫以玉米穗丝、花粉和位于暴露的穗尖上的玉米籽为食。如果wcr成虫在玉米生殖组织存在之前出现，则它们可能以叶组织为食，从而减缓植物生长，并且偶尔会杀死寄主植物。然而，一旦有了偏好的穗丝和花粉，成虫便会快速向其转移。ncr成虫还以玉米植物的生殖组织为食，但相比之下很少以玉米叶为食。
玉米中大部分的根虫损害由幼虫进食引起。新孵出的根虫最初以纤细的玉米根毛为食，并钻入根尖内。随着幼虫长得更大，它们以初生根为食并钻入其中。在有大量玉米根虫时，幼虫进食时常导致根修剪，一直到玉米杆的基部。严重的根损伤妨碍根将水和养分运输到植物中的能力、减缓植物生长，并导致籽粒产生减少，从而时常大幅降低总产量。严重的根损伤还时常导致玉米植物倒伏，这使收获变得更加困难，并进一步降低产量。此外，成虫以玉米生殖组织为食可导致穗尖处的穗丝修剪。如果这种“穗丝剪切”在花粉脱落期间足够严重，则传粉可能受到破坏。
可通过作物轮作、化学杀虫剂、生物杀虫剂(例如，形成孢子的革兰氏阳性细菌苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis))、表达bt毒素的转基因植物或这些手段的组合，来尝试控制玉米根虫。作物轮作的缺陷是不必要地限制了农田的用途。此外，一些根虫物种的产卵可能发生在除玉米以外的作物田中或长期滞育，导致多年的卵孵化，从而降低玉米和大豆实施轮作的有效性。
化学杀虫剂是最为人们所倚重的用于实现玉米根虫控制的策略。尽管如此，使用化学杀虫剂并不是完美的玉米根虫控制策略；如果把化学杀虫剂的成本与使用杀虫剂后仍可能发生的根虫损害所致的损失相加，则美国每年由于玉米根虫可能损失超过10亿美元。大的幼虫群体、暴雨以及杀虫剂应用不当都可导致玉米根虫控制不充分。此外，连续使用杀虫剂可能选择杀虫剂抗性根虫品种，并且由于其中许多杀虫剂对非靶标物种存在毒性，所以有严重的影响环境之虞。
椿象(半翅目，蝽科)构成了另一大类重要的农业害虫。已知全世界有椿象的50多个近缘物种引起作物损坏。mcpherson&mcpherson,r.m.(2000)stinkbugsofeconomicimportanceinamericanorthofmexicocrcpress。这些昆虫存在于大量的重要作物中，这些作物包括玉蜀黍、大豆、水果、蔬菜和谷类。新热带区棕椿象即英雄美洲蝽、红带椿象即盖德拟壁蝽、棕翅蝽、茶翅蝽和南方绿椿象即稻绿蝽尤其受人关注。
椿象在历经多个若虫期后才进入成虫期。从卵发育为成虫的时间在约30至40天内。在温暖的气候下会出现多个世代，造成重大的昆虫压力。
若虫和成虫均以来自软组织的汁液为食，它们还将消化酶注入软组织中，引起口外组织消化和坏死。然后摄入消化的植物材料和养分。耗尽来自植物维管系统的水和养分造成植物组织损坏。对发育中的籽粒和种子的损害最为显著，因为产量和萌发显著减少。
目前对椿象的管理依赖于在单块田基础上用杀虫剂处理。因此，迫切需要替代性管理策略，来将正在发生的作物损失降至最低限度。
rna干扰(rnai)是一种利用内源性细胞途径的方法，凭借该方法，对整个靶标基因序列或靶标基因序列的尺寸足够大的任何部分有特异性的干扰rna(irna)分子(例如dsrna分子)引起由其编码的mrna降解。近年来，在许多物种和实验系统例如秀丽隐杆线虫(caenorhabditiselegans)、植物、昆虫胚胎和组织培养物中的细胞中，已使用rnai执行基因“敲低”。参见例如fire等人，(1998)nature391:806-811；martinez等人，(2002)cell110:563-574；mcmanus和sharp，(2002)naturerev.genetics3:737-747。
rnai通过内源性途径(包括dicer蛋白质复合物)实现mrna的降解。dicer将长的dsrna分子切割成大约20个核苷酸的短片段，称之为小干扰rna(sirna)。sirna解旋成两个单链rna：过客链(passengerstrand)和引导链(guidestrand)。过客链被降解，引导链则被掺入rna诱导的沉默复合物(risc)中。微小核糖核酸(mirna)分子可类似地掺入risc中。当引导链特异性地结合到mrna分子的互补序列并诱导argonaute(risc复合物的催化组分)切割时，发生转录后基因沉默。尽管在诸如植物、线虫类和一些昆虫中，sirna和/或mirna的初始浓度有限，但已知该过程系统性地遍布一些真核生物。
只有与sirna和/或mirna互补的转录物被切割和降解，因此mrna表达的敲低是序列特异性的。在植物中，存在dicer基因的几个功能组。rnai的基因沉默效应持续数天，并且在实验条件下，可导致靶向转录物的丰度下降90％或更多，随之发生相应蛋白质的水平降低。在昆虫中，有至少两种dicer基因，其中dicer1促进mirna在argonaute1指引下降解。lee等人，(2004)cell117(1):69-81。dicer2促进sirna在argonaute2指引下降解。
美国专利号7,612,194以及美国专利公布号2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545公开了自玉米根萤叶甲(d.v.virgiferaleconte)蛹分离的9112种表达序列标签(est)序列的文库。美国专利号7,612,194和美国专利公布号2007/0050860中提出了将与其中公开的玉米根萤叶甲液泡型h+-atp酶(v-atp酶)的几个特定部分序列之一互补的核酸分子可操作地连接到启动子，以便在植物细胞中表达反义rna。美国专利公布号2010/0192265提出了将启动子可操作地连接到下述核酸分子以便在植物细胞中表达反义rna，该核酸分子与具有未知且未公开的功能的玉米根萤叶甲基因的特定部分序列互补(该部分序列据称与秀丽隐杆线虫(c.elegans)中的c56c10.3基因产物58％相同)。美国专利公布号2011/0154545提出了将启动子可操作地连接到下述核酸分子以便在植物细胞中表达反义rna，该核酸分子与玉米根萤叶甲外被体(coatomer)β亚单位基因的两个特定部分序列互补。另外，美国专利号7,943,819公开了自玉米根萤叶甲幼虫、蛹和切开的中肠分离的906种表达序列标签(est)序列的文库，并且提出了将启动子可操作地连接到下述核酸分子以便在植物细胞中表达双链rna，该核酸分子与玉米根萤叶甲带电的多泡体蛋白4b基因的特定部分序列互补。
除了v-atp酶的几个特定部分序列和具有未知功能的基因的特定部分序列之外，美国专利号7,612,194以及美国专利公布号2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545中没有进一步提出使用其中列出的超过9000个序列中的任何特定序列来进行rna干扰。此外，美国专利号7,612,194以及美国专利公布号2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545都没有教示其提供的超过9000个序列中的哪些其他序列在用作dsrna或sirna时在玉米根虫物种中会是致命的，甚至没有教示其有任何其他方面的用处。除了带电多泡体蛋白4b基因的特定部分序列之外，美国专利号7,943,819没有提出使用其中列出的超过900个序列中的任何特定序列来进行rna干扰。此外，美国专利号7,943,819没有教示其提供的超过900个序列中的哪些其他序列在用作dsrna或sirna时在玉米根虫物种中会是致命的，甚至没有教示其有任何其他方面的用处。美国专利申请公布号u.s.2013/040173和pct申请公布号wo2013/169923描述了来源于玉米根叶甲(diabroticavirgifera)snf7基因的序列在玉蜀黍中进行rna干扰的用途。(还公开于bolognesi等人，(2012)plosone7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534中)。
与玉米根虫dna互补的绝大多数序列(诸如前述)在用作dsrna或sirna时，在玉米根虫物种中并不是致命的。例如，baum等人，(2007,naturebiotechnology25:1322-1326)描述了rnai抑制几个wcr基因靶标的作用。这些作者报道，在超过520ng/cm2的极高irna(例如dsrna)浓度下，他们测试的26个靶标基因中有8个不能提供实验上显著的鞘翅目害虫死亡率。因此，需要发现和鉴定有效地下调和抑制昆虫害虫中的基因以防止这些植物害虫侵染和破坏作物的新型irna(例如，dsrna)序列。
技术实现要素：
本文公开了用于控制以下害虫的核酸分子(例如，靶标基因、dna、dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)及其使用方法：鞘翅目害虫，包括例如玉米根萤叶甲(西方玉米根虫，"wcr”)、巴氏根萤叶甲(北方玉米根虫，"ncr”)、十一星根萤叶甲(南方玉米根虫，"scr”)、墨西哥玉米根萤叶甲(墨西哥玉米根虫，"mcr”)、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、南美叶甲和d.u.undecimpunctatamannerheim；以及半翅目害虫，包括例如英雄美洲蝽(euschistusheros)(fabr.)(新热带区棕椿象，“bsb”)、稻绿蝽(nezaraviridula)(南方绿椿象)、盖德拟壁蝽(piezodorusguildinii)(红带椿象)、茶翅蝽(halyomorphahalys)(棕翅蝽)、chinaviahilare(say)(绿椿象)、褐臭蝽(euschistusservus)(棕椿象)、椿虫(dichelopsmelacanthus)、dichelopsfurcatus(f.)、edessameditabunda(f.)、thyantaperditor(f.)(新热带区红肩椿象)、chinaviamarginatum(palisotdebeauvois)、horciasnobilellus(berg)(棉花臭虫)、taediastigmosa(berg)、秘鲁棉红蝽(dysdercusperuvianus)(guérin-méneville)、neomegalotomusparvus(westwood)、leptoglossuszonatus(dallas)、niesthreasidae(f.)、豆荚草盲蝽(lygushesperus)(西部牧草盲蝽)和美国牧草盲蝽(lyguslineolaris)(palisotdebeauvois)。在特定的实例中，公开了示例性核酸分子，这些分子可与鞘翅目和/或半翅目害虫中的一个或多个天然核酸序列的至少一部分同源。
在这些和另外的实例中，天然核酸序列可以是靶标基因，其产物可以例如但不限于：参与代谢过程，或参与幼虫/若虫的发育。在一些实例中，通过包含与靶标基因同源的序列的核酸分子对靶标基因的表达进行翻译后抑制对于鞘翅目和/或半翅目害虫可能是致命的，或可能造生长和/或发育减缓。在具体实例中，可以选择属于小rabgtp酶家族的基因作为转录后沉默的靶标基因，这些酶控制细胞内的膜运输和细胞器身份(本文称为rab5)。在特定的实例中，可用于转录后抑制的靶标基因是在本文称为rab5的新型基因。因此，本文公开了包含rab5(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78)的核苷酸序列、rab5(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78)的互补序列和前述任一者的片段的经分离的核酸分子。
本文还包括转录的核糖核苷酸序列，公开了包含rab5(seqidno:98、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104和seqidno:105)的核苷酸序列、rab5(seqidno:98、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104和seqidno:105)的互补序列和前述任一者的片段的经分离的核酸分子。因此，rab5的转录的核糖核苷酸序列即seqidno:98、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101、seqidno:102、seqidno:103、seqidno:104和seqidno:105可以作为有义rna链包括在一些实施方案中。此外，这些序列的互补序列、反义rna链包括在本文内并包括seqidno:106、seqidno:107、seqidno:108、seqidno:109、seqidno:110、seqidno:111、seqidno:112和seqidno:113。这些互补序列可作为单独的序列提供或通过结合到有义rna链而结合形成双链rna。
还公开了包含编码这样的多肽的核苷酸序列的核酸分子：该多肽与靶标基因产物(例如称为rab5的基因产物)内的氨基酸序列至少约85％相同。例如，核酸分子可包含编码这样的多肽的核苷酸序列：该序列与seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6和seqidno:78(rab5蛋白)的氨基酸序列至少85％相同。在特定的实例中，核酸分子包含编码这样的多肽的核苷酸序列：该多肽与rab5产物内的氨基酸序列85％相同。进一步公开了包含这样的核苷酸序列的核酸分子：该核苷酸序列为编码下述多肽的核苷酸序列的反向互补序列，其中该多肽与靶标基因产物内的氨基酸序列至少85％相同。
还公开了可用于产生irna(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)分子的cdna序列，所述irna分子与鞘翅目和/或半翅目害虫靶标基因(例如rab5)的全部或部分互补。在特定的实施方案中，dsrna、sirna、shrna、mirna和/或hprna可在体外产生或通过基因修饰生物体(诸如植物或细菌)在活体内产生。在特定的实例中，公开了cdna分子，其可用于产生与rab5的全部或一部分(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78)互补的irna分子。
在一些实施方案中，用于控制鞘翅目害虫群体的方法包括向鞘翅目害虫提供irna分子，该irna分子包含选自下列的多核苷酸的全部或部分：seqidno:98；seqidno:98的互补序列；seqidno:99；seqidno:99的互补序列；seqidno:100；seqidno:100的互补序列；seqidno:101；seqidno:101的互补序列；seqidno:102；seqidno:102的互补序列；seqidno:103；seqidno:103的互补序列；seqidno:104；seqidno:104的互补序列；seqidno:105；seqidno:105的互补序列；与鞘翅目害虫(例如，wcr)的天然rab5多核苷酸杂交的多核苷酸；与鞘翅目害虫的天然rab5多核苷酸杂交的多核苷酸的互补序列。
进一步公开了用于抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中的必需基因表达的构件，以及用于保护植物免受鞘翅目和/或半翅目害虫影响的构件。用于抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中的必需基因表达的手段是单链或双链rna分子，其由以下至少一者组成：seqidno:7(叶甲属rab5区域1，本文有时称为rab5reg1)、或seqidno:8(叶甲属rab5区域2，本文有时称为rab5reg2)、或seqidno:9(叶甲属rab5区域3，本文有时称为rab5reg3)、或seqidno:10(叶甲属rab5版本1，本文有时称为rab5v1)、或seqidno:80(英雄美洲蝽rab5区域1，本文有时称为bsb_rab5reg1)、或seqidno:81(英雄美洲蝽rab5版本1，本文有时称为bsb_rab5v1)或其互补序列。用于抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中的必需基因表达的构件的功能等同物包括与含有seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的wcr或bsb基因的全部或部分基本上同源的单链或双链rna分子。一种用于保护植物免受鞘翅目和/或半翅目害虫影响的构件是这样的dna分子：该dna分子包含可操作地连接到启动子且编码用于抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中的必需基因表达的构件的核酸序列，其中该dna分子能够整合到玉蜀黍、大豆和/或棉花植物的基因组中。
公开了用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫群体的方法，包括向鞘翅目和/或半翅目害虫提供irna(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)分子，该irna分子在被所述鞘翅目和/或半翅目害虫摄取后发挥作用以抑制所述鞘翅目和/或半翅目害虫内的生物功能，其中该irna分子包含选自下列的核苷酸序列的全部或部分：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80和seqidno:81；seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80和seqidno:81的互补序列；叶甲属生物体(例如wcr)或半翅目生物体(例如bsb)的天然编码序列，其包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80和seqidno:81中任一者的全部或部分；叶甲属生物体或半翅目生物体的天然编码序列的互补序列，该天然编码序列包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80和seqidno:81中任一者的全部或部分；叶甲属生物体或半翅目生物体的天然非编码序列，其转录成包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80和seqidno:81中任一者的全部或部分的天然rna分子；和叶甲属生物体或半翅目生物体的天然非编码序列的互补序列，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80和seqidno:81中任一者的全部或部分的天然rna分子。
本公开提供了能够下调包含有义rna链和互补反义rna链的玉米根萤叶甲rab5-1基因的表达的双链rna(dsrna)。在该实施方案的一个方面，有义rna链包含与seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:95、seqidno:10具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列，或其任意组合，包括含有上述多核苷酸序列(即，seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:95、seqidno:10)中的任一者的嵌合多核苷酸。在该实施方案的另一个方面，反义rna链包含与seqidno:90、seqidno:91、seqidno:92、seqidno:93、seqidno:94、seqidno:9、seqidno:96具有至少90％序列同一性的多核苷酸序列，或其任意组合，包括含有上述多核苷酸序列(即，seqidno:90、seqidno:91、seqidno:92、seqidno:93、seqidno:94、seqidno:9、seqidno:96)中的任一者的嵌合多核苷酸。在该实施方案的再一个方面，dsrna包含19至3710个核苷酸。在一个实施方案中，rab5基因选自rab5-1、rab5-2或rab5-3基因。在另外的实施方案中，dsrna在转基因植物内表达。因此，当玉米根萤叶甲以转基因植物为食时，dsrna引起玉米根萤叶甲中rab5基因的转录后基因阻遏或抑制。在另一个实施方案中，dsrna由两个独立的互补rna序列形成。在另一个实施方案中，dsrna由具有内部互补序列的单一rna序列形成。
本公开涉及能够抑制或下调玉米根萤叶甲的rab5基因表达的基因表达盒，其中该基因表达盒包含与编码形成双链rna的rna序列的核酸分子可操作地连接的启动子。在该实施方案的一个方面，第一核苷酸序列与seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:95、seqidno:10或其片段具有至少90％的序列同一性。在该实施方案的另一个方面，第二核苷酸序列与seqidno:90、seqidno:91、seqidno:92、seqidno:93、seqidno:94、seqidno:9、seqidno:96或其片段的互补序列具有至少90％的序列同一性。在该实施方案的另一个方面，从基因表达盒转录的rna由跨越19至3,710个核苷酸的片段组成。在一个实施方案中，将基因表达盒转化到植物中。在另一个实施方案中，当玉米根萤叶甲以植物为食时，由基因表达盒表达的dsrna引起玉米根萤叶甲中rab5基因的转录后基因阻遏或抑制。在其他实施方案中，dsrna由两个独立的互补rna序列形成。在另一个实施方案中，dsrna由具有内部互补序列的单一rna序列形成。因此，单个rna序列包含第一rna区段、第二rna区段和第三rna区段，其中第一rna区段包含多核苷酸，其中第三rna区段通过第二rna区段连接到第一rna区段，并且其中第三rna区段基本上为第一rna区段的反向互补序列，使得第一rna区段和第三rna区段在转录成核糖核酸时杂交而形成双链rna。在另一个实施方案中，rab5基因选自rab5-1、rab5-2或rab5-3基因。
本公开涉及包含编码用于使植物害虫或病原体的一个或多个靶标基因沉默的自互补rna的核酸的双链rna(dsrna)，所述自互补rna包含长度为至少19、20或21个核苷酸的双链区，其中所述双链区的一条链由选自以下的多核苷酸获得：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:95或seqidno:10。在一个实施方案中，所述一个或多个靶标基因是rab5基因。在另一个实施方案中，rab5基因选自rab5-1、rab5-2或rab5-3基因。在另一个实施方案中，植物害虫或病原体是玉米根萤叶甲。在其他实施方案中，dsrna在转基因植物内表达。因此，当玉米根萤叶甲以转基因植物为食时，dsrna引起玉米根萤叶甲中rab5基因的转录后基因阻遏或抑制。在一个实施方案中，dsrna包含第一rna区段、第二rna区段和第三rna区段，其中第一rna区段包含多核苷酸，其中第三rna区段通过第二rna区段连接到第一rna区段，并且其中第三rna区段基本上为第一rna区段的反向互补序列，使得第一rna区段和第三rna区段在转录成核糖核酸时杂交而形成双链rna。
本文还公开了下述方法，其中可在基于食料的测定中，或在表达dsrna、sirna、shrna、mirna和/或hprna的基因修饰植物细胞中，向鞘翅目和/或半翅目害虫提供所述dsrna、sirna、shrna、mirna和/或hprna。在这些和另外的实例中，所述dsrna、sirna、shrna、mirna和/或hprna可由鞘翅目害虫若虫和/或半翅目害虫若虫摄入。摄入本公开的dsrna、sirna、shrna、mirna和/或hprna随后可引起若虫中的rnai，rnai进而可造成鞘翅目和/或半翅目害虫的生存力所必需的基因发生沉默，最终引起幼虫死亡。因此，公开了其中向鞘翅目和/或半翅目害虫提供包含可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的示例性核酸序列的核酸分子的方法。在特定的实例中，通过使用本公开的核酸分子而控制的鞘翅目和/或半翅目害虫可以是wcr、ncr、scr、mcr、英雄美洲蝽、褐美洲蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、稻绿蝽、chinaviahilare、c.marginatum、椿虫、d.furcatus、edessameditabunda、thyantaperditor、horciasnobilellus、taediastigmosa、dysdercusperuvianus、neomegalotomusparvus、leptoglossuszonatus、niesthreasidae和/或美国牧草盲蝽。参考下文结合附图的图1和图2进行的对若干实施方案的详细说明，前述特征和其他特征将变得更加明显。
附图说明
图1是从单个转录模板生成dsrna的策略的图形表示。
图2是从两个转录模板生成dsrna的策略的图形表示。
序列表
随附序列表中列出的核酸序列是使用如37c.f.r.§1.822中规定的核苷酸碱基的标准字母缩写示出的。仅示出了每个核酸序列的一条链，但是任何对所显示链的提及应当理解为包括互补链和反向互补链。在随附的序列表中：
seqidno:1显示了包含来自玉米根叶甲的rab5-1的dna序列。
seqidno:2显示了来自玉米根叶甲的rab5-1蛋白的氨基酸序列。
seqidno:3显示了包含来自玉米根叶甲的rab5-2的dna序列。
seqidno:4显示了来自玉米根叶甲的rab5-2蛋白的氨基酸序列。
seqidno:5显示了包含来自玉米根叶甲的rab5-3的dna序列。
seqidno:6显示了来自玉米根叶甲的rab5-3蛋白的氨基酸序列。
seqidno:7显示了用于体外dsrna合成的来自玉米根叶甲的rab5reg1(区域1)的dna序列(未示出在5'和3'末端的t7启动子序列)。
seqidno:8显示了用于体外dsrna合成的来自玉米根叶甲的rab5reg2(区域2)的dna序列(未示出在5'和3'末端的t7启动子序列)。
seqidno:9显示了用于体外dsrna合成的来自玉米根叶甲的rab5reg3(区域3)的dna反向互补序列(未示出在5'和3'末端的t7启动子序列)。
seqidno:10显示了用于体外dsrna合成的来自玉米根叶甲的rab5v1(版本1)的dna序列(未示出在5'和3'末端的t7启动子序列)。
seqidno:11显示了t7噬菌体启动子的dna序列。
seqidno:12显示了用于体外dsrna合成的yfp编码区区段的dna序列(未示出在5'和3'末端的t7启动子序列)。
seqidno:13至20显示了用于扩增来自玉米根叶甲的rab5亚基序列的部分的引物，这些部分包括rab5reg1、rab5reg2和rab5reg3。
seqidno:21显示了idt定制寡核苷酸探针rab5prbset1，其用fam标记，并用zen和iowablack淬灭剂予以双重淬灭
seqidno:22显示了膜联蛋白区域1的dna序列。
seqidno:23显示了膜联蛋白区域2的dna序列。
seqidno:24显示了β血影蛋白2区域1的dna序列。
seqidno:25显示了β血影蛋白2区域2的dna序列。
seqidno:26显示了mtrp-l4区域1的dna序列。
seqidno:27显示了mtrp-l4区域2的dna序列。
seqidno:28至55显示了用来扩增yfp、膜联蛋白、β血影蛋白2和mtrp-l4的基因区域以合成dsrna的引物。
seqidno:56示出了编码tip41样蛋白的玉蜀黍dna序列。
seqidno:57显示了寡核苷酸t20nv的dna序列。
seqidno:58至62显示了用于测量玉蜀黍转录物水平的引物和探针的序列。
seqidno:63显示了用于检测二元载体主干的specr编码区的一部分的dna序列。
seqidno:64显示了用于分析基因组拷贝数的aad1编码区的一部分的dna序列。
seqidno:65显示了玉蜀黍转化酶基因的dna序列。
seqidno:66至74显示了用于分析基因拷贝数的引物和探针的序列。
seqidno:75至77显示了用于分析玉蜀黍表达的引物和探针的序列。
seqidno:78显示了得自新热带区棕椿象(英雄美洲蝽)的bsbrab5转录物的示例性dna序列。
seqidno:79显示了英雄美洲蝽rab5蛋白的氨基酸序列。
seqidno:80显示了用于体外dsrna合成的得自英雄美洲蝽的bsb_rab5reg1(区域1)的dna序列(未示出在5'和3'末端的t7启动子)。
seqidno:81显示了用于体外dsrna合成的得自英雄美洲蝽的bsb_rab5v1(版本1)的dna序列(未示出在5'和3'末端的t7启动子)。
seqidno:82-85显示了用于扩增得自包含bsb_rab5reg1和bsb_rab5v1的英雄美洲蝽rab5序列的部分的引物。
seqidno:86是yfp靶向的dsrna的有义链即yfpv2的引物
seqidno:87-88显示了用于扩增yfp靶向的dsrna的部分即yfpv2的引物
seqidno:89呈现了yfp发夹序列(yfpv2-1)。大写字母碱基是yfp有义链(即，碱基对1-123)；斜体字体的小写字母碱基包含rtm1内含子，非斜体(即，碱基对124-287)；小写字母碱基是yfp反义链(即，碱基对288-410)。yfp有义链和互补yfp反义链彼此完全相同。
atgtcatctggagcacttctctttcatgggaagattccttacgttgtggagatggaagggaatgttgatggccacacctttagcatacgtgggaaaggctacggagatgcctcagtgggaaagtccggcaacatgtttgacgtttgtttgacgttgtaagtctgatttttgactcttcttttttctccgtcacaatttctacttccaactaaaatgctaagaacatggttataactttttttttataacttaatatgtgatttggacccagcagatagagctcattactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat
seqidno:90显示了包含rab5-1的互补dna序列(该序列是seqidno:1的反向互补序列)。
seqidno:91显示了rab5-2的互补dna序列(该序列是seqidno:3的反向互补序列)。
seqidno:92显示了rab5-3的互补dna序列(该序列是seqidno:5的反向互补序列)。
seqidno:93显示了rab5reg1的互补dna序列(该序列是seqidno:7的反向互补序列)。
seqidno:94显示了rab5reg2的互补dna序列(该序列是seqidno:8的反向互补序列)。
seqidno:95显示了rab5reg3的dna序列(seqidno:9与seqidno:95互补)。
seqidno:96显示了rab5v1的互补dna序列(该序列是seqidno:10的反向互补序列)。
seqidno:97显示了来自英雄美洲蝽的rab5的互补dna序列(该序列是seqidno:78的反向互补序列)。
seqidno:98显示了包含来自玉米根叶甲的rab5-1的rna序列。
seqidno:99显示了包含来自玉米根叶甲的rab5-2的rna序列。
seqidno:100显示了包含来自玉米根叶甲的rab5-3的rna序列。
seqidno:101显示了来自玉米根叶甲的rab5reg1(区域1)的rna序列。
seqidno:102显示了来自玉米根叶甲的rab5reg2(区域2)的rna序列。
seqidno:103显示了来自玉米根叶甲的rab5reg3(区域3)的rna反向互补序列。
seqidno:104显示了来自玉米根叶甲的rab5v1(版本1)的rna序列。
seqidno:105显示了得自新热带区棕椿象(英雄美洲蝽)的bsbrab5的示例性dna序列。
seqidno:106显示了包含rab5-1的互补rna序列。
seqidno:107显示了rab5-2的互补rna序列。
seqidno:108显示了rab5-3的互补rna序列。
seqidno:109显示了rab5reg1的互补rna序列。
seqidno:110显示了rab5reg2的互补rna序列。
seqidno:111显示了rab5reg3的rna序列。
seqidno:112显示了rab5v1的互补rna序列。
seqidno:113显示了来自英雄美洲蝽的rab5的互补rna序列。
seqidno:114显示了来自英雄美洲蝽的bsb_rab5reg1(区域1)的互补rna序列。
seqidno:115显示了来自英雄美洲蝽的bsb_rab5v1(版本1)的互补rna序列。
seqidno:116显示了示例性接头多核苷酸，其在rna转录物中转录时形成“环”以形成发夹结构。
具体实施方式
i.若干实施方案的概述
我们使用表达dsrna的转基因植物最可能靶向的害虫物种之一西方玉米根虫，将rna干扰(rnai)开发为管理昆虫害虫的工具。我们在本文中描述了示例性昆虫害虫西方玉米根虫和新热带区棕椿象中由rnai介导的对rab5的敲低，当例如经由摄入或注射rab5dsrna来递送irna分子时，所述敲低显示出具有致命的表型。在本文的实施方案中，通过进食向昆虫递送rab5dsrna的能力赋予了对管理昆虫(例如鞘翅目和半翅目)害虫非常有用的rnai效应。通过将rab5介导的rnai与其他有用的rnai靶标(例如，roprnai靶标，如美国专利申请号14/577,811中所述；rna聚合酶i1rnai靶标，如美国专利申请号62/133,214中所述；rna聚合酶ii140rnai靶标，如美国专利申请号14/577,854中所述；rna聚合酶ii215rnai靶标，如美国专利申请号62/133,202中所述；rna聚合酶ii33rnai靶标，如美国专利申请号62/133,210中所述；ncmrnai靶标，如美国专利申请号62/095487中所述；和dre4rnai靶标，如美国专利申请号14/705,807中所述)组合，影响例如幼虫状态根虫中的多重靶标序列的潜力可增加开发出涉及rnai技术的可持续性昆虫害虫管理方法的机会。
本文公开了用于遗传控制鞘翅目和/或半翅目害虫侵染的方法和组合物。还提供了用于鉴定鞘翅目和/或半翅目害虫的生命周期所必需的一个或多个基因以用作rnai介导的鞘翅目和/或半翅目害虫群体控制的靶标基因的方法。可以设计编码一个或多个dsrna分子的dna质粒载体，来阻遏生长、存活、发育和/或繁殖所必需的一个或多个靶标基因。在一些实施方案中，提供了经由与鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标基因的编码或非编码序列互补的核酸分子来转录后阻遏靶标基因表达或抑制靶标基因的方法。在这些和另外的实施方案中，鞘翅目和/或半翅目害虫可摄入一种或多种从与靶标基因的编码或非编码序列互补的核酸分子的全部或一部分转录的dsrna、sirna、shrna、mirna和/或hprna分子，从而提供植物保护效果。
因此，一些实施方案涉及使用与一个或多个靶标基因的编码序列和/或非编码序列互补的dsrna、sirna、shrna、mirna和/或hprna对靶标基因产物的表达进行序列特异性抑制，以实现对鞘翅目和/或半翅目害虫的至少部分控制。公开了一组经分离和纯化的核酸分子，其包含核苷酸序列，例如如以下任一者中所示：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80、seqidno:81及其片段。在一些实施方案中，可由该序列、其片段或包含这些序列之一的基因表达稳定化的dsrna分子，用于转录后沉默或抑制靶标基因。在某些实施方案中，经分离和纯化的核酸分子包含seqidno:1的全部或部分。在其他实施方案中，经分离和纯化的核酸分子包含seqidno:3的全部或部分。在另外的实施方案中，经分离和纯化的核酸分子包含seqidno:5的全部或部分。在其他实施方案中，经分离和纯化的核酸分子包含seqidno:7的全部或部分。在另外其他实施方案中，经分离和纯化的核酸分子包含seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80或seqidno:81的全部或部分。
一些实施方案涉及在其基因组中具有编码至少一种irna(例如dsrna)分子的至少一种重组dna序列的重组宿主细胞(例如植物细胞)。在特定的实施方案中，dsrna分子可以在被鞘翅目和/或半翅目害虫摄入时产生，用于转录后沉默或抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中靶标基因的表达。重组dna序列可以包括例如任何以下中的一者或多者：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80或seqidno:81中的任一者；seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80或seqidno:81中任一者的片段；或包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:78、seqidno:80或seqidno:81中的一者或多者的基因的部分序列；或其互补序列。
特定的实施方案涉及在其基因组中具有重组dna序列的重组宿主细胞，所述重组dna序列编码包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和/或seqidno:78的全部或部分的至少一种irna(例如dsrna)分子。当被鞘翅目和/或半翅目害虫摄入时，所述一种或多种irna分子可沉默或抑制包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和/或seqidno:78的靶标基因在鞘翅目和/或半翅目害虫中的表达，从而造成鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、发育、繁殖和/或进食停止。
在一些实施方案中，在其基因组中具有编码至少一种dsrna分子的至少一种重组dna序列的重组宿主细胞可以是经转化的植物细胞。一些实施方案涉及包含这样的经转化植物细胞的转基因植物。除此类转基因植物之外，还提供了任何转基因植物世代的后代植物、转基因种子和转基因植物产品，它们中的每一者都包含一种或多种重组dna序列。在特定的实施方案中，可以在转基因植物细胞中表达本公开的dsrna分子。因此，在这些和其他实施方案中，可以从转基因植物细胞中分离本公开的dsrna分子。在特定的实施方案中，转基因植物是选自下列的植物：玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)与禾本科(poaceae)的植物。
一些实施方案涉及用于调控鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中靶标基因的表达的方法。在这些和其他实施方案中，可提供核酸分子，其中该核酸分子包含编码dsrna分子的核苷酸序列。在特定的实施方案中，编码dsrna分子的核苷酸序列可以可操作地连接到启动子，并且还可以可操作地连接到转录终止序列。在特定的实施方案中，用于调控鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中靶标基因的表达的方法可包括：(a)用包含编码dsrna分子的核苷酸序列的载体转化植物细胞；(b)在足以允许包含多个经转化植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养所述经转化植物细胞；(c)选择已将所述载体整合到其基因组中的经转化植物细胞；以及(d)确定所选择的经转化植物细胞包含由所述载体的核苷酸序列编码的dsrna分子。可以从基因组中整合有载体并且包含由该载体的核苷酸序列编码的dsrna分子的植物细胞再生植物。
因此，还公开了包含得自载体的整合dna的转基因植物，该载体具有编码整合在其基因组中的dsrna分子的核苷酸序列，其中所述转基因植物包含由所述载体的核苷酸序列编码的dsrna分子。在特定的实施方案中，在植物中表达dsrna分子足以调控接触所述经转化植物或植物细胞(例如，通过以所述经转化植物、该植物的一部分(例如根)或植物细胞为食)的鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞中靶标基因的表达。本文公开的转基因植物可展示出对鞘翅目和/或半翅目害虫侵染的耐性和/或增强的耐受。特定的转基因植物可展示出对一种或多种选自下列的鞘翅目和/或半翅目害虫的抗性和/或增强的耐受性：wcr、ncr、scr、mcr、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲、d.u.undecimpunctatamannerheim、英雄美洲蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、稻绿蝽、喜绿蝽和褐美洲蝽。
本文还公开了用于将控制剂诸如irna(例如，dsrna)分子递送到鞘翅目和/或半翅目害虫的方法。这样的控制剂可直接或间接导致鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、发育、繁殖和/或进食停止。例如，鞘翅目和/或半翅目害虫由于暴露于控制剂而可能在鞘翅目和/或半翅目害虫进食、生长的能力方面经历损害，或以其他方式导致宿主损伤。在一些实施方案中，提供了一种方法，包括将稳定化的dsrna分子递送到鞘翅目和/或半翅目害虫以阻抑该鞘翅目和/或半翅目害虫中的至少一种靶标基因，从而减轻或消除鞘翅目和/或半翅目害虫造成的植物损坏。在一些实施方案中，抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中靶标基因的表达的方法可引起半翅目害虫的生长、发育、繁殖和/或进食停止。在一些实施方案中，该方法可最终导致鞘翅目和/或半翅目害虫死亡。
在一些实施方案中，提供了包含本公开的irna(例如dsrna)分子的组合物(例如局部用组合物)，以供在植物、动物和/或植物或动物的环境中使用，旨在消除或减轻鞘翅目和/或半翅目害虫侵染。在特定的实施方案中，该组合物可以是要喂食给鞘翅目和/或半翅目害虫的营养组合物或食物来源，或rnai诱饵。一些实施方案包括使鞘翅目和/或半翅目害虫可得到所述营养组合物或食物来源。摄入包含irna分子的组合物可引起该分子被鞘翅目和/或半翅目害虫的一个或多个细胞摄取，进而可引起对鞘翅目和/或半翅目害虫一个或多个细胞中的至少一种靶标基因表达的抑制。通过在鞘翅目和/或半翅目害虫的宿主中提供一种或多种包含本公开的irna分子的组合物，可以在任何存在鞘翅目和/或半翅目害虫的宿主组织或环境之中或之上，限制或消除由于鞘翅目和/或半翅目害虫侵染造成的对植物或植物细胞的摄入或损害。
将dsrna与食物或引诱剂或这二者混合时，形成rnai诱饵。害虫吃下诱饵时，还会吃掉dsrna。诱饵可采取颗粒、凝胶、可流动粉末、液体或固体的形式。在另一个实施方案中，可将rab5掺入诱饵制剂中，诸如美国专利号8,530,440中所述，该专利据此以引用方式并入本文。一般说来，在使用诱饵的情况下，把诱饵放置在昆虫害虫的环境中或周围，这样，例如wcr就可接触到诱饵和/或被诱饵吸引。
本文公开的组合物和方法可与用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫所致损害的其他方法和组合物一同结合使用。例如，如本文所述的用于保护植物免受鞘翅目和/或半翅目害虫损害的irna分子可在这样的方法中使用：该方法包括额外使用一种或多种对鞘翅目和/或半翅目害虫有效的化学药剂、对鞘翅目和/或半翅目害虫有效的生物杀虫剂、作物轮作、或表现出与rnai介导的方法和本公开的rnai组合物的特征不同的特征的重组基因技术(例如，在植物中重组产生对鞘翅目和/或半翅目害虫有害的蛋白质(例如bt毒素)。
ii.缩写
dsrna双链核糖核酸
gi生长抑制
ncbi美国国家生物技术信息中心
gdna基因组脱氧核糖核酸
irna抑制性核糖核酸
orf开放阅读框
rnai核糖核酸干扰
mirna微抑制性核糖核酸
shrna小发夹核糖核酸
sirna小抑制性核糖核酸
hprna发夹核糖核酸
utr非翻译区
wcr西方玉米根虫(玉米根萤叶甲)
ncr北方玉米根虫(巴氏根萤叶甲)
mcr墨西哥玉米根虫(墨西哥玉米根萤叶甲)
pcr聚合酶链式反应
riscrna诱导的沉默复合物
scr南方玉米根虫(十一星根萤叶甲)
bsb新热带区棕椿象(英雄美洲蝽)
yfp黄色荧光蛋白
sem平均值标准误差
iii.术语
在以下的描述和表中，使用了许多术语。为了提供对说明书和权利要求书的清楚且一致的理解，包括要给予此类术语的范围，提供了以下定义：
鞘翅目害虫：如本文所用，术语“鞘翅目害虫”是指以玉米和其他真草为食的叶甲属昆虫。在特定的实例中，鞘翅目害虫选自以下清单：玉米根萤叶甲(wcr)、巴氏根萤叶甲(ncr)、十一星根萤叶甲(scr)、墨西哥玉米根萤叶甲(mcr)、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲和d.u.undecimpunctatamannerheim。
半翅目害虫：如本文所用，术语“半翅目害虫”是指蝽科昆虫，其以广泛的宿主植物为食并具有刺穿和吸吮口部分。在特定的实例中，半翅目害虫选自包括以下各项的清单：英雄美洲蝽(新热带区棕椿象)、稻绿蝽(南方绿椿象)、盖德拟壁蝽(红带椿象)、茶翅蝽(棕翅蝽)、喜绿蝽(绿椿象)和褐美洲蝽(棕椿象)。
(与生物体)接触：如本文所用，与生物体(例如鞘翅目和/或半翅目害虫)“接触”或被生物体“摄取”等术语，就核酸分子而言，包括核酸分子内化到生物体中，例如但不限于：生物体摄入所述分子(例如通过进食)；使生物体与包含核酸分子的组合物接触；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物体。
重叠群：如本文所用，术语“重叠群”是指由来源于单个遗传来源的一组重叠dna区段重建的dna序列。
玉米植物：如本文所用，术语“玉米植物”是指物种玉蜀黍(zeamays)的植物。
编码dsrna：如本文所用，术语“编码dsrna”包括这样的基因，其rna转录产物能够形成分子内dsrna结构(例如，发夹)或分子间dsrna结构(例如，通过与靶标rna分子杂交)。
表达：如本文所用，编码序列(例如，基因或转基因)的“表达”是指这样的过程，通过该过程，核酸转录单元(包括例如基因组dna或cdna)的编码信息转化为细胞的操作部分、非操作部分或结构性部分，通常包括蛋白质的合成。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织或生物体暴露于增加或减少基因表达的药剂。基因表达也可以在从dna到rna再到蛋白质的途径中的任何位置受到调控。调控基因表达例如通过控制对转录、翻译、rna转运和加工、中间分子(诸如mrna)降解的作用，或通过在特异性蛋白分子已产生之后的活化、失活、区室化或降解，或这些的组合而发生。基因表达可通过本领域已知的任何方法，包括但不限于northern(rna)印迹法、rt-pcr、western(免疫)印迹法，或者体外、原位或活体内蛋白质活性测定法，在rna水平或蛋白质水平测量。
遗传物质：如本文所用，术语“遗传物质”包括所有的基因和核酸分子，诸如dna与rna。
抑制：如本文所用，术语“抑制”在用来描述对编码序列(例如基因)的作用时，是指从该编码序列转录的mrna和/或该编码序列的肽、多肽或蛋白质产物在细胞水平上可测量地减少。在一些实例中，抑制编码序列的表达可使得表达几乎消失。“特异性抑制”是指在正实现特异性抑制的细胞中对靶标编码序列的抑制不随之对其他编码序列(例如基因)的表达产生影响。
经分离的：“经分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质)已与该组分所天然存在的生物体细胞中的其他生物组分(即其他染色体和染色体外的dna和rna，以及蛋白质)基本上分离、分开产生或纯化出来。已经“经分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞内重组表达而制备的核酸和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。
核酸分子：如本文所用，术语“核酸分子”可以指核苷酸的聚合形式，可包括rna、cdna、基因组dna的有义链和反义链两者，以及上述各项的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸，或这两种类型核苷酸中任一者的修饰形式。如本文所用的“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义词。除非另外指明，否则核酸分子的长度通常至少为10个碱基。按照惯例，核酸分子的核苷酸序列从该分子的5’端向3’端阅读。核苷酸序列的“互补序列”是指与所述核苷酸序列的核碱基形成碱基对(即，a-t/u和g-c)的核碱基5'至3'序列。核苷酸序列的“反向互补序列”是指与所述核苷酸序列的核碱基形成碱基对的核碱基3'至5'序列。
一些实施方案包括含有转录为rna分子的模板dna的核酸，所述rna分子是mrna分子的互补序列。在这些实施方案中，转录为mrna分子的核酸的互补序列以5’至3’取向存在，使得rna聚合酶(其以5’至3’方向转录dna)将从互补序列转录出可与mrna分子杂交的核酸。因此，除非另有明确说明或者从上下文可清楚看出另有所指，术语“互补序列”是指从5’至3’具有可与参考核酸的核碱基形成碱基对的核碱基的多核苷酸。类似地，除非另有明确说明(或者从上下文可清楚看出另有所指)，核酸的“反向互补序列”是指取向相反的互补序列。前述内容在以下图解中演示：
atgatgatg多核苷酸
tactactac多核苷酸的“互补序列”
catcatcat多核苷酸的“反向互补序列”
本公开的一些实施方案可包括形成发夹rna的rnai分子。在这些rnai分子中，rna干扰所靶向的核酸的互补序列和所述反向互补序列两者可出现在同一个分子中，使得单链rna分子可以“折叠”到包含互补多核苷酸和反向互补多核苷酸的区域上并在该区域上与自身杂交。
“核酸分子”包括单链和双链形式的dna、单链形式的rna和双链形式的rna(dsrna)。术语“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作为个别单链或在双链体中的核酸有义链和反义链两者。术语“核糖核酸”(rna)包括irna(抑制性rna)、dsrna(双链rna)、sirna(小干扰rna)、mrna(信使rna)、shrna(小发夹rna)、mirna(微小rna)、hprna(发夹rna)、trna(转移rna，无论是装载有还是卸下了相应的酰化氨基酸)和crna(互补rna)。术语“脱氧核糖核酸”(dna)包括cdna、基因组dna和dna-rna杂交体。术语“多核苷酸”和“核酸”及其“片段”或更一般地说“区段”将由本领域的技术人员理解为既包括基因组序列、核糖体rna序列、转移rna序列、信使rna序列、操纵子序列也包括编码或可适于编码肽、多肽或蛋白质的较小工程化核苷酸序列的功能性术语。
寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通过切割较长的核酸区段、或通过使单独的核苷酸前体聚合而形成。自动合成仪允许合成长度多达几百个碱基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可与互补的核苷酸序列结合，所以可用作检测dna或rna的探针。由dna组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可在pcr(一种用于扩增dna和rna(逆转录成cdna)序列的技术)中使用。在pcr中，寡核苷酸通常被称为“引物”，其允许dna聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
核酸分子可包括天然存在的核苷酸和/或经修饰的核苷酸，它们通过天然存在的核苷酸连接和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起。如本领域技术人员易于理解的那样，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物置换天然存在的核苷酸中的一者或多者、核苷酸间修饰(例如不带电连接：例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连接：例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分：例如肽类；嵌入剂：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂；烷化剂；以及经修饰的连接：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑构象，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的、圆形的和挂锁形的(padlocked)构象。
如本文相对于dna所用，术语“编码序列”、“结构性核苷酸序列”或“结构性核酸分子”是指这样的核苷酸序列：在被置于适当的调控序列控制下时，经由转录和mrna最终翻译成多肽。就rna而言，术语“编码多核苷酸”是指翻译成肽、多肽或蛋白质的多核苷酸。编码序列的边界由5’-末端的翻译起始密码子和3’-末端的翻译终止密码子来确定。编码多核苷酸包括但不限于：基因组dna、cdna、est和重组核苷酸序列。
如本文所用，“转录的非编码多核苷酸”是指mrna分子的未翻译成肽、多肽或蛋白质的区段，诸如5'utr、3'utr和内含子区段。另外，“转录的非编码多核苷酸”是指转录成在细胞中起作用的rna的核酸，所述rna例如结构性rna(例如核糖体rna(rrna)，举例来说5srrna、5.8srrna、16srrna、18srrna、23srrna和28srrna等)、转移rna(trna)，以及snrna诸如u4、u5、u6等。转录的非编码多核苷酸还包括(例如但不限于)小rna(srna)，该术语通常用来描述小的细菌非编码rna、小核仁rna(snorna)、微小rna、小干扰rna(sirna)、piwi交互作用rna(pirna)和长的非编码rna。还进一步，“转录的非编码多核苷酸”是指这样的多核苷酸：其可天然地在核酸中作为基因内的“接头”存在，并且转录为rna分子。
基因组：如本文所用，术语“基因组”是指存在于细胞核内的染色体dna，也指存在于细胞的亚细胞组分内的细胞器dna。在本公开的一些实施方案中，可将dna分子导入植物细胞中，使得dna分子整合到植物细胞的基因组中。在这些和另外的实施方案中，dna分子可整合到植物细胞的核dna中，或整合到植物细胞的叶绿体或线粒体的dna中。术语“基因组”在应用于细菌时，是指细菌细胞内的染色体和质粒两者。在本公开的一些实施方案中，可将dna分子导入细菌中，使得该dna分子整合到细菌的基因组中。在这些和另外的实施方案中，dna分子可整合于染色体，或者作为稳定的质粒定位或位于稳定的质粒中。
序列同一性：如本文所用，术语“序列同一性”或“同一性”在两个核酸或多肽序列的语境下，是指在指定比较窗口上以最大对应性比对时这两个序列中相同的残基。
如本文所用，术语“序列同一性百分比”可以指通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列(例如核酸序列或多肽序列)确定的值，其中为了实现这两个序列的最佳比对，该比较窗口中的序列部分相比于参考序列(其不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)。通过确定在两个序列中出现相同的核苷酸或氨基酸残基的位置的数目而产生匹配位置数，用该匹配位置数除以比较窗口中位置的总数，将结果乘以100而产生序列同一性的百分比，从而计算出该百分比。每个位置与参考序列相比均相同的序列被认为与参考序列100％相同，反之亦然。
用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法描述于例如以下文献中：smith和waterman(1981)adv.appl.math.2:482；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444；higgins和sharp(1988)gene73:237-244；higgins和sharp(1989)cabios5:151-153；corpet等人，(1988)nucleicacidsres.16:10881-10890；huang等人，(1992)comp.appl.biosci.8:155-165；pearson等人，(1994)methodsmol.biol.24:307-331；tatiana等人，(1999)femsmicrobiol.lett.174:247-250。序列比对方法和同源性计算的详细考虑事项可见于例如altschul等人，(1990)j.mol.biol.215:403-410。
美国国家生物技术信息中心(ncbi)基本局部比对搜索工具(blasttm；altschul等人(1990))可从几个源头(包括美国国家生物技术信息中心(bethesda,md))获得并且可在互联网上获得，以便结合几种序列分析程序使用。怎样使用该程序确定序列同一性的描述可在互联网上blasttm的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用利用设置为默认参数的默认blosum62矩阵的blasttm(blastn)程序的“blast2序列”功能。当通过此方法评估时，与参考序列具有甚至更大相似性的核酸序列将显示同一性百分比增加。
可特异性杂交/特异性互补：如本文所用，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是表明足够程度的互补性的术语，该互补性足以使得在核酸分子与靶标核酸分子之间发生稳定且特异性的结合。两个核酸分子之间的杂交涉及在这两个核酸分子的核酸序列之间形成反平行比对。然后，这两个分子能够与相反链上的相应碱基形成氢键以形成双链体分子，如果该双链体分子足够稳定，则可使用本领域熟知的方法检出。核酸分子与其可特异性杂交的靶标序列不需要是100％互补的。然而，对于特异性杂交必须存在的序列互补性的量随所使用的杂交条件而变化。
导致特定严格性程度的杂交条件将根据选择的杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。一般说来，杂交的温度和杂交的离子强度(尤其是na+和/或mg++浓度)将决定杂交的严格性。洗涤缓冲液的离子强度和洗涤温度也影响严格性。有关获得特定严格性程度所需要的杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且论述于例如以下文献中：sambrook等人(编辑)，molecularcloning:alaboratorymanual，第2版，第1-3卷，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny，1989年，第9和11章及更新；以及hames和higgins(编辑)，nucleicacidhybridization，irlpress，oxford，1985年。有关核酸杂交的进一步详细说明和指导可在以下文献中找到：例如tijssen，"overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays”，载于laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobes，第i部分，第2章，elsevier，ny，1993年；以及ausubel等人(编辑)，currentprotocolsinmolecularbiology，第2章，greenepublishingandwiley-interscience，ny，1995年及更新。
如本文所用，“严格条件”涵盖仅在杂交分子的序列与靶标核酸分子内的同源序列之间存在大于80％的匹配时才发生杂交的条件。“严格条件”包括另外的特定严格性水平。因此，如本文所用，“中等严格性”条件是序列匹配超过80％(即，错配低于20％)的分子将会杂交的条件；“高严格性”条件是匹配超过90％(即，错配低于10％)的序列将会杂交的条件；而“极高严格性”条件是匹配超过95％(即，错配低于5％)的序列将会杂交的条件。
以下是代表性的非限制性杂交条件。
高严格性条件(检测出共享至少90％序列同一性的序列)：在5xssc缓冲液中在65℃下杂交16小时；在2xssc缓冲液中在室温下洗涤两次，每次15分钟；以及在0.5xssc缓冲液中在65℃下洗涤两次，每次20分钟。
中等严格性条件(检测出共享至少80％序列同一性的序列)：在5x-6xssc缓冲液中在65-70℃下杂交16-20小时；在2xssc缓冲液中在室温下洗涤两次，每次5-20分钟；以及在1xssc缓冲液中在55-70℃下洗涤两次，每次30分钟。
非严格对照条件(共享至少50％序列同一性的序列将会杂交)：在6xssc缓冲液中在室温至55℃下杂交16-20小时；在2x-3xssc缓冲液中在室温至55℃下至少洗涤两次，每次20-30分钟。
如本文所用，就毗连核酸序列而言，术语“基本上同源”或“实质性同源性”是指由核酸分子携带的在严格条件下与具有参考核酸序列的核酸分子杂交的毗连核苷酸序列。例如，具有与seqidno:1的参考核酸序列基本上同源的序列的核酸分子是在严格条件(例如，前文示出的中等严格性条件)下与具有seqidno:1的参考核酸序列的核酸分子杂交的那些核酸分子。基本上同源的序列可具有至少80％的序列同一性。例如，基本上同源的序列可具有约80％至100％的序列同一性，诸如约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％和约100％。实质性同源性的特性与特异性杂交密切相关。例如，当存在足够程度的互补性时，核酸分子可特异性杂交，以避免核酸在期望特异性结合的情况下(例如，在严格杂交条件下)与非靶标序列非特异性结合。
如本文所用，术语“直系同源物”是指两种或更多种物种中已经从共同的祖先核苷酸序列演变、并且可以在所述两种或更多种物种中保留相同功能的基因。
如本文所用，当以5’至3’方向阅读的序列的每个核苷酸与以3’至5’方向阅读时的另一序列的每个核苷酸互补时，两个核酸序列分子被认为表现出“完全互补性”。与参考核苷酸序列互补的核苷酸序列将表现出与所述参考核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这些术语和描述是本领域中明确定义的，并且是本领域普通技术人员易于理解的。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系中时，第一核苷酸序列与第二核酸序列可操作地连接。以重组方式产生时，可操作地连接的核酸序列一般是毗连的，并且在必要时可将两个蛋白质编码区连接在同一个阅读框内(例如，在翻译融合的orf中)。然而，可操作地连接的核酸不一定是邻接的。
术语“可操作地连接”在有关调控序列和编码序列的情况下使用时，意味着该调控序列影响连接的编码序列的表达。“调控序列”或“控制元件”是指影响转录的时机和水平/量、rna加工或稳定性、或者相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏物结合序列、终止序列、多聚腺苷酸化识别序列等等。特定的调控序列可位于与其可操作地连接的编码序列的上游和/或下游。而且，与编码序列可操作地连接的特定调控序列可位于双链核酸分子的相关互补链上。
启动子：如本文所用，术语“启动子”是指可以在转录起始上游、并且可能参与rna聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以启动转录的dna区域。启动子可与用于在细胞中表达的编码序列可操作地连接，或者启动子可与编码信号肽的核苷酸序列可操作地连接，所述核苷酸序列可与用于在细胞中表达的编码序列可操作地连接。“植物启动子”可以是能够启动植物细胞中的转录的启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先启动某些组织中的转录的启动子，所述组织诸如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织。此类启动子被称为“组织优先”启动子。仅启动某些组织中的转录的启动子被称为“组织特异性”启动子。“细胞类型特异性”启动子主要驱动一个或多个器官中某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”启动子可以是可处于环境控制下的启动子。可通过诱导型启动子启动转录的环境条件的实例包括厌氧条件和存在光。组织特异性启动子、组织优先启动子、细胞类型特异性启动子和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是可以在大多数环境条件下或在大多数组织或细胞类型中有活性的启动子。
在本公开的一些实施方案中可以使用任何诱导型启动子。参见ward等人，(1993)plantmol.biol.22:361-366。利用诱导型启动子，转录速率响应于诱导剂而增大。示例性诱导型启动子包括但不限于：来自acei系统的响应于铜的启动子；来自玉蜀黍的响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的in2基因启动子；来自tn10的tet阻遏物；以及来自类固醇激素基因的诱导型启动子，其转录活性可通过糖皮质类固醇激素诱导(schena等人，1991年，proc.natl.acad.sci.usa88:10421-10425)。
示例性组成型启动子包括但不限于：来自植物病毒的启动子诸如来自花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子、来自水稻肌动蛋白基因的启动子、泛素启动子、pemu、mas、玉蜀黍h3组蛋白启动子和als启动子，欧洲油菜(brassicanapus)als3结构基因5’的xba1/ncoi片段(或与所述xba1/ncoi片段类似的核苷酸序列)(美国专利号5,659,026)。
此外，在本公开的一些实施方案中可以利用任何组织特异性或组织优先启动子。用包含与组织特异性启动子可操作地连接的编码序列的核酸分子转化的植物可唯一地或优先地在特异性组织中产生所述编码序列的产物。示例性的组织特异性或组织优先启动子包括但不限于：种子优先启动子，诸如来自菜豆素基因的启动子；叶特异性和光诱导型启动子，诸如来自cab或rubisco的启动子；花药特异性启动子，诸如来自lat52的启动子；花粉特异性启动子，诸如来自zm13的启动子；以及小孢子优先启动子，诸如来自apg的启动子。
大豆植物：如本文所用，术语“大豆植物”是指大豆属(glycine)物种的植物，例如大豆(glycinemax)。
转化：如本文所用，术语“转化”或“转导”是指将一个或多个核酸分子转移到细胞中。在核酸分子通过将核酸分子并入细胞基因组中、或通过附加型复制而由细胞稳定复制的情况下，细胞被转导到该细胞中的核酸分子“转化”。如本文所用，术语“转化”涵盖可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(fromm等人，(1986)nature319:791-793)；脂质体转染(felgner等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84:7413-7417)；显微注射(mueller等人，(1978)cell15:579-585)；农杆菌(agrobacterium)介导的转移(fraley等人，(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803-4807)；直接dna摄取；以及微粒轰击(klein等人，(1987)nature327:70)。
转基因：外源性核酸序列。在一些实例中，转基因可以是编码dsrna分子的一条或两条链的序列，所述dsrna分子包含与存在于鞘翅目和/或半翅目害虫中的核酸分子互补的核苷酸序列。在另外的实例中，转基因可以是反义核酸序列，其中该反义核酸序列的表达抑制靶标核酸序列的表达。在另外的实例中，转基因可以是基因序列(例如，除草剂抗性基因)、编码工业或药学上有用的化合物的基因或编码所需农业性状的基因。在这些和其他实例中，转基因可含有与转基因的编码序列可操作地连接的调控序列(例如启动子)。
载体：导入细胞中例如以产生经转化细胞的核酸分子。载体可包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体的实例包括但不限于：质粒、粘粒、噬菌体，或携带外源性dna进入细胞的病毒。载体也可以是rna分子。载体也可包括一个或多个基因、反义序列和/或选择性标记基因以及本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而引起细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。载体任选地包括辅助核酸分子实现进入细胞的物质(例如脂质体、蛋白质包衣等)。
产量：相对于在相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，约100％或更大的稳定化产量。在特定的实施方案中，“提高的产量”或“提高产量”意指相对于在含有相当大密度的对作物有害的鞘翅目和/或半翅目害虫的相同生长位置在相同时间且在相同条件下生长的检验品种的产量，具有105％至115％或更大的稳定化产量的栽培种。
除非特别指明或暗示，如本文所用的术语“一个”、“一种”和“该/所述”表示“至少一个/种”。
除非另外特别地解释，否则本文使用的全部技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。分子生物学中常见术语的定义可在以下出版物中找到：例如lewin’sgenesx,jones&bartlettpublishers,2009(isbn100763766321)；krebs等人(编辑)，theencyclopediaofmolecularbiology,blackwellscienceltd.,1994(isbn0-632-02182-9)；以及meyersr.a.(编辑)，molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,vchpublishers,inc.,1995(isbn1-56081-569-8)。除非另外指明，所有百分比均以重量计，所有溶剂混合物比例均以体积计。所有温度均以摄氏度计。
iv.包含鞘翅目和/或半翅目害虫序列的核酸分子
a.概述
本文描述了可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子。所描述的核酸分子包括靶标序列(例如，天然基因和非编码序列)、dsrna、sirna、hprna、shrna和mirna。例如，在一些实施方案中描述了dsrna、sirna、shrna、mirna和/或hprna分子，这些分子可与鞘翅目和/或半翅目害虫中的一种或多种天然核酸序列的全部或部分特异性互补。在这些和另外的实施方案中，天然核酸序列可以是一个或多个靶标基因，其产物可以例如但不限于：参与代谢过程、参与生殖过程或参与幼虫的发育。本文描述的核酸分子在导入包含与所述核酸分子特异性互补的至少一种天然核酸序列的细胞中时，可以在细胞中启动rnai，因此降低或消除所述天然核酸序列的表达。在一些实例中，借助包含与靶标基因特异性互补的序列的核酸分子降低或消除靶标基因的表达可造成鞘翅目和/或半翅目害虫死亡或导致生长和/或繁殖减慢。
在一些实施方案中，可选择鞘翅目和/或半翅目害虫中的至少一种靶标基因，其中该靶标基因包含含有rab5(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78)的核苷酸序列。在特定的实例中，选择鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标基因，其中该靶标基因包含含有rab5(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78)的新型核苷酸序列。
在一些实施方案中，靶标基因可以是包含这样的核苷酸序列的核酸分子：该核苷酸序列编码包含与rab5(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78)的蛋白产物的氨基酸序列至少85％相同(例如，约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％或100％相同)的毗连氨基酸序列的多肽。靶标基因可以是鞘翅目和/或半翅目害虫中的任何核酸序列，其转录后抑制对鞘翅目和/或半翅目害虫具有有害影响，或为植物提供对抗鞘翅目和/或半翅目害虫的保护益处。在特定的实例中，靶标基因是包含这样的核苷酸序列的核酸分子，该核苷酸序列编码包含与新型核苷酸序列seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的蛋白产物的氨基酸序列至少85％相同、约90％相同、约95％相同、约96％相同、约97％相同、约98％相同、约99％相同、约100％相同或100％相同的毗连氨基酸序列的多肽。
根据本公开提供了核苷酸序列，其表达产生包含核苷酸序列的rna分子，该核苷酸序列与由鞘翅目和/或半翅目害虫中的编码序列编码的天然rna分子的全部或部分特异性互补。在一些实施方案中，在鞘翅目和/或半翅目害虫摄入表达的rna分子之后，可获得鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中的编码序列的下调。在特定的实施方案中，鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中的编码序列的下调可对鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、生存力、增殖和/或繁殖造成有害影响。
在一些实施方案中，靶标序列包括转录的非编码rna序列，诸如5'utr；3'utr；剪接的前导序列；内含子序列；末端内含子序列(例如，随后在反式剪接中修饰的5'utrrna)；donatron(例如，提供反式剪接的供体序列所需要的非编码rna)以及靶标鞘翅目和/或半翅目害虫基因的其他非编码转录rna。此类序列可来源于单顺反子基因和多顺反子基因两者。
因此，本文结合一些实施方案还描述了包含至少一种核苷酸序列的irna分子(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标核酸的全部或部分特异性互补。在一些实施方案中，irna分子可包含与多个靶标序列(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个靶标序列)的全部或部分互补的一种或多种核苷酸序列。在特定的实施方案中，irna分子可在体外产生，或通过基因修饰生物体(诸如植物或细菌)在活体内产生。还公开了cdna序列，其可用于产生与鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标核酸的全部或部分特异性互补的dsrna分子、sirna分子、shrna分子、mirna分子和/或hprna分子。进一步描述了在实现特定宿主靶标的稳定转化中使用的重组dna构建体。经转化宿主靶标可从该重组dna构建体表达有效水平的dsrna、sirna、shrna、mirna和/或hprna分子。因此，还描述了一种植物转化载体，其包含与在植物细胞中具有功能的异源性启动子可操作地连接的至少一种核苷酸序列，其中所述核苷酸序列的表达产生包含核苷酸序列的rna分子，该核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标序列的全部或部分特异性互补。
在一些实施方案中，可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子可以包括：从叶甲属或半翅目分离的天然核酸序列的全部或部分，其包含rab5(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78)；在表达时产生这样的rna分子的核苷酸序列，所述rna分子包含与由rab5(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78)编码的天然rna分子的全部或部分特异性互补的核苷酸序列；包含与rab5(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78)的全部或部分特异性互补的至少一种核苷酸序列的irna分子(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)；可用于产生与rab5(seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78)的全部或部分特异性互补的dsrna分子、sirna分子、shrna分子、mirna和/或hprna分子的cdna序列；以及用于实现特定宿主靶标的稳定转化的重组dna构建体，其中转化的宿主靶标包含前述核酸分子中的一者或多者。
b.核酸分子
本公开尤其提供了抑制鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞、组织或器官中的靶标基因表达的irna(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)分子；以及能够在细胞或微生物中表达为irna分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞、组织或器官中的靶标基因表达的dna分子。
本公开的一些实施方案提供了一种经分离的核酸分子，其包含选自下列的至少一种(例如一种、两种、三种或更多种)核苷酸序列：seqidno:1；seqidno:1的互补序列；seqidno:3；seqidno:3的互补序列；seqidno:5；seqidno:5的互补序列；seqidno:78；seqidno:78的互补序列；seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78中任一者的至少15个毗连核苷酸(例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个毗连核苷酸)的片段；seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78中任一者的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；鞘翅目或半翅目生物体(例如wcr和bsb)的天然编码序列，其包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78中任一者的全部或部分；鞘翅目或半翅目生物体的天然编码序列的互补序列，该天然编码序列包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78中任一者的全部或部分；鞘翅目或半翅目生物体的天然非编码序列，其转录成包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78中任一者的全部或部分的天然rna分子；鞘翅目或半翅目生物体的天然非编码序列的互补序列，该非天然编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78中任一者的全部或部分的天然rna分子；鞘翅目或半翅目生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，该非天然编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78中任一者的全部或部分的天然rna分子；鞘翅目或半翅目生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，该非天然编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78中任一者的全部或部分的天然rna分子；鞘翅目或半翅目生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，该天然编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78的天然rna分子；鞘翅目或半翅目生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，该天然编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78的天然rna分子。在特定的实施方案中，鞘翅目和/或半翅目害虫接触或摄取该经分离的核酸序列抑制鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、发育、繁殖和/或进食。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子可以包含能够在细胞或微生物中表达为irna分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害虫细胞、组织或器官中的靶标基因表达的至少一种(例如一种、两种、三种或更多种)dna序列。此类dna序列可以可操作地连接到在包含所述dna分子的细胞中发挥作用的启动子序列，以引发或增强能够形成dsrna分子的编码rna的转录。在一个实施方案中，所述至少一个(例如，一个、两个、三个或更多个)dna序列可衍生自选自以下的多核苷酸：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:78。seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的衍生物包括seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的片段。在一些实施方案中，这样的片段可以包含例如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的至少约15个毗连核苷酸或其互补序列。因此，这样的片段可以包含例如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200个或更多个毗连的核苷酸或其互补序列。在这些和另外的实施方案中，这样的片段可以包含例如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的多于约15个毗连核苷酸或其互补序列。因此，seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的片段可包含例如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的15、16、17、18、19、20、21、约25(例如22、23、24、25、26、27、28和29)、约30、约40(例如35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45)、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200个或更多个毗连核苷酸或其互补序列。
一些实施方案包括将部分或完全稳定的dsrna分子导入鞘翅目和/或半翅目害虫以抑制鞘翅目和/或半翅目害虫细胞、组织或器官中靶标基因的表达。当表达为irna分子(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)并由鞘翅目和/或半翅目害虫摄取时，包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的一个或多个片段的核酸序列可导致以下中的一者或多者：鞘翅目和/或半翅目害虫死亡、生长印制、雌雄比变化、育雏数降低、感染停止和/或进食停止。例如，在一些实施方案中，提供了一种dsrna分子，其包含含有基本上与鞘翅目和/或半翅目害虫靶标基因序列同源的约15至约300或约19至约300个核苷酸的核苷酸序列，并且包含含有seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的核苷酸序列的一个或多个片段。这样的dsrna分子的表达可例如导致摄取该dsrna分子的鞘翅目和/或半翅目害虫的死亡和/或生长抑制。
在某些实施方案中，由本公开提供的dsrna分子包含与含有seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的靶标基因互补的核苷酸序列和/或与seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的片段互补的核苷酸序列，所述靶标基因在鞘翅目和/或半翅目害虫中受到抑制导致对于鞘翅目和/或半翅目害虫生长、发育或其他生物功能必不可少的蛋白或核苷酸序列剂减少或消除。选择的核苷酸序列可与seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78，seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78所示的核苷酸序列的连续片段以及前述中任一者的互补序列表现出约80％至约100％序列同一性。例如，所选的核苷酸序列可表现出与seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78，seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78所示的核苷酸序列的毗连片段或前述任一者的互补序列约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约98.5％、约99％、约99.5％或约100％的序列同一性。
在一些实施方案中，能够在细胞或微生物中表达为irna分子以抑制靶标基因表达的dna分子可包含与存在于一个或多个靶标鞘翅目和/或半翅目害虫物种中的天然核酸序列的全部或部分特异性互补的单个核苷酸序列，或者dna分子可以由多个此类特异性互补的序列构建成嵌合体。
在一些实施方案中，核酸分子可包含由“间隔序列”分开的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列。间隔序列可以是包含促进第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的二级结构形成(在期望的情况下)的任何核苷酸序列的区域。在一个实施方案中，间隔序列是mrna的有义编码序列或反义编码序列的一部分。作为替代，间隔序列可包含能够共价连接到核酸分子的核苷酸或其同源物的任何组合。
例如，在一些实施方案中，dna分子可包含编码一种或多种不同rna分子的核苷酸序列，其中所述不同rna分子中的每一种都包含第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，其中第一核苷酸序列和第二核苷酸序列彼此互补。所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列在rna分子内可通过间隔序列连接。间隔序列可构成所述第一核苷酸序列或所述第二核苷酸序列的一部分。包含所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列的rna分子的表达可通过所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列的特异性分子内碱基配对而引起本公开的dsrna分子形成。所述第一核苷酸序列或所述第二核苷酸序列可基本上与鞘翅目和/或半翅目害虫的天然核酸序列(例如，靶标基因或转录的非编码序列)、其衍生物或其互补序列相同。
dsrna核酸分子包含聚合核糖核苷酸序列的双链，并且可包含对磷酸根-糖主干或核苷的修饰。可以适当调整rna结构的修饰以使特异性抑制能够发生。在一个实施方案中，可通过普遍存在的酶促过程来修饰dsrna分子，以便可以生成sirna分子。该酶促过程可利用体外或活体内的rna酶iii酶，诸如真核生物中的dicer。参见elbashir等人，(2001)nature411:494-498；以及hamilton和baulcombe，(1999)science286(5441):950-952。dicer或功能上等同的rna酶iii酶将较大的dsrna链和/或hprna分子切割成较小的寡核苷酸(例如sirna)，所述寡核苷酸中每一者的长度为约19-25个核苷酸。由这些酶生成的sirna分子具有2至3个核苷酸3’突出，以及5’磷酸根末端和3’羟基末端。由rna酶iii酶生成的sirna分子在细胞中解旋并分成单链rna。然后，sirna分子与从靶标基因转录的rna序列特异性杂交，这两种rna分子随后通过固有的细胞rna降解机制得到降解。该过程可引起由靶标生物体中的靶标基因编码的rna序列有效降解或移除。结果是所靶向的基因发生转录后沉默。在一些实施方案中，通过内源性rna酶iii酶由异源性核酸分子产生的sirna分子可有效介导鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标基因的下调。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子可包括至少一种可被转录成单链rna分子的非天然存在的核苷酸序列，所述单链rna分子能够在活体内通过分子间杂交形成dsrna分子。此类dsrna序列通常自组装，并且可以提供给鞘翅目和/或半翅目害虫(例如，在鞘翅目和/或半翅目害虫的营养来源中)，以实现靶标基因的转录后抑制。在实施方案中，本公开的核酸分子可包含至少一种非天然存在的核苷酸序列，其与鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标基因特异性互补。当向鞘翅目和/或半翅目害虫以dsrna分子的形式提供这样的核酸分子时，该dsrna分子抑制靶标基因在鞘翅目和/或半翅目害虫中的表达。在这些和另外的实施方案中，本公开的核酸分子可包含两种不同的非天然存在的核苷酸序列，其中每种核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫中的不同靶标基因特异性互补。当向鞘翅目和/或半翅目害虫以dsrna分子的形式提供这样的核酸分子时，dsrna分子抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中至少两种不同靶标基因的表达。
c.获得核酸分子
可使用鞘翅目和/或半翅目害虫中的多种天然序列作为靶标序列来设计本公开的核酸分子，诸如irna和编码irna的dna分子。然而，天然序列的选择并非是直截了当的过程。鞘翅目和/或半翅目害虫中的天然序列中只有少数会是有效的靶标。例如，无法肯定地预测特定的天然序列是否可被本公开的核酸分子有效下调，或者特定的天然序列的下调是否会对鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、生存力、增殖和/或繁殖有不利影响。绝大部分天然鞘翅目和/或半翅目害虫序列诸如从其分离的est(例如，如美国专利号7,612,194和美国专利号7,943,819中所列)对鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、生存力、增殖和/或繁殖无有害影响，所述鞘翅目和/或半翅目害虫诸如为wcr、ncr、scr、bsb、稻绿蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、chinaviahilare、褐美洲蝽、椿虫、dichelopsfurcatus、edessameditabunda、thyantaperditor、chinaviamarginatum、horciasnobilellus、taediastigmosa、秘鲁棉红蝽、neomegalotomusparvus、leptoglossuszonatus、niesthreasidae、豆荚草盲蝽和美国牧草盲蝽。
也无法预测，在可以对鞘翅目和/或半翅目害虫有不利影响的天然序列中，哪些能够在重组技术中使用，从而在宿主植物中表达与此类天然序列互补的核酸分子，并且在鞘翅目和/或半翅目害虫进食后对其造成不利影响，同时不对宿主植物造成危害。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如，要在鞘翅目和/或半翅目害虫的宿主植物中提供的dsrna分子)被选择为靶向这样的cdna序列，该cdna序列编码鞘翅目和/或半翅目害虫存活所必需的蛋白质或蛋白质部分，诸如涉及代谢或分解代谢生物化学途径、细胞分裂、繁殖、能量代谢、消化、宿主植物识别等的氨基酸序列。本公开提供了包含一种或多种dsrna(所述dsrna的至少一个区段与靶标害虫生物体的细胞中产生的rna的至少一个基本上相同的区段特异性互补)的组合物向靶标生物体的递送，从而导致该靶标生物体的死亡或其他抑制作用。如本文所述，靶标害虫生物体摄入含有一种或多种dsrna(所述dsrna的至少一个区段与靶标生物体的细胞中产生的rna的至少一个基本上相同的区段特异性互补)的组合物，可导致该靶标的死亡或其他抑制作用。可使用来源于鞘翅目和/或半翅目害虫的核苷酸序列(dna或rna)来构建抗鞘翅目和/或半翅目害虫侵染的植物细胞。例如，可以转化鞘翅目和/或半翅目害虫的宿主植物(例如玉米或大豆)，使其含有来源于鞘翅目和/或半翅目害虫的如本文所提供的一种或多种核苷酸序列。转化到宿主中的核苷酸序列可编码在经转化宿主内的细胞或生物流体中形成dsrna序列的一种或多种rna，因此，如果鞘翅目和/或半翅目害虫与转基因宿主形成营养关系或者当鞘翅目和/或半翅目害虫与转基因宿主形成营养关系时，使得dsrna可用。这可引起对鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中一种或多种基因的表达的阻抑，并最终造成死亡或者对害虫生长或发育的抑制。
因此，在一些实施方案中，靶向实质上参与鞘翅目和/或半翅目害虫的生长、发育和繁殖的基因。本公开中使用的其他靶标基因可包括例如那些在鞘翅目和/或半翅目害虫的生存力、运动、迀移、生长、发育、感染性、进食部位的建立和繁殖中发挥重要作用的靶标基因。因此，靶标基因可以是管家基因或转录因子。此外，本公开中使用的天然鞘翅目和/或半翅目害虫核苷酸序列也可来源于植物、病毒、细菌或昆虫基因的同源物(例如直系同源物)，该同源物的功能是本领域技术人员已知的，并且其核苷酸序列与靶标鞘翅目和/或半翅目害虫的基因组中的靶标基因可特异性杂交。通过杂交鉴定具有已知核苷酸序列的基因的同源物的方法是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，本公开提供了用于获得核酸分子的方法，该核酸分子包含用于产生irna(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)分子的核苷酸序列。一个这样的实施方案包括：(a)分析一种或多种靶标基因在鞘翅目和/或半翅目害虫中，在dsrna介导的基因阻抑后的表达、功能和表型；(b)用探针探查cdna或gdna文库，所述探针包含来自所靶向鞘翅目和/或半翅目害虫的核苷酸序列的全部或部分或者其同源物，所靶向害虫在dsrna介导的阻抑分析中显示出改变的(例如减弱的)生长或发育表型；(c)鉴定与探针特异性杂交的dna克隆；(d)分离步骤(b)中鉴定的dna克隆；(e)对包含步骤(d)中所分离的克隆的cdna或gdna片段测序，其中测序的核酸分子包含所述rna序列的全部或大部分或者其同源物；以及(f)化学合成基因序列或者sirna或mirna或shrna或hprna或mrna或dsrna的全部或大部分。
在另外的实施方案中，用于获得包含用于产生大部分的irna(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)分子的核苷酸序列的核酸片段的方法包括：(a)合成第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物，它们与来自所靶向的鞘翅目和/或半翅目害虫的天然核苷酸序列的一部分特异性互补；以及(b)使用步骤(a)的第一寡核苷酸引物和第二寡核苷酸引物扩增克隆载体中存在的cdna或gdna插入物，其中扩增的核酸分子包含sirna或shrna或mirna或hprna或mrna或dsrna分子的大部分。
本公开的核酸可通过多种方法分离、扩增或产生。例如，可通过pcr扩增来源于gdna或cdna文库的靶标核酸序列(例如，靶标基因或转录的靶标非编码序列)或其部分来获得irna(例如dsrna、sirna、shrna、mirna和hprna)分子。可从靶标生物体提取dna或rna，并且可使用本领域普通技术人员已知的方法从所述dna或rna制备核酸文库。可使用由靶标生物体生成的gdna文库或cdna文库对靶标基因进行pcr扩增和测序。可使用确认的pcr产物作为体外转录的模板，以在最低限度启动子的情况下生成有义和反义rna。作为替代，核酸分子可通过许多技术中的任一种合成(参见例如ozaki等人，(1992)nucleicacidsresearch,20:5205-5214；以及agrawal等人，(1990)nucleicacidsresearch,18:5419-5423)，包括使用自动dna合成仪(例如，p.e.biosystems,inc.(fostercity,calif.)的392或394型dna/rna合成仪)、使用标准化学品(诸如亚磷酰胺化学品)。参见例如beaucage等人，(1992)tetrahedron,48:2223-2311；美国专利号4,415,732、4,458,066、4,725,677、4,973,679和4,980,460。还可采用引起非天然主链基团的替代性化学品，诸如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。
本公开的rna、dsrna、sirna、mirna、shrna或hprna分子可由本领域技术人员通过手动反应或自动反应以化学或酶促方式产生，或者在包含含有编码rna、dsrna、sirna、mirna、shrna或hprna分子的序列的核酸分子的细胞中于活体内产生。还可通过部分或完全有机合成产生rna，可通过体外酶促或有机合成导入任何经修饰的核糖核苷酸。可通过细胞rna聚合酶或噬菌体rna聚合酶(例如，t3rna聚合酶、t7rna聚合酶和sp6rna聚合酶)合成rna分子。可用于克隆和表达核苷酸序列的表达构建体是本领域已知的。参见例如美国专利号5,593,874、5,693,512、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693。可以先纯化化学合成的或通过体外酶促合成而合成的rna分子，再将其导入细胞中。例如，可通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、色谱法或这些手段的组合从混合物纯化rna分子。作为替代，可以在不进行任何纯化或进行最小程度纯化的情况下使用化学合成的或通过体外酶促合成而合成的rna分子，例如，以避免由于样品加工所致的损失。可将rna分子干燥以贮存，或溶解在水溶液中。该溶液可含有缓冲剂或盐，以促进dsrna分子双链体链退火和/或稳定化。
在实施方案中，可通过单条自身互补的rna链或者由两条互补的rna链形成dsrna分子。dsrna分子可以在活体内或在体外合成。细胞的内源性rna聚合酶可在活体内介导一条或两条rna链的转录，或者可使用克隆的rna聚合酶在活体内或在体外介导转录。转录后抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标基因，通过宿主的器官、组织或细胞类型中的特异性转录(例如，通过使用组织特异性启动子进行)；刺激宿主中的环境条件(例如，通过使用响应于感染、应激、温度和/或化学诱导物的诱导型启动子进行)；和/或工程化改造宿主的某个发育期或发育龄的转录(例如，通过使用发育期特异性启动子进行)，可以是宿主靶向的。形成dsrna分子的rna链(不论是体外还是活体内转录的)可以是也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可能能够也可能不能够被细胞的翻译装置翻译成多肽。
d.重组载体和宿主细胞转化
在一些实施方案中，本公开还提供了用于导入细胞(例如，细菌细胞、酵母细胞或植物细胞)中的dna分子，其中该dna分子包含这样的核苷酸序列，该核苷酸序列在表达为rna并被鞘翅目和/或半翅目害虫摄取后，实现对鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞、组织或器官中的靶标基因的阻抑。因此，一些实施方案提供了重组核酸分子，其包含能够在植物细胞中表达为irna(例如dsrna、sirna、mirna、shrna和hprna)分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标基因表达的核苷酸序列。为了启动或增强表达，此类重组核酸分子可包含一种或多种调控序列，所述调控序列可以与能够表达为irna的核酸序列可操作地连接。在植物中表达基因阻抑分子的方法是已知的，并且可用于表达本公开的核苷酸序列。参见例如国际pct公布号wo06/073727；以及美国专利公布号2006/0200878al)。
在具体的实施方案中，本公开的重组dna分子可包含编码dsrna分子的核酸序列。此类重组dna分子可以编码这样的dsrna分子，所述dsrna分子在被摄入后能够抑制鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中一种或多种内源性靶标基因的表达。在许多实施方案中，转录的rna可形成这样的dsrna分子，所述dsrna分子可按稳定化形式提供；例如，以发夹和茎环结构的形式提供。
在这些和另外的实施方案中，dsrna分子的一条链可通过从核苷酸序列转录而形成，该核苷酸序列基本上与由以下组成的核苷酸序列同源：seqidno:1；seqidno:1的互补序列；seqidno:3；seqidno:3的互补序列；seqidno:5；seqidno:5的互补序列；seqidno:1、3或5的至少19个毗连核苷酸的片段；seqidno:1、3或5的至少19个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体(例如，wcr)的天然编码序列，其包含seqidno:1、3或5；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，该天然编码序列包含seqidno:1、3或5；叶甲属生物体的天然非编码序列，其转录成包含seqidno:1、3或5的天然rna分子；叶甲属生物体的天然非编码序列的互补序列，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、3或5的天然rna分子；叶甲属生物体(例如，wcr)的天然编码序列的至少19个毗连核苷酸的片段，该天然编码序列包含seqidno:1、3或5；叶甲属生物体的天然编码序列的至少19个毗连核苷酸的片段的互补序列，该天然编码序列包含seqidno:1、3或5；叶甲属生物体的天然非编码序列的至少19个毗连核苷酸的片段，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、3或5的天然rna分子；和叶甲属生物体的天然非编码序列的至少19个毗连核苷酸的片段的互补序列，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、3或5的天然rna分子。
在其他实施方案中，dsrna分子的一条链可通过从核苷酸序列转录而形成，所述核苷酸序列与由以下组成的核苷酸序列基本上同源：seqidno:78；seqidno:78的互补序列；seqidno:78的至少15个毗连核苷酸的片段；seqidno:78的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；半翅目生物体的天然编码序列，其包含seqidno:78；半翅目生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列，所述天然rna分子包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的互补序列，所述天然rna分子包含seqidno:78；半翅目生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含seqidno:78；半翅目生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然rna分子包含seqidno:78；以及转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然rna分子包含seqidno:78。
在特定的实施方案中，编码dsrna分子的重组dna分子可在转录序列内包含至少两个核苷酸序列区段，此类序列的布置使得转录序列包含处于有义取向的第一核苷酸序列区段，和处于反义取向的第二核苷酸序列区段(包括第一核苷酸序列区段的互补序列)，其中有义核苷酸序列区段和反义核苷酸序列区段通过约五(～5)至约一千(～1000)个核苷酸的间隔序列区段连接或结合。通常，间隔区不表现出彼此互补的序列，但在一些实施方案中，间隔区的最5'和3'末端可表现出一定程度的互补性。因此，间隔序列区段可在有义序列区段与反义序列区段之间形成环。有义核苷酸序列区段或反义核苷酸序列区段可基本上与靶标基因(例如，包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的基因)的核苷酸序列或其片段同源。然而，在一些实施方案中，重组dna分子可以编码不含间隔序列的dsrna分子。在实施方案中，有义编码序列和反义编码序列可具有不同长度。
在其他实施方案中，编码dsrna分子的重组dna分子可以包含至少两个单独的核苷酸序列区段。在这样的实施方案中，第一核苷酸序列包含有义方向上的第一核苷酸序列区段。比较而言，第二核苷酸序列包含反义方向上的第二核苷酸序列区段。两个序列基本上彼此互补(例如，共享至少约80％、约85％、约87.5％、约90％、约92.5％、约95％、约97.5％、约99％、约99.9％、约100％或100％的序列同一性)，使得序列可以化学连接形成dsrna。任一序列可以与至少一个启动子可操作地连接，使得有义核苷酸序列区段和反义核苷酸序列区段在细胞(例如细菌细胞、酵母细胞或植物细胞)内表达或以合成方式产生。序列可以在细胞中共表达，其中它们在细胞内退火形成dsrna分子。在其他情况下，序列可以在不同的细胞中分开合成或表达，其中对所述序列进行分离、纯化和组合以退火并形成dsrna分子。有义核苷酸序列区段或反义核苷酸序列区段可基本上与靶标基因(例如，包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的基因)的核苷酸序列或其片段同源。在实施方案中，有义编码序列和反义编码序列可具有不同长度。
通过在本发明的重组核酸分子中创建适当的表达盒，可容易地将鉴定为具有对鞘翅目和/或半翅目害虫的有害影响或者具有就鞘翅目和/或半翅目害虫而言的植物保护效果的序列掺入表达的dsrna分子中。例如，可通过以下步骤将此类序列表达为具有茎环结构的发夹：取得对应于靶标基因序列(例如，seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:78及其片段)的第一区段；将该序列连接到第二区段间隔序列区，所述第二区段间隔序列区与第一区段不是同源或互补的；然后将该连接物连接到第三区段，其中第三区段的至少一部分与第一区段基本上互补。这样的构建体通过第一区段与第三区段的分子内碱基配对而形成茎环结构，其中所述环结构形成并包含第二区段。参见例如美国专利公布号2002/0048814和2003/0018993；以及国际pct公布号wo94/01550和wo98/05770。可例如以双链结构诸如茎环结构(例如发夹)的形式生成dsrna分子，由此通过共表达靶标基因的片段(例如在额外的植物可表达盒上的靶标基因的片段)而增强靶向天然鞘翅目和/或半翅目害虫序列的sirna的产生，这造成sirna产生增强，或者减轻甲基化以防止dsrna发夹启动子的转录基因沉默。
本公开的实施方案包括将本公开的重组核酸分子导入植物中(即转化)，以实现一种或多种irna分子的鞘翅目和/或半翅目害虫抑制水平的表达。重组dna分子可以例如是载体，诸如线性或闭合环状质粒。载体系统可以是单一载体或质粒，或者共同含有要导入宿主基因组中的总dna的两个或更多个载体或质粒。另外，载体可以是表达载体。可以例如在合适启动子的控制下将本公开的核酸序列适当地插入载体中，所述启动子在一种或多种宿主中发挥功能以驱动连接的编码序列或其他dna序列表达。许多载体可用于该目的，并且对适当载体的选择主要将取决于要插入载体中的核酸的大小和要用载体转化的特定宿主细胞。根据每种载体的功能(例如，扩增dna或表达dna)及与其相容的特定宿主细胞，每种载体含有各种组分。
为了赋予转基因植物对鞘翅目和/或半翅目害虫的耐性，例如可以在重组植物的组织或流体内将重组dna转录成irna分子(例如，形成dsrna分子的rna分子)。irna分子可包含与可对宿主植物物种造成损害的鞘翅目和/或半翅目害虫内的相应转录核苷酸序列基本上同源且可特异性杂交的核苷酸序列。所述鞘翅目和/或半翅目害虫可例如通过摄入包含所述irna分子的转基因宿主植物的细胞或流体而接触在转基因宿主植物细胞中转录的所述irna分子。因此，靶标基因的表达在侵染转基因宿主植物的鞘翅目和/或半翅目害虫内受到irna分子阻抑。在一些实施方案中，对靶标鞘翅目和/或半翅目害虫中靶标基因表达的阻抑可导致植物抗害虫攻击。
为了使irna分子能够被递送给与已用本公开的重组核酸分子转化的植物细胞处于营养关系的鞘翅目和/或半翅目害虫，需要在植物细胞中表达(即转录)irna分子。因此，重组核酸分子可包含与一种或多种调控序列(诸如在宿主细胞中发挥作用的异源性启动子序列)可操作地连接的本公开的核苷酸序列，所述宿主细胞诸如其中要扩增核酸分子的细菌细胞，以及其中要表达核酸分子的植物细胞。
适合用于本公开的核酸分子的启动子包括诱导型启动子、病毒启动子、合成启动子或组成型启动子，它们都是本领域熟知的。描述此类启动子的非限制性实例包括美国专利号6,437,217(玉蜀黍rs81启动子)、5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)、6,426,446(玉蜀黍rs324启动子)、6,429,362(玉蜀黍pr-1启动子)、6,232,526(玉蜀黍a3启动子)、6,177,611(玉蜀黍组成型启动子)，5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(camv35s启动子)，6,433,252(玉蜀黍l3油质蛋白启动子)、6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和水稻肌动蛋白2内含子)、6,294,714(光诱导型启动子)、6,140,078(盐诱导型启动子)、6,252,138(病原体诱导型启动子)、6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)、6,388,170(双向启动子)、6,635,806(γ-薏苡醇溶蛋白(coixin)启动子)，以及美国专利公布号2009/757,089(玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子)。额外的启动子包括胭脂碱合酶(nos)启动子(ebert等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84(16):5745-5749)和章鱼碱合酶(ocs)启动子(两者都在根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒组启动子，诸如花椰菜花叶病毒(camv)19s启动子(lawton等人，(1987)plantmol.biol.9:315-324)；camv35s启动子(odell等人，(1985)nature313:810-812)；玄参花叶病毒35s-启动子(walker等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84(19):6624-6628)；蔗糖合酶启动子(yang和russell，(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:4144-4148)；r基因复合体启动子(chandler等人，(1989)plantcell1:1175-1183)；叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；camv35s(美国专利号5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196)；fmv35s(美国专利号5,378,619和6,051,753)；pc1sv启动子(美国专利号5,850,019)；scp1启动子(美国专利号6,677,503)；以及agrtu.nos启动子(genbanktm登录号v00087；depicker等人，(1982)j.mol.appl.genet.1:561-573；bevan等人，(1983)nature304:184-187)。
在特定的实施方案中，本公开的核酸分子包含组织特异性启动子，诸如根特异性启动子。根特异性启动子驱动唯一地或优先地在根组织中表达可操作连接的编码序列。根特异性启动子的实例是本领域已知的。参见例如美国专利号5,110,732、5,459,252和5,837,848；opperman等人，(1994)science263:221-3；以及hirel等人，(1992)plantmol.biol.20:207-18。在一些实施方案中，可以在两个根特异性启动子之间克隆根据本公开的用于鞘翅目和/或半翅目害虫控制的核苷酸序列或片段，所述根特异性启动子相对于所述核苷酸序列或片段以相反的转录方向取向、在转基因植物细胞中可操作，并且在转基因植物细胞中表达从而在其中产生rna分子，这些rna分子随后可形成dsrna分子，如前文所述。鞘翅目和/或半翅目害虫可以摄入植物组织中表达的irna分子，从而实现对靶标基因表达的阻抑。
可任选地与感兴趣的核酸分子可操作地连接的额外的调控序列包括内含子和/或5'utr，它们充当位于启动子序列和编码序列之间的翻译前导序列。翻译前导序列存在于完全加工的mrna中，并且可影响初级转录物的加工和/或rna的稳定性。翻译前导序列的实例包括玉蜀黍和矮牵牛花热休克蛋白前导序列(美国专利号5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)前导序列等。参见例如turner和foster，(1995)molecularbiotech.3(3):225-36。5'utr的非限制性实例包括gmhsp(美国专利号5,659,122)、phdnak(美国专利号5,362,865)、atant1、tev(carrington和freed，(1990)j.virol.64:1590-7)和agrtunos(genbanktm登录号v00087；bevan等人，(1983)nature304:184-7)。内含子的非限制性实例包括来自玉米肌动蛋白解聚合因子的内含子(美国专利号7,071,385)、拟南芥内含子(美国专利号8,673,631)、hsp70内含子(美国专利号5,593,874)、来自大米的内含子(美国专利号8,088,971)和水稻肌动蛋白2内含子(美国专利号6,429,357)。
可任选地与感兴趣的核酸分子可操作地连接的额外的调控序列还包括3’非翻译序列、3’转录终止区或多聚腺苷酸化区。这些是位于核苷酸序列下游的遗传元件，包括提供多聚腺苷酸化信号和/或能够影响转录或mrna加工的其他调控信号的多核苷酸。多聚腺苷酸化信号在植物中发挥作用，引起多聚腺苷酸化核苷酸添加至mrna前体的3’端。多聚腺苷酸化序列可以来源于多种植物基因或t-dna基因。3’转录终止区的一个非限制性实例是胭脂碱合酶3’区(nos3’；fraley等人，(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803-7)。使用不同的3’非翻译区的实例在ingelbrecht等人，(1989)plantcell1:671-80中提供。多聚腺苷酸化信号的非限制性实例包括来自豌豆(pisumsativum)rbcs2基因的信号(ps.rbcs2-e9；coruzzi等人，(1984)emboj.3:1671-9)和agrtu.nos(genbanktm登录号e01312)。
一些实施方案可包括植物转化载体，该植物转化载体包含经分离和纯化的dna分子，该dna分子包含与本公开的一种或多种核苷酸序列可操作地连接的上述调控序列中的至少一者。所述一种或多种核苷酸序列在表达时生成一种或多种包含下述核苷酸序列的irna分子，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫中的天然rna分子的全部或部分特异性互补。因此，所述一种或多种核苷酸序列可包含编码所靶向的鞘翅目和/或半翅目害虫rna转录物内存在的核糖核苷酸序列的全部或部分的区段，并且可包含所靶向的鞘翅目和/或半翅目害虫转录物的全部或部分的反向重复序列。植物转化载体可含有与超过一种靶标序列特异性互补的序列，从而允许产生超过一种dsrna以抑制靶标鞘翅目和/或半翅目害虫的一个或多个群体或物种的细胞中两种或更多种基因的表达。可将与不同基因中存在的核苷酸序列特异性互补的核苷酸序列的区段组合成单个复合核酸分子，以便在转基因植物中表达。这样的区段可以是连续的，或由间隔序列分开。
在一些实施方案中，已含有本公开的至少一种核苷酸序列的本公开的质粒可通过在同一质粒中相继插入额外的一种或多种核苷酸序列来修饰，其中所述额外的一种或多种核苷酸序列与原有的至少一种核苷酸序列可操作地连接于相同的调控元件。在一些实施方案中，核酸分子可设计用于抑制多种靶标基因。在一些实施方案中，要抑制的多种基因可得自相同的鞘翅目和/或半翅目害虫物种，这样可增强核酸分子的有效性。在其他实施方案中，基因可来源于不同的鞘翅目和/或半翅目害虫，这样可拓宽一种或多种药剂对其有效的鞘翅目和/或半翅目害虫的范围。当靶向多种基因以实现阻抑或者表达和阻抑的组合时，可以制造多顺反子dna元件。
本公开的重组核酸分子或载体可包含赋予经转化细胞(诸如植物细胞)可选择表型的可选择标记。也可使用可选择标记来选择包含本公开的重组核酸分子的植物或植物细胞。所述标记可编码杀生物剂抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遗传霉素(g418)、博来霉素、潮霉素等)或除草剂耐受性(例如草甘膦等)。可选择标记的实例包括但不限于：编码卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、g418等选择的neo基因；编码双丙氨膦抗性的bar基因；编码草甘膦抗性的突变epsp合酶基因；赋予对溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；赋予咪唑啉酮或磺酰脲耐受性的突变乙酰乳酸合酶(als)基因；以及甲氨蝶呤抗性dhfr基因。有多种可选择标记可供使用，其赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦、嘌呤霉素、壮观霉素、利福平、链霉素和四环素等的抗性。此类可选择标记的实例例示于例如美国专利号5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中。
本公开的重组核酸分子或载体还可包含可筛选标记。可使用可筛选标记来监测表达。示例性可筛选标记包括：β-葡萄糖醛酸酶或uida基因(gus)，其编码已知各种生色底物的酶(jefferson等人，(1987)plantmol.biol.rep.5:387-405)；r-基因座基因，其编码调控植物组织中花色素苷色素(红色)产生的产物(dellaporta等人，(1988)"molecularcloningofthemaizer-njallelebytransposontaggingwithac”，载于第18届斯塔德勒遗传学研讨会(stadlergeneticssymposium)，p.gustafson和r.appels编辑，newyork:plenum，第263-82页)；β-内酰胺酶基因(sutcliffe等人，(1978)proc.natl.acad.sci.usa75:3737-41)；编码已知各种生色底物的酶(例如padac，一种生色头孢菌素)的基因；荧光素酶基因(ow等人，(1986)science234:856-9)；xyle基因，其编码可转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶(zukowski等人，(1983)gene46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(ikatu等人，(1990)bio/technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其编码能够将酪氨酸氧化为dopa和多巴醌(其继而缩合成黑色素)的酶(katz等人，(1983)j.gen.microbiol.129:2703-14)；以及α-半乳糖苷酶。
在一些实施方案中，在用于创建转基因植物和在植物中表达异源性核酸的方法中，可使用如前文所述的重组核酸分子来制备表现出对鞘翅目和/或半翅目害虫的易感性降低的转基因植物。可以例如通过将编码irna分子的核酸分子插入植物转化载体中，然后将这些导入植物中来制备植物转化载体。
用于转化宿主细胞的合适方法包括可将dna导入细胞中的任何方法，诸如通过转化原生质体(参见例如美国专利号5,508,184)、通过干燥/抑制介导的dna摄取(参见例如potrykus等人，(1985)mol.gen.genet.199:183-8)、通过电穿孔(参见例如美国专利号5,384,253)、通过用碳化硅纤维搅拌(参见例如美国专利号5,302,523和5,464,765)、通过农杆菌介导的转化(参见例如美国专利号5,563,055、5,591,616、5,693,512、5,824,877、5,981,840和6,384,301)以及通过加速dna包被的粒子(参见例如美国专利号5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861和6,403,865)，等等。特别可用于转化玉米的技术描述于例如美国专利号5,591,616、7,060,876和7,939,328中。通过应用诸如这些的技术，可稳定地转化几乎任何物种的细胞。在一些实施方案中，将转化dna整合到宿主细胞的基因组中。在多细胞物种的情况下，可将转基因细胞再生为转基因生物体。可使用这些技术中的任一种来产生转基因植物，例如在其基因组中包含编码一种或多种irna分子的一种或多种核酸序列的转基因植物。
用于将表达载体导入植物中的最广泛使用的方法以各种农杆菌物种的天然转化系统为基础。根癌农杆菌和发根农杆菌(a.rhizogenes)是遗传转化植物细胞的植物致病性土壤细菌。根癌农杆菌和发根农杆菌的ti质粒和ri质粒分别携带负责遗传转化植物的基因。ti(肿瘤诱导)质粒含有转移到经转化植物的大区段，称为t-dna。ti质粒的另一个区段vir区负责t-dna转移。t-dna区以末端重复序列为边界。在经修饰的二元载体中，肿瘤诱导基因已缺失，vir区的功能用来转移以t-dna边界序列为边界的外来dna。t-区还可含有用于有效回收转基因细胞和植物的可选择标记，以及用于插入转移序列诸如dsrna编码核酸的多克隆位点。
因此，在一些实施方案中，植物转化载体来源于根癌农杆菌的ti质粒(参见例如美国专利号4,536,475、4,693,977、4,886,937和5,501,967，以及欧洲专利号ep0122791)或发根农杆菌的ri质粒。额外的植物转化载体包括(例如但不限于)由herrera-estrella等人，(1983)nature303:209-13；bevan等人，(1983)nature304:184-7；klee等人，(1985)bio/technol.3:637-42；以及欧洲专利号ep0120516描述的那些，以及来源于前述载体中任一者的那些。可以修饰天然地与植物相互作用的其他细菌，诸如中华根瘤菌属(sinorhizobium)、根瘤菌属(rhizobium)和中慢生根瘤菌属(mesorhizobium)，以介导到许多各种各样的植物的基因转移。通过获取卸甲ti质粒和合适的二元载体这两者，可使这些植物相关的共生细菌能够胜任基因转移。
在向受体细胞提供外源性dna之后，通常鉴定经转化的细胞以供进一步培养和植物再生。为了提高鉴定经转化细胞的能力，技术人员可能期望采用如前提出的可选择或可筛选标记基因，其中转化载体用来生成转化体。在使用可选择标记的情况下，通过使细胞暴露于一种或多种选择剂而在潜在经转化的细胞群体内鉴定出经转化细胞。在使用可筛选标记的情况下，可针对期望的标记基因性状来筛选细胞。
可将暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞置于支持植物再生的培养基中培养。在一些实施方案中，可通过包含另外的物质(诸如生长调节剂)来改良任何合适的植物组织培养基(例如ms培养基和n6培养基)。可将组织维持在具有生长调节剂的基础培养基上，直到可得到足够的组织用于启动植物再生工作时为止，或者在重复多轮的手动选择之后，直到组织形态适合于再生时为止(例如，通常约2周)，然后转移到有益于芽形成的培养基中。定期转移培养物，直到已出现充分的芽形成时为止。一旦形成芽，就将其转移到有益于根形成的培养基中。一旦形成足够的根，就可将植物转移到土壤中，以便进一步生长和成熟。
为了确认再生植物中存在感兴趣的核酸分子(例如，编码一种或多种irna分子的dna序列，所述irna分子抑制鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标基因表达)，可执行多种测定。此类测定包括例如：分子生物学测定，诸如southern印迹和northern印迹、pcr和核酸测序；生物化学测定，诸如检测是否存在蛋白质产物，例如通过免疫学手段(elisa和/或免疫印迹)或借助酶功能；植物部分测定，诸如叶或根测定；以及对再生全植物的表型的分析。
可例如通过使用例如对感兴趣的核酸分子有特异性的寡核苷酸引物进行pcr扩增来分析整合事件。pcr基因分型应当理解为包括但不限于：来源于经分离的宿主植物愈伤组织的基因组dna的聚合酶链式反应(pcr)扩增，所述愈伤组织预测含有整合到基因组中的感兴趣核酸分子，接着是pcr扩增产物的标准克隆和序列分析。pcr基因分型的方法已得到充分描述(例如rios,g.等人，(2002)plantj.32:243-53)，并且可应用于来源于任何植物物种(例如玉蜀黍或大豆)或组织类型的gdna，包括来源于细胞培养物的基因组dna。
使用农杆菌依赖性转化方法形成的转基因植物通常含有插入一条染色体中的单个重组dna序列。该单个重组dna序列被称为“转基因事件”或“整合事件”。此类转基因植物对于插入的外源性序列而言是半合子的。在一些实施方案中，通过将含有单个外源性基因序列的独立的分离转基因植物与自身(例如t0植物)有性交配(自交)以产生t1种子，可获得相对于转基因为纯合的转基因植物。所产生的t1种子的四分之一相对于所述转基因会是纯合的。萌发t1种子产生的植物可用于测试杂合性，所述测试通常使用snp测定或热扩增测定，使得允许区分杂合子和纯合子(即接合性测定)。
在特定的实施方案中，在植物细胞中产生具有鞘翅目和/或半翅目害虫抑制效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种不同的irna分子。可以从导入不同转化事件中的多种核酸序列、或从导入单个转化事件中的单个核酸序列表达irna分子(例如dsrna分子)。在一些实施方案中，在单个启动子的控制下表达多个irna分子。在其他实施方案中，在多个启动子的控制下表达多个irna分子。可以表达包含多个核酸序列的单一irna分子，所述核酸序列各自与在相同的鞘翅目和/或半翅目害虫物种的不同群体中或在不同的鞘翅目和/或半翅目害虫物种中的一个或多个鞘翅目和/或半翅目害虫内的不同基因座(例如，由seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78限定的基因座)同源。
除了用重组核酸分子直接转化植物之外，可通过使具有至少一个转基因事件的第一植物与缺乏这种事件的第二植物杂交来制备转基因植物。例如，可将包含编码irna分子的核苷酸序列的重组核酸分子导入易于转化的第一植物品系中以产生转基因植物，该转基因植物可与第二植物品系杂交，以使编码irna分子的核苷酸序列渗入到第二植物品系中。
本公开还包括含有本文公开的一个或多个序列的商品。特定的实施方案包括从包含本公开的核苷酸序列中的一者或多者的重组植物或种子产生的商品产品。包含本公开的序列中的一者或多者的商品产品旨在包括但不限于：植物的粗粉、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，以及包含含有本发明的序列中的一者或多者的重组植物或种子的任何粗粉、油或者碾碎的或完整的籽粒的任何食物产品或动物饲料产品。在本文设想的一种或多种商品或商品产品中检出本公开的序列中的一者或多者实际上证明了：该商品或商品产品是出于使用dsrna介导的基因抑制方法来控制鞘翅目和/或半翅目植物害虫的目的而被设计为表达本公开核苷酸序列中的一者或多者的转基因植物产生的。
在一些方面，包括由来源于经转化植物细胞的转基因植物产生的种子和商品产品，其中所述种子或商品产品包含可检出量的本公开的核酸序列。在一些实施方案中，可例如通过获得转基因植物并由其制备食物或饲料来生产此类商品产品。包含本公开的核酸序列中的一者或多者的商品产品包括(例如但不限于)：植物的粗粉、油类、碾碎的或完整的籽粒或种子，以及包含含有本公开的核酸序列中的一者或多者的重组植物或种子的任何粗粉、油或者碾碎的或完整的籽粒的任何食物产品。在一种或多种商品或商品产品中检出本公开的序列中的一者或多者，实际上证明了该商品或商品产品是由出于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的目的被设计为表达本公开的irna分子中的一者或多者的转基因植物产生的。
在一些实施方案中，包含本公开的核酸分子的转基因植物或种子也可在其基因组中包含至少一个其他的转基因事件，包括但不限于：自其转录靶向鞘翅目和/或半翅目害虫中与由下列各项限定的基因座不同的基因座的irna分子的转基因事件：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78，所述不同的基因座诸如选自下列的一种或多种基因座：caf1-180(美国专利申请公布号2012/0174258)、vatpasec(美国专利申请公布号2012/0174259)、rho1(美国专利申请公布号2012/0174260)、vatpaseh(美国专利申请公布号2012/0198586)、ppi-87b(美国专利申请公布号2013/0091600)、rpa70(美国专利申请公布号2013/0091601)、rps6(美国专利申请公布号2013/0097730)、rop(美国专利申请号14/577,811)、rna聚合酶i1(美国专利申请公布号62/133,214)、rna聚合酶ii140(美国专利申请公布号14/577,854)、rna聚合酶ii215(美国专利申请公布号62/133,202)、rna聚合酶ii33(美国专利申请公布号62/133,210)、ncm(美国专利申请公布号62/095487)、dre4(美国专利申请公布号14/705,807)、copiα(美国专利申请公布号62/063,199)、copiβ(美国专利申请公布号62/063,203)、copiγ(美国专利申请公布号62/063,192)、copiδ(美国专利申请公布号62/063,216)、snap25(美国专利申请号62/193502)、转录伸长因子spt5(美国专利申请号62/168,613)和转录伸长因子spt6(美国专利申请号62/168,606)；自其转录靶向与鞘翅目和/或半翅目害虫不同的生物体(例如植物寄生性线虫)中的基因的irna分子的转基因事件；编码杀虫蛋白(例如苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白，诸如cry34ab1(美国专利号6,127,180、6,340,593和6,624,145)、cry35ab1(美国专利号6,083,499、6,340,593和6,548,291)、单个事件(例如玉蜀黍事件das-59122-7；美国专利号7,323,556)中的“cry34/35ab1”组合、cry3a(例如美国专利号7,230,167)、cry3b(例如美国专利号8,101,826)、cry6a(例如美国专利号6,831,062)及其组合(例如美国专利申请号2013/0167268、2013/0167269和2013/0180016)的基因；除草剂耐受性基因(例如，提供对草甘膦、草铵膦、麦草畏或2,4-d(例如美国专利号7,838,733)的耐受性的基因)；以及促成转基因植物中期望的表型(诸如产量增加、脂肪酸代谢改变或细胞质雄性不育性恢复)的基因。在特定的实施方案中，可以在植物中将编码本公开irna分子的序列与其他昆虫控制性状或抗病性状组合，以实现增强对昆虫损害和植物病害的控制的期望性状。将采用独特作用模式的昆虫控制性状组合由于例如对所述一种或多种性状的抗性会在田间形成的概率降低，可以提供具有优于含单一控制性状的植物的出色耐久性的受保护转基因植物。
v.鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标基因阻抑
a.概述
在本公开的一些实施方案中，可向鞘翅目和/或半翅目害虫提供至少一种可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子，其中所述核酸分子在所述鞘翅目和/或半翅目害虫中引起rnai介导的基因沉默。在特定的实施方案中，可向鞘翅目和/或半翅目害虫提供irna分子(例如dsrna、sirna、mirna、shrna和hprna)。在一些实施方案中，可通过使可用于控制鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子与鞘翅目和/或半翅目害虫接触，来向所述害虫提供所述核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可以在鞘翅目和/或半翅目害虫的进食基质(例如营养组合物)中提供可用于控制所述鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子。在这些和另外的实施方案中，可通过摄入被鞘翅目和/或半翅目害虫摄入的包含可用于控制所述鞘翅目和/或半翅目害虫的核酸分子的植物材料，来提供所述核酸分子。在某些实施方案中，核酸分子通过表达导入植物材料中的重组核酸序列而存在于所述植物材料中，所述表达例如通过用包含重组核酸序列的载体转化植物细胞，然后从经转化植物细胞再生植物材料或全植物而进行。
b.rnai介导的靶标基因阻抑
在实施方案中，本公开提供可被设计成靶向鞘翅目和/或半翅目害虫(例如wcr、ncr、mcr、bsb、稻绿蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、喜绿蝽和褐美洲蝽)转录组中的必需天然核苷酸序列(例如必需基因)的irna分子(例如dsrna、sirna、mirna、shrna和hprna)，例如通过设计包含至少一条含有与靶标序列特异性互补的核苷酸序列的链的irna分子。如此设计的irna分子的序列可以与靶标序列相同，或者可以掺入不阻止irna分子与其靶标序列之间的特异性杂交的错配。
本公开的irna分子可以在用于鞘翅目和/或半翅目害虫中的基因阻抑的方法中使用，从而降低由害虫对植物(例如，包含irna分子的受保护的经转化植物)造成的损害的水平或发生率。如本文所用，术语“基因阻抑”是指用于降低由于基因转录成mrna及随后mrna翻译而产生的蛋白质的水平的任一种熟知方法，包括降低由基因或编码序列表达的蛋白质，包括转录后抑制表达和转录阻抑。转录后抑制通过从被靶向以受阻抑的基因转录的mrna的全部或部分与用于阻抑的相应irna分子之间的特异性同源性来介导。此外，转录后抑制是指细胞中用于被核糖体结合的可用mrna的量出现实质性及可测量的下降。
在其中irna分子为dsrna分子的特定实施方案中，酶dicer可将dsrna分子切割成短sirna分子(长度大约为20个核苷酸)。借助dicer对dsrna分子的活性而生成的双链sirna分子可分成两个单链sirna：“过客链”和“引导链”。过客链可降解，引导链则可掺入risc中。转录后抑制通过引导链与mrna分子的特异性互补序列的特异性杂交，随后通过酶argonaute(risc复合物的催化组分)切割而发生。
在本公开的实施方案中，可使用任何形式的irna分子。本领域的技术人员会理解，在制备过程中以及在向细胞提供irna分子的步骤过程中，dsrna分子通常比单链rna分子更稳定，并且在细胞中通常也是更稳定的。因此，例如，虽然在一些实施方案中sirna分子和mirna分子可能是同等有效的，但dsrna分子可能由于其稳定性而被选用。
在特定的实施方案中，提供了包含核苷酸序列的核酸分子，该核苷酸序列可在体外表达以产生irna分子，该irna分子与鞘翅目和/或半翅目害虫基因组内的核苷酸序列所编码的核酸分子基本上同源。在某些实施方案中，体外转录的irna分子可以是包含茎环结构的稳定化dsrna分子。在鞘翅目和/或半翅目害虫接触体外转录的irna分子之后，可发生对该鞘翅目和/或半翅目害虫中的靶标基因(例如必需基因)的转录后抑制。
在本公开的一些实施方案中，在用于转录后抑制鞘翅目害虫中的靶标基因的方法中使用包含核苷酸序列的至少15个毗连核苷酸的核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自：seqidno:1；seqidno:1的互补序列；seqidno:3；seqidno:3的互补序列；seqidno:5；seqidno:5的互补序列；seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的至少15个毗连核苷酸的片段；seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体(例如，wcr)的天然编码序列，其包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5；叶甲属生物体的天然编码序列的互补序列，该天然编码序列包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5；叶甲属生物体的天然非编码序列，其转录成包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的天然rna分子；叶甲属生物体的天然非编码序列的互补序列，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的天然rna分子；叶甲属生物体的天然非编码序列的互补序列，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的天然rna分子；叶甲属生物体(例如，wcr)的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，该天然编码序列包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，该天然编码序列包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5；叶甲属生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的天然rna分子；和叶甲属生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的天然rna分子。在某些实施方案中，可以使用与前述中任一者至少80％(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％和100％)相同的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于鞘翅目害虫的至少一个细胞中的rna分子特异性杂交的核酸分子。
在本公开的某些实施方案中，在用于转录后抑制半翅目害虫中的靶标基因的方法中使用包含核苷酸序列的至少15个毗连核苷酸的核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自：seqidno:78；seqidno:78的互补序列；seqidno:78的至少15个毗连核苷酸的片段；seqidno:78的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；半翅目生物体的天然编码序列seqidno:78；半翅目生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列，所述天然rna分子包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的互补序列，所述天然rna分子包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的互补序列，所述天然rna分子包含seqidno:78；半翅目生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含seqidno:78；半翅目生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然rna分子包含seqidno:78；以及转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然rna分子包含seqidno:78。在某些实施方案中，可以使用与前述中任一者至少80％(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％和100％)相同的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于半翅目害虫的至少一个细胞中的rna分子特异性杂交的核酸分子。
在一些实施方案中，在用于转录后抑制鞘翅目害虫中的靶标基因的方法中可以使用包含核苷酸序列的至少15个毗连核苷酸的至少一个核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自：seqidno:1；seqidno:1的互补序列；seqidno:3；seqidno:3的互补序列；seqidno:5；seqidno:5的互补序列；seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的至少15个毗连核苷酸的片段；seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；叶甲属生物体(例如，wcr)的天然编码序列，其包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5；叶甲属生物体(例如，wcr)的天然编码序列的互补序列，该天然编码序列包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5；叶甲属生物体的天然非编码序列，其转录成包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的天然rna分子；叶甲属生物体的天然非编码序列的互补序列，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的天然rna分子；叶甲属生物体(例如，wcr)的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，该天然编码序列包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5；叶甲属生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，该天然编码序列包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5；叶甲属生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的天然rna分子；和叶甲属生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，该天然非编码序列转录成包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的天然rna分子。在某些实施方案中，可以使用与前述中任一者至少80％(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％和100％)相同的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于鞘翅目害虫的至少一个细胞中的rna分子特异性杂交的核酸分子。在特定的实例中，这样的核酸分子可包含含有seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的核苷酸序列。
在本公开的特定实施方案中，在用于转录后抑制半翅目害虫中的靶标基因的方法中使用包含核苷酸序列的至少15个毗连核苷酸的核酸分子的表达，其中所述核苷酸序列选自：seqidno:78；seqidno:78的互补序列；seqidno:78的至少15个毗连核苷酸的片段；seqidno:78的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列；半翅目生物体的天然编码序列seqidno:78；半翅目生物体的天然编码序列的互补序列，所述天然编码序列包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列，所述天然rna分子包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的互补序列，所述天然rna分子包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的互补序列，所述天然rna分子包含seqidno:78；半翅目生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然编码序列包含seqidno:78；半翅目生物体的天然编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然编码序列包含seqidno:78；转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段，所述天然rna分子包含seqidno:78；以及转录成天然rna分子的半翅目生物体的天然非编码序列的至少15个毗连核苷酸的片段的互补序列，所述天然rna分子包含seqidno:78。在某些实施方案中，可以使用与前述中任一者至少80％(例如，80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100％和100％)相同的核酸分子的表达。在这些和另外的实施方案中，可以表达与存在于半翅目害虫的至少一个细胞中的rna分子特异性杂交的核酸分子。在特定的实例中，这样的核酸分子可包含含有seqidno:78的核苷酸序列。
本公开的一些实施方案的重要特征在于，rnai转录后抑制系统能够容忍靶标基因中预期由于遗传突变、株系多态性或进化趋异而可能发生的序列变异。导入的核酸分子可以不必与靶标基因的初级转录产物或完全加工的mrna绝对同源，只要导入的核酸分子与靶标基因的初级转录产物或完全加工的mrna可特异性杂交即可。另外，相对于靶标基因的初级转录产物或完全加工的mrna，导入的核酸分子可以不必是全长的。
使用本公开的irna技术抑制靶标基因是序列特异性的；也就是说，靶向与一种或多种irna分子基本上同源的核苷酸序列进行遗传抑制。在一些实施方案中，可以使用包含与靶标基因序列的一部分相同的核苷酸序列的rna分子进行抑制。在这些和另外的实施方案中，可以使用包含相对于靶标基因序列具有一个或多个插入、缺失和/或点突变的核苷酸序列的rna分子。在特定的实施方案中，irna分子和靶标基因的一部分可共享例如至少从约80％、至少从约81％、至少从约82％、至少从约83％、至少从约84％、至少从约85％、至少从约86％、至少从约87％、至少从约88％、至少从约89％、至少从约90％、至少从约91％、至少从约92％、至少从约93％、至少从约94％、至少从约95％、至少从约96％、至少从约97％、至少从约98％、至少从约99％、至少从约100％以及100％的序列同一性。作为替代，dsrna分子的双链体区可与靶标基因转录物的一部分可特异性杂交。在可特异性杂交的分子中，表现出较大同源性的小于全长的序列补偿较长的、同源性较低的序列。dsrna分子的双链体区中与靶标基因转录物的一部分相同的核苷酸序列的长度可以是至少约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、25、50、100、200、300、400、500个或至少约1000个碱基。在一些实施方案中，可以使用大于15个至100个核苷酸的序列。在特定的实施方案中，可以使用大于约200个至300个核苷酸的序列。在特定的实施方案中，根据靶标基因的大小，可以使用大于约500个至1000个核苷酸的序列。
在某些实施方案中，可以将鞘翅目和/或半翅目害虫中靶标基因的表达在该鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞内抑制至少10％、至少33％、至少50％或至少80％，使得发生显著抑制。显著抑制是指高于阈值的抑制，该抑制造成可检出的表型(例如，生长停止、进食停止、发育停止、诱导性死亡等)，或与正在抑制的靶标基因对应的rna和/或基因产物出现可检出的减少。虽然在本公开的某些实施方案中，在所述鞘翅目和/或半翅目害虫的基本上所有细胞中均发生抑制，但在其他实施方案中，仅在表达靶标基因的细胞子集中发生抑制。
在一些实施方案中，细胞中的转录阻抑由表现出与启动子dna序列或其互补序列的实质性序列同一性的dsrna分子的存在所介导，从而实现所谓的“启动子反式阻抑”。基因阻抑可以在可摄入或接触此类dsrna分子的鞘翅目和/或半翅目害虫中(例如通过摄入或接触含有所述dsrna分子的植物材料)针对靶标基因起效。在启动子反式阻抑中使用的dsrna分子可以特异性地设计为抑制或阻抑鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中的一种或多种同源或互补序列的表达。美国专利号5,107,065、5,231,020、5,283,184和5,759,829中公开了通过反义或有义取向的rna进行转录后基因阻抑以调控植物细胞中的基因表达。
c.提供给鞘翅目和/或半翅目害虫的irna分子的表达
可按许多体外形式或活体内形式中的任一种表达用于在鞘翅目和/或半翅目害虫中进行rnai介导的基因抑制的irna分子。然后可向鞘翅目和/或半翅目害虫提供irna分子，例如通过使irna分子与害虫接触，或通过引起害虫摄入或以其他方式内化irna分子。本公开的一些实施方案包括鞘翅目和/或半翅目害虫的经转化宿主植物、经转化植物细胞和经转化植物的后代。经转化植物细胞和经转化植物可工程化改造为例如在异源性启动子的控制下表达所述irna分子中的一者或多者，以提供害虫保护效果。因此，当鞘翅目和/或半翅目害虫在进食期间食用转基因植物或植物细胞时，该害虫可摄入转基因植物或细胞中表达的irna分子。也可将本公开的核苷酸序列导入多种多样的原核微生物宿主和真核微生物宿主中以产生irna分子。术语“微生物”包括原核物种和真核物种，诸如细菌和真菌。
调控基因表达可包括对这种表达的部分或完全阻抑。在另一个实施方案中，用于阻抑鞘翅目和/或半翅目害虫中的基因表达的方法包括在害虫宿主的组织中提供基因阻抑量的由如本文所述的核苷酸序列在转录后形成的至少一种dsrna分子，其至少一个区段与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞内的mrna序列互补。根据本公开由鞘翅目和/或半翅目害虫摄取的dsrna分子(包括其修饰形式，诸如sirna、mirna、shrna或hprna分子)可以与从包含含有seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5或seqidno:78的核苷酸序列的核酸分子转录的rna分子至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约100或100％相同。因此，提供了用于提供本公开的dsrna分子的经分离和基本上纯化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的核苷酸序列和重组dna构建体，其在导入鞘翅目和/或半翅目害虫时阻抑或抑制其中的内源性编码序列或靶标编码序列的表达。
特定的实施方案提供了用于递送irna分子以便转录后抑制鞘翅目和/或半翅目植物害虫中的一种或多种靶标基因并且控制所述鞘翅目和/或半翅目植物害虫的群体的递送系统。在一些实施方案中，所述递送系统包括对宿主转基因植物细胞或包含在宿主细胞中转录的rna分子的宿主细胞内容物的摄入。在这些和另外的实施方案中，创建转基因植物细胞或转基因植物，其含有用于提供本公开的稳定化dsrna分子的重组dna构建体。包含编码特定irna分子的核酸序列的转基因植物细胞和转基因植物可通过下述方式产生：采用重组dna技术(这些基础技术是本领域熟知的)构建包含编码本公开的irna分子(例如，稳定化的dsrna分子)的核苷酸序列的植物转化载体，以此转化植物细胞或植物，并以此生成含有转录的irna分子的转基因植物细胞或转基因植物。
为了赋予转基因植物对鞘翅目和/或半翅目害虫的抗性，可以例如将重组dna分子转录成irna分子，诸如dsrna分子、sirna分子、mirna分子、shrna分子或hprna分子。在一些实施方案中，从重组dna分子转录的rna分子可以在重组植物的组织或流体内形成dsrna分子。这样的dsrna分子可以包含在核苷酸序列的一部分中，所述核苷酸序列与从可侵染宿主植物的类型的鞘翅目和/或半翅目害虫内的dna序列转录的相应核苷酸序列相同。靶标基因在鞘翅目和/或半翅目害虫内的表达受到摄入的dsrna分子的抑制，并且鞘翅目和/或半翅目害虫中靶标基因表达的抑制导致例如鞘翅目和/或半翅目害虫停止进食，最终结果是例如转基因植物免受鞘翅目和/或半翅目害虫的进一步损害。已显示dsrna分子的调控作用适用于害虫中表达的多种基因，包括例如负责细胞代谢或细胞转化的内源性基因，包括管家基因；转录因子；蜕皮相关基因；以及编码涉及细胞代谢或正常生长和发育的多肽的其他基因。
为了从活体内转基因或表达构建体转录，可以在一些实施方案中使用调控区(例如，启动子、增强子、沉默子和多聚腺苷酸化信号)来转录一条或多条rna链。因此，在一些实施方案中，如前文示出的，在产生irna分子中使用的核苷酸序列可以与在植物宿主细胞中具有功能的一种或多种启动子序列可操作地连接。启动子可以是通常驻留于宿主基因组中的内源性启动子。在可操作地连接的启动子序列控制下的本公开的核苷酸序列可进一步侧接有利地影响其转录和/或所得转录物稳定性的额外序列。此类序列可位于可操作地连接的启动子上游、表达构建体3’端下游，并且可既存在于所述启动子上游、又存在于表达构建体3’端下游。
一些实施方案提供了用于减轻由以植物为食的鞘翅目和/或半翅目害虫引起的对宿主植物(例如玉米植物)的损害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表达本公开的至少一种核酸分子的经转化植物细胞，其中所述核酸分子在被所述鞘翅目和/或半翅目害虫摄取后发挥作用以抑制所述鞘翅目和/或半翅目害虫内靶标序列的表达，该表达抑制造成所述鞘翅目和/或半翅目害虫死亡、生长减缓和/或繁殖降低，从而减轻由所述鞘翅目和/或半翅目害虫引起的对宿主植物的损害。在一些实施方案中，所述核酸分子包括dsrna分子。在这些和另外的实施方案中，所述核酸分子包括dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超过一种与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交。
在其他实施方案中，提供了用于提高作物(例如，玉米作物)产量的方法，其中所述方法包括将本公开的至少一种核酸分子导入植物(例如，玉米植物)中；栽培该植物(例如，玉米植物)，以允许表达包含所述核酸序列的irna分子，其中包含所述核酸序列的irna分子的表达抑制鞘翅目和/或半翅目害虫生长和/或鞘翅目和/或半翅目害虫损害，从而降低或消除由于鞘翅目和/或半翅目害虫侵染所致的产量损失。在一些实施方案中，所述irna分子为dsrna分子。在这些和另外的实施方案中，所述核酸分子包括dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超过一种与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交。
在一些实施方案中，提供了用于调控鞘翅目和/或半翅目害虫中靶标基因的表达的方法，所述方法包括：用包含编码本公开的至少一种核酸分子的核酸序列的载体转化植物细胞，其中所述核苷酸序列与启动子和转录终止序列可操作地连接；在足以允许包含多个经转化植物细胞的植物细胞培养物发育的条件下培养经转化植物细胞；选择已将所述核酸分子整合到其基因组中的经转化植物细胞；针对由整合的核酸分子编码的irna分子的表达，筛选经转化植物细胞；选择表达irna分子的转基因植物细胞；然后用选择的转基因植物细胞饲喂所述鞘翅目和/或半翅目害虫。还可从表达由整合的核酸分子编码的irna分子的经转化植物细胞再生植物。在一些实施方案中，所述irna分子为dsrna分子。在这些和另外的实施方案中，所述核酸分子包括dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超过一种与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述核酸分子由一种核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与鞘翅目和/或半翅目害虫细胞中表达的核酸分子可特异性杂交。
可将本公开的irna分子以来自掺入植物细胞基因组中的重组基因的表达产物、或者以掺入应用于种植前种子的包衣或种子处理中，而掺入植物物种(例如玉米)的种子之内。包含重组基因的植物细胞被视为转基因事件。本公开的实施方案中还包括用于将irna分子递送到鞘翅目和/或半翅目害虫的递送系统。例如，可将本公开的irna分子直接导入鞘翅目和/或半翅目害虫的细胞中。用于导入的方法可包括将irna与来自鞘翅目和/或半翅目害虫宿主的植物组织直接混合，以及向宿主植物组织应用包含本公开的irna分子的组合物。例如，可将irna分子喷洒到植物表面上。作为替代，可通过微生物表达irna分子，然后可将微生物施用到植物表面上，或通过物理手段诸如注射导入根或茎中。如前文论述的，也可以对转基因植物进行遗传工程改造，使其以足以杀死已知要侵染植物的鞘翅目和/或半翅目害虫的量表达至少一种irna分子。通过化学方法或酶促合成方法产生的irna分子也可按符合常见农业实践的方式配制，并且作为喷雾产品使用以控制鞘翅目和/或半翅目害虫所致的植物损害。配制剂可包含有效叶覆盖所需的适当粘着剂和湿润剂，以及保护irna分子(例如dsrna分子)免受紫外线损害的紫外线保护剂。此类添加剂常用于生物杀虫剂产业中，并且是本领域技术人员熟知的。此类应用可与其他喷雾杀虫剂应用(基于生物学或其他方面)组合，以增强植物对鞘翅目和/或半翅目害虫的防护性。
本文引用的全部参考文献(包括出版物、专利和专利申请)据此以引用方式并入，并入程度与本公开的明确细节不冲突，并且以与下述相同的程度这样并入：如同单独地和具体地指明每篇参考文献均以引用方式并入且在本文中全文示出。提供本文论述的参考文献仅仅是为了参考其在本申请提交日之前的公开内容。本文中的任何内容都不应被理解为承认发明人由于在先发明而无权先于这样的公开内容。
提供以下实施例是为了例示某些特定的特征和/或方面。这些实施例不应被理解为将本公开限于所描述的特定特征或方面。
实施例
实施例1
昆虫食料生物测定
样品制备和生物测定；使用
在使用饲喂人工昆虫食料的新生昆虫幼虫进行的生物测定中测试样品的昆虫活性。wcr卵获自cropcharacteristics,inc.(farmington,mn)。
生物测定在特别为昆虫生物测定设计的128孔塑料托盘(c-dinternational,pitman,nj)中进行。每个孔装有约1.0ml设计用于支持鞘翅目昆虫生长的人工食料。用移液管将60μl等份的dsrna样品递送到每个孔的食料的表面上(40μl/cm2)。dsrna样品浓度作为孔中每平方厘米表面积(1.5cm2)的dsrna量(ng/cm2)来计算。将经处理的托盘保持在通风橱中，直到食料表面上的液体蒸发或吸收到食料中为止。
在孵化后的几个小时内，用湿润的骆驼毛刷拾取幼虫个体，将其放置在经处理的食料上(每孔一个或两个幼虫)。然后用透明塑料粘合片密封128孔塑料托盘上带虫的孔，并通气以允许气体交换。使生物测定托盘在受控环境条件(28℃，约40％相对湿度，16:8(光照：黑暗))下保持9天，之后记录暴露于每个样品的昆虫总数、死亡昆虫数以及存活昆虫的重量。计算每个处理的平均死亡率百分比和平均生长抑制。生长抑制(gi)如下计算：
gi＝[1–(twit/tnit)/(twibc/tnibc)]
其中twit是处理中的活昆虫的总重量；
tnit是处理中的昆虫的总数；
twibc是背景检查(缓冲液对照)中的活昆虫的总重量；
tnibc是背景检查(缓冲液对照)中的昆虫的总数。
使用jmptm软件(sas,cary,nc)进行统计分析。
lc50(致死浓度)定义为50％的测试昆虫被杀死时的剂量。gi50(生长抑制)定义为测试昆虫的平均生长(例如活体重)为背景检查样品中观察到的平均值的50％时的剂量。
重复的生物测定证明，摄入特定的样品造成了玉米根虫幼虫的令人惊讶且意想不到的死亡率和生长抑制。
实施例2
鉴定候选靶标基因
选择多个wcr(玉米根萤叶甲)发育期进行汇集的转录组分析，以提供通过rnai转基因植物昆虫抗性技术控制的候选靶标基因序列。
在一个范例中，从约0.9g的完整第一龄wcr幼虫(孵化后4到5天；保持在16℃)分离总rna，并使用下述基于苯酚/tri
室温下将幼虫置于装有10ml
小心取出并弃去上清液，然后通过用75％乙醇涡旋将rna沉淀洗涤两次，每次洗涤后通过以7,500xg(4℃或25℃)离心5分钟加以回收。小心地除去乙醇，让沉淀风干3至5分钟，然后溶解在无核酸酶的无菌水中。通过在260nm和280nm处测量吸光度(a)来测定rna浓度。从约0.9g幼虫的典型提取过程产生超过1mg的总rna，其中a260与a280的比值为1.9。如此提取的rna在-80℃储存，直到进一步加工。
通过使等份跑过1％琼脂糖凝胶来测定rna质量。在经高温灭菌的容器中，使用由经depc(焦碳酸二乙酯)处理的水稀释的经高温灭菌10xtae缓冲液(tris乙酸盐edta；1x浓度为0.04mtris乙酸盐、1mmedta(乙二胺四乙酸钠盐)，ph8.0)制成琼脂糖凝胶溶液。使用1xtae作为运行缓冲液。使用前，用rnaseawaytm(invitrogeninc.,carlsbad,ca)清洁电泳槽和造孔梳。取2μlrna样品与8μlte缓冲液(10mmtrishcl，ph7.0；1mmedta)和10μlrna样品缓冲液(
由商业服务提供商(eurofinsmwgoperon,huntsville,al)利用随机引发自幼虫总rna制备标准化的cdna文库。在eurofinsmwgoperon通过gsflx454titaniumtm系列化学品以1/2板规模对标准化的幼虫cdna文库进行测序，产生平均读段长度为348bp的超过600,000个读段。将350,000个读段组装成超过50,000个重叠群。使用公众可得到的程序formatdb(可获自ncbi)将未组装的读段和重叠群这两者都转换成可blast的数据库。
类似地由在其他wcr发育期收获的材料制备了总rna和标准化的cdna文库。合并代表各发育期的cdna文库成员，由此构建用于筛选靶标基因的汇集的转录组文库。
rnai靶向的候选基因利用关于其他昆虫如果蝇和赤拟谷盗中特定基因的致死性rnai效应的信息来选择。假设这些基因对于鞘翅目昆虫的存活和生长是必需的。对于选择的靶标基因，在转录组序列数据库中鉴定其同源物，如下所述。通过pcr扩增靶标基因的全长或部分序列，来制备用于产生双链rna(dsrna)的模板。
使用候选蛋白质编码序列针对含有未组装的叶甲属序列读段或已组装的重叠群的可blast数据库运行tblastn搜索。使用blastx针对ncbi非冗余数据库确认对叶甲属序列的显著命中(定义为：对于重叠群同源性，优于e-20；对于未组装的序列读段同源性，优于e-10)。此blastx搜索的结果确认，在tblastn搜索中鉴定的叶甲属同源物候选基因序列确实包含叶甲属基因，或者是针对叶甲属序列中存在的非叶甲属候选基因序列的最佳命中。在大多数情况下，拟谷盗属(tribolium)候选基因标被注为编码蛋白质，给出与叶甲属转录组序列中的一个或多个序列的确定序列同源性。在少数情况下可明显看出，一些基于与非叶甲属候选基因的同源性选择的叶甲属重叠群或未组装的序列读段有重叠，并且对重叠群的组装未能连接起这些重叠。在这些情况下，使用sequenchertmv4.9(genecodescorporation,annarbor,mi)将序列组装成更长的重叠群。
编码叶甲属rab5的候选靶标基因(seqidno:1、seqidno:3和seqidno:5)被鉴定为可造成鞘翅目害虫死亡，wcr生长抑制、发育抑制和/或繁殖抑制的基因。
seqidno:1、seqidno:3和seqidno:5的序列是新颖的。这些序列未在公共数据库中提供，也未在wo/2011/025860、美国专利申请号20070124836、美国专利申请号20090306189、美国专利申请号2007005086、美国专利申请号2010019226或美国专利号7612194中公开。
rab5dsrna转基因可与其他dsrna分子组合，以提供冗余的rnai靶向和意料之外的rnai效应(例如，协同rnai效应)。表达靶向rab5的dsrna的转基因玉米事件可用于防止玉米根虫对根的进食损害。rab5dsrna转基因代表了在昆虫抗性管理基因累加(或叠堆)中与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白技术相结合的新作用模式，以阻碍抗这些根虫控制技术中的任一种的根虫群体的发育。
使用叶甲属候选基因(本文称为rab5)的序列的全长或部分克隆来生成pcr扩增物以供dsrna合成。
seqidno:1显示了叶甲属rab5-1的3710bpdna序列。
seqidno:3显示了叶甲属rab5-2的1005bpdna序列。
seqidno:5显示了叶甲属rab5-3的544bpdna序列。
seqidno:7显示了rab5reg1的444bpdna序列。
seqidno:8显示了rab5reg2的491bpdna序列。
seqidno:9显示了rab5reg3的474bpdna序列。
seqidno:10显示了rab5v1的128bpdna序列。
实施例3
扩增靶标基因以产生dsrna
设计引物，以便通过pcr扩增每个靶标基因的编码区部分。参见表1。在适当情况下，将t7噬菌体启动子序列(ttaatacgactcactatagggaga；seqidno:11)掺入经扩增的有义链或反义链的5’端。参见表1。从wcr提取总rna，并使用第一链cdna作为pcr反应的模板，所述pcr反应采用反向定位的引物来扩增天然靶标基因序列的全部或部分。还从dna克隆扩增dsrna，该dna克隆包含黄色荧光蛋白(yfp)的编码区(seqidno:12；shagin等人，(2004)mol.biol.evol.21(5):841-50)。
表1.用来扩增示例性rab5靶标基因和yfp阴性对照基因的编码区部分的引物和引物对。
实施例4
rnai构建体
通过pcr制备模板以及dsrna合成。
图1中示出了用于提供特异性模板以产生rab5和yfpdsrna的策略。使用表1中的引物对，以及由分离自wcr第一龄幼虫的总rna制备的第一链cdna(作为pcr模板)，通过pcr制备了意图在rab5dsrna合成中使用的模板dna。对于每个选定的rab5和yfp靶标基因区，pcr扩增在经扩增的有义链和反义链的5’端导入了一个t7启动子序列(yfp区段扩增自yfp编码区的dna克隆)。在有义链和反义链的5'端具有t7启动子序列的pcr产物用作产生dsrna的转录模板。参见图1。用特定引物对扩增的dsrna模板的序列为：seqidno:7(rab5reg1)、seqidno:8(rab5reg2)、seqidno:9(rab5reg3)、seqidno:10(rab5v1)和yfp(seqidno:12)。使用
构建植物转化载体
使用化学合成片段(dna2.0，menlopark,ca)的组合以及标准分子克隆方法，组装了入门载体，该入门载体包含具有rab5的区段(seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5)的用于形成发夹的靶标基因构建体。通过(在单个转录单位内)以彼此相反的取向排布rab5靶标基因序列的两个拷贝来易化rna初级转录物形成分子内发夹，所述两个区段被一个接头多核苷酸(例如，环(诸如seqidno:116)和st-ls1内含子(vancanneyt等人，(1990)mol.gen.genet.220(2):245-50))分开。因此，初级mrna转录物含有被所述接头序列分开的两个rab5基因区段序列，这两个区段序列互为大的反向重复序列。使用启动子(例如，玉蜀黍泛素1，美国专利号5,510,474；来自花椰菜花叶病毒(camv)的35s；甘蔗杆状病毒(scbv)启动子；来自水稻肌动蛋白基因的启动子；泛素启动子、pemu、mas、玉蜀黍h3组蛋白启动子、als启动子、菜豆素基因启动子、cab、rubisco、lat52、zm13和/或apg)的拷贝来驱动初级mrna发夹转录物的产生，并用一个包含3’非翻译区(例如，玉蜀黍过氧化物酶5基因(zmper53'utrv2；美国专利6,699,984)、atubi10、atef1或stpinii)的片段来终止表达发夹rna的基因的转录。
在标准的
二元目的载体包含处于植物可操作启动子(例如，甘蔗杆状病毒(scbv)启动子(schenk等人，(1999)plantmol.biol.39:1221-30)或zmubi1(美国专利号5,510,474))的调控之下的除草剂耐受性基因(芳氧基链烷酸酯加双氧酶；aad-1v3)(美国专利7838733(b2)，以及wright等人，(2010)proc.natl.acad.sci.u.s.a.107:20240-5)。5'utr和接头定位在所述启动子区段的3’端与aad-1编码区的起始密码子之间。使用一个包含来自玉蜀黍脂肪酶基因的3’非翻译区(zmlip3'utr；美国专利号7,179,902)的片段来终止aad-1mrna的转录。
借助使用典型的二元目的载体与入门载体的标准
实施例5
筛选候选靶标基因
在基于食料的测定中，将设计为抑制实施例2中鉴定的靶标基因序列的合成dsrna施用于wcr时，引起了死亡和生长抑制。观察到rab5reg1和rab5v1在该测定中相比筛选的其他dsrna表现出大大增强的功效。
重复的生物测定证明，摄入来源于rab5reg1和rab5v1的dsrna制备物造成了西方玉米根虫幼虫的死亡和/或生长抑制。表2和表3示出了在wcr幼虫暴露于这些dsrna9天之后的基于食料的饲喂生物测定的结果，以及由黄色荧光蛋白(yfp)编码区(seqidno:12)制备的dsrna阴性对照样品获得的结果。
表2.利用西方玉米根虫幼虫进食9天之后获得的rab5dsrna食料饲喂测定的结果。anova分析发现了平均死亡率％和平均生长抑制(gi)％上的显著差异。使用tukey-kramer检验分离平均值。
*sem＝平均值标准误差括号中的字母指明统计水平。不是由同一字母连接的水平存在显著差异(p<0.05)。
**te＝trishcl(1mm)加edta(1mm)缓冲液，ph7.2。
***yfp＝黄色荧光蛋白
表3.rab5dsrna对wcr幼虫的口服效力(ng/cm2)汇总。
以前有人提出，某些叶甲属物种基因可用于rnai介导的昆虫控制。参见美国专利公布号2007/0124836(其公开了906个序列)和美国专利号7,612,194(其公开了9,112个序列)。然而，技术人员确定，许多被提出对rnai介导的昆虫控制有效用的基因并不能有效地控制叶甲属。技术人员还确定，与被提出对rnai介导的昆虫控制有效用的其他基因相比，序列rab5reg1和rab5v1各自提供了令人惊讶且意想不到的对叶甲属的出色控制。
例如，美国专利号7,612,194中提出，膜联蛋白、β血影蛋白2和mtrp-l4在rnai介导的昆虫控制中全都有效。seqidno:22为膜联蛋白区域1(reg1)的dna序列，而seqidno:23为膜联蛋白区域2(reg2)的dna序列。seqidno:24为β血影蛋白2区域1(reg1)的dna序列，而seqidno:25为β血影蛋白2区域2(reg2)的dna序列。seqidno:26为mtrp-l4区域1(reg1)的dna序列，而seqidno:27为mtrp-l4区域2(reg2)的dna序列。还使用yfp序列(seqidno:12)来产生作为阴性对照的dsrna。
使用前述序列中的每一个通过实施例3的方法来产生dsrna。图2中示出了用于提供特异性模板以产生dsrna的策略。使用表4中的引物对，以及由分离自wcr第一龄幼虫的总rna制备的第一链cdna(作为pcr模板)，通过pcr制备了意图在dsrna合成中使用的模板dna。(yfp从dna克隆扩增。)对于每个选择的靶标基因区，执行两次单独的pcr扩增。第一次pcr扩增在经扩增有义链的5’端导入t7启动子序列。第二次反应在反义链的5’端掺入t7启动子序列。然后将每个靶标基因区的两个经pcr扩增的片段以大致相等的量混合，并将混合物用作产生dsrna的转录模板。参见图2。使用
表4.用来扩增基因的编码区部分的引物和引物对。
表5.利用9天之后的西方玉米根虫幼虫获得的食料饲喂测定的结果。
*te＝trishcl(10mm)加edta(1mm)缓冲液，ph8。
**yfp＝黄色荧光蛋白
实施例6
产生包含杀虫发夹dsrna的转基因玉蜀黍组织
农杆菌介导的转化；在农杆菌介导的转化之后，制备了通过表达稳定地整合到植物基因组中的嵌合基因而产生一种或多种杀虫dsrna分子(例如，至少一种dsrna分子，包括靶向包含rab5-1(seqidno:1)、rab5-2(seqidno:3)、rab5-3(seqidno:5)、rab5reg1(seqidno:7)、rab5reg2(seqidno:8)、rab5reg3(seqidno:9)、rab5v1(seqidno:10)、bsb_rab5(seqidno:78)、bsb_rab5reg1(seqidno:80)或bsb_rab5v1(seqidno:81)的基因的dsrna分子)的转基因玉蜀黍细胞、组织和植物。采用超二元转化载体或二元转化载体的玉蜀黍转化方法是本领域已知的，如例如美国专利号8,304,604中所述，该专利全文以引用方式并入本文。根据在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力来选择经转化组织，并酌情筛选经转化组织来产生dsrna。可将一部分这样的经转化组织培养物提供给新生玉米根虫幼虫以执行生物测定，大体上如实施例1中所述。
农杆菌培养启动；将包含上述二元转化载体(实施例4)的农杆菌菌株dat13192细胞(wo2012/016222a2)的甘油储备液划线接种在含有适当抗生素的ab基本培养基平板(watson等人，(1975)j.bacteriol.123:255-264)上，并在20℃下生长3天。然后将培养物划线接种到含有相同抗生素的yep平板(酵母提取物，10g/l；蛋白胨，10g/l；nacl，5g/l)上，并在20℃下温育1天。
农杆菌培养；实验当天，以适合于实验中的构建体数目的体积制备接种培养基和乙酰丁香酮的储备液，并将其吸移到250ml一次性无菌烧瓶中。接种培养基(frame等人，(2011)genetictransformationusingmaizeimmaturezygoticembryos，载于plantembryoculturemethodsandprotocols:methodsinmolecularbiology。t.a.thorpe和e.c.yeung(编辑)，springerscienceandbusinessmedia,llc.，第327-341页)含有：2.2g/lms盐，1xisu改良的ms维生素(frame等人，出处同上)，68.4g/l蔗糖，36g/l葡萄糖，115mg/ll-脯氨酸，以及100mg/l肌醇；ph为5.4。将乙酰丁香酮从100％二甲基亚砜中的1m储备液添加到装有接种培养基的烧瓶中，达到200μm的最终浓度，并充分混合溶液。
对于每种构建体，将来自yep平板的1或2个满接种环的农杆菌悬浮在50ml一次性无菌离心管内的15ml接种培养基/乙酰丁香酮储备液中，然后在分光光度计中测量溶液在550nm处的光密度(od550)。然后使用额外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬浮液稀释到0.3至0.4的od550。然后将装有农杆菌悬浮液的管水平放置在平台摇床(设置在室温下，约75rpm)上，在进行胚切开的同时振摇1至4小时。
穗消毒和胚分离；从玉米近交系b104(hallauer等人，(1997)cropscience37:1405-1406)植物获得未成熟玉蜀黍胚，所述植物在温室中培养，并进行自花授粉或近缘授粉以产生穗。在授粉后大约10至12天收获穗。实验当天，将穗脱壳，通过浸没在市售漂白剂(ultra
农杆菌共培养；分离之后，将胚在摇动平台上放置5分钟。然后将管的内容物倾倒在共培养培养基的平板上，所述培养基含有4.33g/lms盐、1xisu改良的ms维生素、30g/l蔗糖、700mg/ll-脯氨酸、3.3mg/l麦草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)的koh溶液、100mg/l肌醇、100mg/l酪蛋白酶水解物、15mg/lagno3、200μm乙酰丁香酮的dmso溶液和3g/lgelzantm，ph为5.8。用一次性无菌移液管移除液态农杆菌悬浮液。然后借助显微镜，使用无菌镊子使胚取向为盾片面朝上。盖上平板，用3mtmmicroporetm医用胶带密封，然后放置在具有大约60μmolm-2s-1光合有效辐射(par)的连续光照的25℃培养箱中。
选择愈伤组织和再生转基因事件；在共培养期之后，将胚转移到静息培养基上，静息培养基的组成为：4.33g/lms盐、1xisu改良的ms维生素、30g/l蔗糖、700mg/ll-脯氨酸、3.3mg/l麦草畏的koh溶液、100mg/l肌醇、100mg/l酪蛋白酶水解物、15mg/lagno3、0.5g/lmes(2-(n-吗啉代)乙磺酸一水合物；phytotechnologieslabr.；lenexa,ks)、250mg/l羧苄青霉素和2.3g/lgelzantm，ph为5.8。将不超过36个胚移到每个平板上。将平板放置在透明的塑料盒中，在27℃和大约50μmolm-2s-1par的连续光照下温育7至10天。然后将愈伤的胚转移(<18个/板)到选择培养基i上，该培养基由具有100nmr-吡氟氯禾灵酸(0.0362mg/l；用于选择包含aad-1基因的愈伤组织)的静息培养基(如上文)组成。将平板放回透明盒中，在27℃和大约50μmolm-2s-1par的连续光照下温育7天。然后将愈伤的胚转移(<12个/板)到选择培养基ii上，该培养基由具有500nmr-吡氟氯禾灵酸(0.181mg/l)的静息培养基(如上文)组成。将平板返回到透明盒中，在27℃和大约50μmolm-2s-1par的连续光照下温育14天。这一选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。
将增殖中的胚性愈伤组织转移(<9个/板)到预再生培养基上。预再生培养基含有4.33g/lms盐、1xisu改良的ms维生素、45g/l蔗糖、350mg/ll-脯氨酸、100mg/l肌醇、50mg/l酪蛋白酶水解物、1.0mg/lagno3、0.25g/lmes、0.5mg/l萘乙酸的naoh溶液、2.5mg/l脱落酸的乙醇溶液、1mg/l6-苄基氨基嘌呤、250mg/l羧苄青霉素、2.5g/lgelzantm和0.181mg/l吡氟氯禾灵酸，ph为5.8。将平板保存在透明盒中，在27℃和大约50μmolm-2s-1par的连续光照下温育7天。然后将再生中的愈伤组织转移(<6个/板)到phytatraystm(sigma-aldrich)中的再生培养基上，在28℃下以每天16小时光照/8小时黑暗(大约160μmolm-2s-1par)温育14天，或直到发出芽和根为止。再生培养基含有4.33g/lms盐、1xisu改良的ms维生素、60g/l蔗糖、100mg/l肌醇、125mg/l羧苄青霉素、3g/lgellantm胶和0.181mg/lr-吡氟氯禾灵酸，ph为5.8。然后分离具有初生根的小芽，不经选择直接转移到伸长培养基上。伸长培养基含有4.33g/lms盐、1xisu改良的ms维生素、30g/l蔗糖和3.5g/lgelritetm，ph为5.8。
根据在含有吡氟氯禾灵的培养基上生长的能力来选择经转化的植物芽，将这些芽从phytatraystm移栽到填充生长培养基(promixbx；premiertechhorticulture)的小盆中，小盆用杯子或humi-domes(arcoplastics)覆盖，然后在conviron生长室中炼苗(白天27℃/夜晚24℃，16小时光周期，50-70％rh，200μmolm-2s-1par)。在一些情况下，分析推定的转基因小植物的转基因相对拷贝数，这使用被设计为检测整合到玉蜀黍基因组中的aad1除草剂耐受性基因的引物通过定量实时pcr测定来完成。另外，利用qpcr测定来检测推定的转化体中是否存在接头序列和/或靶标序列。然后将选择的经转化小植物移到温室中，以便进一步生长和测试。
转移t0植物并在温室中定植，以进行生物测定和产生种子；当植物达到v3-v4期时，将其移栽到iecustomblend(profile/metromix160)土壤混合物中，在温室中(光暴露类型：光合或同化；高光限值：1200par；16小时昼长；白天27℃/夜晚24℃)培植到开花。
将要用于昆虫生物测定的植物从小盆移栽到tinustm350-4
通过对t0转基因植物的穗丝授粉(其中花粉从非转基因优良近交系b104植物或其他适当的花粉供体采集而来)并种植所得的种子而获得t1世代植物。在可能时执行互交。
实施例7
转基因玉蜀黍组织的分子分析
对在评估噬根性损害同天从温室培植的植物采集的叶的样品执行了玉蜀黍组织的分子分析(例如rt-qpcr)。
使用感兴趣的基因的rt-qpcr测定的结果来验证转基因的表达。可以使用所表达的rna中的接头序列(为形成dsrna发夹分子必不可少的)的rt-qpcr测定结果来验证是否存在发夹转录物。测量了相对于内源性玉蜀黍基因的rna水平的转基因rna表达水平。
通过dnaqpcr分析检测基因组dna中aad1编码区的一部分，用来估计转基因插入拷贝数。从培植在环境室中的植物采集样品用于这些分析。将结果与被设计为检测单拷贝天然基因的一部分的测定法的dnaqpcr结果进行比较，并且将简单事件(具有rab5转基因的一个或两个拷贝)推进到温室中的进一步研究。
此外，使用被设计为检测壮观霉素抗性基因(specr；包含在t-dna外部的二元载体质粒上)的一部分的qpcr测定来确定转基因植物是否含有外来的整合质粒主干序列。
发夹rna转录物表达水平：靶向qpcr；通过靶标序列的实时定量pcr(qpcr)来分析愈伤组织细胞事件或转基因植物以确定全长发夹转录物的相对表达水平，与内部玉蜀黍基因(seqidno:56，genbank登录号bt069734)的转录物水平比较，所述内部玉蜀黍基因编码tip41样蛋白(即，genbank登录号at4g34270的玉蜀黍同源物；tblastx得分为74％同一性)。使用norgenbiotek总rna分离试剂盒(norgen,thorold,on)分离rna。按照试剂盒建议的方案对总rna进行柱上dnasei(sigma-aldrich)处理。然后在nanodrop8000分光光度计(thermoscientific)上对rna定量，并将浓度归一化为50ng/μl。基本上按照制造商推荐的方案，使用高容量cdna合成试剂盒(invitrogen)制备第一链cdna，反应体积为10μl，含有5μl变性rna。略微修改该方案，包括将10μl的100μmt20vn寡核苷酸(idt)(seqidno:57；ttttttttttttttttttttvn，其中v为a、c或g，而n为a、c、g或t/u)添加到随机引物储备混合物的1ml管中，以制备随机引物和寡dt混合的工作储备液。
在cdna合成后，用无核酸酶的水将样品以1:3稀释，并储存在-20℃直到测定时为止。
在lightcyclertm480(rochediagnostics,indianapolis,in)上以10μl反应体积分别执行对靶标基因和tip41样转录物的实时pcr测定。对于靶标基因测定，利用引物rab5(f)(seqidno:58)和rab5(r)(seqidno:59)，以及idt定制寡核苷酸探针rab5prbset1(用fam标记，并用zen和iowablack淬灭剂予以双重淬灭)(seqidno:21)进行反应。对于tip41样参考基因测定，使用引物tipmxf(seqidno:60)和tipmxr(seqidno:61)，以及用hex(六氯荧光素)标记的探针hxtip(seqidno:62)。
所有测定都包括没有模板的阴性对照(仅有混合物)。为绘制标准曲线，在源板中还包括空白(源孔中加水)，以检查样品交叉污染。引物和探针的序列在表6中示出。用于检测各种转录物的反应组分配方在表7中公开，pcr反应条件汇总于表8中。在465nm处激发fam(6-羧基荧光素亚磷酰胺)荧光部分，并测量510nm处的荧光；hex(六氯荧光素)荧光部分的对应值为533nm和580nm。
表6.用于转基因玉蜀黍中转录物水平的分子分析的寡核苷酸序列。
*tip41样蛋白。
表7.用于检测转录物的pcr反应配方。
表8.用于rnaqpcr的热循环仪条件。
使用lightcyclertm软件v1.5，根据供应商的推荐利用二阶导数最大算法计算cq值，通过相对定量分析数据。对于表达分析，使用δδct方法(即2-(cqtarget–cqref))计算表达值，该方法依赖于比较两个靶标之间的cq值的差异，其中假定对于优化的pcr反应，每个循环产物都加倍，基值选择为2。
发夹转录物大小和完整性：northern印迹测定；在一些情况下，使用northern印迹(rna印迹)分析来确定在表达rab5dsrna的转基因植物中rab5发夹dsrna的分子大小，从而获得转基因植物的额外的分子表征。
所有的材料和设备在使用之前用rnazap(ambion/invitrogen)处理。将组织样品(100mg至500mg)采集到2mlsafelockeppendorf管中，用配备三颗钨珠的kleckotm组织粉碎器(garciamanufacturing,visalia,ca)在1mltrizol(invitrogen)中破碎5分钟，然后在室温(rt)下温育10分钟。任选地，将样品在4℃下以11,000rpm离心10分钟，然后将上清液转移到新鲜的2mlsafelockeppendorf管中。在将200μl氯仿添加到匀浆中之后，通过翻转该管2至5分钟进行混合，在rt下温育10分钟，然后在4℃下以12,000xg离心15分钟。将上层相转移到无菌的1.5mleppendorf管中，添加600μl的100％异丙醇，在rt下温育10分钟至2小时之后，在4℃至25℃下以12,000xg离心10分钟。弃去上清液，用1ml的70％乙醇将rna沉淀洗涤两次，在两次洗涤之间，在4℃至25℃下以7,500xg离心10分钟。弃去乙醇，将沉淀短暂风干3至5分钟，然后重悬在50μl无核酸酶的水中。
使用
电泳之后，在2xssc中将凝胶漂洗5分钟，然后在geldoc工作站(biorad,hercules,ca)上成像，接着在rt下过夜，使rna被动地转移到尼龙膜(millipore)上，其中使用10xssc作为转移缓冲液(由3m氯化钠和300m梓檬酸三钠组成的20xssc，ph7.0)。转移后，在2xssc中将膜漂洗5分钟，利用紫外线使rna与膜交联(agilent/stratagene)，然后使膜在rt下干燥最多2天。
使膜在ultrahyb缓冲液(ambion/invitrogen)中预杂交1至2小时。探针由含有感兴趣序列的pcr扩增产物组成，其借助rocheappliedsciencedig程序用地高辛配基标记。在杂交管中推荐的缓冲液中，于60℃的温度下杂交过夜。杂交后，对印迹进行dig洗涤，包装，暴露于胶片1至30分钟，然后将胶片显影，所有这些操作都通过dig试剂盒的供应商所推荐的方法来进行。
确定转基因拷贝数；
将大约等同于2个叶冲孔块(punch)的玉蜀黍叶片收集在96孔的收集平板(qiagen)中。用配备一颗不锈钢珠的kleckotm组织粉碎器(garciamanufacturing,visalia,ca)在biosprint96ap1裂解缓冲液(与biosprint96plantkit一起提供；qiagen)中进行组织破碎。组织浸软之后，使用biosprint96植物试剂盒和biosprint96提取机器人以高通量形式分离基因组dna(gdna)。在设立qpcr反应之前，以1:3的dna:水稀释基因组dna。
qpcr分析；通过使用
使用拟合点算法(
表9.用于确定基因拷贝数和检测二元载体质粒主干的引物和探针(具有荧光缀合物)的序列。
cy5＝青色素-5
表10.用于分析基因拷贝数和检测质粒主干的反应组分。
*na＝不适用
**nd＝未确定
表11.用于dnaqpcr的热循环仪条件
实施例8
转基因玉蜀黍的生物测定
体外昆虫生物测定；通过生物测定方法来证实在植物细胞中产生的本公开的dsrna的生物活性。参见例如baum等人，(2007)nat.biotechnol.25(11):1322-1326。技术人员能够例如通过在受控的饲喂环境下给靶标昆虫喂食来源于产生杀虫dsrna的植物的各种植物组织或组织片来证实效力。作为替代，由来源于产生杀虫dsrna的植物的各种植物组织制备提取物，并将提取的核酸分配在用于如本文之前描述的生物测定的人工食料上面。将这样的饲喂测定的结果与类似进行的采用来自不产生杀虫dsrna的宿主植物的适当对照组织、或其他对照样品的生物测定进行比较。
使用转基因玉蜀黍事件的昆虫生物测定；选择从经洗涤的卵孵化的两条西方玉米根虫幼虫(1至3日龄)，并将其置于生物测定托盘的每个孔中。然后将这些孔用“拉-揭”(pulln’peel)护盖(bio-cv-16,bio-serv)覆盖，并置于具有18小时/6小时的光照/黑暗周期的28℃培养箱中。在初始侵染九天之后，评估幼虫死亡率，其按照每个处理中死亡昆虫在昆虫总数中所占的百分比来计算。将昆虫样品在-20℃冷冻两天，然后汇集来自每个处理的昆虫幼虫并称重。生长抑制百分比按照实验处理的平均重量除以两个对照孔处理的平均重量的均值来计算。数据表示为(阴性对照的)生长抑制百分比。将超过对照平均重量的平均重量归一化为零。
温室中的昆虫生物测定；从cropcharacteristics(farmington,mn)收到带有西方玉米根虫(wcr，玉米根萤叶甲)卵的土壤。在28℃下温育wcr卵10至11天。洗掉卵上的土壤，将卵置于0.15％琼脂溶液中，把浓度调节至每0.25ml等份大约75至100个卵。将一份卵悬浮液加入培养皿中以设置孵化平板，用于监测孵化速率。
用150至200个wcr卵侵染
转基因阴性对照植物通过用包含被设计为产生黄色荧光蛋白(yfp)的基因的载体转化而生成。进行生物测定，其中每一组植物材料中均包括阴性对照。一些构建体提供了对根防止wcr的保护(表12)。
表12.表达rab5的玉蜀黍植物和yfp对照植物的温室生物测定和分子分析结果。
实施例9
包含鞘翅目害虫序列的转基因玉米
如实施例6中所述生成10至20株转基因t0玉米植物。获得另外的10至20个表达rnai构建体的发夹dsrna的t1玉米独立品系用于玉米根虫攻击。可衍生出包含seqidno:1、seqidno:3和seqidno:5的全部或一部分的发夹dsrna。额外的发夹dsrna可来源于例如鞘翅目害虫序列，诸如caf1-180(美国专利申请公布号2012/0174258)、vatpasec(美国专利申请公布号2012/0174259)、rho1(美国专利申请公布号2012/0174260)、vatpaseh(美国专利申请公布号2012/0198586)、ppi-87b(美国专利申请公布号2013/0091600)、rpa70(美国专利申请公布号2013/0091601)、rps6(美国专利申请公布号2013/0097730)、rop(美国专利申请号14/577,811)、rna聚合酶ii140(美国专利申请号14/577,854)、rna聚合酶i1(美国专利申请号62/133,214)、rna聚合酶ii-215(美国专利申请号62/133,202)、rna聚合酶33(美国专利申请号62/133,210)、ncm(美国专利申请号62/095487)、dre4(美国专利申请号14/705,807)、copiα(美国专利申请号62/063,199)、copiβ(美国专利申请号62/063,203)、copiγ(美国专利申请号62/063,192)或copiδ(美国专利申请号62/063,216)。这些通过rt-pcr或其他分子分析方法得到确认。来自选择的独立t1品系的总rna制备物任选地用于rt-pcr，其中引物被设计为在每个rnai构建体中的发夹表达盒的接头中结合。另外，用于rnai构建体中每个靶标基因的特异性引物任选地用于扩增在植物内产生sirna所需要的预加工mrna，并用于确认产生了所述预加工的mrna。对于每个靶标基因的期望条带的扩增确认每个转基因玉米植物中表达了发夹rna。随后任选地利用rna印迹杂交在独立的转基因品系中确认靶标基因的dsrna发夹加工成了sirna。
另外，具有与靶标基因存在80％以上序列同一性的错配序列的rnai分子影响玉米根虫的方式类似于使用与靶标基因具有100％序列同一性的rnai分子时所见的方式。错配序列与天然序列的配对在同一个rnai构建体中形成发夹dsrna，由此递送能够影响进食中的鞘翅目害虫的生长、发育和生存力的经植物加工的sirna。
在植物内递送对应于靶标基因的dsrna、sirna或mirna，随后被鞘翅目害虫通过进食而摄取，造成鞘翅目害虫中的靶标基因由于rna介导的基因沉默而下调。当靶标基因在发育的一个或多个阶段发挥重要作用时，鞘翅目害虫的生长、发育和繁殖受到影响，并且就wcr、ncr、scr、mcr、黄瓜条根萤叶甲、黄瓜十一星叶甲和d.u.undecimpunctatamannerheim中的至少一者而言，造成鞘翅目害虫无法成功地侵染、进食、发育和/或繁殖，或造成鞘翅目害虫死亡。然后通过选择靶标基因和成功应用rnai来控制鞘翅目害虫。
转基因rnai品系和非转化大豆的表型比较；选择用于创建发夹dsrna的靶标鞘翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列都没有相似性。因此，预期由靶向这些鞘翅目害虫基因或序列的构建体产生或活化(系统性)rnai不会对转基因植物产生任何有害影响。然而，将转基因品系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的“空”载体转化的那些转基因品系进行比较。比较了植物的根、芽、叶和生殖特征。记录植物的芽特征，诸如高度、叶片数和大小、开花时间、花的大小和外观。一般说来，当在体外和在温室土壤中培养时，在转基因品系和未表达靶标irna分子的那些品系之间没有可观察到的形态差异。
实施例10
包含鞘翅目害虫序列和额外的rnai构建体的转基因玉米
转基因玉米植物在其基因组中包含异源性编码序列，该异源性编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物体的irna分子，对这样的转基因玉米植物经由农杆菌或whiskerstm方法(参见petolino和arnold，(2009)methodsmol.biol.526:59-67)进行二次转化，以产生一种或多种杀虫dsrna分子(例如，至少一种dsrna分子，包括靶向包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的基因的dsrna分子)。大体上如实施例4中所述制备植物转化质粒载体，经由农杆菌或whiskerstm介导的转化方法递送到获自转基因hiii或b104玉米植物的玉蜀黍悬浮细胞或未成熟玉蜀黍胚中，所述玉米植物在其基因组中包含异源性编码序列，所述异源性编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫之外的生物体的irna分子。
实施例11
包含rnai构建体和额外的鞘翅目害虫控制序列的转基因玉米
转基因玉米植物在其基因组中包含被转录成靶向鞘翅目害虫生物体的irna分子的异源性编码序列(例如，至少一种dsrna分子，包括靶向包含seqidno:1、seqidno:3或seqidno:5的基因的dsrna分子)，对这样的转基因玉米植物经由农杆菌或whiskerstm方法(参见petolino和arnold，(2009)methodsmol.biol.526:59-67)进行二次转化，以产生一种或多种杀虫蛋白分子，例如cry3或cry34/cry35ab1杀虫蛋白。大体上如实施例4中所述制备植物转化质粒载体，经由农杆菌或whiskerstm介导的转化方法递送到获自转基因b104玉米植物的玉蜀黍悬浮细胞或未成熟玉蜀黍胚中，所述玉米植物在其基因组中包含异源性编码序列，所述异源性编码序列被转录成靶向鞘翅目害虫生物体的irna分子。获得产生用于控制鞘翅目害虫的irna分子和杀虫蛋白的双重转化植物。
实施例12
新热带区棕椿象(英雄美洲蝽)在注射rab5rnai后的死亡率
新热带区棕椿象(bsb；英雄美洲蝽)集落；bsb在27℃的培养箱中，在65％相对湿度和16小时:8小时的光照:黑暗周期下饲养。将历经2至3天收集的1克卵接种在底部有滤纸盘的5l容器中，用18目网覆盖容器以便通风。每个饲养容器产生约300至400条bsb成虫。在所有阶段，每周向昆虫饲喂新鲜青豆三次，每周更换一次装有向日葵种子、大豆和花生(重量比3:1:1)的种子混合物的小袋。在小瓶中补充水，用棉塞作为捻子。在最初的两周后，每周一次将昆虫转移到新的容器上。
bsb人工食料；bsb人工食料如下制备(在制备后两周内使用)。在magic
bsb转录组的组装；选择六个bsb发育期用于制备mrna文库。从冷冻在-70℃的昆虫提取总rna，然后将其置于
bsbrab5直系同源物鉴定；使用查询序列果蝇属rab5蛋白同种型a至i序列执行bsb汇集的转录组的tblastn搜索：genbank登录号np_722795、np_722796、np_722797、np_722798、np_523457、np_722799、np_001259925、np_001259926和np_001259927。bsbrab5(seqidno:78)被鉴定为英雄美洲蝽候选靶标基因产物，其具有预测的肽序列seqidno:79。
模板制备和dsrna合成；使用
cdna扩增；使用针对rt-pcr的superscriptiiifirst-strandsynthesissystemtm(invitrogen)，遵循供应商的推荐方案，从5μg的bsb总rna模板和寡dt引物反转录出cdna。用无核酸酶的水将转录反应的最终体积调节为100μl。
将引物bsb_rab5-1-for(seqidno:82)和bsb_rab5-1-rev(seqidno:83)用于扩增bsb_rab5区域1，也称为bsb_rab5reg1模板。将引物bsb_rab5-v1-for(seqidno:84)和bsb_rab5-v1-rev(seqidno:85)用于扩增bsb_rab5版本1，也称为bsb_rab5v1模板。以1μlcdna(如上文)作为模板，通过触地(touch-down)pcr(退火温度从60℃降至50℃，以1℃/循环降低)扩增dna模板。在35个pcr循环期间生成了包含bsb_rab5reg1(seqidno:80)的283bp区段和bsb_rab5v1(seqidno:81)的121bp区段的片段。还使用上述程序，利用yfpv2-f(seqidno:88)和yfpv2-r(seqidno:86)引物来扩增301bp阴性对照模板yfpv2(seqidno:87)。bsb_rab5和yfpv2引物在其11’端含有t7噬菌体启动子序列(seqidno:5)，因此使得yfpv2和bsb_rab5dna片段能够用于dsrna转录。
dsrna合成；利用megascripttmrnai试剂盒(ambion)，根据制造商的说明，使用2μlpcr产物(如上文)作为模板来合成dsrna。(参见图1)。在nanodroptm8000分光光度计上将dsrna定量，并在无核酸酶的0.1xte缓冲液(1mmtrishcl，0.1mmedta，ph7.4)中稀释到500ng/μl。
注射dsrna到bsb血腔中；bsb在27℃的培养箱中，在65％相对湿度和16小时:8小时的光照:黑暗光周期下，以集落形式饲养在青豆和种子食料上。用小刷子轻轻操作第二龄若虫(每只重1至1.5mg)以防损伤，并将它们置于冰上的培养皿中，以使昆虫感到寒冷从而固定不动。给每只昆虫注射55.2nl的500ng/μldsrna溶液(即，27.6ngdsrna；18.4至27.6μg/g体重的剂量)。使用配备有由drummond3.5英寸#3-000-203-g/x玻璃毛细管拉制而成的注射针的nanojecttmii注射器(drummondscientific,broomhall,pa)进行注射。把针尖打破，用轻矿物油装填毛细管，然后填充2至3μl的dsrna。将dsrna注射到若虫的腹部中(每次试验每份dsrna注射10只昆虫)，在不同的三天重复试验。将经注射的昆虫(每孔5只)转移到装有人工bsb食料小丸并覆盖有pull-n-peeltm盖片(bio-cv-4；bio-serv)的32孔托盘(bio-rt-32饲养托盘(bio-rt-32rearingtray)；bio-serv，frenchtown,nj)中。借助带棉捻子且装有1.25ml水的1.5ml微量离心管提供水分。将这些托盘在26.5℃、60％湿度和16小时:8小时的光照:黑暗光周期下温育。在注射7天之后，获取生存力计数和重量。
将bsbrab5确定为致死dsrna靶标的注射；将靶向yfp编码区的区段yfpv2的dsrna用作bsb注射实验中的阴性对照。如表13中所汇总，将27.6ngbsb_rab5reg1dsrna注射到第二龄bsb若虫的血腔中在七天内产生了高死亡率。bsb_rab5reg1dsrna导致的死亡率明显不同于相同量的注射yfpv2dsrna(阴性对照)所见的死亡率，p＝0.00263(学生t检验)。
表13bsb_rab5reg1dsrna注射到第二龄棕椿象若虫的血腔中七天之
后的结果。
*每种dsrna每次试验注射10只昆虫。
实施例13
包含半翅目害虫序列的转基因玉米
如实施例7中所述，生成10至20株包含核酸的表达载体的转基因t0玉米植物，所述核酸包含seqidno:78、seqidno:80和/或seqidno:81。获得另外的10至20个表达rnai构建体的发夹dsrna的t1玉米独立品系用于bsb攻击。发夹dsrna可以如seqidno:80、seqidno:81所示或另外进一步包含seqidno:78而衍生。这些通过rt-pcr或其他分子分析方法得到确认。来自选择的独立t1品系的总rna制备物任选地用于rt-pcr，其中引物被设计为在每个rnai构建体中的发夹表达盒的接头中结合。另外，用于rnai构建体中每个靶标基因的特异性引物任选地用于扩增在植物内产生sirna所需要的预加工mrna，并用于确认产生了所述预加工的mrna。对于每个靶标基因的期望条带的扩增确认每个转基因玉米植物中表达了发夹rna。随后任选地利用rna印迹杂交在独立的转基因品系中确认靶标基因的dsrna发夹加工成了sirna。
另外，具有与靶标基因存在80％以上序列同一性的错配序列的rnai分子影响玉米根虫的方式类似于使用与靶标基因具有100％序列同一性的rnai分子时所见的方式。错配序列与天然序列的配对在同一个rnai构建体中形成发夹dsrna，由此递送能够影响进食中的半翅目害虫的生长、发育和生存力的经植物加工的sirna。
在植物内递送对应于靶标基因的dsrna、sirna、shrna或mirna，随后被半翅目害虫通过进食而摄取，造成半翅目害虫中的靶标基因由于rna介导的基因沉默而下调。当靶标基因的功能在发育的一个或多个阶段具有重要意义时，半翅目害虫的生长、发育和繁殖受到影响，并且在英雄美洲蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、稻绿蝽、喜绿蝽和褐美洲蝽中至少一者的情况下，导致不能成功侵染、进食、发育和/或繁殖，或导致半翅目害虫死亡。然后通过选择靶标基因和成功应用rnai来控制半翅目害虫。
转基因rnai品系和非转化大豆的表型比较；选择用于创建发夹dsrna的靶标半翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列都没有相似性。因此，预期由靶向这些半翅目害虫基因或序列的构建体产生或活化(系统性)rnai不会对转基因植物产生任何有害影响。然而，将转基因品系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的“空”载体转化的那些转基因品系进行比较。比较了植物的根、芽、叶和生殖特征。转基因植物和非转化植物在根长度和生长模式上没有可观察到的差异。植物的芽特征诸如高度、叶片数和大小、开花时间、花的大小和外观是相似的。一般说来，当在体外和在温室土壤中培养时，在转基因品系和未表达靶标irna分子的那些品系之间没有可观察到的形态差异。
实施例14
包含半翅目害虫序列的转基因大豆
生成10至20株包含核酸的表达载体的转基因t0大豆植物，所述核酸包含seqidno:78、seqidno:80和/或seqidno:81，所述植物按照本领域已知的方式生成，包括例如通过如下所述的农杆菌介导的转化。用氯气将成熟大豆(glycinemax)种子消毒十六小时过夜。用氯气消毒之后，将种子置于laminartm层流罩内的开放容器中以驱散氯气。接着，使用黑盒，在黑暗中24℃下使消过毒的种子吸收无菌h2o十六小时。
制备分割种子大豆；包含部分胚轴的大豆种子的分割方案需要制备纵向切开的大豆种子材料，纵向切开使用附连在解剖刀上的10号刀片，沿种子的种脐分离并除去种皮，然后把种子分割为两个子叶部分。小心地移除部分胚轴，其中约1/2–1/3的胚轴保持附着于子叶的节端。
接种；然后将包含部分胚轴的分割大豆种子置于根癌农杆菌(例如，菌株eha101或eha105)的溶液中浸没约30分钟，所述根癌农杆菌携带包含seqidno:78、seqidno:80和/或seqidno:81。在浸入带胚轴的子叶之前，将根癌农杆菌溶液稀释到λ＝0.6od650的最终浓度。
共培养；接种后，让分割的大豆种子与根癌农杆菌菌株在共培养培养基(wang,kan.agrobacteriumprotocols.2.1.newjersey:humanapress,2006.print.)上共培养5天，共培养培养基置于培养皿中，培养皿用一片滤纸覆盖。
芽诱导；在共培养5天之后，将分割的大豆种子置于由b5盐、b5维生素、28mg/l二价铁、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖、0.6g/lmes、1.11mg/lbap、100mg/ltimentintm、200mg/l头孢噻肟和50mg/l万古霉素组成的液体芽诱导(si)培养基(ph5.7)中洗涤。然后将分割的大豆种子置于由b5盐、b5维生素、7g/l诺布尔琼脂、28mg/l二价铁、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖、0.6g/lmes、1.11mg/lbap、50mg/ltimentintm、200mg/l头孢噻肟、50mg/l万古霉素组成的芽诱导i(sii)培养基(ph5.7)上培养，其中子叶的平坦一侧面朝上，而子叶的节端埋入培养基中。在培养2周之后，将来自经转化的分割大豆种子的外植体转移到芽诱导ii(siii)培养基中，该培养基含有补充了6mg/l草铵膦
芽伸长；在siii培养基上培养2周之后，将子叶从外植体去除，通过在子叶的基部切口而切下含有胚轴的齐平的芽垫。将分离自子叶的芽垫转移到芽伸长(se)培养基上。该se培养基由ms盐、28mg/l二价铁、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖和0.6g/lmes、50mg/l天冬酰胺、100mg/ll-焦谷氨酸、0.1mg/liaa、0.5mg/lga3、1mg/l玉米素核苷、50mg/ltimentintm、200mg/l头孢噻肟、50mg/l万古霉素、6mg/l草铵膦、7g/l诺布尔琼脂组成，ph为5.7。每2周将培养物转移到新鲜的se培养基上。培养物在convirontm生长室中在24℃下生长，使用18h光周期，光强度为80至90μmol/m2s。
生根；从子叶芽垫发出的伸长芽，通过在子叶芽垫基部切割伸长芽加以分离，并将伸长芽浸入1mg/liba(吲哚3-丁酸)中1至3分钟以促进生根。接着，将伸长芽转移到phyta托盘中的生根培养基(ms盐、b5维生素、28mg/l二价铁、38mg/lna2edta、20g/l蔗糖和0.59g/lmes、50mg/l天冬酰胺、100mg/ll-焦谷氨酸、7g/l诺布尔琼脂，ph5.6)中。
培养；在convirontm生长室中，在24℃和18小时光周期下培养1至2周后，将已生根的芽转移到带盖的圣代杯内的土壤混合物中，放到convirontm生长室(cmp4030和cmp3244型，controlledenvironmentslimited,winnipeg,manitoba,canada)内，置于长日照条件下(16小时光照/8小时黑暗)，光强度为120-150μmol/m2s，温度(22℃)和湿度(40-50％)恒定，以驯化小植物。生根的小植物在圣代杯中驯化数周之后，转移到温室中以便进一步驯化并定植健壮的转基因大豆植物。
获得另外的10至20个表达rnai构建体的发夹dsrna的t1大豆独立品系用于bsb攻击。发夹dsrna可以如seqidno:80、seqidno:81所示或另外进一步包含seqidno:78而衍生。这些通过rt-pcr或其他分子分析方法得到确认。来自选择的独立t1品系的总rna制备物任选地用于rt-pcr，其中引物被设计为在每个rnai构建体中的发夹表达盒的接头中结合。另外，用于rnai构建体中每个靶标基因的特异性引物任选地用于扩增在植物内产生sirna所需要的预加工mrna，并用于确认产生了所述预加工的mrna。对于每个靶标基因的期望条带的扩增确认每个转基因大豆植物中表达了发夹rna。随后任选地利用rna印迹杂交在独立的转基因品系中确认靶标基因的dsrna发夹加工成了sirna。
另外，具有与靶标基因存在80％以上序列同一性的错配序列的rnai分子影响玉米根虫的方式类似于使用与靶标基因具有100％序列同一性的rnai分子时所见的方式。错配序列与天然序列的配对在同一个rnai构建体中形成发夹dsrna，由此递送能够影响进食中的半翅目害虫的生长、发育和生存力的经植物加工的sirna。
在植物内递送对应于靶标基因的dsrna、sirna、shrna或mirna，随后被半翅目害虫通过进食而摄取，造成半翅目害虫中的靶标基因由于rna介导的基因沉默而下调。当靶标基因的功能在发育的一个或多个阶段具有重要意义时，半翅目害虫的生长、发育和繁殖受到影响，并且在英雄美洲蝽、盖德拟壁蝽、茶翅蝽、稻绿蝽、喜绿蝽和褐美洲蝽中至少一者的情况下，导致不能成功侵染、进食、发育和/或繁殖，或导致半翅目害虫死亡。然后通过选择靶标基因和成功应用rnai来控制半翅目害虫。
转基因rnai品系和非转化大豆的表型比较。选择用于创建发夹dsrna的靶标半翅目害虫基因或序列与任何已知的植物基因序列都没有相似性。因此，预期由靶向这些半翅目害虫基因或序列的构建体产生或活化(系统性)rnai不会对转基因植物产生任何有害影响。然而，将转基因品系的发育和形态特征与非转化植物、以及用没有发夹表达基因的“空”载体转化的那些转基因品系进行比较。比较了植物的根、芽、叶和生殖特征。转基因植物和非转化植物在根长度和生长模式上没有可观察到的差异。植物的芽特征诸如高度、叶片数和大小、开花时间、花的大小和外观是相似的。一般说来，当在体外和在温室土壤中培养时，在转基因品系和未表达靶标irna分子的那些品系之间没有可观察到的形态差异。
实施例15
以人工食料为食的英雄美洲蝽的生物测定
在使用人工食料的dsrna饲喂测定中，与注射实验(实施例12)相同，设置具有一颗约18mg的人工食料小丸和水的32孔托盘。将浓度为200ng/μl的dsrna添加到食物小丸和水样品中，向两个孔中的每一个添加100μl。向每个孔中加入5只第二龄的英雄美洲蝽若虫。将水样品和靶向yfp转录物的dsrna用作阴性对照。在三个不同的日期重复实验。对存活昆虫称重，并在处理8天后测定死亡率。
实施例16
包含半翅目害虫序列的转基因拟南芥(arabidopsisthaliana)
使用与实施例4相似的标准分子方法生成含有用于形成发夹的靶标基因构建体的拟南芥属(arabidopsis)转化载体，该靶标基因构建体包含rab5的区段(seqidno:78)。使用标准的基于农杆菌的方法执行拟南芥属转化。用草铵膦耐受性可选择标记来选择t1种子。生成转基因t1拟南芥属植物，并生成纯合的单拷贝t2转基因植物用于昆虫研究。对具有花序的生长中的拟南芥属植物执行生物测定。取五至十只昆虫放置在每株植物上，并在14天内监测存活情况。
构建拟南芥属转化载体；使用化学合成片段(dna2.0，menlopark，ca)的组合，以及标准的分子克隆方法，组装基于入门载体的入门克隆，这些入门克隆含有用于形成发夹的靶标基因构建体，该靶标基因构建体包含rab5的区段(seqidno:78)。通过(在单个转录单位内)以相反的取向排布靶标基因区段的两个拷贝来易化rna初级转录物形成分子内发夹，所述两个区段被一个接头序列(例如环(诸如seqidno:116)或st-ls1内含子序列(vancanneyt等人(1990)mol.gen.genet.220(2):245-50)分开。因此，初级mrna转录物含有被所述接头序列分开的两个rab5基因区段序列，这两个区段序列互为大的反向重复序列。使用拟南芥泛素10启动子(callis等人，(1990)j.biologicalchem.265:12486-12493)的拷贝来驱动初级mrna发夹转录物的产生，并使用包含来自根癌农杆菌开放阅读框23的3’非翻译区(atuorf233'utrv1；美国专利号5,428,147)的片段来终止表达发夹rna的基因的转录。
将上述入门载体内的发夹克隆用于标准的
二元目的载体包含在木薯叶脉花叶病毒启动子(csvmv启动子v2，美国专利号7,601,885；verdaguer等人，(1996)plantmolecularbiology,31:1129-1139)调控下的除草剂耐受性基因dsm-2v2(美国专利公布号2011/0107455)。使用包含来自根癌农杆菌开放阅读框1的3’非翻译区(atuorf13'utrv6；huang等人，(1990)j.bacteriol.172:1814-1822)的片段来终止dsm2v2mrna的转录。
借助使用典型的二元目的载体与入门载体的标准
产生包含杀虫发夹rna的转基因拟南芥属：农杆菌介导的转化；将含有发夹序列的二元质粒电穿孔到农杆菌菌株gv3101(pmp90rk)中。通过对重组农杆菌菌落的质粒制备物的限制性分析确认重组农杆菌克隆。使用qiagen质粒大提试剂盒(plasmidmaxkit)(qiagen，目录号12162)，遵循制造商推荐的方案从农杆菌培养物提取质粒。
拟南芥属转化和t1选择；取12至15株拟南芥属植物(columbia栽培变种)在温室中的4英寸盆中生长，温室中的光强度为250μmol/m2，温度为25℃，采用18小时:6小时的光照:黑暗条件。转化前一周修剪主花茎。通过将10μl重组农杆菌甘油储备液置于以225rpm振荡的28℃下的100mllb肉汤(sigmal3022)+100mg/l壮观霉素+50mg/l卡那霉素中温育72小时来制备农杆菌接种物。收获农杆菌细胞，将其悬浮于5％蔗糖+0.04％silwet-l77(lehleseeds目录号vis-02)+10μg/l苯甲氨基嘌呤(ba)溶液中，至od6000.8～1.0，然后进行花序浸蘸。将植物的地上部分浸入农杆菌溶液5至10分钟，轻柔搅动。然后将植物转移到温室中进行正常生长，并定期浇水施肥，直到种子成形。
实施例17
转基因拟南芥属的生长和生物测定。
选择用发夹rnai构建体转化的t1拟南芥属；将来自每次转化的多达200mg的t1种子置于0.1％琼脂糖溶液中分层。把种子种植在装有5号阳光培养基(sunshinemedia)的发芽托盘(10.5英寸×21英寸×1英寸；t.o.plasticsinc.,clearwater,mn.)中。在种植后6天和9天，选择对280g/ha的
英雄美洲蝽植物饲喂生物测定；为每个构建体选择至少四个低拷贝(1至2个插入)事件、四个中拷贝(2至3个插入)事件和四个高拷贝(≥4个插入)事件。使植物生长至开花期(植物有花和长角果)。土壤表面覆盖有～50ml体积的白色沙子，以便于鉴别昆虫。将5至10只第二龄的英雄美洲蝽若虫引到每株植物上。植物用直径为3英寸、高16英寸、壁厚0.03英寸的塑料管(产品号484485，visipackfentonmo)覆盖，用尼龙网盖住管子以隔离昆虫。在conviron培养箱中将植物保持在正常的温度、光照和浇水条件下。在14天中，收集昆虫并称重，计算死亡率百分比以及生长抑制(1–处理重量/对照重量)。用表达yfp发夹的植物作为对照。
生成t2拟南芥属种子和t2生物测定；对于每个构建体，由选择的低拷贝(1至2个插入)事件产生t2种子。如上所述，对植物(纯合的和/或杂合的)进行英雄美洲蝽饲喂生物测定。从纯合子收获t3种子并储存用于将来分析。
实施例18
转化额外的作物物种
用rab5(具有或不具有叶绿体转运肽)转化棉花，来提供对半翅目昆虫的控制，该过程利用了本领域技术人员已知的方法，例如，与以前在美国专利号7,838,733的实施例14、或pct国际专利公布号wo2007/053482的实施例12中所述基本上相同的技术。
实施例19
昆虫管理中的rab5dsrna
将rab5dsrna转基因与转基因植物中的其他dsrna分子组合，以提供冗余的rnai靶向和协同的rnai效应。表达靶向rab5的dsrna的转基因植物包括(例如但不限于)玉米、大豆和棉花，这些转基因植物可用于预防鞘翅目昆虫和半翅目昆虫造成的进食损害。rab5dsrna转基因还在植物中与苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白技术结合，以代表昆虫抗性管理基因累加中的新作用模式。当在转基因植物中与靶向昆虫害虫的其他dsrna分子和/或苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白结合时，观察到意料之外的杀虫效应(例如，协同的杀虫效应)，该效应还减缓了抗性昆虫群体壮大的速度。同样，rab5dsrna转基因在植物中与发光杆菌属(photorhabdus)或致病杆菌属(xenorhabdus)杀虫蛋白技术结合，以代表昆虫抗性管理基因累加中的新作用模式。当在转基因植物中与靶向昆虫害虫的其他dsrna分子和/或与发光杆菌属或致病杆菌属杀虫蛋白结合时，观察到意料之外的杀虫效应(例如，协同的杀虫效应)，该效应减缓了抗性昆虫群体壮大的速度。
虽然本公开可容许各种修改和替代形式，但已通过实例在本文中详细地描述了具体的实施方案。然而应当理解，本公开并不意在限于所公开的特定形式。相反，本公开旨在涵盖落入由以下所附权利要求书及其合法等同物限定的本公开范围内的所有修改、等同物和替代物。
序列表
<110>dowagrosciencesllc
narva,kene.
frey,meghan
fishilevich,elane
worden,sarah
rangasamy,murugesan
lo,wendy
gandra,premchand
<120>赋予对鞘翅目和半翅目害虫的抗性的rab5核酸分子
<130>76818
<160>116
<170>patentin3.5版
<210>1
<211>3710
<212>dna
<213>玉米根叶甲
<400>1
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taaaatcacaaatttaaaatttacaagaagtgaaccttaagttttgtattctgatgaaga900
gaaaaaaaaaagaagaagcaaacagcaaaaaaaattgataaaagaatgaaaagtgaaccg960
atgaagaaaatgaaaattatttaatacacacacacattactacac1005
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<213>玉米根叶甲
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seralavalglylysserserleuvalleuargphevallysglygln
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phehisglutyrglngluserthrileglyalaalapheleuthrgln
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asnilevalilealaleualaglyasnlysalaaspleuserasnser
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leuleuphemetgluthrseralalysthralametasnvalasnasp
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ccat544
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<213>玉米根叶甲
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<213>玉米根叶甲
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<213>玉米根叶甲
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<213>玉米根叶甲
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<211>53
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<213>玉米根叶甲
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<213>玉米根叶甲
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<213>人工序列
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<223>引物寡核苷酸
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<210>46
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<212>dna
<213>人工序列
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<212>dna
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<223>引物寡核苷酸
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<220>
<223>引物寡核苷酸
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<211>1150
<212>dna
<213>玉米
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caacggggcagcactgcactgcactgcaactgcgaatttccgtcagcttggagcggtcca60
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<221>misc_feature
<222>(22)..(22)
<223>n为a、c、g或t
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<213>英雄美洲蝽
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alasercyscyslys
210
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