本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
背景技术：
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些蛋白酶的分离的核酸序列。本发明还涉及包含这些核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞(包括植物和动物细胞)，以及生产和使用(尤其在洗涤剂中使用这些蛋白酶)这些蛋白酶的方法。
相关领域的说明
本发明提供具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
多年来，洗涤剂工业已经在洗涤剂配制品中应用了不同酶，最常用的酶包括蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶，每种酶适于除去不同类型的污物。除这些酶之外，洗涤剂组合物典型地包括成分的复杂组合。例如，多数清洁产品包括表面活性剂系统，漂白剂或助洗剂。不管当前洗涤剂的复杂度如何，但是对于研发包括新的酶和/或酶共混物的新的洗涤剂组合物仍存在需要。
传统地，已经在升高的温度下进行洗涤，并且已经选择熟知的洗涤剂在较高的温度下进行。
对改进洗涤过程以便使得它们更环保的增加的聚焦导致如下全球趋势：降低洗涤时间、ph和温度，并且减少可能负面地影响环境的洗涤剂组分的量。因此存在希望，例如希望在较低温度下洗涤，并且因此对在不同条件下(例如在低温下)具有高性能的洗涤剂蛋白酶存在需要。
来自bacilluslehensis的蛋白酶(joshi等人，bioresour.technol.[生物资源技术]2013131:76-85，uniprot:i3qii3)与本发明的蛋白酶具有81.9％一致性。
技术实现要素：
本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下组成：
(a)多肽，该多肽与seqidno:2的成熟多肽具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
(b)多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与seqidno:1的成熟多肽编码序列具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列一致性；
(c)seqidno:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失和/或插入；以及
(d)(a)、(b)或(c)的多肽的片段，该片段具有蛋白酶活性。
本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞；以及产生所述多肽的方法。
本发明还涉及本发明的蛋白酶在清洁过程中的用途，以及产生洗涤剂组合物的方法。
本发明还涉及编码包括seqidno:2的氨基酸-111至-85或由其组成的信号肽的多核苷酸、编码包括seqidno:2的氨基酸-84至-1或由其组成的前肽的多核苷酸、或编码包括seqidno:2的氨基酸-111至-1或由其组成的信号肽和前肽的多核苷酸，其每一者被可操作地连接至编码蛋白质的基因；包括这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体、以及重组宿主细胞；以及产生蛋白质的方法。
序列表综述
seqidno:1是来自芽孢杆菌属物种-13231的s8蛋白酶的dna序列。
seqidno:2是由seqidno:1编码的氨基酸序列。
seqidno:3是克劳氏芽孢杆菌分泌信号。
seqid:no:4是商业蛋白质(savinase)的成熟氨基酸序列。
定义
具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对n-和c-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。
术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于ec3.4酶组(包括其13个亚类中的每一个)的任何酶。ec编号参考加利福尼亚州(california)的圣迭戈(sandiego)的nc-iubmb学术出版社(academicpress)的1992年酶命名法，分别包括出版于eur.j.biochem.[欧洲生物化学杂志]1994，223，1-5；eur.j.biochem.[欧洲生物化学杂志]1995，232，1-6；eur.j.biochem.[欧洲生物化学杂志]1996，237，1-5；eur.j.biochem.[欧洲生物化学杂志]1997，250，1-6；以及eur.j.biochem.[欧洲生物化学杂志]1999，264，610-650的增刊1-5。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网(www)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
本发明的蛋白酶是：
(a)属于ec3.4.21酶组的蛋白酶；和/或
(b)s8肽酶家族的丝氨酸蛋白酶；
如在biochem.j.[生物化学杂志]290:205-218(1993)和在merops蛋白酶数据库，发行9.4(www.merops.ac.uk)中所述的。该数据库描述于rawlings,n.d.,barrett,a.j.和bateman,a.(2010)merops:thepeptidasedatabase[merops：肽酶数据库].nucleicacidsres[核酸研究]38,d227-d233中。
为了测定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和s8家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
s8家族的蛋白酶包含按asp、his、ser顺序的催化三联体。该催化三联体的任意氨基酸的突变将导致酶活性的变化或损失。来自芽孢杆菌属物种-13231(seqidno:2)的s8蛋白酶1的催化三联体的氨基酸可能是位置asp32、his62和ser215。
可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定ph和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定ph值的实例是ph2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。测定温度的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如azurine-crosslinkedcasein(天青精-交联的酪蛋白，azcl-酪蛋白)、或suc-aapf-pna。适合的蛋白酶测定的实例描述于实验部分中。
术语“蛋白酶活性”意指通过水解多肽链中的将氨基酸连接在一起的肽键，催化酰胺键或蛋白的水解的蛋白水解活性(ec3.4.21.)。用于测定蛋白酶活性的若干测定在本领域是可获得的。出于本发明的目的，如在本申请的实例中所述，可以使用protazymeak片剂(交联并且染色的酪蛋白，来自麦格酶公司(megazyme))，来测定蛋白酶活性。本发明的这些多肽具有seqidno:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。
术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“催化结构域”意指一种酶的含有该酶的催化机构的区域。
术语“cdna”是指可以通过得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mrna分子的反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可以存在于对应基因组dna中的内含子序列。早先的初始rna转录本是mrna的前体，其在呈现为成熟的剪接的mrna之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
术语“清洁组合物”和“清洁配制品”是指用于从有待清洁的物品上除去不希望的化合物的组合物，这些物品是例如织物、地毯、餐具(包括玻璃器皿)、接触镜、硬表面(例如瓷砖、锌、地板和桌面)、头发(香波)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口剂、牙膏)等。这些术语涵盖针对具体类型的所希望的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、颗粒、或喷雾组合物)所选的任何材料/化合物，只要该组合物与根据本发明的蛋白酶以及该组合物中使用的其他一种或多种酶可相容即可。清洁组合物材料的特定选择可通过考虑待清洁的表面、物品或织物，以及组合物对于使用时的清洁条件合意的形式而容易地作出。这些术语进一步是指适于清洁、漂白、消毒、和/或灭菌任何物品和/或表面的任何组合物。旨在该术语包括但不限于洗涤剂组合物(例如液体和/或固体衣物洗涤剂和精纺织物(finefabric)洗涤剂；硬表面清洁配制品，如用于玻璃、木材、陶瓷和金属台面以及窗户；地毯清洁剂；炉灶清洁剂；织物清新剂；织物柔软剂；以及纺织品和衣物预去污剂，连同餐具洗涤剂)。
术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框以起始密码子(如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(如taa、tag或tga)结束。编码序列可以是基因组dna、cdna、合成dna或其组合。
术语“控制序列”是指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制性酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
除非另外指明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉末状的通用或重垢洗涤剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的通用洗涤剂，尤其是所谓的重垢液体(hdl)类型；液体精细织物洗涤剂；手动餐具洗涤剂或轻垢餐具洗涤剂，尤其是高起泡类型的那些；机器餐具洗涤剂，包括用于供家庭和公共机构使用的不同的片剂、颗粒、液体和漂洗助剂类型；液体清洁剂和消毒剂，包括抗菌性手洗型、清洁棒、漱口液、义齿清洁剂、轿车或地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和洗发剂；沐浴凝胶、泡沫浴液；金属清洁剂；以及清洁助剂如漂白添加剂和“去污棒(stain-stick)”或预处理型添加剂。
就预期用于玷污的物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在一些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代性实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具洗涤洗涤剂”)。其并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。其意图是，除了根据本发明的蛋白酶以外，该术语涵盖了包含以下的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelatingagent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、聚合物以及增溶剂。
术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。
在此将术语“酶洗涤益处”或“洗涤”定义为将一种酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的同一洗涤剂相比的有利效果。可由酶提供的重要洗涤益处是污渍去除伴随在洗涤和/或清洁之后无可见污垢或污垢非常少、阻止或减少在洗涤过程中释放的污垢再沉积(又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(又称作增白的作用)，其中所述纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。不直接与污垢的催化去污或其再沉积的阻止相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一种织物转移至另一种织物或同一种织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的作用)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的作用)，改进织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。
术语“表达”包括涉及多肽的产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰以及分泌。
术语“表达载体”意指直链或环状dna分子，该dna分子包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非编织材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。
术语“片段”意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。
在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、及刀具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。
术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
在此将术语“改进的洗涤性能”定义为一种酶，例如一种蛋白酶(还有酶的共混物，不只是变体还有骨架，以及与某种清洁组合物组合，等)相对于另一种蛋白酶或亲本蛋白酶的洗涤性能展示出例如所述蛋白酶的洗涤性能的改变，例如增加的去污。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。
术语“分离的”意指处于非天然存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面中，基于使用edman降解化学的氨基酸测序，成熟多肽是seqidno:2的氨基酸1至269。本领域已知，宿主细胞可产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。
术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的一种多核苷酸。在一个方面中，成熟多肽编码序列是seqidno:1的核苷酸334-1140。
术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
术语“可操作地连接”意指以下配置，其中控制序列相对于多核苷酸的编码序列放置在适当位置，以使得控制序列指导编码序列的表达。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性,如emboss程序包的needle程序中所执行的(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，rice等人，2000，trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)。所使用的参数是空位开始罚分10、空位延伸罚分0.5、以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的needle输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且计算如下：
(一致的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，rice等人,2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的needle输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)
严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑精dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。
术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因工程化多肽生产系统内部的形式的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10％、最多8％、最多6％、最多5％、最多4％、最多3％、最多2％、最多1％和最多0.5％与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选处于基本上纯的形式。
术语“基本上纯的多肽”意指包含按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是与其天然或重组地相关的。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以例如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。
术语“纺织品”意指任何纺织品材料，该任何纺织品材料包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料，这些材料制造的织物和由这些织物制成的产品(例如，服装和其他物品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非织造物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。这些纺织品可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括粘胶纤维/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以不基于纤维素，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物以及其基于纤维素和不基于纤维素的纤维的共混物。共混物的实例是棉布和/或人造丝/粘胶纤维与一种或多种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳香族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/粘胶纤维、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如染污的家居衣物。当使用术语织物或衣服时，旨在还包括广义术语纺织品。
不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的术语“纺织品护理益处”，对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一种纺织品转移至另一种纺织品或同一种纺织品的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改进纺织品柔软性，纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。
术语“变体”意指具有蛋白酶活性的、在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的一个多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个(例如，若干个)氨基酸(例如，1-5个氨基酸)。
术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于有待清洁的物体上的污物的能力。
在此将术语“白度”定义为在不同领域并且针对不同顾客具有不同含义的广义术语。白度的损失可以例如归因于灰化、黄化、或光学增亮剂/调色剂的去除。灰化和黄化可归因于污垢再沉积、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染料转移的着色。白度可包括来自以下列表的一个或若干个问题：着色剂或染料作用；不完全污物去除(例如身体污垢、皮脂等)；再沉积(物体的灰化、黄化或其他变色)(去除的污垢与纺织品的其他部分(弄脏的或未弄脏的)再关联)；在应用过程中纺织品的化学变化；以及颜色的澄清或淡色化。
具体实施方式
在一个实施例中，本发明涉及与seqidno:2的成熟多肽具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽，该多肽具有蛋白酶活性。在一个方面中，该多肽与seqidno:2的成熟多肽相差不超过20个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个。
本发明的多肽优选地包括seqidno:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有蛋白酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括seqidno:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包含seqidno:2的氨基酸1至269或由其组成。
在另一个实施例中，本发明涉及由以下多核苷酸编码的具有蛋白酶活性的分离的多肽，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与seqidno:1的成熟多肽编码序列，或其全长互补体杂交(sambrook等人，1989，molecularcloning,alaboratorymanual[分子克隆实验指南]，第2版，冷泉港，纽约)。
seqidno:1的多核苷酸或其子序列，连同seqidno:2的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有蛋白酶活性的多肽的dna。具体地，可以遵循标准dna印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组dna或cdna杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。可以使用dna和rna探针两者。典型地将探针进行标记(例如，用32p、3h、35s、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。
可以筛选从此类其他菌株制备的基因组dna或cdna文库的与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽的dna。来自此类其他菌株的基因组dna或其他dna可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。可以将来自文库的dna或分离的dna转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与seqidno:1或其子序列杂交的克隆或dna，在dna印迹中使用该载体材料。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)seqidno:1；(ii)seqidno:1的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低至非常高严格条件下进行。可以使用例如x-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一个方面中，该核酸探针是seqidno:1的核苷酸101至1405、核苷酸188至1222、核苷酸665至1222、或核苷酸800至1200。在另一方面，核酸探针是编码以下的多核苷酸：seqidno:2的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一方面，核酸探针是seqidno:1。
在另一个实施例中，本发明涉及与seqidno:1的成熟多肽编码序列具有至少78％、至少79％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多核苷酸编码的具有蛋白酶活性的分离的多肽。
在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的seqidno:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入seqidno:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目不超过20，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、或19。在另一个实施例中，包括在seqidno:2的成熟多肽中的取代、缺失和/或插入的位置的数目是在1和20之间，例如1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，包括在seqidno:2的成熟多肽中的取代、缺失和/或插入的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一个实施例中，在seqidno:2的成熟多肽中的取代、缺失和/或插入的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一个实施例中，seqidno:2的成熟多肽中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在另一个实施例中，seqidno:2的成熟多肽中的保守取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由h.neurath和r.l.hill,1979,于theproteins[蛋白质]，学术出版社(academicpress)，纽约中描述。常见取代为ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly。
可替代地，这些氨基酸变化具有这样的性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸变化可改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适ph等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(cunningham和wells,1989,science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，hilton等人，1996,j.biol.chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性位点还可以通过对结构的物理分析来确定，如通过这样的技术确定：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同对推定的接触位点氨基酸进行突变。参见，例如，devos等人，1992，science[科学]255:306-312；smith等人，1992,j.mol.biol.[分子生物学杂志]224:899-904；wlodaver等人，1992，febslett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单一或多种氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由reidhaar-olson和sauer，1988，science[科学]241:53-57；bowie和sauer,1989,proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院刊]86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625所披露的那些。其他可使用的方法包括易错pcr、噬菌体展示(例如lowman等，1991，biochemistry[生物化学])30:10832-10837；美国专利号5,223,409；wo92/06204)以及区域定向诱变(derbyshire等人，1986，gene[基因]46:145；ner等人，1988，dna7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(ness等人，1999，naturebiotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的dna分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中个体氨基酸残基的重要性。
该多肽可为杂合多肽，其中一个多肽的区域在另一个多肽的区域的n-末端或c-末端处融合。
该多肽可为融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一个多肽在本发明多肽的n-末端或c-末端处融合。通过将编码另一个多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。还可使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(cooper等人，1993，emboj.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；dawson等人，1994，science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割而释放所述两个多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中公开的位点：martin等，2003，j.ind.microbiol.biotechnol.[工业微生物学生物技术杂志]3:568-576；svetina等人，2000，j.biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；rasmussen-wilson等人，1997,appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；ward等人，1995，biotechnology[生物技术]13:498-503；以及contreras等人，1991，biotechnology[生物技术]9:378-381；eaton等人，1986，biochemistry[生物化学]25:505-512；collins-racie等人，1995，biotechnology[生物技术]13:982-987；carter等人，1989，proteins:structure、function、andgenetics[蛋白质：结构、功能与遗传学]6:240-248；以及stevens，2003，drugdiscoveryworld[世界药物发现]4:35-48。
实施例
在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的热特性如热稳定性、蒸汽稳定性、ph特性如酸稳定性等。
酸度/碱度特性
在本发明的某些实施例中，就ph而言，本发明的蛋白酶展现了有益的特性，例如酸稳定性等。蛋白酶在一个低的ph下的稳定性是有益的，这是因为该蛋白酶可以在穿越胃之后在肠中具有活性。因为洗涤剂组合物常常具有碱性ph，所以蛋白酶在高ph下的稳定性对清洁和洗涤是有益的。本发明的蛋白酶展现了出人意料的ph特性，尤其是ph稳定性特性，这使得它们成为用于在洗涤剂中使用的感兴趣的候选物。
洗涤性能
在本发明的某些实施例中，本发明的蛋白酶展现了有益的洗涤性能。因此，与没有任何蛋白酶的去污剂相比，具有来自芽孢杆菌属物种-13231的s8蛋白酶1的洗涤剂在去除污渍方面更有效。
具有蛋白酶活性的多肽的来源
可以从任何属的微生物获得本发明的具有蛋白酶活性的多肽。出于本发明的目的，如在此结合给定来源使用的术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面中，从给定来源获得的多肽被分泌至细胞外。
该多肽可以是细菌多肽。
在一个方面中，该多肽是来自放线菌纲的细菌的蛋白酶，例如来自放线菌目，或来自微单孢菌亚目，或来自微单孢菌科，或来自属。在另一方面，该多肽是芽孢杆菌属物种-13231多肽。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(atcc)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh，dsmz)、荷兰菌种保藏中心(centraalbureauvoorschimmelcultures，cbs)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(agriculturalresearchservicepatentculturecollection,northernregionalresearchcenter，nrrl)。使用的菌株在登录号atcc31203或dsm43911下是公开可获得的。
可使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的dna样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和dna的技术是本领域已知的。然后可通过类似地筛选另一微生物的基因组dna或cdna文库或混合的dna样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可通过利用本领域普通技术人员所知的技术(参见，例如sambrook等人，1989，见上文)分离或克隆多核苷酸。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的且包括从基因组dna或cdna或其组合进行分离。可例如通过使用熟知的聚合酶链反应(pcr)或表达文库的抗体筛选以检测具有共有结构特征的克隆的dna片段，来实现从基因组dna克隆多核苷酸。参见例如，innis等人，1990，pcr:aguidetomethodsandapplication[pcr：方法和应用指南]，academicpress[学术出版社]，纽约。可以使用其他核酸扩增程序如连接酶链式反应(lcr)、连接激活转录(lat)和基于多核苷酸的扩增(nasba)。这些多核苷酸可以由指孢囊菌属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种变体。
编码本发明多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可以因某种工程化方式而与从其天然来源分离的多肽不同，例如在比活性、热稳定性、最适ph等方面不同的变体。这些变体可以基于以seqidno:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主有机体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸置换的一般描述，参见，例如ford等人，1991，proteinexpressionandpurification[蛋白质表达与纯化]2:95-107。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这个或这些控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸，以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子含有转录控制序列，其介导该多肽的表达。该启动子可为在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短的及杂合的启动子，并可从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例为从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢杆菌xyla和xylb基因、苏云金芽孢杆菌cryiiia基因(agaisse和lereclus，1994，molecularmicrobiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(egon等人，1988，gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂糖酶基因(daga)、以及原核β-内酰胺酶基因(villa-kamaroff等人，1978，proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(deboer等人，1983，proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述在gilbert等人，1980，scientificamerican[科学美国人]242:74-94的“usefulproteinsfromrecombinantbacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和sambrook等人，1989，见上文中。串联启动子的实例披露于wo99/43835中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的适合启动子的实例是从以下的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(wo96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、镶片镰孢daria(wo00/56900)、镶片镰孢quinn(wo00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶i、里氏木霉纤维二糖水解酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶i、里氏木霉内切葡聚糖酶ii、里氏木霉内切葡聚糖酶iii、里氏木霉内切葡聚糖酶iv、里氏木霉内切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶，以及na2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导子由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导子替代；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其变体、截短型及杂合型启动子。
在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(eno-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(gal1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(adh1，adh2/gap)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(tpi)、酿酒酵母金属硫蛋白(cup1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。romanos等人，1992，yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子与编码该多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下酶的基因获得：克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)碱性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyl)、和大肠杆菌核糖体rna(rrnb)。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素c(cyc1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。由romanos等人，1992(见上文)描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mrna稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mrna稳定子区域的实例是从以下基因获得：苏云金芽孢杆菌cryiiia基因(wo94/25612)和枯草芽孢杆菌sp82基因(hue等人,1995,journalofbacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
该控制序列也可以是前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mrna区域。该前导序列可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5’-末端。可使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉taka淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。
对于酵母宿主细胞合适的前导子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(eno-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(adh2/gap)。
该控制序列还可以是多腺苷酸化序列；与多核苷酸3’-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mrna添加聚腺苷酸残基的信号的序列。可使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下酶的基因获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶和尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在guo和sherman，1995，mol.cellularbiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990中得以描述。
控制序列也可为编码与多肽的n-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可固有地含有在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-末端可含有对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地含有信号肽编码序列的情况下，可需要外来的信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌ncib11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)和枯草芽孢杆菌prsa的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由simonen和palva,1993,microbiologicalreviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特异腐质霉(humicolainsolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶v、疏棉状腐质霉(humicolalanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其他的有用的信号肽编码序列由romanos等人，1992，见上文描述。
控制序列也可为编码处于多肽的n-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(apre)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt)、嗜热毁丝霉漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的n-末端且该信号肽序列位于紧邻该前肽序列的n-末端。
也可为合意的是添加调节序列，所述调节序列调节相对于宿主细胞的生长的多肽的表达。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用adh2系统或gal1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉takaα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该多肽的多核苷酸将与调控序列有效地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，其可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在这些位点处的插入或取代。可替代地，多核苷酸可通过将该多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列有效地连接。
重组表达载体可以是可方便地经受重组dna程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总dna，或可以使用转座子。
载体优选地含有一个或多个选择性标志，这些选择性标志容许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等。选择性标志物是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养性等。
细菌选择性标志物的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志物。用于酵母宿主细胞的适合的标志物包括但不限于：ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1和ura3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niad(硝酸还原酶)、pyrg(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sc(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpc(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水链霉菌bar基因。
载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以含有用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与相应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步含有使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pbr322、puc19、pacyc177、以及pacyc184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pub110、pe194、pta1060、以及pamβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ars1、ars4、ars1与cen3的组合、及ars4与cen6的组合。
用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是ama1和ans1(gems等人，1991，gene[基因]98:61-67；cullen等人，1987，nucleicacidsres.[核酸研究]15:9163-9175；wo00/24883)。可根据wo00/24883中公开的方法完成ama1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标志基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域的技术人员熟知的(参见，例如，sambrook等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，这个或这些控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择会在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
宿主细胞可为在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可为任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可为任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
可通过如下方法实现将dna引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化(参见，例如，chang和cohen,1979,mol.gen.genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，young和spizizen，1961，j.bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829或dubnau和davidoff-abelson,1971,j.mol.biol.[分子生物学杂志]56:209-221)，电穿孔(参见，例如，shigekawa和dower,1988,biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见，例如，koehler和thorne,1987,j.bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。可通过如下方法实现将dna引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化(参见，例如，hanahan,1983,j.mol.biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，dower等人，1988，nucleicacidsres.[核酸研究]16:6127-6145)。可通过如下方法实现将dna引入到链霉菌属细胞：原生质体转化，电穿孔(参见，例如，gong等人,2004,foliamicrobiol.[叶线形微生物学](布拉格)49:399-405)、接合(参见例如，mazodier等人，1989，j.bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)，或转导(参见，例如，burke等人,2001,proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院刊]98:6289-6294)。可通过如下方法实现将dna引入到假单胞菌属细胞：电穿孔(参见，例如，choi等人，2006,j.microbiol.methods[应用与环境微生物学]64:391-397)或接合(参见例如，pinedo和smets，2005，appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可通过如下方法实现将dna引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(naturalcompetence)(参见，例如，perry和kuramitsu,1981,infect.immun.[感染与免疫]32:1295-1297)，原生质体转化(参见，catt和jollick,1991,microbios[微生物学]68:189-207)，电穿孔(参见，例如，buckley等人,1999,appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见，例如，clewell，1981，microbiol.rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可使用本领域已知的将dna引入宿主细胞的任何方法。
宿主细胞还可为真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可为真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)以及卵菌门(oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如由hawksworth等人，于：ainsworthandbisby'sdictionaryofthefungi[安斯沃思和拜斯比真菌词典]，第8版，1995，国际应用生物科学中心(cabinternational)，大学出版社(universitypress)，剑桥(cambridge)，英国)所定义的。
真菌宿主细胞可为酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(fungiimperfecti)(芽孢纲(blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如biologyandactivitiesofyeast[酵母的生物学与活性](skinner,passmore和davenport编，soc.app.bacteriol.symposiumseriesno.9[应用细菌学学会专题论文集系列9]，1980)中所描述的那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属细胞、汉逊酵母属细胞、克鲁维酵母属细胞、毕赤酵母属细胞、酵母菌属细胞、裂殖酵母或耶罗维亚酵母属细胞、如乳酸克鲁弗酵母细胞、卡尔酵母细胞、酿酒酵母细胞、糖化酵母细胞、道格拉氏酵母细胞、克鲁弗酵母细胞、诺地酵母细胞、卵形酵母细胞或解脂耶罗维亚酵母细胞。
真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(eumycota)和卵菌门的亚门(如由hawksworth等，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵性的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌、昆士兰金孢子菌(chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(coprinuscinereus)、毛革盖菌(coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢菌、禾赤镰孢(fusariumgraminum)、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢菌、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢菌、硫色镰孢菌、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(phlebiaradiata)、刺芹侧耳(pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(trametesvillosa)、变色栓菌(trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法描述于ep238023、yelton等人，1984，proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]81:1470-1474以及christensen等人，1988，bio/technology[生物/技术]6:1419-1422中。用于转化镰孢菌属物种的适合方法由malardier等人，1989，gene[基因]78:147-156、以及wo96/00787描述。可使用由如以下文献描述的方法转化酵母：becker和guarente，于abelson，j.n.和simon，m.i.编，guidetoyeastgeneticsandmolecularbiology[酵母遗传学与分子生物学指南],methodsinenzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(academicpress,inc.)，纽约；ito等，1983，j.bacteriol.[生物技术杂志]153:163；和hinnen等人，1978,proc.natl.acad.sci.usa[美国科学院院报]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生本发明多肽的方法，该方法包括：(a)培养细胞，该细胞处于其野生型形式，在有益于产生该多肽的条件下产生该多肽；以及(b)回收该多肽。在优选的方面中，该细胞是芽孢杆菌属细胞。在更优选的方面中，该细胞是孢杆菌属物种-13231细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括：(a)在有益于产生该多肽的条件下培养本发明的重组宿主细胞；以及(b)回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽被分泌到营养培养基中，那么可以直接从该培养基中回收多肽。如果多肽不进行分泌，那么其可以从细胞裂解液中进行回收。
可以使用本领域已知的对于该多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定法来确定多肽的活性。
可使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，可通过常规方法，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从营养介质回收多肽。
可通过本领域已知的多种方法纯化多肽以获得基本上纯的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page或提取(参见，例如，proteinpurification[蛋白质纯化]，janson和ryden编辑，vch出版公司(vchpublishers)，纽约，1989)。
在替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包含本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。可从植物或植物部分回收多肽或结构域。
转基因植物可为双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草例如草地早熟禾(蓝草，早熟禾属)，饲草例如羊茅属(festuca)、黑麦草属(lolium)，温带草例如剪股颖属(agrostis)和谷物例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、水稻、高粱、和玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familybrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子和块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。特定植物细胞区室，如叶绿体、质外体(apoplast)、线粒体、液泡、过氧化物酶体以及细胞质也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论是何种组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以有助于本发明的利用的特定组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊粉和种皮。
同样包括于本发明范围内的是此类植物、植物部分以及植物细胞的后代。
可根据本领域已知的方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。简而言之，通过将编码该多肽或结构域的一个或多个表达构建体结合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中并且将所得修饰的植物或植物细胞繁殖成转基因的植物或植物细胞来构建植物或植物细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，其包括(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编码该多肽或结构域的多核苷酸；和(b)回收该多肽或结构域。
信号肽和前肽
本发明还涉及一种编码信号肽的分离的多核苷酸，该信号肽包括seqidno:2的氨基酸-111至-85或由其组成。本发明还涉及一种编码前肽的分离的多核苷酸，该前肽包括seqidno:2的氨基酸-84至-1或由其组成。本发明还涉及一种编码信号肽和前肽的分离的多核苷酸，该信号肽和前肽包括seqidno:2的氨基酸-111至-1或由其组成。所述多核苷酸可以进一步包括编码蛋白质的基因，所述蛋白质与信号肽和/或前肽可操作地连接。该蛋白质优选地对于该信号肽和/或前肽来说是外源的。在一个方面中，编码该信号肽的多核苷酸是seqidno:1的核苷酸1至81。在另一方面，编码该前肽的多核苷酸是seqidno:1的核苷酸82至333。在另一方面，编码该信号肽和该前肽的多核苷酸是seqidno:1的核苷酸1至333。
本发明亦涉及包含此类多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞。
酶组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的组合物。
发酵液配制品或细胞组合物
组合物可以是包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，所述宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如在本申请中使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下温育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的且包括耗尽的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制物和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物；且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述中的两种或更多种的混合物。
在一个方面中，该组合物包含有机酸，并且任选地进一步包含杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于：山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如本文所述的，全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
洗涤剂组合物
在一个实施例中，本发明针对组合物，该组合物包含结合一种或多种另外的清洁组合物组分的本发明的多肽。因而，在一个实施例中，本发明涉及包含与seqidno:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽的洗涤剂组合物，这些多肽具有蛋白酶活性。
另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。对于织物护理，组分的选择可以包括以下考虑：待清洁的织物的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对下面提及的组分通过通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被技术人员所理解的，一种组分可以包括另外的功能性。
在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至洗涤剂组合物中：每升的洗液0.001mg-200mg的蛋白，例如0.005mg-100mg的蛋白，优选0.01mg-50mg的蛋白，更优选0.05mg-20mg的蛋白，甚至更优选0.1mg-10mg的蛋白。
可以使用常规的稳定剂来稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些稳定剂是例如多元醇(如丙二醇或甘油)、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物(例如芳香硼酸酯、或苯基硼酸衍生物(如4-甲酰基苯基硼酸))，并且可以如在例如wo92/19709和wo92/19708中描述配制该组合物，或者如在wo2005/105826和wo2009/118375中描述的可使用肽醛或酮对根据本发明的多肽进行稳定。
表面活性剂
洗涤剂组合物可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的，或其混合物。在具体实施例中，该洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且包括本领域中已知的任何常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。
当包含在其中时，所述洗涤剂通常将会包含按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％，包括从约5％至约15％、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地，直链烷基苯磺酸盐(las)、las的异构体、支链烷基苯磺酸盐(babs)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(aos)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(as)(如十二烷基硫酸钠(sds))、脂肪醇硫酸盐(fas)、伯醇硫酸盐(pas)、醇醚硫酸盐(aes或aeos或fes、也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(sas)、石蜡烃磺酸盐(ps)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-sfme或ses)(包括甲酯磺酸盐(mes))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(dtsa)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(admeaq)、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)、二甲基二硬脂酰氯化铵(dsdmac)、烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(aqa)、及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(ae或aeo)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(pfa)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(ape)、壬基酚乙氧基化物(npe)、烷基多糖苷(apg)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(fam)、脂肪酸二乙醇酰胺(fada)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(efam)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(pfam)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的n-酰基n-烷基衍生物(葡糖酰胺(ga)、或脂肪酸葡糖酰胺(faga))、连同在span和tween商品名下可获得的产品及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(ao)(如烷基二甲基氧化胺)、n-(椰油基烷基)-n,n-二甲基氧化胺和n-(牛油-烷基)-n,n-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。
当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、及其组合。
助水溶剂
助水溶剂是以下化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶物具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，助水溶剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过hodgdon和kaler(2007)，currentopinionincolloid&interfacescience[胶体和界面科学新见]12：121-128的综述。助水溶剂并不显示临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多助水溶剂显示连续类型的聚集过程，在该过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。助水溶剂常规在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高粘度。
该洗涤剂可以包含按重量计0％-5％，如约0.5％至约5％，或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(sts)、二甲苯磺酸钠(sxs)、枯烯磺酸钠(scs)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。
助洗剂和共助洗剂
该洗涤剂组合物可以含有按重量计约0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具清洗洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有ca和mg的水溶性络合物的螫合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(stp或stpp)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(hoechst)的sks-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(mea)、二乙醇胺(dea，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(tea，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(cmi)及其组合。
洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-65％，例如约5％至约40％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(paa)或共聚(丙烯酸/马来酸)(paa/pma)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(nta)、乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(ids)、乙二胺-n,n’-二丁二酸(edds)、甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、谷氨酸-n,n-二乙酸(glda)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(hedp)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(edtmpa)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(dtpmpa)、n-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(edg)、天冬氨酸-n-单乙酸(asma)、天冬氨酸-n,n-二乙酸(asda)、天冬氨酸-n-单丙酸(asmp)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(ida)、n-(2-磺甲基)-天冬氨酸(smas)、n-(2-磺乙基)-天冬氨酸(seas)、n-(2-磺甲基)-谷氨酸(smgl)、n-(2-磺乙基)-谷氨酸(segl)、n-甲基亚氨基二乙酸(mida)、α-丙氨酸-n,n-二乙酸(α-alda)、丝氨酸-n,n-二乙酸(seda)、异丝氨酸-n,n-二乙酸(isda)、苯丙氨酸-n,n-二乙酸(phda)、邻氨基苯甲酸-n,n-二乙酸(anda)、磺胺酸-n,n-二乙酸(slda)、牛磺酸-n,n-二乙酸(tuda)以及磺甲基-n,n-二乙酸(smda)、n-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-n,n’,n’-三乙酸盐(hedta)、二乙醇甘氨酸(deg)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(dtpmp)、氨基三(亚甲基膦酸)(atmp)、及其组合和盐。进一步的示例性增洁剂和/或共增洁剂在例如wo09/102854、us5977053中描述。
漂白系统
洗涤剂可以包含按重量计0％-10％，如大约1％至大约5％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括但不限于：过氧羧酸及盐、过碳酸及盐、过亚氨酸(perimidicacid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(oxone(r))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括与过酸形成漂白活化剂组合的基于过氧化物的漂白体系，其可以包含例如无机盐，包括碱金属盐例如过硼酸盐的钠盐(通常为单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。因此形成的过酸构成活化的漂白剂。在此将使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(taed)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(isonobs)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(lobs)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(dobs)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(nobs)、和/或披露于wo98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于ep624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(atc)。atc或短链甘油三酸酯(像特雷森(triacin))具有以下优点，其是环境友好的，因为其最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是有效的漂白活化剂。最后，atc为衣物洗涤添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺、或砜型的过氧酸。该漂白系统还可以包括过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(pap)。该漂白系统还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下组成：具有下式的有机催化剂：
(iii)及其混合物；其中每个r1独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个r1独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个r1独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三基和异十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如wo2007/087258、wo2007/087244、wo2007/087259、wo2007/087242中。合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。
聚合物
洗涤剂可以含有按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(cmc)、聚(乙烯醇)(pva)、聚(乙烯吡咯烷酮)(pvp)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(peg)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(cmi)、和聚羧化物，如paa、paa/pma、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰的cmc(hm-cmc)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(pet-poet)、pvp、聚(乙烯基咪唑)(pvi)、聚(乙烯吡啶-n-氧化物)(pvpo或pvpno)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(pvpvi)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(peo-ppo)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如wo2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。
织物调色剂
本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包含所述洗涤剂组合物的洗涤液体接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(colourindex)(c.i.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物，例如如描述于wo2005/03274、wo2005/03275、wo2005/03276和ep1876226(通过引用并入本文)中。洗涤剂组合物优选包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是特别优选的。合适的调色剂还披露于例如wo2007/087257、wo2007/087243中。
另外的酶
洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物可以包括一种或多种酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶(例如，漆酶)和/或过氧化物酶。
一般而言，一种或多种所选酶的特性应与选定的洗涤剂相容(即，最适ph，与其他酶和非酶成分的相容性，等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质工程化的变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢菌属、梭孢壳菌属、支顶孢属的纤维素酶，例如披露于us4,435,307、us5,648,263、us5,691,178、us5,776,757以及wo89/09259中的由特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖孢镰孢菌产生的真菌纤维素酶。
尤其适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。这类纤维素酶的实例是在ep0495257、ep0531372、wo96/11262、wo96/29397、wo98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在wo94/07998、ep0531315、us5,457,046、us5,686,593、us5,763,254、wo95/24471、wo98/12307以及pct/dk98/00299中描述的那些。
可商购的纤维素酶包括celluzymetm、和carezymetm(诺维信公司(novozymesa/s))、clazinasetm、和puradaxhatm(杰能科国际有限公司(genencorinternationalinc.))、以及kac-500(b)tm(花王株式会社(kaocorporation))。
蛋白酶：适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选是微生物来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是s1家族(如胰蛋白酶)或s8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族m4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自m5、m7或m8家族的那些。
术语“枯草杆菌酶”是指根据siezen等人，proteinengng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和siezen等人，proteinscience[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是通过在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸来表征的蛋白酶的一个亚组。枯草杆菌蛋白酶(subtilase)可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(thermitase)家族、蛋白酶k家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶(lantibioticpeptidase)家族、kexin家族和pyrolysin家族。
枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于us7262042和wo09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于wo89/06279中的枯草杆菌蛋白酶lentus、枯草杆菌蛋白酶novo、枯草杆菌蛋白酶carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶bpn’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(wo93/18140)中的蛋白酶pd138。其他有用的蛋白酶可以是描述于wo92/175177、wo01/016285、wo02/026024以及wo02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于wo89/06270、wo94/25583和wo05/040372中)，以及来源于纤维单胞菌(cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于wo05/052161和wo05/052146中)。
进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌dsm5483的碱性蛋白酶(如在例如wo95/23221中所述)、及其变体(在wo92/21760、wo95/23221、ep1921147以及ep1921148中描述的)。
金属蛋白酶的实例是如描述于wo07/044993(杰能科国际公司(genencorint.))中的中性金属蛋白酶，例如来源于解淀粉芽孢杆菌的那些。
有用的蛋白酶的实例是于以下描述的变体：wo92/19729、wo96/034946、wo98/20115、wo98/20116、wo99/011768、wo01/44452、wo03/006602、wo04/03186、wo04/041979、wo07/006305、wo11/036263、wo11/036264，尤其是在以下位置中的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、24、27、42、55、59、60、66、74、85、96、97、98、99、100、101、102、104、116、118、121、126、127、128、154、156、157、158、161、164、176、179、182、185、188、189、193、198、199、200、203、206、211、212、216、218、226、229、230、239、246、255、256、268以及269，其中所述位置对应于wo2016/001449的seqidno1所示的迟缓芽孢杆菌蛋白酶的位置。更优选枯草杆菌酶变体可以包含以下突变：s3t、v4i、s9r、s9e、a15t、s24g、s24r、k27r、n42r、s55p、g59e、g59d、n60d、n60e、v66a、n74d、n85s、n85r、、g96s、g96a、s97g、s97d、s97a、s97sd、s99e、s99d、s99g、s99m、s99n、s99r、s99h、s101a、v102i、v102y、v102n、s104a、g116v、g116r、h118d、h118n、n120s、s126l、p127q、s128a、s154d、a156e、g157d、g157p、s158e、y161a、r164s、q176e、n179e、s182e、q185n、a188p、g189e、v193m、n198d、v199i、y203w、s206g、l211q、l211d、n212d、n212s、m216s、a226v、k229l、q230h、q239r、n246k、n255w、n255d、n255e、l256e、l256d、t268a、r269h。这些蛋白酶变体优选地是在wo2016/001449的seqidno1中所示的迟缓芽孢杆菌蛋白酶
在以下一个或多个位置包含取代的蛋白酶变体,该位置相应于wo2004/067737的seqidno:1的位置171、173、175、179或180，其中所述蛋白酶变体与wo2004/067737的seqidno:1具有至少75％但少于100％的序列一致性。
适合的可商购蛋白酶包括以下列商标名下出售的那些：
脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如来自如描述于ep258068和ep305216中的疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(wo96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(ep218272)、洋葱假单胞菌(ep331376)、假单胞菌属菌株sd705(wo95/06720和wo96/27002)、威斯康星假单胞菌(p.wisconsinensis)(wo96/12012)；gdsl-型链霉菌属脂肪酶(wo10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(wo10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(us5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(thermobifidafusca)的脂肪酶(wo11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(wo11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(wo11/084599)；以及来自灰色链霉菌(wo11/150157)和始旋链霉菌(s.pristinaespiralis)的脂肪酶(wo12/137147)。
其他实例是脂肪酶变体，例如在ep407225、wo92/05249、wo94/01541、wo94/25578、wo95/14783、wo95/30744、wo95/35381、wo95/22615、wo96/00292、wo97/04079、wo97/07202、wo00/34450、wo00/60063、wo01/92502、wo07/87508和wo09/109500中所描述的那些。
优选的商业化脂肪酶产品包括lipolasetm、lipextm；lipolextm和lipocleantm(诺维信公司)，lumafast(来自杰能科公司(genencor))以及lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(gist-brocades))。
再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(candidaantarctica)脂肪酶a具有同源性的酰基转移酶(wo10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(mycobacteriumsmegmatis)的酰基转移酶(wo05/56782)、来自ce7家族的过水解酶(wo09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(huntsmantextileeffectspteltd)的商业产品gentlepowerbleach中所用的s54v变体)(wo10/100028)。
淀粉酶：可以与本发明的蛋白酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌来源。包括经化学修饰的或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如gb1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。
合适的淀粉酶包括具有在wo95/10603中的seqidno:2的淀粉酶或与seqidno:3具有90％序列一致性的其变体。优选的变体描述于wo94/02597、wo94/18314、wo97/43424以及wo99/019467的seqidno:4中，如在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。
不同的合适的淀粉酶包括具有在wo02/010355中的seqidno:6的淀粉酶或与seqidno:6具有90％序列一致性的其变体。seqidno:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。
其他适合的淀粉酶是包含示于wo2006/066594的seqidno:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于wo2006/066594的seqidno:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这种杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：g48、t49、g107、h156、a181、n190、m197、i201、a209以及q264。包含示于wo2006/066594的seqidno:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和seqidno:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：
m197t；
h156y+a181t+n190f+a209v+q264s；或
g48a+t49i+g107a+h156y+a181t+n190f+i201f+a209v+q264s。
另外的适合的淀粉酶是具有在wo99/019467中的seqidno:6的淀粉酶或其与seqidno:6具有90％序列一致性的变体。seqidno:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：r181、g182、h183、g184、n195、i206、e212、e216以及k269。特别优选的淀粉酶是在位置r181和g182或位置h183和g184中具有缺失的那些。
能被使用的另外的淀粉酶是具有wo96/023873的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:2或seqidno:7的那些或其与seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:7具有90％序列一致性的变体。seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、或seqidno:7的优选的变体是在以下一个或多个位置具有取代、缺失或插入的变体的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476，使用wo96/023873的seqid2用于编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置中具有缺失的那些，例如位置181和182、182和183、或位置183和184。seqidno:1、seqidno:2或seqidno:7的最优选淀粉酶变体是那些在位置183和184具有缺失并在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个具有取代的变体。
其他能被使用的淀粉酶是具有wo08/153815的seqidno:2、wo01/66712的seqidno:10的淀粉酶或与wo08/153815的seqidno:2具有90％序列一致性或wo01/66712的seqidno:10具有90％序列一致性的其变体。wo01/66712中的seqidno:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。
另外的适合的淀粉酶是具有wo09/061380的seqidno:2的淀粉酶或其与seqidno:2具有90％序列一致性的变体。seqidno:2的优选变体是具有c末端截短和/或在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：q87、q98、s125、n128、t131、t165、k178、r180、s181、t182、g183、m201、f202、n225、s243、n272、n282、y305、r309、d319、q320、q359、k444和g475。seqidno:2的更优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代：q87e,r、q98r、s125a、n128c、t131i、t165i、k178l、t182g、m201l、f202y、n225e,r、n272e,r、s243q,a,e,d、y305r、r309a、q320r、q359e、k444e以及g475k，和/或在位置r180和/或s181或t182和/或g183中具有缺失的那些。seqidno:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：
n128c+k178l+t182g+y305r+g475k；
n128c+k178l+t182g+f202y+y305r+d319t+g475k；
s125a+n128c+k178l+t182g+y305r+g475k；或
s125a+n128c+t131i+t165i+k178l+t182g+y305r+g475k，其中这些变体是c末端截短的并且任选地进一步包括在位置243的取代和/或在位置180和/或位置181的缺失。
其他适合的淀粉酶是具有wo01/66712中的seqidno:12的α-淀粉酶或与seqidno:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在wo01/66712中的seqidno:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：r28、r118、n174；r181、g182、d183、g184、g186、w189、n195、m202、y298、n299、k302、s303、n306、r310、n314；r320、h324、e345、y396、r400、w439、r444、n445、k446、q449、r458、n471、n484。特别优选的淀粉酶包括具有d183和g184的缺失并且具有取代r118k、n195f、r320k及r458k的变体，以及在选自下组的一个或多个位置中另外具有取代的变体：m9、g149、g182、g186、m202、t257、y295、n299、m323、e345和a339，最优选的是在所有这些位置中另外具有取代的变体。
其他的实例是淀粉酶变体，如在wo2011/098531、wo2013/001078、和wo2013/001087中描述的那些。
可商购的淀粉酶是duramyltm、termamyltm、fungamyltm、stainzymetm、stainzymeplustm、natalasetm、liquozymex及bantm(来自诺维信公司)，以及rapidasetm、purastartm/effectenztm、powerase及preferenzs100(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(genencorinternationalinc./dupont))。
过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括经化学修饰的或蛋白质工程化的变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，及其变体，如在wo93/24618、wo95/10602、以及wo98/15257中描述的那些。
可商购的过氧化物酶包括guardzymetm(诺维信公司(novozymesa/s))。
可以通过添加包含一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂而将洗涤剂酶包含在洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂剂型为颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆液。
无尘颗粒可以例如如在us4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行涂覆。蜡状包衣材料的实例是具有平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，peg)；具有从16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；具有从12个至20个碳原子并且存在15个至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯、和甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在gb1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据ep238,216中披露的方法来制备。
辅料
还可以利用本领域中已知的用于在洗衣洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐蚀剂、防缩剂、抗污垢再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegrationagent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、cmc和/或多元醇如丙二醇)、织物调理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污垢悬浮剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在洗衣洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在技术人员的技术范围内。
分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉末洗涤剂，powdereddetergents,surfactantscienceseriesvolume71,marceldekker,inc.[表面活性剂科学系列，第71卷，马塞尔德克尔公司]中。
染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺n-氧化物聚合物、n-乙烯吡咯烷酮与n-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。
荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨基芪-磺酸衍生物类型的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(n-甲基-n-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐，4,4'-双-(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐；4,4'-双-(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐和5-(2h-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(e)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠；优选的荧光增白剂是可从汽巴-嘉基股份有限公司(ciba-geigyag)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(tinopal)dms和天来宝cbs。天来宝dms是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝cbs是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的parawhitekx，由派拉蒙矿物与化学(paramountmineralsandchemicals)，孟买，印度供应。适合用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。
适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。
污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物帮助从织物，例如棉布或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污垢释放聚合物可以例如是基于非离子型或阴离子型对苯二甲酸的聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉末洗涤剂(powdereddetergents)，表面活性剂科学系列(surfactantscienceseries)第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(marceldekker，inc.)。另一种类型的污垢释放聚合物是包括核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如wo2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污垢释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于wo2007/138054、wo2006/108856以及wo2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物，如ep1867808或wo2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用结合在此)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。
抗再沉积剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(cmc)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(peg)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。
其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、防皱剂、杀菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物柔软剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂、用于液体洗涤剂的结构化剂(structurants)和/或结构弹力剂。
洗涤剂产品的配制品
本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒、均匀的片剂、具有两层或更多层的片剂、常规的或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或常规的、压缩的或浓缩的液体。
洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器配量单位的形式。
可以将小袋配置为单一隔室或多隔室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。该袋由水溶性膜制成，它包含了内部体积。所述内部体积可以分成袋的隔室。优选的膜是高分子材料，优选被制成膜或片的形式的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(hpmc)。优选地，聚合物在膜例如pva中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包含可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号m8630下，如由美国印第安纳州的monosol有限责任公司出售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包含固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与含有固体的室不同。参考文献：(us2009/0011970a1)。
可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。因此，可以避免组分间的不良的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。
这些形式的定义/特征：
不按单位配量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％和高达95％的水，如高达大约70％的水，高达大约65％的水，高达大约55％的水，高达大约45％的水，高达大约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包含于水性液体或凝胶中。含水液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。
液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。
洗衣皂条
本发明的多肽可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combobar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们含有的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括含有来自脂肪酸的皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随时间显著变化的物理形式，即如果固体物体(如洗衣皂条)被放置在容器里，该固体物体不会为了填充其被放置的容器而发生改变。该条是固体时典型地是条的形式但也可能是其他的固体形状如圆形或椭圆。
该洗衣皂条可以含有一个或多个另外的酶、蛋白酶抑制剂如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)、硼酸、硼酸盐、硼砂和/或苯基硼酸衍生物如4-甲酸基本硼酸、一个或多个皂或合成的表面活性剂、多元醇如甘油、ph控制化合物如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸、和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如na+、k+或nh4+并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得该一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。
洗衣皂条还可以含有络合剂像edta和hedp、香料和/或不同类型的填充剂、表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂、助洗剂、聚合的污垢释放剂、洗涤剂螯合剂、稳定试剂、填充剂、染料、着色剂、染料转移抑制剂、烷氧基化的聚碳酸酯、抑泡剂、结构剂、粘合剂、浸出剂、漂白活化剂、粘土去污剂、抗再沉积剂、聚合分散剂、增亮剂、织物柔软剂、香料和/或本领域已知的其他化合物。
洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包含研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。
用途
本发明还针对根据本发明的蛋白酶或其组合物在纺织品或织物洗衣中的使用方法，如居家衣物清洗和工业衣物清洗。
本发明还针对用于在硬表面清洁例如自动餐具洗涤(adw)、汽车洗涤以及工业表面清洁中使用其组合物的方法。因而，在一个实施例中，本发明涉及根据本发明的蛋白酶或包含根据本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物在清洗(如衣物洗涤或餐具洗涤)中的用途，该蛋白酶与seqidno:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。因而，在一个实施例中，本发明涉及与seqidno:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽的用途，这一分离的多肽在洗涤剂、清洁过程和/或衣物洗涤过程中具有蛋白酶活性。
在洗涤剂中的用途。可以将本发明的多肽添加至洗涤剂组合物中并且因此变成洗涤剂组合物的组分。
本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。
在特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括如在此描述的本发明的多肽。
本发明的蛋白酶在洗涤剂中的用途
对于洗涤剂配制者而言重要的污物和污渍由许多不同物质构成，已经开发具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表面清洁(例如餐具洗涤)两者中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一过程相比，它们在其应用至其中的清洁过程中特异性地改进污渍去除。本领域中已知的去污酶包括以下酶，例如糖酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、角质酶以及果胶酶。
在一个方面中，本发明涉及与seqidno:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％至少80％至少81％至少82％至少83％至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的分离的多肽在洗涤剂组合物和清洁过程，例如衣物洗涤和硬表面清洁中的用途。因而，在一个方面中，本发明展示了本发明的多种示例性蛋白酶对各种污物以及在各种条件下的洗涤效果。在本发明的特定的方面中，该洗涤剂组合物及在清洁过程中的用途涉及本发明的蛋白酶与以上提及的去污酶中的至少一种一起使用。
在本发明的优选的方面中，根据本发明有用的本发明的蛋白酶可以与至少两种酶组合。这些另外的酶详细描述于“其他酶”部分中，更优选是至少三种、四种或五种酶。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如碳水化合物分解活性(carbolyticactivity)、蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。酶组合可以例如是本发明的一种蛋白酶与另一种去污酶，例如本发明的一种蛋白酶与一种淀粉酶、本发明的一种蛋白酶与一种纤维素酶、本发明的一种蛋白酶与一种半纤维素酶、本发明的一种蛋白酶与一种脂肪酶、本发明的一种蛋白酶与一种角质酶、本发明的一种蛋白酶与一种果胶酶或本发明的一种蛋白酶与一种抗再沉积酶。更优选地，本发明的蛋白酶可以与至少两种其他去污酶组合，例如本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种淀粉酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种果胶酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种角质酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶及一种半纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种果胶酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种角质酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种脂肪酶及一种半纤维素酶。甚至更优选地，本发明的一种蛋白酶可以与至少三种其他去污酶组合，例如本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一种果胶酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一种角质酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一种纤维素酶；或本发明的一种蛋白酶、一种淀粉酶、一种脂肪酶及一张半纤维素酶。本发明的蛋白酶可以与任何选自非穷尽性列表的酶组合，该列表包括：糖酶(例如淀粉酶)、半纤维素酶、果胶酶、纤维素酶、黄原胶酶或支链淀粉酶，肽酶，其他蛋白酶或脂肪酶。
在本发明的另一个实施例中，本发明的蛋白酶可以与一种或多种金属蛋白酶组合，例如m4金属蛋白酶，包括neutrasetm或嗜热菌蛋白酶。此类组合可以进一步包括如上概述的其他洗涤剂酶的组合。
清洁过程或者纺织品护理过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室瓷砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用衣物洗涤，但是它也可以是工业衣物洗涤。此外，本发明涉及一种用于洗涤织物和/或衣物的方法，其中该方法包括用包含一种洗涤剂组合物和至少一种本发明的蛋白酶的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是包含洗涤剂组合物的水洗溶液。
经过洗涤、清洁的织物和/或衣物或者本发明的纺织品保养过程可以是常规的可洗涤衣物洗涤，例如家用洗涤。优选地，衣物洗涤的主要部分是衣物和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯弹性纤维(spandex)/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的例子是棉布和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料如羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。
最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学品而不损害清洗性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物比较时类似或改进的清洗性能。
本发明进一步涉及本发明的蛋白酶在除去蛋白质污物过程中的用途。蛋白质污渍可能是如食品污渍等污渍，如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血液、牛奶、墨水、草、或其组合。
典型的洗涤剂组合物包括除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污渍被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化去除颜色并且许多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。再其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。
在一个具体实施例中，本发明涉及包括本发明的蛋白酶的一种组合物在衣物或餐具洗涤中的用途，其中所述酶组合物进一步包括以下中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分。
在本发明的一个优选实施例中，表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的蛋白酶情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量有所减小。优选地，作为一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的该至少一种组分按以下量存在：比在不添加本发明的蛋白酶的情况下组分在系统中的量(例如，此组分的常规的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。在一个方面中，将本发明的蛋白酶用于洗涤剂组合物中，其中所述组合物不含至少一种组分，该组分是一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。
洗涤方法
包含本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物理想地适用于在衣物洗涤应用中使用。因此，本发明包括一种洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包含根据本发明的洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包含能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约9的ph。可以在溶液中按以下浓度使用这些组合物：从约100ppm，优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约90℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。
在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的ph下执行该洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约8。
在多个具体实施例中，在以下硬度下进行该洗涤方法：从约0°dh至约30°dh，例如约1°dh、约2°dh、约3°dh、约4°dh、约5°dh、约6°dh、约7°dh、约8°dh、约9°dh、约10°dh、约11°dh、约12°dh、约13°dh、约14°dh、约15°dh、约16°dh、约17°dh、约18°dh、约19°dh、约20°dh、约21°dh、约22°dh、约23°dh、约24°dh、约25°dh、约26°dh、约27°dh、约28°dh、约29°dh、约30°dh。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dh，在典型美国洗涤条件下，是约6°dh，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dh。
本发明涉及用包含本发明的蛋白酶的洗涤剂组合物清洁织物、餐具或硬表面的方法。
一个优选实施例涉及清洁方法，所述方法包括在适合于清洁物体的条件下将所述物体与包含本发明的蛋白酶的清洁组合物接触的步骤。在一个优选实施例中，该清洁组合物是一种洗涤剂组合物并且该过程是一个洗衣或餐具洗涤过程。
另一个实施例涉及一种用于从织物上除去污渍的方法，该方法包括在适合于清洁所述物体的条件下将所述织物与包含本发明的蛋白酶的组合物接触。
在优选实施例中，用于在以上方法中使用的组合物进一步包括至少一种如以上“其他酶”部分列出的另外的酶，如选自下组的酶，该组由以下组成：糖酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶，木聚糖酶或角质酶或其组合。在又另一个优选实施例中，这些组合物包括减少的量的以下组分中的至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分或聚合物。
还考虑了使用一种或多种本发明的蛋白酶处理织物(例如，使纺织品脱浆)的组合物和方法。可以任何织物处理方法使用蛋白酶，这些方法在本领域是已熟知的(参见，例如，美国专利号6,077,316)。例如，在一个方面中，通过如下方法改进织物的触感和外观，该方法包括将该织物与溶液中的蛋白酶接触。在一个方面中，在压力下用该溶液处理该织物。
在一个实施例中，在纺织品编织过程中或之后或者在脱浆阶段或一个或多个另外的织物加工步骤过程中应用该蛋白酶。在纺织品编织过程中，螺纹暴露于大量的机械应变中。在机械织布机上进行编织之前，为了提高拉伸强度并防止破裂，经常在经纱上涂上淀粉浆或淀粉衍生物。可以应用该蛋白酶来除去这些蛋白质浆或蛋白质衍生物。在编织完纺织品之后，织物可以进行到脱浆阶段。这之后可以是一个或多个另外的织物加工步骤。脱浆是从纺织品上除去浆料的作用。编织后，为了确保均匀和耐洗效果，应在对织物进行进一步加工之前除去所涂的浆料。还提供了一种脱浆方法，该方法包括通过酶的作用酶促水解浆料。
低温用途
本发明的一个实施例涉及一种进行衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁的方法，该方法包括使有待清洁的表面与本发明的一种蛋白酶接触，并且其中所述衣物洗涤、餐具洗涤、工业或机构清洁在约40℃或以下的温度进行。本发明的一个实施例涉及本发明的蛋白酶在衣物洗涤、餐具洗涤或清洁过程中的用途，其中衣物洗涤、餐具洗涤、工业清洁中的温度是约40℃或以下。
在另一个实施例中，本发明涉及本发明的蛋白酶在除蛋白过程中的用途，其中除蛋白过程中的温度是约40℃或以下。
因而，本发明的一个方面涉及与seqidno:2的成熟多肽具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的多肽的用途，该多肽在衣物洗涤、餐具洗涤或清洁过程中具有蛋白酶活性，其中在衣物洗涤、餐具洗涤、工业清洁中的温度是约40℃或更低。
本发明还涉及本发明的蛋白酶在衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁过程中的用途，该蛋白酶与具有(seqidno4)的枯草杆菌蛋白酶309蛋白酶相比具有至少一种改进的特性，并且其中衣物洗涤、餐具洗涤或工业清洁过程中的温度在约40℃或以下的温度进行。
在以上确定的方法和用途的每一者中，洗涤温度是约40℃或以下，例如约39℃或以下、例如约38℃或以下、例如约37℃或以下、例如约36℃或以下、例如约35℃或以下、例如约34℃或以下、例如约33℃或以下、例如约32℃或以下、例如约31℃或以下、例如约30℃或以下、例如约29℃或以下、例如约28℃或以下、例如约27℃或以下、例如约26℃或以下、例如约25℃或以下、例如约24℃或以下、例如约23℃或以下、例如约22℃或以下、例如约21℃或以下、例如约20℃或以下、例如约19℃或以下、例如约18℃或以下、例如约17℃或以下、例如约16℃或以下、例如约15℃或以下、例如约14℃或以下、例如约13℃或以下、例如约12℃或以下、例如约11℃或以下、例如约10℃或以下、例如约9℃或以下、例如约8℃或以下、例如约7℃或以下、例如约6℃或以下、例如约5℃或以下、例如约4℃或以下、例如约3℃或以下、例如约2℃或以下、例如约1℃或以下。
在另一个优选实施例中，洗涤温度在约5℃-40℃的范围内，例如约5℃-30℃、约5℃-20℃、约5℃-10℃、约10℃-40℃、约10℃-30℃、约10℃-20℃、约15℃-40℃、约15℃-30℃、约15℃-20℃、约20℃-40℃、约20℃-30℃、约25℃-40℃、约25℃-30℃或约30℃-40℃。在一个特别优选的实施例中，洗涤温度是约30℃。
在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的ph下执行该低温洗涤方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8，优选约5.5至约9，并且更优选约6至约9。
在具体实施例中，在以下硬度下进行该低温洗涤方法：从约0°dh至约30°dh，例如约1°dh、约2°dh、约3°dh、约4°dh、约5°dh、约6°dh、约7°dh、约8°dh、约9°dh、约10°dh、约11°dh、约12°dh、约13°dh、约14°dh、约15°dh、约16°dh、约17°dh、约18°dh、约19°dh、约20°dh、约21°dh、约22°dh、约23°dh、约24°dh、约25°dh、约26°dh、约27°dh、约28°dh、约29°dh、约30°dh。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dh，在典型美国洗涤条件下，是约6°dh，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dh。
在去除鸡蛋污渍中的用途
本发明的另一个具体实施例涉及鸡蛋污渍的去除。这些类型的污渍通常非常难于完全去除。鸡蛋污渍在硬表面清洁中是特别有问题的，例如餐具洗涤，其中污渍在洗涤后通常留在盘和刀具上。本发明的金属蛋白酶特别适于去除鸡蛋污渍。
因此，本发明进一步涉及用于从纺织品、织物和/或硬表面(像餐具和刀具)，特别是从织物和纺织品去除鸡蛋污渍的方法。本发明的优选的方面涉及一种从纺织品和/或织物去除鸡蛋污渍的方法，该方法包括使需要去除鸡蛋污渍的表面与本发明的金属蛋白酶接触。在一个实施例中，本发明包括一种从纺织品和/或织物去除鸡蛋污渍的方法，该方法包括使需要去除鸡蛋污渍的表面与包括本发明的金属蛋白酶的洗涤剂组合物接触。本发明还涉及一种去除鸡蛋污渍的方法，该方法包括向待洗衣物和/或在洗涤过程中添加本发明的金属蛋白酶，其中所述纺织品和/或织物包括不同鸡蛋污渍。
本发明的一个实施例涉及一种用于从硬表面或从待洗衣物去除鸡蛋污渍的方法，该方法包括将含鸡蛋污渍的硬表面或含鸡蛋污渍的衣物与包含本发明的金属蛋白酶的清洁或洗涤剂组合物，优选衣物洗涤或餐具洗涤组合物接触。
另一个实施例涉及一种用于从织物或纺织品去除鸡蛋污渍的方法，该方法包括使该织物或纺织品与包括本发明的金属蛋白酶的清洁或洗涤剂组合物，优选衣物洗涤或餐具洗涤组合物接触。
仍另外的实施例涉及一种用于从织物或纺织品去除鸡蛋污渍的方法，该方法包括使所述织物或纺织品与包括本发明的金属蛋白酶的组合物接触，其中所述组合物进一步包括至少一种如以上“其他酶”部分列出的另外的酶，例如一种选自下组的酶，该组由以下组成：糖酶、肽酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、角质酶或其组合。
在具体实施例中，在从约5.0至约11.5的ph下进行该除鸡蛋方法，或在替代性实施例中，甚至从约6至约10.5，例如约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9或约7至约8、约5.5至约9，优选约6至约8.5，并且更优选约6至约8。
在具体实施例中，在以下硬度下进行该除鸡蛋方法：从约0°dh至约30°dh，例如约1°dh、约2°dh、约3°dh、约4°dh、约5°dh、约6°dh、约7°dh、约8°dh、约9°dh、约10°dh、约11°dh、约12°dh、约13°dh、约14°dh、约15°dh、约16°dh、约17°dh、约18°dh、约19°dh、约20°dh、约21°dh、约22°dh、约23°dh、约24°dh、约25°dh、约26°dh、约27°dh、约28°dh、约29°dh、约30°dh。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约15°dh，在典型美国洗涤条件下，是约6°dh，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dh。
实例
材料与方法
标准洗涤剂的组成
在液体洗涤剂和粉末洗涤剂中研究了蛋白酶的洗涤性能，其具有以下组成：
表2：洗涤实验中使用的标准洗涤剂的组成(量以wt％表示)
将2％aeo添加至洗涤剂x和洗涤剂y中
测试材料
蛋白酶的洗涤性能在以下测试材料中研究：
c-05(在棉布上的血液/牛奶/墨水)
c-10(在棉布上的油/牛奶/颜料)
cs-37(在棉布上的整蛋连同非老化颜料)
empa117(在棉布上的血液/牛奶/墨水，额外的热处理)
empa164(在棉布上的草)
pc-03(在棉布/聚酯上的巧克力/牛奶/油墨)
pc-05(在棉布/聚酯上的血液/牛奶/墨水)
测试材料获得自测试材料bv中心，邮政信箱120，3133kt弗拉尔丁恩，荷兰和empa测试材料ag，
洗涤测定
用于衣物洗涤的自动机械应力测定(amsa)
为了评定洗涤性能，在衣物洗涤中使用自动机械应力测定(amsa)进行洗涤实验。使用amsa，可以检查大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。amsa平板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压衣物洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，将平板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性振荡方式施加机械应力。关于进一步描述，参见wo02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(specialmethodembodiments)”段落。
将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品被沾污时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(kodakiqsmart(柯达(kodak))、midtager29、dk-2605
为了从扫描的图像中提取光强度的值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(rgb)的值。可以通过将rgb值作为向量相加并随后考虑所得向量的长度计算强度值(int)：
terg-o-tometer(tom)对于衣物洗涤的洗涤测定
terg-o-tometer(tom)是一种中等规模标准洗涤系统，它可以用于同时测试16种不同的洗涤条件。tom基本上是大型的具有多达16个开放金属烧杯淹没至其中的温度受控的水浴。每个烧杯构成一个小的顶部加载型洗涤机器并且在实验期间，它们中的每一者将含有特定洗涤剂/酶系统的溶液并且在弄脏的和未弄脏的织物上测试其性能。通过旋转搅拌臂获得机械应力，该旋转搅拌臂用120rpm搅拌每个烧杯内的液体。
在tom实验中，因素如压载物与污垢的比率和织物与洗涤液的比率可以变化。因此，tom提供了在小规模实验(如amsa)与在全规模洗涤机中的更费时的全规模实验之间的联系。
在洗涤后，将小块布样在标签水下漂洗5min，并然后在洗涤后在室温(约20℃-25℃)和40％湿度在托盘上干燥过夜(12h-20h)。第二天用macbethcolor-eye7000分光光度计在460nm处测量小块布样。
蛋白酶测定
1)suc-aapf-pna测定：
pna底物：suc-aapf-pna(巴亨公司(bachem)l-1400)。
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mm琥珀酸，100mmhepes，100mmches，100mmcabs，1mmcacl2，150mmkcl，0.01％tritonx-100，用hcl或naoh调节至ph值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0及11.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％tritonx-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μlpna底物(50mg，溶解在1.0mldmso中，并进一步地用0.01％tritonx-100稀释45倍)开始进行测定。监测od405的增加作为蛋白酶活性的量度。
2)普罗塔酶ak(protazymeak)测定：
底物：普罗塔酶ak(protazymeak)片剂(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(megazyme))
温度：受控的(测定温度)。
测定缓冲液：100mm琥珀酸，100mmhepes，100mmches，100mmcabs，1mmcacl2，150mmkcl，0.01％tritonx-100，ph7.0。
通过温和搅拌，将普罗塔酶ak(protazymeak)片剂悬浮于2.0ml0.01％tritonx-100中。将500μl的这种悬浮液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％tritonx-100中)。通过将eppendorf管转移至设定为测定温度的eppendorf恒温混匀仪中来启动测定。将管在eppendorf恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm)下孵育15分钟。通过将该管转移返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取od650作为蛋白酶活性的量度。在测定中包括空白缓冲液(bufferblind)(代替酶)。
3)suc-aapx-pna测定：
pna底物：suc-aapa-pna(巴亨公司(bachem)l-1775)
suc-aapr-pna(巴亨公司(bachem)l-1720)
suc-aapd-pna(巴亨公司(bachem)l-1835)
suc-aapi-pna(巴亨公司(bachem)l-1790)
suc-aapm-pna(巴亨公司(bachem)l-1395)
suc-aapv-pna(巴亨公司(bachem)l-1770)
suc-aapl-pna(巴亨公司(bachem)l-1390)
suc-aape-pna(巴亨公司(bachem)l-1710)
suc-aapk-pna(巴亨公司(bachem)l-1725)
suc-aapf-pna(巴亨公司(bachem)l-1400)
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mm琥珀酸，100mmhepes，100mmches，100mmcabs，1mmcacl2，150mmkcl，0.01％tritonx-100，ph9.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％tritonx-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μlpna底物(50mg，溶解在1.0mldmso中，并进一步地用0.01％tritonx-100稀释45倍)开始进行测定。监测od405的增加作为蛋白酶活性的量度。
大豆-玉米粉测定法(smm测定法)
在ph3、4、5、6、和7处对大豆-玉米粉的蛋白酶活性
使用大豆-玉米粉作为底物的终点测定以获得在ph3-7时该蛋白酶的活性曲线。
测定缓冲液：100mm琥珀酸，100mmhepes，100mmches，100mmcaps，1mmcacl2，150mmkcl，0.01％tritonx-100，使用hcl或naoh调节以给出ph-值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，此时将10ml测定缓冲液与1g大豆-玉米粉(30:70比例)混合。
在添加蛋白酶之前将2ml大豆-玉米粉浆液混合30min，并且在40℃孵育3小时(500rpm)。经由100μl100mm乙酸钠(naac)缓冲液(9.565g/lnaac，1.75g/l乙酸，5mmcacl2，0.01％bsa，0.01％tween20，ph6.0)添加蛋白酶。在离心(10min，4000rpm，0℃)之后收集上清液，并且基于邻苯二醛(opa)方法使用比色测定来确定蛋白酶活性，该方法基本上根据nielsen等人(nielsen、pm,petersen、d,dampmann、c.用于确定食品蛋白质水解度的改进的方法(improvedmethodfordeterminingfoodproteindegreeofhydrolysis)，jfoodsci[食品科学杂志]，2001，66:642-646)。本测定检测游离α-氨基基团，并且因此蛋白酶活性可被测量为吸光度的增加。将每份上清液的第一个500μl通过100kda微量浓缩过滤器经由离心(60min，11,000rpm，5℃)进行过滤。将这些样品在去离子水中稀释10x，并将25μl的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。最后，将200μlopa试剂分配在所有孔中，并振荡该板(10sec，750rpm)，并且在340nm下测量吸光度。蛋白酶活性水平被计算为酶处理的样品和空白样品的吸光度之间的差异，并且表示为‘absx稀释系数’。
实例
实例1.来自芽孢杆菌属物种-13231的s8蛋白酶的克隆和表达
具有seqid:1中给出的核苷酸序列的蛋白酶原子从美国收集的土壤样品中分离的细菌菌株。来自纯的培养物中的染色体dna经过纯化并且经过使用illumina技术进行全基因组测序。装配的基因组序列和16s核糖体亚基基因序列对arb-silva数据库的后续分析(thesilvaribosomalrnagenedatabaseproject:improveddataprocessingandweb-basedtools[silva核糖体rna基因数据库项目：改进的数据处理和基于网络的工具]quast等人，nucl.acidsres.[核酸研究]41(2013):d590-d596.)证实该菌株的身份为芽孢杆菌属内的新物种，其被命名为芽孢杆菌属物种-13231。
编码蛋白酶的基因通过pcr扩增，并且与调节元件和同源区域融合，用于重组进枯草芽孢杆菌基因组。
线性整合构建体是soe-pcr融合产物(horton,r.m.,hunt,h.d.,ho,s.n.,pullen,j.k.和pease,l.r.(1989)，engineeringhybridgeneswithouttheuseofrestrictionenzymes,genesplicingbyoverlapextension[不使用限制酶，通过重叠延伸的基因剪接的工程化杂种基因]gene[基因]77:61-68)，该融合产物由两个枯草芽孢杆菌染色体区域之间的基因连同强启动子与氯霉素抗性标记的融合制备。soepcr方法也描述于专利申请wo2003095658中。
在三联启动子系统(如wo99/43835中所述)的控制下表达该基因，该启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyq)启动子和苏云金芽孢杆菌cryiiia启动子组成。
用克劳氏芽孢杆菌分泌信号(编码以下氨基酸序列：mkkplgkivastallisvafsssiasa)代替天然的分泌信号来表达该基因。
该soe-pcr产物被转化进枯草芽孢杆菌中并且在染色体上通过同源重组将其整合到果胶酸裂解酶位点中。随后将包含该整合表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆在液体培养基中进行生长。将培养液离心(20000xg，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开，并用于酶的纯化。
n-末端aqsvpwg通过埃德曼降解确定，得到269个氨基酸的成熟多肽。
实例2.分子量的确定：
使用maxisii电喷雾质谱仪(布鲁克-达尔托尼克公司(brukerdaltonikgmbh)，不来梅港市(bremen)，de)进行纯化的酶的完整分子量分析。将样品在mq水中稀释至0.1mg/ml。将稀释的样品应用于aeriswideporec4柱(phenom-enex)。将样品洗涤并从运行乙腈线性梯度的柱洗脱，并通过ultimate3000lc系统(dionex)以300ml/min的流速引入电喷雾源。用dataanalysis版本4.2(brukerdaltonikgmbh)，不来梅港市(bremen)，de)进行数据分析。通过原始数据的最大熵解捻值计算样品的分子量，其范围为10,000da至40.000da。在28873.08da分子量处观察到的主峰对应于seqid:2中成熟蛋白酶的0.3da内的计算的分子量。
实例3：衣物洗涤中的洗涤性能-terg-o-tometer(tom)
为了评定衣物洗涤中的洗涤性能，使用terg-o-tometer(tom)测定进行衣物洗涤实验。在以下指定的实验条件下进行tom实验：
如上所述，在tom洗涤中测试所示的蛋白酶。在20℃和40℃以不同的蛋白酶剂量在若干种不同的污渍上用液体和粉末洗涤剂进行测试。将洗涤性能与用于洗涤剂的已知的蛋白酶(savinase(seqidno4)，源自克劳氏芽孢杆菌的蛋白酶)进行比较。结果显示在表4和5中。
结果表明，芽孢杆菌属物种-13231s8蛋白酶在不同温度下在所有研究的污渍上的液体洗涤剂中具有良好的洗涤性能。特别是在洗涤剂j中，并且在某种程度上也在20℃，芽孢杆菌属物种-13231s8蛋白酶显示出优于已知衣物洗涤蛋白酶savinase的洗涤性能。
结果显示，芽孢杆菌属物种-13231s8蛋白酶在20℃和40℃在所有研究的污渍上都具有良好的洗涤性能。特别是在低剂量的洗涤剂x中，芽孢杆菌属物种-13231s8蛋白酶显示出与已知衣物洗涤蛋白酶savinase明显较好的洗涤性能。
序列表
<110>诺维信公司（novozymesa/s）
<120>具有蛋白酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸
<130>13238-wo-pct
<160>4
<170>patentin版本3.5
<210>1
<211>1140
<212>dna
<213>芽孢杆菌属物种13231
<220>
<221>cds
<222>(1)..(1140)
<220>
<221>信号肽
<222>(1)..(81)
<220>
<221>尚未归类的特征
<222>(1)..(3)
<223>seqidno:2中显示的多肽中的以及由seqidno:1中显示的多肽编码的的第一氨基酸（位置-111）应该是met而不是leu。当第一个密码子是ttg时，虽然ttg通常编码为leu，但编码为met。
<220>
<221>前肽
<222>(82)..(333)
<220>
<221>成熟肽
<222>(334)..(1140)
<400>1
ttgaataagaaaatggggaaaattgtagcaagtactgcactactc45
leuasnlyslysmetglylysilevalalaserthralaleuleu
-110-105-100
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ileserilealapheserserserilealaglnalaalaglugluala
-95-90-85
aaagaaaaatatctaattggattcaatgagcaagaagcggtttcaacc141
lysglulystyrleuileglypheasngluglnglualavalserthr
-80-75-70-65
tttgtcgagcaaatggaggaagatgcttttacaatccttgctgaagat189
phevalgluglnmetglugluaspalaphethrileleualagluasp
-60-55-50
aaagaagaggttgatattgaacttctctatgaatttgaaaccatccct237
lysglugluvalaspilegluleuleutyrgluphegluthrilepro
-45-40-35
gttttatcagtcgaattaagcccagacgatgtggcttcccttgagttg285
valleuservalgluleuserproaspaspvalalaserleugluleu
-30-25-20
gacccagcaatatcttatattgaagaagatttcgaagtaaccacgatg333
aspproalailesertyrileglugluaspphegluvalthrthrmet
-15-10-5-1
gcacaatcagttccttgggggattgaccgagttcaggcgccaattgct381
alaglnservalprotrpglyileaspargvalglnalaproileala
151015
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202530
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260265
<210>2
<211>380
<212>prt
<213>芽孢杆菌属物种-13231
<400>2
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<210>3
<211>27
<212>prt
<213>克劳氏芽孢杆菌
<400>3
metlyslysproleuglylysilevalalaserthralaleuleuile
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servalalapheserserserilealaserala
2025
<210>4
<211>269
<212>prt
<213>克劳氏芽孢杆菌
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