靶向基于甘露聚糖的肺炎克雷伯氏菌的O-抗原的抗体的制作方法
本发明涉及分离的抗体，该分离的抗体特异性识别肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的脂多糖(LPS)O3b-抗原结构的表位，其是包含迄今为止未识别的结构的并入O3b抗原中的O3b-表位。
背景技术：
肺炎克雷伯氏菌是导致显著的发病率和死亡率的医院内感染的重要肠道细菌病原体。多重耐药(MDR)菌株最近出现并在全球蔓延，对此的治疗方案有限。目前的目标是开发用于预防和治疗由MDR克雷伯氏菌菌株引起的感染的治疗性单克隆抗体。预期的mAb的分子靶标是认为是克雷伯氏菌表面上少数(如果不是唯一的)抗原之一的LPS O-抗原。
根据公布的关于O型分布的流行病学数据(1,2)，大多数临床相关的分离株属于4种血清型，即O1、O2、O3和O5。O1和O2抗原由半乳糖的均聚物(即半乳聚糖)组成，而O3和O5血清群由甘露糖均聚物(即甘露聚糖)组成(3)。
O3血清型以“经典的”五甘露糖结构为特征，显示于图1(发表于(3))。已经阐明了克雷伯氏菌O3抗原的五甘露糖结构(10)。编码该O3抗原的rfb操纵子已经以登录号AB795941.1保藏在Genbank中。
大肠杆菌血清型O8和O9分别具有与克雷伯氏菌血清型O5和O3结构相同的O-特异性甘露糖同多糖。已经描述了从大肠杆菌O9在血清上区分出大肠杆菌O9a(大肠杆菌O9亚型)的单克隆抗体(Sugiyama等人，1998，J.Bacteriol.180(10):2775-2778)。大肠杆菌O9和O9a在结构和血清学上彼此相似。
大肠杆菌O9的结构以及其遗传决定因子(genetic determinant)与克雷伯氏菌O3抗原的结构及遗传决定因子相同。证明了血清群O9的亚型，即大肠杆菌O9a是由WbdA内的点突变引起的(7)。O9a的结构显示为四甘露糖结构(8)。
表：O-特异性甘露糖同多糖的重复单元的结构(Sugiyama等人发表)
已经描述了抗大肠杆菌O9a单克隆抗体与克雷伯氏菌O3多糖交叉反应，表明在克雷伯氏菌O3菌株中存在大肠杆菌O9a型O多糖(Kido等人，1997，Microbiol.Immunol.41:519-525。所述抗体识别大肠杆菌O9a多糖但不识别大肠杆菌O9。明确O9和O9a多糖所需的甘露糖残基的最小数量确定为4，并且已经描述了4-甘露糖结构为抗体结合的表位的最短候选物。
Van der Meer等人(Infection and Immunity 1994,62(3):1052-1057)描述了针对明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)R595产生的单克隆抗体(mAb)且其对内核的结构具有特异性，该结构是α-3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖酸。所述抗体与几乎所有肺炎克雷伯氏菌的O-血清型反应，表明LPS核心中的表位如同明尼苏达沙门氏菌内核中的表位。
WO2008/135446A2公开了肽类克雷伯氏菌抗原和抗体。
Pollack等人(Journal of Clinical Investigation 1987,79(5):1421-1430)描述了识别LPS的核心-脂质A区域中的表位的mAb。
Yokochi等人(Infection and Immunity 1992,60(11):4953-4956)描述了来自肺炎克雷伯氏菌的LPS的佐剂活性。表明克雷伯氏菌O3LPS的佐剂性可能需要克雷伯氏菌脂质A部分和甘露糖同多糖部分的组合。
Curvall等人(Acta Chemica Scandinavica 1973,27:2645-2649)公开了克雷伯氏菌O3 LPS中O-特异性侧链的结构。描述了克雷伯氏菌O3：K58LPS由五糖重复单元组成。
存在对肺炎克雷伯氏菌的新靶标的需要。特别是，需要确定免疫相关的靶标且可以用于开发治疗剂和诊断剂。
技术实现要素：
本发明的目的是提供针对肺炎克雷伯氏菌的抗体，其具有改善的靶向病原体的相关性，用于预防或治疗肺炎克雷伯氏菌感染。进一步的目的是提供能够以快速和可靠的方式诊断肺炎克雷伯氏菌的手段和方法。
所述目的通过本发明的主题来解决。
根据本发明，提供了分离的抗体，其特异性识别肺炎克雷伯氏菌的脂多糖(LPS)O3b-抗原结构的表位，其为并入到包含式(I)结构的O3b-抗原中的O3b-表位，包括一种或多种O3b-抗原甘露糖均聚物重复单元，其中式(I)为：
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]n
其中，
MeP是磷酸甲酯；和
n是0-50。
特别地，磷酸甲酯基团位于甘露糖残基的非还原端。
O3b表位的具体特征在于式(I)所示的三甘露糖重复单元。
特别地，抗体是针对O3b-抗原结构产生的，或通过工程改造和选择技术获得的，并且通过结合至这样的结构或并入其中的O3b-表位来鉴定。
特别地，抗体能够结合这样的O3b-表位。
根据特定的方面，抗体与O3a-表位和/或O3-表位交叉反应，其中
a)O3a-表位并入包含式(II)结构的肺炎克雷伯氏菌的LPS O3a-抗原中，包括一种或多种O3a-抗原甘露糖均聚物重复单元，其中式(II)为：
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
其中m是0至50；
和
b)O3-表位并入包含式(III)结构的肺炎克雷伯氏菌的LPS O3-抗原中，包括一种或多种O3-抗原甘露糖均聚物重复单元，其中式(III)为：
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
其中m是0至50。
O3a表位的特别特征在于式(II)中所示的四甘露糖重复单元。
O3表位的特别特征在于式(III)中所示的五甘露糖重复单元。
此类交叉反应抗体的特征在于针对O3b-表位的O3特异性和针对O3a和O3表位之一或两者的进一步的交叉特异性。
特别地，抗体是泛O3特异性抗体，其特异性识别或结合O3b-表位并与O3a-表位和O3-表位交叉反应。交叉反应性特别地基于O3a和O3LPS抗原中存在O3b-表位。
例如，抗体是实施例中所述的泛O3特异性抗体，并且命名为2F8-G6或4D3-A4，或这种抗体的功能变体，例如基本上具有与2F8-G6或4D3-A4抗体相同的结合特异性的功能变体，或者竞争性结合O3b表位的功能变体。2F8-G6的具体特征在于在本文中提及的并入在保藏材料中的六个CDR序列和/或VH/VL序列。4D3-A4的具体特征在于在本文中描述的并入在HC和LC序列中的六个CDR序列和/或VH/VL序列。
特别地，2F8-G6或4D3-A4抗体及其功能变体的特征在于针对O3b表位和结构的结合特异性，其也并入在O3a和O3结构中，导致产生交叉反应性，也称为泛O3特异性。
为了提供变体，此类抗体在本文中称为亲本抗体，并且CDR或框架序列在本文中称为亲本CDR或亲本框架序列。
根据具体的方面，变体抗体与亲本抗体结合相同的表位。
根据进一步的具体方面，变体抗体包含与亲本抗体相同的结合位点。
功能活性变体抗体可以在任何VH或VL序列中不同，或者共享共同的VH和VL序列，并且包含相应FR中的修饰。通过诱变衍生自亲本抗体的变体抗体可以通过本领域公知的方法产生。
可特别地制造抗体的功能变体以获得CDR突变抗体，例如以改善抗体的亲和力和/或靶向亲本抗体所靶向的表位附近的相同的一个或多个表位(表位替换(epitope shift))。
特别地，功能活性变体是功能活性CDR变体，其在亲本CDR序列中包含至少一个点突变，并且包含或组成为与亲本CDR序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，优选具有至少70％，至少80％，至少90％序列同一性。
特异性功能变体具有亲和力，以小于10-8M，优选小于10-9M，优选小于10-10M，优选小于10-11M的Kd结合O3b-抗原，例如，具有皮摩尔范围的亲和力。
具体的变体是例如亲本抗体的人源化变体，其中将亲本CDR序列并入到人或人源化框架序列中，其中每个亲本CDR序列中的的任选1、2、3或4个氨基酸残基可以通过引入点突变进一步突变以提高亲本或人源化抗体的稳定性、特异性和亲和力。
根据具体方面，抗体包含例如不同来源的重组CDR和框架序列，其中CDR和框架序列中的至少一个包括人、人源化、嵌合的、鼠或亲和力成熟的序列，优选其中框架序列是任何免疫球蛋白同种型特别是IgG抗体的框架序列。
通过亲和力成熟产生的亲本抗体的变体，本文称为亲和力成熟变体，可以具有增加的结合亲和力，与亲本抗体相比，Kd差异为至少1个对数级(log)，或2个对数级，或3个对数级。亲和力成熟的变体通常具有结合O3b-抗原的亲和力，其具有小于10-8M或小于10-9M的Kd。如果亲本抗体具有小于10-8M或小于10-9M的Kd的亲和力，并且亲本抗体正在进行亲和力成熟，则亲和力成熟的变体可以具有甚至更高的亲和力，其Kd分别小于10-9M和小于10-10M。
根据具体的实施方案，抗体是2F8-G6抗体或竞争性结合其特异性表位的抗体，其中2F8-G6抗体的特征在于并入到如本文所述的保藏材料中的重链(VH)和轻链(VL)序列。
特别地，2F8-G6抗体的特征在于：
a)并入到保藏材料DSM 32059中的VH；和
b)并入到保藏材料DSM 32060中的轻VL。
根据另一具体实施方案，
抗体是4D3-A4抗体或竞争性结合其特异性表位的抗体。
特别地，4D3-A4抗体的特征在于以下任一：
a)图10中鉴定的6个CDR序列，特别是分别由SEQ ID 1、2、3、4、5和6鉴定的CDR1、2、3、4、5和6，其中编号是根据Kabat；或分别由SEQ ID 7、8、9、10、11和12鉴定的CDR1、2、3、4、5和6，其中编号是根据IMGT；和/或
b)图10中鉴定的VH和VL序列，特别是由SEQ ID 15鉴定的VH序列和由SEQ ID 16鉴定的VL序列；和/或
c)图10中鉴定的HC和LC序列，特别是由SEQ ID 13鉴定的HC序列和由SEQ ID 14鉴定的LC序列。
特别地，本文提及的根据Kabat的CDR序列理解为根据Kabat命名法确定的抗体的那些氨基酸序列(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，U.S.Department of Health and Human Services(美国卫生和人类服务部)(1991))。
特别地，如本文所提及的根据IMGT的CDR序列理解为根据IMGT系统确定的抗体的那些氨基酸序列(The international ImMunoGeneTics，Lefranc等人，1999，Nucleic Acids Res.27:209-212)。
优选地，通过竞争ELISA分析或ForteBio分析来确定结合竞争。
竞争性结合2F8-G6或4D3-A4抗体中任一种的任何示例性抗体的抗体或功能变体的具体特征在于通过竞争性ELISA分析或通过ForteBio分析确定的与其靶标结合的相对抑制，该相对抑制优选大于30％。
根据特定的方面，抗体相对于O3a-表位优先结合O3b-表位，或者其不与O3a-表位交叉反应，其中O3a-表位并入到肺炎克雷伯氏菌的LPS O3a-抗原结构的O3a-抗原重复单元中，其中O3a-抗原重复单元是式(II)的甘露糖均聚物。
根据另一特定方面，抗体相对于O3-表位优先结合O3b-表位，或者其不与O3-表位交叉反应，其中O3-表位并入到肺炎克雷伯氏菌的LPS O3-抗原结构的O3-抗原重复单元中，其中O3-抗原重复单元是式(III)的甘露糖均聚物。
特别地，所述优先结合是抗体的特有特征，其能够以比结合其它O3-抗原更高的亲和力和/或亲合力结合O3b-表位，特别是，相对于O3a-表位和/或O3-表位，抗体优先结合O3b-表位，例如，与任何其它O3-抗原相比，其结合O3b-表位或O3b-抗原的亲和力更高。根据具体实施方案，与任何其它的O3-抗原相比，所述抗体结合O3b-表位或O3b-抗原的亲和力至少高两倍，特别地至少两倍差异，或至少三倍，至少四倍，至少5倍，或甚至至少10倍的差异，例如亲和力和/或亲合力的差异。例如，优先结合O3b-抗原相对于O3a-抗原和/或O3-抗原的Kd差异是至少0.5或1个对数级(log)，或者甚至至少2个对数级，或者至少3个对数级差异，如通过免疫测定法，优选免疫印迹法、ELISA或其它免疫学方法所确定。
根据进一步的具体方面，抗体不与O3a-表位和O3-表位中的任何一个交叉反应。特别地，抗体以较低亲和力与任何其它O3-抗原结合，例如，其中优先结合O3b-表位或O3b-抗原相对于任何其它O3-抗原的Kd差异为至少2个对数级，优选至少3个对数级。
根据进一步的具体方面，抗体不与肺炎克雷伯氏菌的非O3LPS分子的表位交叉反应。这种非O3LPS分子是例如O1、O2、O4、O12LPS分子。特别地，抗体不与任何其它肺炎克雷伯氏菌抗原交叉反应，和/或抗体以较低亲和力与任何其它肺炎克雷伯氏菌抗原结合，例如，其中优先结合O3b-表位或O3b-抗原相对于其它肺炎克雷伯氏菌抗原(除O3b抗原外)的Kd差异至少为2个对数级，优选至少3个对数级。
特别地，非交叉反应通过使用O3b-抗原和其它抗原(所述抗体不显著结合)的ELISA测定或免疫印迹确定。
根据具体实施方案，抗体具有结合O3b-表位的亲和力，其具有小于10-7M，优选小于10-8M，甚至更优选小于10-9M，或优选小于10-10M，或优选小于10-11M的Kd，例如具有皮摩尔范围的亲和力。
特别地，泛O3特异性抗体能够以高亲和力结合O3b-表位、O3a-表位和O3-表位中的每一个，比如具有小于10-7M，优选小于10-8M，甚至更优选小于10-9M的Kd。
根据具体方面，抗体是中和抗体。特别地，抗体中和表达O3b或任何O3a或O3LPS分子的肺炎克雷伯氏菌菌株的内毒素，例如通过体外或体内检测方法测定。特别地，抗体在体外中和特定LPS分子的内毒素效应。
特别地，抗体中和表达O3b-表位或O3b-抗原的肺炎克雷伯氏菌菌株的内毒素，其中中和效力至少是参考抗体(例如，本文称为4D3-A4的示例性抗体)的效力。
特别地，抗体是交叉中和抗体，其具有中和效力以中和肺炎克雷伯氏菌菌株血清型O3b，以及O3a和O3中的至少一种或两者的内毒素，其中和效力至少为参考抗体(例如，本文称为4D3-A4的示例性抗体)的效力。
特别地，提供所述抗体用于细菌性杀灭O3b型的肺炎克雷伯氏菌。
根据具体方面，使用本发明抗体的免疫疗法可以有效地抵抗活细菌攻击，例如，如在各种动物模型中所测定的。
所述抗体可以特异性中和致死性内毒素血症。这种功能活性可以在适当的体内模型中确定(用纯的LPS进行攻击)。
抗体通过补体介导的杀灭特别地有效抵抗O3b型肺炎克雷伯氏菌，如通过体外血清杀菌测定法(SBA)确定的，例如高于对照样品(未添加抗体或添加不相关的对照mAb)至少20％的细菌杀灭。
抗体通过抗体介导的吞噬作用特别地有效抵抗O3b型肺炎克雷伯氏菌，如通过体外调理吞噬细胞杀伤试验(OPK)确定的，例如，比对照样品(未添加抗体或添加不相关的对照mAb)高至少20％的输入细菌摄取或低20％的最终CFU计数。
抗体通过中和内毒素功能特别地有效抵抗O3b-型肺炎克雷伯氏菌，如通过体外LAL测定法或toll样受体4(TLR4)报告测定确定的，例如与对照样品(未添加抗体或添加不相关的对照mAb)相比内毒素活性降低至少20％。
根据进一步的具体方面，抗体中和动物(包括人类和非人类动物)中的靶病原体，并抑制体内发病，优选任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎模型。
特别地，抗体是全长单克隆抗体，其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包含至少一个含有结合位点的抗体结构域，所述融合蛋白包含至少一个含有结合位点的抗体结构域，特别地，其中抗体是非天然存在的抗体，其包含随机或人造氨基酸序列。特别地，抗体是全长IgG1、双特异性IgG1或F(ab')2片段中的任一种。
特别地，抗体选自以下组：鼠，羊驼(lama)，兔，山羊，牛，嵌合的、人源化或人抗体，重链抗体，Fab，Fd，scFv和单结构域抗体如VH、VHH或VL，优选人IgG抗体或鼠IgG抗体。
根据具体实施方案，抗体至少包含抗体重链可变区或结构域(VH)，例如其特征在于2F8-G6或4D3-A4抗体的任何VH-CDR1至VH-CDR3序列，或其功能活性CDR变体。根据Kabat的编号系统特别命名CDR序列。
根据具体方面，抗体仅包含作为抗原结合部分的VH结构域，因此可包含VH-CDR1-3,例如2F8-G6或4D3-A4抗体的VH-CDR1-3，或2F8-G6或4D3-A4抗体的功能CDR变体，没有各自的VL结构域。
根据另一具体方面，抗体包含VH结构域并且还包含抗体轻链可变区或结构域(VL)，例如其特征在于2F8-G6或4D3-A4抗体的任何VL-CDR1至VL-CDR3序列，或其功能活性CDR变体。
根据另一具体方面，抗体包含2F8-G6或4D3-A4抗体中任一个抗体的结合位点，其特征在于6个CDR序列(其是VH-CDR1-3和VL-CDR1-3序列)，或其功能活性CDR变体。
根据Kabat的编号系统特别命名CDR序列。
根据具体的方面，本发明提供了示例性(亲本)2F8-G6或4D3-A4抗体以产生此类亲本抗体的抗体变体，特别是包括与亲本抗体结合基本上相同的表位的变体，亲本抗体的特征在于特异性结合位点，所述特异性结合位点通过以下形成：单独的VH序列或，如在序列表中鉴定的或可从保藏材料获得的VH和VL氨基酸序列两者，或通过相应的CDR序列。这样的抗体可以例如是通过修饰亲本抗体的相应CDR或抗体序列获得的功能活性变体抗体。很好理解的是，此处描述的任何抗体序列被认为是“亲本”序列，其经历例如通过点突变的变异。
实施例中描述的2F8-G6和4D3-A4抗体是鼠来源的，其已经与人序列嵌合。通过人源化和任选的亲和力成熟获得的变体可以使用公知的技术制造。这些变体抗体结合靶抗原，因此认为是功能活性的。可行的是，也可以使用例如在相应FR或CDR序列中具有修饰的变体VH或VL结构域，其具有功能活性，例如与亲本抗体结合相同的表位或包含相同的结合位点或具有相同的结合特征。本文所述抗体的一些FR或CDR序列可以由其它抗体的FR或CDR序列交换，也是可行的。
特别地，抗体包含2F8-G6或4D3-A4抗体的任何CDR序列的功能活性CDR变体，其中功能活性CDR变体包含以下中的至少一个：
a)亲本CDR序列中的1、2或3个点突变；和/或
b)亲本CDR序列的四个C末端或四个N末端或四个中心氨基酸位置中的任一个中的1或2个点突变；和/或
c)与亲本CDR序列具有至少60％的序列同一性；
优选地其中所述功能活性CDR变体在由少于4或5个氨基酸组成的任何CDR序列中包含1或2个点突变。
特别地，功能活性变体与亲本抗体不同，不同之处在于氨基酸序列中优选在CDR中的至少一个点突变，其中每个CDR氨基酸序列中的点突变的数目为0、1、2或3。
根据具体的方面，点突变是一个或多个氨基酸的氨基酸取代、缺失和/或插入中的任一个。
特别地，抗体是人、人源化、嵌合的或鼠源的。
根据具体的方面，本发明的抗体包含CDR和框架序列，其中CDR和框架序列中的至少一个包括人、人源化、嵌合的、鼠或亲和力成熟的序列，优选地其中框架序列是IgG抗体例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型的框架序列，或IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体的框架序列。
提供特定抗体作为框架突变抗体，例如以提高亲本抗体的可制造性或耐受性，例如以提供具有低免疫原性潜力的改良(突变)抗体，比如与亲本抗体相比，在任何CDR序列和/或框架序列中具有突变的人源化抗体。
特别地，抗体是单克隆抗体。特别地，抗体是非天然存在的抗体，比如包括人工可变和/或恒定结构域序列，例如从随机化序列文库获得的序列(比如Fc序列的CDR)。
根据具体方面，提供抗体用于治疗处于患有肺炎克雷伯氏菌感染或定植的风险或患有肺炎克雷伯氏菌感染或定植的主体，包括向主体施用有效量的抗体以限制主体中的感染或减轻由所述感染引起的病情，优选用于治疗或预防任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
优选地，用于治疗目的的抗体是中和靶病原体的LPS的中和抗体。
因此，本发明进一步提供了通过在相应适应症中施用有效量的抗体来治疗主体的方法。
特别地，抗体的使用是通过向主体施用有效量的抗体以限制主体中的感染或减轻由所述感染导致的病情，优选用于治疗或预防任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
特别地，主体是人类。特别地，主体是任何健康或患有疾病的人类。特别地，所述人类是免疫功能低下的(immunocompromised)或免疫抑制的患者或其接触者。
本发明进一步提供包含本文所述抗体的药物制剂，优选包含肠胃外(例如静脉内或肌肉内)或粘膜(例如口服)制剂，任选含有药学上可接受的载体或赋形剂。粘膜制剂是例如乳化的、纳米颗粒化的或雾化的。
这样的药物组合物可以含有抗体作为唯一的活性物质，或与其它活性物质，或者活性物质的混合物，比如至少两种或三种不同抗体的组合或混合物组合。
根据本发明，本发明的抗体具体用于医学、诊断或分析用途。
本发明进一步提供了本文所述的抗体用于诊断主体中的肺炎克雷伯氏菌感染或定植，或相关疾病，比如原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
特别地，提供抗体用于如本文所描述的用途，其中通过使所述主体的生物样品与抗体接触来离体测定主体中O3b型肺炎克雷伯氏菌的系统性感染或定植，其中抗体的特异性免疫反应确定所述感染或定植。
特别地，生物样品是体液或组织样品，优选选自以下组成的组：血液样品、粪便样品、皮肤样品、尿液样品、脑脊髓液和呼吸道样品如气管内抽吸物、胸膜液、肺液(lung tap)、鼻拭子或痰，或来自任何前述样品的肺炎克雷伯氏菌分离株。特别地，测试体液样品的特异性免疫反应，该样品选自尿液、血液、血液分离物或血液培养物、抽吸物、痰、插管主体的灌洗液和粪便。
特别地，处理生物样品以产生源自生物样品的肺炎克雷伯氏菌分离株，该分离株可以进一步表征其O3b基因型或表型，和/或O3b抗原表达水平。用于产生细菌分离株的优选样品制备方法是使用细菌富集和培养步骤。
特别地，处理生物样品以直接在样品中测定O3b-抗原水平，任选地在富集或纯化的准备步骤之后以降低基质效应并增加测试的特异性和敏感性。准备步骤包括根据标准培养程序培养生物样本，例如但不限于标准生长培养基中的血培养，以及如在常规微生物学实验室中进行的在固体琼脂上培养样本(包括表型分析-即抗菌谱)。细菌可以传代培养用于在不同生长培养基(标准培养基和/或化学成分确定的培养基；高营养、低营养、有限生长培养基组合物)中扩增CFU的表达以增强毒力因子的表达。可以制备细菌悬液并在标准缓冲溶液中洗涤以去除潜在的基质效应。
特别地，通过至少一种免疫测定法，优选ELISA、CIA、RIA、IRMA、凝集测定法、免疫层析法、试纸测定法和Western印迹/免疫印迹、生物传感器、阵列技术或质谱、核磁共振(NMR)中的任一种来测定O3b-抗原。
特别地，根据本发明的诊断用途是指从临床样本回收的纯肺炎克雷伯氏菌培养物体外测定肺炎克雷伯氏菌的血清型，以确定细菌是否为O3b型。
本发明进一步提供了本文所述抗体的诊断制剂，其在组合物或成套试剂盒(a kit of parts)中包含抗体和另外的诊断试剂，包含组分：
a)如本文所述的抗体；和
b)另外的诊断试剂；
c)和任选的固相，以固定抗体和诊断试剂中的至少一种。
诊断制剂任选地在组合物或成套试剂盒中包含本发明的抗体和另外的诊断试剂。
诊断试剂盒优选包含全部必要组分，以确定生物样品中的O3b-抗原表达，任选地没有常见或非特异性物质或组分，比如水、缓冲液或赋形剂。储存稳定的试剂盒可以优选储存至少6个月，更优选至少1或2年。它可以由干燥(例如冻干)组分组成，和/或包含防腐剂。
优选的诊断试剂盒作为包装或预包装单元提供，例如，其中组分仅包含在一个包装中，这有利于常规实验。这样的包装可以包括一个或多个测试所必需的试剂，例如适合于执行一系列生物样品的测试。所述试剂盒可以进一步适当地含有O3b-抗原制剂作为标准或参照对照。
诊断组合物可以是随时可用于与生物样品的反应混合物中的试剂，或这种试剂的保存形式，例如储存稳定的形式，比如冻干的；速冻(例如在液氮中)，超低温储存(-70℃和-80℃)，冷储存(-20℃和5℃)和控制的室温(15℃-27℃)；标准样品储存例如甘油贮存液、组织石蜡块、(口腔)拭子和其它标准生物样品储存方法，保存形式的试剂可以重构或制备以获得随时可用的试剂。这种随时可用的试剂的形式通常为水溶液，特别是(生理)缓冲液条件(例如EDTA缓冲液、磷酸盐缓冲液、HBSS、柠檬酸盐缓冲液等)。
特别地，所述另外的诊断试剂是与抗体和/或所述抗体结合其抗原的反应产物特异性反应的试剂。合适的诊断试剂适合用于进行用于诊断或监测肺炎克雷伯氏菌感染或定植的主体中的免疫测定。合适的诊断试剂可以是溶剂、缓冲液、染料、抗凝血剂、特异性结合本发明抗体和/或抗体-抗原免疫复合物的配体。
特别地，本发明提供了本发明的抗体的诊断制剂，其任选地含有具有标记的抗体和/或具有标记的另外的诊断试剂，比如特异性识别抗体或抗体与相应的靶抗原的免疫复合物的试剂，和/或固相以固定抗体和诊断试剂中的至少一种。
特别地，所述另外的诊断试剂是诊断标记或与抗体和/或抗体结合其抗原的反应产物特异性反应的试剂。
抗体或诊断试剂可以直接标记或间接标记。间接标记可以包含与O3b-抗原的抗体或诊断试剂形成复合物的标记结合剂。
标记通常是可以在测定中检测到的分子或分子的一部分。示例性标记是发色团、荧光染料或放射性分子。在一些实施方案中，抗体或诊断试剂与可检测的标记缀合，该可检测的标记可以包括其自身可检测的分子(例如荧光部分、电化学标记、金属螯合物等)以及可以通过可检测到的反应产物的产生而间接检测的分子(例如酶，比如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或通过自身可检测到的特异性结合分子而间接检测的分子(例如生物素、洋地黄毒苷(digoxigenin)、麦芽糖、寡聚组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐(phenylarsenate)、ssDNA、dsDNA等)。
优选的诊断制剂或测定法包括固定在固相上的本发明的抗体，固相例如乳胶微球、金颗粒等，例如以测试从待测试样品获得的O3b型细菌抗体的凝集。
本发明进一步提供了诊断由肺炎克雷伯氏菌菌株引起的主体中的肺炎克雷伯氏菌感染或定植的方法，包括：
a)提供如本文所述的抗体；和
b)检测抗体是否与待测试主体的生物样品中的O3b-表位特异性免疫反应，由此诊断肺炎克雷伯氏菌感染或定植。
特别地，生物样品是体液或组织样品，优选的样品选自由以下组成的组：血液样品、粪便样品、皮肤样品、尿液样品、脑脊髓液和呼吸道样本比如气管内抽吸物、胸膜液、肺液(tap)、鼻拭子或痰，或来自任何前述样品的肺炎克雷伯氏菌分离株。
这种诊断特别指明MDR肺炎克雷伯氏菌感染定植的情况，特别是针对O3b型的MDR肺炎克雷伯氏菌。任选地，诊断测定可以涉及两种不同抗体具有不同特异性和/或亲和力以结合O3b-抗原和/或任何其它O3a-抗原和O3-抗原，从而可能区分各种O3-抗原。
根据具体的方面，本发明提供伴随式诊断，以通过本发明的诊断或本发明的诊断方法测定肺炎克雷伯氏菌对主体的感染，以提供用针对这种感染的治疗剂进行治疗的基础，例如采用免疫疗法，比如用本发明的抗体进行治疗。
根据具体的方面，本发明提供了灵敏的床旁诊断，以通过测定游离LPS，例如来自活细菌数量有限的临床样本的游离LPS，来诊断肺炎克雷伯氏菌对主体的感染。此类测定的灵敏度具体小于100ng的LPS，优选小于10ng的LPS。
本发明进一步提供了编码如本文所述的抗体的分离的核酸。
本发明进一步提供了包含编码序列的表达盒或质粒以表达蛋白质构建体(construct)，比如包含或组成为多肽或蛋白质或蛋白质衍生物，包含如本文所述的抗体的VH和/或VL。
本发明进一步提供了包含如本文所述的表达盒或质粒的宿主细胞。
本发明进一步提供了产生如本文所述的抗体的方法，其中在产生所述抗体的条件下培养或维持宿主细胞。
特别优选的是宿主细胞和采用这类宿主细胞的产生方法，该宿主细胞包含：
-本发明的质粒或表达盒，其含有表达抗体轻链的编码序列；和
-本发明的质粒或表达盒，其含有表达抗体重链的编码序列。
根据另一方面，本发明提供了产生本发明抗体的方法，包括：
a)用肺炎克雷伯氏菌的O3b-抗原免疫非人动物并分离产生抗体的B细胞；
b)从分离的B细胞形成永生化细胞系；
c)筛选细胞系以鉴定产生特异性结合O3b-抗原和任选的O3a-抗原和/或O3-抗原的单克隆抗体的细胞系，例如其中确定与任何其它O3-抗原相比优先结合O3b-抗原；和
d)产生单克隆抗体，或该抗体的人源化或人形式，或其与单克隆抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
或者，所述方法包括筛选步骤：按照结合靶抗原的B细胞的单细胞分选，筛选从外周血分离的人供体的B细胞，并对免疫球蛋白基因克隆和测序。
本发明进一步提供了鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供含有抗体或抗体产生细胞的样品；和
b)评估样品中或由样品产生的抗体与本文定义的O3b-表位的结合，其中抗体与表位之间的阳性反应将抗体鉴定为候选抗体。
本发明进一步提供了鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供含有抗体或抗体产生细胞的样品；和
b)评估样品中或由样品产生的抗体与本文定义的O3b-表位的结合，其中相对于本文所定义的O3a-表位和/或O3-表位，或相对于肺炎克雷伯氏菌的任何非O3LPS分子，抗体和O3b-表位之间的特异性阳性反应将抗体鉴定为候选抗体。
特别地，如果候选抗体识别O3b-表位、O3a-表位和O3-表位，则鉴定为泛O3特异性抗体。
特别地，泛O3特异性抗体能够以高亲和力结合O3b-表位、O3a-表位和O3-表位中的每一个，比如具有小于10-7M，优选小于10-8M，甚至更优选小于10-9M的Kd。
特别地，泛O3特异性抗体不与非O3表位如O1、O2、O4和O12交叉反应或不明显交叉反应。
本发明进一步提供了产生如本文所述的抗体的方法，包括：
a)提供如本文所述鉴定的候选抗体；和
b)产生单克隆抗体，或候选抗体的人源化或人形式，或其与候选抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
附图说明
图1.肺炎克雷伯氏菌经典的O3抗原的结构。由N和Q形成的二糖结构是所谓的将五甘露糖O-抗原亚单元桥接至载体-引物(CP)的衔接子。最后的O-抗原重复通过终止子分子(T)封端，其实际上是Kubler-Kielb等人阐述的3-连接的甲基磷酸酯(4)
图2.属于O3血清群的肺炎克雷伯氏菌菌株的LPS模式的异质性。泳道1：PCM-11，2：Kp14，3：Kp62，4：Kp18，5：Kp35。
图3.从肺炎克雷伯氏菌的不同O3(泳道4-9)和不相关血清型(泳道1-3)菌株纯化的LPS样品的ProQ染色(A)和免疫印迹(B和C)。用1μg/ml的mAb 1G6-B8(B)或2F8-G6(C)进行免疫印迹。泳道1：#63(O1：K2)，2：#79(O2：K27)，3：Kp108(O5)，4：PCM-11，5：Kp14，6：Kp62，7：Kp18，8：Kp35，9：Kp82。
图4.肺炎克雷伯氏菌Kp81LPS的O-PS片段1a、1b、1c的1H NMR谱(左图)和MALDI-TOF MS谱(右图)。插图结构代表Kp81O-PS。*MeP-磷酸甲酯。
图5.肺炎克雷伯氏菌Kp81LPS的片段1b的负离子模式MALDI-TOF质谱。
图6.用各种特异性mAb对表达不同O3抗原的活的克雷伯氏菌菌株的表面染色。
图7.表1。对从肺炎克雷伯氏菌LPS(菌株Kp81)分离的O-PS(1a)观察到的1H NMR和13C NMR化学位移和残基间连接性。MeP：3.61，3.63/53.7，11.0Hz的JP,H。31P、1H HMBC显示P(～2ppm)与MeP的质子(3.61和3.63ppm)和C’的H-3(4.26ppm)之间的相关性。31P、1H HMQC-TOCSY显示P与C’残基的H-1、H-2、H-3、H-4、H-5之间的相关性。糖残基的异构体构型(α)基于171-174Hz的JH1,C1确定。b,c,d,e,f,g-重叠信号。
图8.肺炎克雷伯氏菌O3菌株的血清敏感性。指定O3亚型的对数中期培养物(3×103CFU/ml)在50％正常人血清中温育。在0、90和180分钟的时间点一式两份测定细菌数目。
图9.体外中和从O3a(A)或O3b(B)肺炎克雷伯氏菌菌株中提取的LPS的TLR-4信号传导。将LPS用不同浓度的抗体或多粘菌素B在96孔板中混合并在室温下温育30分钟。然后，将每孔5×104hTLR4HEK Blue细胞(InvivoGen)加入到反应中，并将混合物在37℃和5％CO2下温育过夜。测量OD630的吸光度，并将中和能力表示为分泌型碱性磷酸酶(SEAP)诱导的％抑制，其具有下式：％抑制＝100-[100×SEAP(mAb)/SEAP(仅LPS对照)]，其中SEAP是每种处理相对于不存在LPS的模拟未处理对照的信号。
图10.4D3-A4抗体序列
根据Kabat系统鉴定的抗体4D3-A4的CDR序列，CDR1(SEQ ID 1)、CDR2(SEQ ID 2)、CDR3(SEQ ID 3)、CDR4(SEQ ID 4)、CDR5(SEQ ID 5)、CDR6(SEQ ID 6)，(A)；并且列出根据IMGT系统命名CDR区的相同抗体，CDR1(SEQ ID 7)、CDR2(SEQ ID 8)、CDR3(SEQ ID 9)、CDR4(SEQ ID 10)、CDR5(SEQ ID 11)、CDR6(SEQ ID 12)，(B)。
缩写：
CDR1＝VH-CDR1
CDR2＝VH-CDR2
CDR3＝VH-CDR3
CDR4＝VL-CDR4或VL-CDR1
CDR5＝VL-CDR5或VL-CDR2
CDR6＝VL-CDR6或VL-CDR3
鉴定可变区和恒定区VH(SEQ ID 15)和VL(SEQ ID 16)的重链(HC，SEQ ID 13)和轻链(LC，SEQ ID 14)的全长序列，(C)。
可变区VH或VL：加粗和带下划线的大写字母
恒定区：正常的大写字母。
具体实施方式
如本文所用的术语“抗体”应指组成为或包含抗体结构域的多肽或蛋白质，抗体结构域理解为免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定和/或可变结构域，具有或不具有接头序列。如果包含由至少两条通过环序列连接的抗体结构域结构的β链组成的β-桶结构，则多肽理解为抗体结构域。抗体结构域可以是天然结构或通过诱变或衍生化修饰，例如修饰抗原结合性质或任何其它性质，比如稳定性或功能性质，比如与Fc受体FcRn和/或Fcγ受体的结合。
如本文所用的抗体具有特异性结合位点以结合一个或多个抗原或此类抗原的一个或多个表位，特别地包含单个可变抗体结构域如VH、VL或VHH的CDR结合位点，或可变抗体结构域对的结合位点，可变抗体结构域对如VL/VH对，包含VL/VH结构域对和恒定抗体结构域的抗体，比如Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fv，或全长抗体。
如本文所用的术语“抗体”应特别是指抗体形式，其包含或组成为单个可变抗体结构域如VH、VL或VHH，或具有或不具有连接序列或铰链区的可变和/或恒定抗体结构域的组合，包括可变抗体结构域对，如VL/VH对，包含或组成为VL/VH结构域对和恒定抗体结构域的抗体，如重链抗体、Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fd、Fv或全长抗体，例如IgG型(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)，IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。术语“全长抗体”可以用于指包含至少大部分Fc结构域和天然存在的抗体单体中常见的其它结构域的任何抗体分子。该短语在本文中用于强调特定抗体分子不是抗体片段。
术语“抗体”应特别包括分离形式的抗体，其基本上不含针对不同靶抗原的其它抗体或包含抗体结构域的不同结构排列。尽管如此，分离的抗体可以包含在组合制剂中，其含有分离的抗体与例如至少一种其它抗体比如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段的组合。
术语“抗体”应该用于动物来源的抗体，包括人类物种，比如哺乳动物，包括人、鼠、兔、山羊、羊驼(lama)、牛和马，或禽类，比如母鸡，该术语应该特别包括基于动物起源的序列(例如人类序列)的重组抗体。
术语“抗体”进一步适用于具有不同物种来源序列的嵌合抗体，比如鼠源和人源的序列。
关于抗体使用的术语“嵌合”是指那些抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与衍生自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而链的其余部分与另一物种或类别中的相应序列同源。典型地，轻链和重链的可变区都模拟衍生自一种哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分与衍生自另一种哺乳动物物种的抗体的序列同源。例如，可变区可以来源于目前已知的来源(使用容易获得的来自非人宿主生物的B细胞或杂交瘤)，与衍生自例如人细胞制备物的恒定区组合。
术语“抗体”可以进一步应用于人源化抗体。
关于抗体使用的术语“人源化”是指具有基本上源自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子，其中所述分子的剩余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可以包含融合到恒定结构域上的完整可变结构域或仅包含嫁接到可变结构域中适当框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或修饰的，例如通过一个或多个氨基酸取代，优选修饰来更接近类似人免疫球蛋白。某些形式的人源化抗体保留所有CDR序列(例如含有来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。其它形式具有一个或多个相对于原始抗体改变的CDR。
术语“抗体”进一步应用于人抗体。
关于抗体使用的术语“人”理解为包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。人抗体包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因动物中分离的抗体。
术语“抗体”特别应用于任何类别或亚类的抗体。根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将抗体分成主要类别的抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
所述术语进一步应用于单克隆或多克隆抗体，特别是重组抗体，该术语包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体和抗体结构，比如源自动物例如哺乳动物(包括人)的抗体，其包含来自不同来源的基因或序列，例如鼠、嵌合的、人源化抗体或杂交瘤衍生的抗体。进一步的例子涉及从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，或从抗体或抗体结构域的重组、组合文库中分离的抗体，或通过涉及剪接抗体基因序列到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。
应该理解，术语“抗体”还指抗体的衍生物，特别是功能活性衍生物。抗体衍生物理解为一个或多个抗体结构域或抗体的任何组合和/或融合蛋白，其中抗体的任何结构域可以在一个或多个其它蛋白质的任何位置融合，比如其它抗体，例如包含CDR环的结合结构，受体多肽以及配体、支架蛋白、酶、毒素等。抗体的衍生物可以通过各种化学技术比如共价偶联、静电相互作用、二硫键等与其它物质缔合或结合而获得。与抗体结合的其它物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机和无机分子或它们的任何组合(例如PEG、前药或药物)。在具体的实施方案中，抗体是包含允许与生物可接受的化合物特异性相互作用的其它标签的衍生物。对可用于本发明的标签没有特别限制，只要它对抗体与其靶标的结合没有负面影响或具有可耐受的负面影响即可。合适的标签的实例包括His-标签、Myc-标签、FLAG-标签、Strep-标签、钙调蛋白-标签、GST-标签、MBP-标签和S-标签。在另一个具体实施方案中，抗体是包含标记的衍生物。如本文所用的术语“标记”是指可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合至抗体以产生“标记的”抗体。所述标记本身可以被检测到，例如，放射性同位素标记或荧光标记，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。
如本文所述的优选衍生物在抗原结合方面具有功能活性，优选其具有抗肺炎克雷伯氏菌的效力，例如在SBA、OPK或LAL测定中测定的，或防止细菌攻击或中和内毒素血症的效力。
特别地，衍生自本发明抗体的抗体可以包含功能活性有差别地结合O3b-抗原(例如特异性或选择性地结合O3b-抗原)的至少一个或多个其CDR区或CDR变体。
衍生自亲本抗体或抗体序列(比如亲本CDR或FR序列)的抗体在本文中特别理解为通过例如在计算机(in silico)或重组工程中或者通过化学衍生或合成获得的突变体或变体。
应理解，术语“抗体”还指抗体的变体，包括具有亲本CDR序列的功能活性CDR变体的抗体和亲本抗体的功能活性变体抗体。
特别地，源自本发明抗体的抗体可以包含其至少一个或多个CDR区或CDR变体，例如重链可变区的至少3个CDR和/或轻链可变区的至少3个CDR，在CDR或FR区中的至少一个或在HC或LC的恒定区中具有至少一个点突变，具有功能活性，例如特异性结合O3b-抗原。
术语“变体”应特别指抗体，比如突变抗体或抗体片段，例如通过诱变方法获得，特别是缺失、交换，将插入物引入到特定抗体氨基酸序列或区域或化学衍生氨基酸序列，例如在恒定结构域中，以工程改造抗体稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变结构域中，以改善抗原结合性质，例如通过本领域可用的亲和力成熟技术。可以使用任何已知的诱变方法，包括在所需位置上的点突变，例如通过随机化技术获得。在某些情况下，位置是随机选择的，例如用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸使抗体序列随机化。术语“诱变”是指用于改变多核苷酸或多肽序列的任何本领域公认的技术。优选的诱变类型包括易错PCR诱变、饱和诱变或其它定点诱变。
术语“变体”应特别包含功能活性变体。
如本文所用的CDR序列的术语“功能活性变体”应理解为“功能活性CDR变体”，并且如本文所用的抗体的“功能活性变体”应理解为“功能活性抗体变体”。功能活性变体是指由该序列(亲本抗体或亲本序列)的修饰而产生的序列，所述修饰通过一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代，或化学衍化氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列内的核苷酸，或在序列的远端的任一端或两端，例如在CDR序列中N末端和/或C末端1、2、3或4个氨基酸，和/或居中的1、2、3或4个氨基酸(即在CDR序列的中间)，并且其修饰不会影响尤其是损害该序列的活性。在结合位点对选择的靶抗原具有特异性的情况下，抗体的功能活性变体仍将具有预定的结合特异性，尽管这可以改变，例如以改变特定表位的精确特异性(fine specificity)、亲和力、亲合力、Kon或Koff比率等。例如，亲和力成熟的抗体特别理解为功能活性变体抗体。因此，亲和力成熟的抗体中的修饰的CDR序列理解为功能活性的CDR变体。
特别地，本发明抗体的功能活性变体具有结合O3b-抗原的效力，或相对于其它O3-抗原或肺炎克雷伯氏菌的任何其它抗原优先结合O3b-抗原的特异性或选择性，例如与O3b-抗原结合并且不结合(或者基本上不结合)肺炎克雷伯氏菌的O3a-抗原或O3-抗原，或不与O3a-抗原或O3-抗原显著结合，和/或不结合肺炎克雷伯氏菌的其它抗原。
可以获得功能活性变体，例如通过改变亲本抗体的序列，例如包含与2F8-G6抗体相同的结合位点的抗体，但除了结合位点之外在抗体区域内具有修饰，或者通过结合位点内的修饰衍生自此类亲本抗体但不损害抗原结合的抗体，并且其优选具有与亲本抗体基本相同的生物活性，或者甚至具有改善的活性，包括特异性或选择性结合O3b-抗原的能力。
任选地，功能活性变体可以进一步包括中和效力和/或在SBA测定中的补体介导的杀伤效力，和/或任选地进一步包括在OPK测定中抗体介导的吞噬作用的效力，和/或任选地进一步包括在LAL测定中的内毒素中和功能，例如具有基本上相同的生物学活性，例如通过靶向肺炎克雷伯氏菌的特异性结合测定或功能测试所确定的。
如本文所用，关于结合靶抗原或生物学活性的术语“基本上相同”是指由基本上相同的活性表示的活性，是确定的可比(comparable)或亲本抗体的活性的至少20％，至少50％，至少75％，至少90％，例如至少100％，或至少125％，或至少150％，或至少175％，或例如高达200％，或甚至更高的活性。
如本文所述的优选的变体或衍生物在抗原结合方面具有功能活性，优选其具有特异性结合O3b-抗原的效力，或相对于其它O3-抗原或肺炎克雷伯氏菌的任何其它抗原优先结合O3b-抗原的特异性或选择性，例如与O3b-抗原结合并且不结合(或基本上不结合)肺炎克雷伯氏菌的O3a-抗原或O3-抗原，或不显著结合O3a-抗原或O3-抗原，和/或不与肺炎克雷伯氏菌的其它抗原结合。优选的变体不结合肺炎克雷伯氏菌的其它抗原，其Kd值差异为至少2个对数级，优选至少3个对数级，并且任选地进一步包括在SBA测定中的补体介导的杀伤效力，例如相对于不含抗体的对照样品实现细菌计数的显著降低，和/或任选地进一步包括在OPK测定中抗体介导的吞噬作用的效力，比如相对于不含抗体的对照样品实现细菌计数的显著降低，和/或任选地进一步包括在LAL或TLR4信号转导测定中的内毒素中和功能，比如相对于不含抗体的对照样品实现内毒素活性的显著降低，例如具有基本上相同的生物活性，如通过特异性结合测定或功能测试靶向肺炎克雷伯氏菌所确定的。在各种测定中活性的显著降低通常是指至少50％，优选至少60％、70％、80％、90％、95％或98％的降低，直至约100％(+/-1％)的完全降低。
在优选的实施方案中，亲本抗体的功能活性变体：
a)是抗体的生物活性片段，所述片段包含至少50％的分子序列，优选至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％，最优选至少97％、98％或99％；
b)通过至少一个氨基酸取代、添加和/或缺失而衍生自抗体，其中功能活性变体与分子或其一部分具有序列同一性，比如至少50％序列同一性的抗体，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，还更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少97％、98％或99％；和/或
c)由抗体或其功能活性变体和另外至少一个与多肽或核苷酸序列异源的氨基酸或核苷酸组成。
在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的抗体的功能活性变体与上述变体基本相同，但分别与其多肽或核苷酸序列不同，不同之处在于其来源于不同的物种的同源序列。这些称为天然存在的变体或类似物。
术语“功能活性变体”还包括天然存在的等位基因变体，以及突变体或任何其它非天然存在的变体。如本领域所知，等位基因变体是(多)肽的替代形式，其特征在于具有基本上不改变多肽的生物学功能的一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。
功能活性变体可以通过多肽或核苷酸序列中的序列改变来获得，例如通过一个或多个点突变，其中当与本发明组合使用时，所述序列改变保留或改善未改变的多肽或核苷酸序列的功能。这种序列改变可以包括但不限于(保守的)取代、添加、缺失、突变和插入。
特定的功能活性变体是CDR变体。CDR变体包括由CDR区中的至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学改变或部分改变，该修饰允许变体保留未修饰序列的生物特征。CDR氨基酸序列的部分改变可以通过一个至几个氨基酸的缺失或取代，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或者通过一个至几个氨基酸的添加或插入，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过一个到几个氨基酸的化学衍生，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或其组合。氨基酸残基中的取代可以是保守取代，例如，用一个疏水性氨基酸取代另一个疏水性氨基酸。
保守取代是发生在与它们的侧链和化学性质相关的氨基酸家族内的那些。这类家族的实例是具有碱性侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂肪族侧链、具有非极性芳族侧链、具有不带电荷的极性侧链、具有小侧链、具有大侧链等等的氨基酸。
点突变特别理解为多核苷酸的工程改造，其导致一个或多个单一(非连续的)或双重的氨基酸被取代或交换、缺失或插入成不同氨基酸而不同于非工程改造的氨基酸序列的氨基酸序列表达。
优选的点突变是指相同极性和/或电荷的氨基酸的交换。对此，氨基酸是指由64个三联体密码子编码的20种天然存在的氨基酸。这20种氨基酸可以分成那些具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：
下面显示了“中性”氨基酸以及它们各自的三个字母和单个字母的代码和极性：
丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；
天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；
半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；
谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；
甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；
异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；
亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；
蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；
苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；
脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；
丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；
苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；
色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；
酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；
缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；和
组氨酸：(His，H)极性，正(10％)中性(90％)。
“正”电荷氨基酸是：
精氨酸：(Arg，R)极性，正；和
赖氨酸：(Lys，K)极性，正。
“负”电荷氨基酸是：
天冬氨酸：(Asp，D)极性，负；和
谷氨酸：(Glu，E)极性，负。
关于本文所述的抗体序列和同源物的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为候选序列中与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，这是在序列比对并在必要时引入间隙以实现最大百分比序列同一性之后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大限度比对所需的任何算法。
抗体变体特别理解为包括具有特定糖基化模式的同源物、类似物、片段、修饰或变体，例如，由糖基化工程改造产生，它们是功能性的并且可以用作功能等价物，例如结合到特异性靶标并具有功能特性。
本发明的抗体可以显示或不显示Fc效应子功能。尽管作用模式主要由不具有Fc效应子功能的中和抗体介导，但Fc可以通过形成免疫复合物从循环中募集补体并帮助消除靶抗原如毒素。
特异性抗体可以没有活性Fc部分，因此其可以由不含有抗体的Fc部分或不含有Fcγ受体结合位点的抗体结构域组成，或包含缺乏Fc效应子功能的抗体结构域，例如通过修饰以降低Fc效应子功能，特别是消除或降低ADCC和/或CDC活性。可以工程改造可替代的抗体以引入修饰来增加Fc效应子功能，特别是增强ADCC和/或CDC活性。
这种修饰可通过诱变来实现，例如Fcγ受体结合位点中的突变或通过衍生物或试剂干扰抗体形式的ADCC和/或CDC活性，从而实现Fc效应子功能的减少或增加。
Fc效应子功能的显著降低通常理解为是指通过ADCC和/或CDC活性测量的Fc效应子功能是未修饰(野生型)形式的小于10％，优选小于5％。通常理解Fc效应子功能的显著增加是指通过ADCC和/或CDC活性测量的Fc效应子功能增加是未修饰(野生型)形式的至少10％，优选至少20％、30％、40％或50％。
关于抗体序列，术语“糖基化工程改造”变体应指由于糖基化工程改造而具有修饰的免疫调节(例如抗炎)性质的糖基化变体。所有抗体在重链恒定区的保守位置含有碳水化合物结构，每种同种型都具有一系列不同的N-连接的碳水化合物结构，其可变地影响蛋白质组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是在每个CH2结构域的N297处具有保守的N-连接的糖基化位点的糖蛋白。与N297连接的两个复合双触角寡糖掩埋在CH2结构域之间，与多肽主链形成广泛接触，并且它们的存在对于抗体结合Fc受体并介导效应子功能是必需的。除去N297处的N-聚糖，例如通过突变N297，例如至A，或T299，通常导致具有减少的ADCC的非糖基化抗体形式。特别地，本发明的抗体可以是糖基化的或糖基化工程改造的或无糖基化的抗体。
抗体糖基化的主要差异发生在细胞系之间，或甚至在不同培养条件下生长的相同细胞系中。在细菌细胞中的表达通常提供非糖基化抗体。用编码人β-1,4-半乳糖基转移酶1和β-半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶1的基因转染的CHO细胞提供具有半乳糖基化和α-2,6-唾液酸化的抗体。除了选择宿主细胞之外，在重组产生抗体期间影响糖基化的因子包括生长模式、培养基配方、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等。
术语“抗原结合位点”或“结合位点”是指参与抗原结合的抗体部分。抗原结合位点由重(“H”)和/或轻(“L”)链的N端可变(“V”)区域或其可变结构域的氨基酸残基形成。称为“高变区”的重链和轻链V区内的三个高度不同的区段插入在称为框架区的更保守的侧翼区段之间。抗原结合位点提供了与结合的表位或抗原的三维表面互补的表面，并且高变区称为“互补决定区”或“CDR”。并入CDR中的结合位点在本文中也称为“CDR结合位点”。
与如本文所使用的术语“抗原”可互换的术语“靶”或“靶抗原”应指完整的靶分子或由抗体结合位点识别的此类分子的片段。特别地，抗原的亚结构，例如多肽或碳水化合物结构，例如通常称为“表位”，例如B细胞表位或T细胞表位，其是免疫相关的，可以通过这样的结合位点识别。特定抗原如各种O3-抗原包含碳水化合物(甘露聚糖)结构，并且可以作为任选提供在人造载体上的分离的抗原提供，或者以表达抗原的肺炎克雷伯氏菌细胞或其细胞部分的形式提供。
如本文所使用的术语“表位”应特别指可完全构成抗体结合位点的特异性结合配偶体或特异性结合配偶体的一部分的分子结构。表位可以由碳水化合物、肽结构、脂肪酸、有机物、生物化学或无机物质或其衍生物及其任何组合组成。如果表位包含在肽结构中，如肽、多肽或蛋白质中，则其通常包含至少3个氨基酸，优选5至40个氨基酸，更优选约10-20个氨基酸。表位可以是线性或构象表位。线性表位由多肽或碳水化合物链的一级序列的单个片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。
构象表位由通过折叠多肽形成三级结构而聚集在一起的氨基酸或碳水化合物组成，并且所述氨基酸不一定在线性序列中彼此相邻。特别地，关于多肽抗原，构象表位或不连续表位的特征在于存在两个或更多个分离的氨基酸残基，其在一级序列中分开，但当所述多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，在分子表面组装成一致的结构。
本文中术语“表位”应特别指由抗体识别的单个表位，或由至少两种不同抗原共享且任选由交叉反应性抗体识别的交叉反应性表位。
术语“表达”通过以下方式理解。含有表达产物(如本文所述的抗体)的所需编码序列和控制序列如可操作连接的启动子的核酸分子可用于表达目的。用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码的蛋白质。为了实现转化，可以将表达系统包含在载体中；但是，相关的DNA也可以整合到宿主染色体中。特别地，所述术语是指宿主细胞和相容的载体在合适的条件下，例如用于表达由载体携带并导入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白质。
编码DNA是编码特定多肽或蛋白质(比如抗体)的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是启动、调节或介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自相同的基因或来自不同的基因，并且可以来自相同或不同的生物体。重组克隆载体通常会包括一个或多个用于克隆或表达的复制系统、一个或多个在宿主中用于选择的标记，例如抗生素抗性，和一个或多个表达盒。
本文使用的“载体”定义为克隆重组核苷酸序列(即重组基因)转录和它们的mRNA在合适的宿主生物体中翻译所需的DNA序列。
“表达盒”是指编码可在限定的限制性位点处插入到载体的表达产物的DNA编码序列或DNA片段。盒式限制性位点设计用于确保盒在适当的阅读框中的插入。通常，将外源DNA插入载体DNA的一个或多个限制性位点，然后由载体携带与可传播载体DNA一起进入宿主细胞中。具有插入的或添加的DNA的DNA片段或序列，比如表达载体，也可称为“DNA构建体”。
表达载体包含表达盒并且另外通常包含在宿主细胞中自主复制的起点或基因组整合位点、一个或多个可选择的标记(例如氨基酸合成基因或赋予抗生素(比如博莱霉素、卡那霉素、G418或潮霉素)抗性的基因)、大量限制酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些组件可操作地连接在一起。如本文所用的术语“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合的核苷酸序列。常见类型的载体是“质粒”，其通常是双链DNA的自含式分子，其可以容易地接受另外的(外源)DNA并且可以容易地引入合适的宿主细胞中。质粒载体通常含有编码DNA和启动子DNA，并具有一个或多个适合插入外源DNA的限制性位点。特别地，术语“载体”或“质粒”是指可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞中以便转化宿主并促进表达(例如转录和翻译)引入序列的媒介。
如本文所用的术语“宿主细胞”应指经转化以产生特定重组蛋白(如本文所述的抗体)的原代主体细胞，及其任何子代。应该理解的是，并非所有子代都与亲本细胞完全相同(由于有意或无意的突变或环境差异)，但是，这些改变的子代包括在这些术语中，只要子代保留与原始转化细胞相同的功能。术语“宿主细胞系”是指用于表达重组基因以产生重组多肽如重组抗体的宿主细胞的细胞系。如本文所用的术语“细胞系”是指已经获得了长时间增殖能力的特定细胞类型的已建立的克隆。这种宿主细胞或宿主细胞系可以维持在细胞培养中和/或经培养以产生重组多肽。
本文所用的关于核酸、抗体或其它化合物的术语“分离的”或“分离”应指这样的化合物，其与其天然结合的环境充分分离，使得以“基本上纯”的形式存在。“分离的”不一定意味着排除具有其它化合物或材料的人造或合成混合物，或存在不干扰基本活性的杂质，并且可以存在例如由于不完全纯化而存在的杂质。特别地，本发明分离的核酸分子还旨在包括不是天然存在的例如密码子优化的核酸或cDNA，或化学合成的那些。
同样，本发明分离的抗体特别地非天然存在，例如提供于与另一抗体或活性剂的组合制剂中，所述组合不是天然存在的，或天然存在的抗体的优化的或亲和力成熟的变体，或具有经工程改造以改善抗体的可制造性的框架区的抗体。通过这样优化或改造，抗体包含一个或多个合成序列或特征，其不会在自然界中抗体的背景下发现。
关于本发明的核酸，有时使用术语“分离的核酸”。这个术语，当应用于DNA时，是指从与它在其起源的生物体的天然存在的基因组中紧邻的序列中分离的DNA分子。例如，“分离的核酸”可以包含插入到载体(比如质粒或病毒载体)或整合到原核或真核细胞或宿主生物体的基因组DNA中的DNA分子。当应用于RNA时，术语“分离的核酸”主要指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者，所述术语可指从其天然状态下(即在细胞或组织中)与其相关的其它核酸充分分开的RNA分子。“分离的核酸”(DNA或RNA)可以进一步表示由生物或合成手段直接产生的分子，并将其与其产生过程中存在的其它组分分开。
关于多肽或蛋白质，比如本发明的分离的抗体或表位，术语“分离的”应具体指没有或基本上不含与它们天然相关的物质的化合物，比如在发现它们的自然环境中的其它化合物，或当通过重组DNA技术在体外或体内实施这种制备时其制备环境(例如细胞培养)中的其它化合物。分离的化合物可以用稀释剂或佐剂配制，并且仍然对于实际目的是分离的-例如，当用于诊断或治疗时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。特别地，本发明的分离的抗体不同于针对肺炎克雷伯氏菌菌株产生的多克隆血清制剂，因为其以分离和纯化的形式提供，优选提供于包含分离的抗体作为唯一活性物质的制剂中。但是，这并不排除分离的抗体提供于包含有限数量的其它明确定义的(分离的)抗体的组合产品中。分离的抗体也可以提供在固体、半液体或液体载体，比如珠粒上。
术语“中和(neutralizing)”或“中和(neutralization)”在本文中以最广泛的含义使用，是指任何抑制病原体如肺炎克雷伯氏菌感染主体，或抑制病原体通过产生内毒素来促进感染，或抑制内毒素发挥其生物活性的分子，而不考虑其实现中和的机制。可以通过例如抑制肺炎克雷伯氏菌对粘膜表面的定植、侵入无菌身体部位以及在宿主中引发不利的生物信号(在最坏情况下诱导感染性休克)的抗体来实现中和。
严格意义上的中和意指抑制特定LPS与其同源受体(例如Toll样受体-4复合物)结合并因此引起生物活性。这种中和效力通常在标准测定中确定，例如体外或体内中和测定，例如LAL测试或基于TLR-4的测定，其中内毒素的生物活性的抑制例如通过比色法测量。
抵抗或中和肺炎克雷伯氏菌的抗体干扰病原体和致病反应，因此能够限制或预防感染和/或改善由这种感染引起的病情，或抑制肺炎克雷伯氏菌的发病机理，特别是传播和复制进入宿主的无菌体腔/位点或在宿主的无菌体腔/位点内传播和复制。就此而言，中和抗体还理解为“保护性抗体”，意思是所述抗体负责对主动或被动免疫中观察到的传染原(infectious agent)免疫。特别地，如本文所述的中和抗体或保护性抗体可能用于治疗目的，例如用于预防或治疗，以预防、改善、治疗或至少部分阻止由病原体诱导的疾病症状、副作用或疾病进展。特别地，保护性抗体能够通过例如诱导血清杀菌或调理吞噬活性来杀死或阻止活的肺炎克雷伯氏菌细胞的复制，或者在治疗性应用(即在确定的感染时给予)之后从无菌体部位除去整个细菌细胞或其LPS分子。或者，预防性应用的保护性抗体通过上述或其它机制之一抑制感染的建立(即肺炎克雷伯氏菌从非无菌部位扩散至无菌体腔)。
本文使用的术语“生物样品”是指从主体(比如人类)获得的任何材料，含有或可能含有可包含肺炎克雷伯氏菌的生物材料。生物样品可以是组织、液体或细胞培养样品。根据本发明使用的样品的实例包括但不限于患者样品，例如组织或体液，特别是呼吸道样本，比如气管内抽吸物、胸膜液、肺液、鼻拭子或痰、血液样品、粪便样品、皮肤和尿液样品或脑脊髓液。
生物样品通常包含复杂的生物基质，比如含有多种类型的生物和小的有机分子的复杂粘性生物流体，例如富含蛋白质物质的粘液渗出物。可以使用合适的添加剂或提取程序来减少与样品中的基质相关的非特异性结合和/或通过溶解和/或分解样品基质的粘性或固体组分来降低基质粘度。可采用样品制备方法，其从生物体中释放标记和/或分解和/或液化生物基质。可以分析的生物基质包括含有粘液的样品，比如鼻分泌物、唾液、痰、咽分泌物、尿道或阴道分泌物，以及这些膜表面的洗涤物。
合适的样品制备方法包括减少生物基质对测定的影响的方法步骤。这样的方法步骤可以包括但不限于例如捕获、色谱法、旋转-离心和透析。
从主体获得的物质也可以是细菌分离物的形式，例如用于培养分离的肺炎克雷伯氏菌的细胞培养物或细胞培养产物的形式。培养基可以有选择性地仅仅富集肺炎克雷伯氏菌群，或是非选择性的。
细菌分离物制备通常涉及孵育步骤以保持样品处于增强肺炎克雷伯氏菌增殖的条件下，从而富集样品中的肺炎克雷伯氏菌群。
一旦获得分离物，可通过生物化学和/或血清学测试进一步研究细菌，例如以确定O型和O3b-抗原表达的水平。有几种分型方法可用于研究肺炎克雷伯氏菌菌株。这些方法通常包括血清分型、毒素分型、遗传关系/系统发育的标准分型包括多位点序列分型(MLST)，或脉冲场凝胶电泳(PFGE)。
如本文所用的术语“O3b-抗原”也称为“O3b-型”应指式(I)中所示的肺炎克雷伯氏菌的LPS O-抗原的(含甲基磷酸酯)碳水化合物结构，特别是包含甘露聚糖聚合物和包含包括在式(I)中的至少一种三甘露糖重复单元的结构。迄今尚未鉴定这种结构和三甘露糖重复单元。该结构与O3a-抗原(式(II))或O3-抗原(式(III))的结构相似但不同。因此，令人惊讶的是，新鉴定的O3b-结构包含不同的表位。先前发现特异性识别O3-抗原的五甘露糖结构的抗体不识别O3a-抗原(四甘露糖结构)。定义O3a和O3多糖所需的甘露糖残基的最小数量在现有技术中描述为4，并且发现抗体表位的最短候选物是四甘露聚糖(参见(7))。O3b在本文中理解为新的血清型决定簇，其与O3a或O3血清型相似但不同，O3a或O3血清型的特征在于存在其它O3-抗原并且不存在O3b(三甘露糖)结构。
在本文中包含O3b结构的相应O-抗原称为“O3b-抗原”，其包括由本发明的O3b-特异性抗体识别的“O3b-表位”。O3b抗原理解为O3b O型肺炎克雷伯氏菌LPS的外部部分，其为包含并入其中的一种或多种特定O3b-表位的表面可及的抗原性碳水化合物结构。
O3b-型肺炎克雷伯氏菌的基因型的特征在于基因wbdD和wbdA序列与O3和O3a-型肺炎克雷伯氏菌菌株rfb操纵子中相应基因相比，同源性低。
以包含至少一个O3b结构的LPS O-抗原为特征的任何肺炎克雷伯氏菌在本文中称为O3b-型肺炎克雷伯氏菌。O3b-型肺炎克雷伯氏菌的LPS可以包含O3b结构，或包含两种，O3b与O3a和/或O3结构。
O3a-抗原理解为O3a-型肺炎克雷伯氏菌LPS的外部部分，其为包含并入其中的一种或多种特定O3a-表位的表面可及的抗原性碳水化合物结构，并且其不包含任何O3b-结构。
O3-抗原理解为O3-型肺炎克雷伯氏菌的LPS的外部部分，其为包含并入其中的一种或多种特定O3-表位的表面可及的抗原性碳水化合物结构，并且其不包含任何O3b-结构或O3a-结构。
如本文所用的术语“O3-抗原”应指所有的O3b、O3a和O3-抗原。当比较O3b-抗原与其它O3-抗原时，其它O3-抗原应指O3a-抗原和/或O3抗原。
如本文所用的关于由“泛-O3-抗体”识别的靶抗原的术语“泛-O3”应指所有的O3b-抗原、O3a-抗原和O3-抗原，以及交叉反应性但O3-特异性的抗体识别O3b-抗原、O3a-抗原和O3-抗原中的每一种。
如本文所用的，“特异性”结合、识别或靶向是指结合剂例如抗体或其抗原结合部分，对分子的异源群中的靶抗原或相应表位表现出可观的亲和力。因此，在指定条件下(例如免疫测定)，结合剂特异性结合靶O3b抗原并且不以显著的量结合样品中存在的其它分子。特异性结合是指结合在所选的靶标同一性，高、中或低结合亲和力或亲合力(按照选择)方面是选择性的。与另一靶标相比，如果结合常数或结合动力学至少是10倍差异(理解为至少1个对数级差异)，优选差异为至少100倍(理解为至少2个对数级差异)，更优选至少1000倍(理解为至少3个对数级差异)，则通常实现选择性结合。
术语“特异性”也理解为应用于结合一种或多种分子的结合剂，例如交叉特异性结合剂。优选的交叉特异性(也称为多特异性或交叉反应性)结合剂靶向至少两个不同靶标或表位或这些靶标的核苷酸序列，或靶向至少两个不同靶标上的交叉反应性表位或核苷酸序列，以基本相似的结合亲和力特异性结合靶标，例如具有小于100倍的差异或甚至小于10倍的差异，或者具有基本上不同的结合亲和力，例如具有至少10倍或至少100倍的差异。交叉特异性结合剂识别第一(例如O3b-抗原)和第二(例如，O3a-抗原和任选还有O3抗原)靶标，其优先结合第一靶标超过第二靶标，通常特征为通过相对于第二靶标，对第一靶标具有相等的亲和力或更高的亲和力，特别地其中相对于第二抗原优先结合第一抗原的差异结合亲和力具体地至少相等或大于相等，例如高至少1.5倍，或至少2倍，或至少3倍，或至少4倍，或至少5倍，或至少6倍，或至少7倍，或至少8倍，或至少9倍，或至少10倍。这种差异结合可以通过免疫测定优选免疫印迹、ELISA或其它免疫学方法来测定。
本发明的优选抗体以高亲和力(特别是以高缔合和/或低解离速率)或高结合亲合力结合O3b-抗原(仅O3b，或相对于O3a-抗原和/或O3-抗原优先结合O3b)。抗体的结合亲和力通常以抗体的浓度来表征，其中抗原结合位点的一半被占据时的抗体浓度，称为解离常数(Kd或KD)。通常认为具有Kd<10-7M的结合剂是高亲和力结合剂，在一些情况下，例如出于治疗目的，具有更高的亲和力，例如Kd<10-8M，优选Kd<10-9M，甚至更优选的是Kd<10-10M。
然而，在特别优选的实施方案中，单独的抗原结合亲和力是中等亲和力，例如当与至少两个抗原结合时Kd小于10-6M且至多10-8M。
可以根据本发明提供中等亲和力结合剂，优选与亲和力成熟过程结合，如果有需要。
亲和力成熟是产生对靶抗原具有增加的亲和力的抗体的过程。根据本文公开的本发明的各种实施方案，可以使用本领域可用的制备和/或使用亲和力成熟文库的任何一种或多种方法以产生亲和力成熟的抗体。示例性的此类亲和力成熟的方法和用途，比如随机诱变、细菌突变株传代、定点诱变、突变热点靶向、简约诱变、抗体改组、轻链改组、重链改组、CDR1和/或CDR1诱变，和根据本文公开的本发明的各种实施方案生产和使用适合实施方法和用途的亲和力成熟文库的方法，包括例如Prassler等人；Immunotherapy,卷1(4),571-583页；Sheedy等人(2007),Biotechnol.Adv.,卷25(4),333-352页；WO2012/009568；WO2009/036379；WO2010/105256；US2002/0177170；WO2003/074679中公开的那些。
随着抗体的结构变化(包括氨基酸诱变或由于免疫球蛋白基因区段中的体细胞突变)，产生针对抗原的结合位点的变体并选择更大的亲和力的变体。亲和力成熟的抗体可表现出比亲本抗体高几个log的亲和力。单个亲本抗体可以经历亲和力成熟。或者，对靶抗原具有相似结合亲和力的抗体库可视为亲本结构，其经变化以获得亲和力成熟的单独抗体或亲和力成熟的此类抗体的库。
根据本发明的抗体的优选亲和力成熟变体显示结合亲和力增加至少2倍，优选至少5倍，优选至少10倍，优选至少50倍，或优选增加至少100倍。在相应亲本分子的文库的选择活动过程中可以采用亲和力成熟，或者采用具有中等结合亲和力的抗体来获得具有结合亲和力Kd<10-8M的特异性靶标结合特性的本发明抗体。或者，亲和力可以通过根据本发明的抗体的亲和力成熟而进一步提高，以获得对应于Kd小于10-9M，优选小于10-10M或甚至小于10-11M，最优选皮摩尔范围的高值。
在某些实施方案中，通过亲和ELISA测定法测定结合亲和力。在某些实施方案中，通过BIAcore、ForteBio或MSD测定法来测定结合亲和力。在某些实施方案中，结合亲和力通过动力学方法确定。在某些实施方案中，结合亲和力由平衡/溶液法测定。
使用术语“具有相同的特异性”、“具有相同的结合位点”或“结合相同的表位”指示相当的单克隆抗体表现出相同或基本相同的即相似的免疫反应(结合)特性并竞争结合预先选择的目标结合序列。抗体分子对特定靶标的相对特异性可以通过竞争测定来相对确定，例如，如Harlow等人描述于ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)。
如本文关于抗体所使用的术语“竞争”是指第一抗体或其抗原结合部分以与第二抗体或其抗原结合部分的结合充分相似的方式与表位结合，使得第一抗体与其同源表位结合的结果在第二抗体存在下与不存在第二抗体时的第一抗体结合相比可检测地下降。可选地，在第一抗体存在下第二抗体与其表位的结合也可检测地下降，可以是但不一定是这种情况。也就是说，第一抗体可抑制第二抗体与其表位的结合，而第二抗体不抑制第一抗体与其相应表位的结合。但是，在每种抗体可检测地抑制另一种抗体与其同源表位结合的情况下，无论是相同程度、更大程度或者更小程度，都称抗体彼此“竞争”结合它们相应的表位。本发明特别包括与任何示例性抗体竞争结合O3b-抗原的抗体。
本文中的“竞争性结合”或“竞争”是指通过竞争ELISA分析或ForteBio分析测定的大于约30％的相对抑制。可能需要设定更高的相对抑制的阈值作为在特定情况下是合适的竞争水平的标准，例如，在使用竞争分析来选择或筛选新抗体时，该新抗体设计有结合抗原的预期功能。因此，例如，可以设定竞争性结合的标准，其中检测到至少40％的相对抑制，或至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或甚至至少100％时，认为抗体具有足够竞争性。
如本文所用的术语“诊断试剂盒”是指试剂盒或成套组件，其中组合物或混合物可用于进行一种或多种分析物或标志物的测量/检测以确定疾病或病情，或者预测疾病或疾病进展。尤其是，试剂盒至少含有检测分子和/或结合剂，其中检测分子和/或结合剂特异性识别分析物或标记物或这种分析物或标记物的反应产物。另外，试剂盒中可以包含各种试剂或工具。诊断试剂盒可以包含用于实施本发明主题方法的任何有用的试剂，包括比如微珠或平面阵列或孔的基底、用于生物标记分离的试剂、针对特定靶标的检测分子、试剂比如用于核酸测序或扩增的引物、用于核酸杂交的阵列、可检测的标记、溶剂或缓冲液等，各种接头、各种测定组分、阻断剂等。
试剂盒还可以包括用于诊断方法的说明书。这样的说明书可以例如提供于包括在试剂盒中的器械上，例如用来制备用于诊断目的的生物样品的工具或器械，比如在确定标记之前分离含有细胞和/或蛋白质的部分。所述试剂盒可方便地以储存稳定形式提供，比如具有至少6个月的保质期的商业试剂盒。
特定诊断试剂盒还包含固体支持物，其包含检测分子或具有针对目标标记物的固定化图案(patterned)阵列的检测分子，优选包括含有针对第一标记物的第一结合试剂的第一区域和含有针对第二标记物的第二结合试剂的第二区域。
特别是可以使用夹心形式。例如，一种或多种结合剂在与生物样品接触之前与基质缀合。所述一种或多种结合剂可以与可检测的标记缀合以用作检测分子。在其它实施方案中，所述一种或多种结合剂与可检测的标记缀合。在这种构造中，一种或多种结合剂可以在与生物样品接触之前与基底缀合以用作捕获剂。此外，一种或多种结合剂可以在与生物样品接触之前与基底缀合，和/或一种或多种结合剂与可检测的标记缀合。在这种情况下，一种或多种结合剂可以充当捕获剂和检测剂中的任一或两者。
诊断试剂盒特别提供用于免疫测定法，其中检测分子是通过免疫反应与分析物或标记物结合的特异性结合剂。这种结合剂可以是结合靶抗原的抗体或抗体片段或抗体样支架。
合适的免疫测定法是ELISA、CIA、RIA、IRMA、凝集测定法、免疫色谱法、试纸条测定法和蛋白质印迹法中的任一种。
术语“肺炎克雷伯氏菌感染”和“肺炎克雷伯氏菌定植”以如下方式理解：肺炎克雷伯氏菌是革兰氏阴性细菌，它是肠杆菌科成员。它是一种无处不在的细菌，其也可以定植于人类宿主，通常在肠道或上呼吸道。作为机会致病菌，在免疫系统无法正确控制的情况下，它可以从这些位点侵入无菌体位点。在这些位点的不受控制的细菌复制将会诱发炎症，在很大程度上由从肺炎克雷伯氏菌释放的内毒素(即LPS)分子介导。在菌血症的情况下，内毒素分子可以引发感染性休克。
肺炎克雷伯氏菌定植是指主体在可检测到的位点处具有足够高浓度的肺炎克雷伯氏菌，但细菌不引起任何体征或症状。定植可以持续很长一段时间，溶解(resolution)受到对生物体的免疫响应、该位点来自其它生物体的竞争的影响，以及有时使用抗微生物剂的影响。
通常，由肺炎克雷伯氏菌引起的菌血症可以用已知的常规抗菌疗法成功治疗，比如用抗生素、类固醇和非类固醇炎症抑制剂治疗。本发明提供了新的免疫疗法，采用特异性识别肺炎克雷伯氏菌的抗体，其任选地与抗细菌或抗炎疗法组合。用于治疗患有肺炎克雷伯氏菌感染的患者的示例性抗生素是氨基糖苷类、头孢菌素类、氨基青霉素类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、替加环素(tygecycline)、粘菌素等。
多重耐药性(MDR)肺炎克雷伯氏菌特别理解为表现出对三种或更多种抗生素的抗性的那些菌株，例如以下试剂/组：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类、氨基糖苷类、四环素类、氟喹诺酮类、呋喃妥因、甲氧苄啶(及其组合)、磷霉素、多粘菌素、氯霉素、氨曲南或替加环素。
随着最近出现抗生素耐药菌株，治疗这种性质的菌血症变得明显更加困难了。患有肺炎克雷伯氏菌病的患者与没有患肺炎克雷伯氏菌病的患者相比，患者的住院时间、ICU停留时间更长，死亡率更高，且医疗保健成本更高。当患者被肺炎克雷伯氏菌严重定植时，肺炎克雷伯氏菌病预防，可以通过预防而不是治疗来改善患者护理并降低医院内感染。
肺炎克雷伯氏菌病特别理解为由肺炎克雷伯氏菌感染引起的疾病。这些疾病包括局部和全身性疾病。严重的疾病例如是原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
本文使用的术语“重组”是指“通过基因工程制备或产生”。重组宿主具体包括表达载体或克隆载体，或者它经过基因工程改造以含有重组核酸序列，特别是使用外源于宿主的核苷酸序列。通过在宿主中表达相应的重组核酸产生重组蛋白。如本文所用，术语“重组抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，比如(a)从人免疫球蛋白基因转基因或转染色体的动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库或抗体的抗原结合序列文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组抗体包含经工程改造以包含例如在抗体成熟期间发生的重排和突变的抗体。根据本发明，可以使用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如Maniatis，Fritsch&Sambrook，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，(1982)。
选择性结合可以通过本领域已知的重组抗体优化方法进一步改进。例如，本文描述的免疫球蛋白链的可变区的某些区域可以进行一种或多种优化策略，包括轻链改组、目的诱变、CDR融合和所选CDR和/或框架区的定向诱变。
本文所用术语“主体”应指温血哺乳动物，特别是人类或非人类动物。肺炎克雷伯氏菌是极其重要的人类病原体，也是兽药领域的新兴问题。它存在于范围广泛的非人类动物物种中。因此，术语“主体”还可以特别涉及动物，包括狗、猫、兔、马、牛、猪和家禽。特别地，本发明的医学用途或相应的治疗方法适用于需要预防或治疗与肺炎克雷伯氏菌感染相关的病情的主体。主体可以是有风险患有肺炎克雷伯氏菌感染或患有疾病(包括早期或晚期疾病)的患者。术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其它哺乳动物主体。术语“治疗”因此意味着包括预防性和治疗性治疗。
例如治疗主体以预防或治疗肺炎克雷伯氏菌病情。尤其是，治疗有风险感染或发生此类疾病或疾病复发的主体，或患有此类感染和/或与此类感染相关的疾病的主体。
特别地，术语“预防”是指旨在包括防止发病机理发生的防止措施或降低发病风险的预防措施。
特别地，治疗可以通过干扰作为病症致病因子的肺炎克雷伯氏菌的发病机理进行。
如本文所用的术语“基本上纯的”或“纯化的”应指包含至少50％(w/w)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物(比如核酸分子或抗体)的制剂。纯度通过适合所述化合物的方法(例如色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)测量。
本文中的术语“治疗有效量”与化合物(例如本发明的抗体)的任一术语“有效量”或“足够量”可互换使用，是指当施用给主体时足以引起有益的效果或期望的结果(包括临床结果)的量或活性，因此，其有效量或同义词取决于其施用的背景。
有效量旨在表示足以治疗、预防或抑制此类疾病或病症的化合物的量。在疾病的情况下，本文所述的治疗有效量的抗体特别地用于治疗、调节、减弱、逆转或影响受益于抑制肺炎克雷伯氏菌发病机理的疾病或病症，例如粘膜表面的粘附和定植、无菌体位点内的不受控制的复制，以及细菌产物对宿主细胞的毒性。
对应于这种有效量的化合物的量将根据各种因素而变化，比如给定的药物或化合物、药物制剂、给药途径、疾病或病症的类型、受治疗主体或宿主的身份等等，但仍可由本领域技术人员常规确定。
如本文所述的治疗有效量的抗体，比如提供给有此需要的人类患者，具体可以为0.5-50mg/kg，优选5-40mg/kg，甚至更优选高达20mg/kg，高达10mg/kg，高达5mg/kg，尽管可以指示更高的剂量，例如用于治疗急性病情。如果使用高度有效的抗体，剂量可以大幅降低。在这种情况下，有效量可以为0.005至5mg/kg，优选0.05至1mg/kg。
此外，具有本发明治疗有效量的抗体的主体的治疗或预防方案可以由单次给药组成，或者包括一系列应用。例如，抗体可以一年至少一次，半年至少一次或至少一个月一次施用。但是，在另一个实施方案中，对于给定的治疗，可以将抗体从约每周一次至约每日施用而施用于主体。治疗期的长度取决于多种因素，比如疾病的严重程度、急性或慢性疾病、患者的年龄、抗体形式的浓度和活性。还将理解，用于治疗或预防的有效剂量可以在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断测定可以导致剂量的变化并且变得明显。在某些情况下，可能需要长期施用。
对O3b具有高度特异性的单克隆抗体(mAb)，特别是泛O3抗体作为鉴定肺炎克雷伯氏菌的诊断试剂具有很大的潜力。此外，特别是在人源化后，这些mAb适合用于预防(例如高风险群)和治疗肺炎克雷伯氏菌感染。
曾认为O3血清群是单一的均一结构，然而，令人惊讶的是，它包含三种不同的亚型，其重复单元内的甘露糖残基的数目不同。结构中的这些改变代表了抗原差异，如对O3血清群有特异性的单克隆抗体的反应模式所证实的。与O3血清群内所有3种不同血清型交叉反应的单克隆抗体的选择对于推定的产品开发具有高度相关性。
编码甘露糖聚合的相应基因(即O-抗原亚单位的合成)的遗传分析揭示了证实观察到的结构改变的差异。基于遗传和表型差异，我们提出将新描述的血清型称为O3a和O3b，以便将它们与已知作为O3血清型的已发表的“经典”五甘露糖结构区分开(图1-发表于(3))。
筛选超过150个临床分离物的采集样(collection)显示，比任何其它甘露聚糖类型(即O3、O3a和O5)一起更多的分离物表达新描述的O3b血清型。
基于LPS分离模式，在O3血清群肺炎克雷伯氏菌菌株中提示O-抗原重复单元的结构多样性。编码O3侧链的rfb操纵子内的遗传异质性证实了所提出的结构差异。选择对这些变体之一具有特异性或与O3血清群内的所有三种类型交叉反应的mAb。
生物化学结构分析的初步数据表明，五甘露糖重复单元结构被四糖和三糖重复单元取代，因此代表不同的抗原结构；在此指定为血清型O3a和O3b。
克雷伯氏菌O3a亚单元与大肠杆菌O9a的相同，但是，O3b抗原代表新型结构，因此对O3b有特异性的抗体以及在O3、O3a和O3b之间交叉反应的那些抗体对于例如免疫治疗和/或免疫诊断是有价值的手段。O3交叉反应性(泛O3反应性)mAb对几乎四分之一(23.2％)的所有克雷伯氏菌分离株是有特异性的，因此作为诊断和/或治疗产品候选物的这种mAb的进一步开发可以是合理的。
一旦鉴定出具有所需结合特性的抗体，可以通过本领域众所周知的方法(包括例如杂交瘤技术或重组DNA技术)产生此类抗体包括抗体片段。
例如，可以使用公知的重组表达载体例如本发明的质粒或包含编码抗体序列的核苷酸序列的表达盒，通过分离编码所需抗体链的DNA并用编码序列转染重组宿主细胞进行表达来产生重组单克隆抗体。重组宿主细胞可以是原核和真核细胞，比如上述那些。
根据具体的方面，核苷酸序列可用于遗传操作以使抗体人源化或改善抗体的亲和性或其它特征。例如，如果抗体用于人类的临床试验和治疗，则恒定区可以工程改造为更接近人类恒定区以避免免疫应答。可以需要基因操作抗体序列以获得对O3b靶标更大的亲和力和更高的抗肺炎克雷伯氏菌效力。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以对抗体进行一个或多个多核苷酸改变并仍然保持其与靶O3b-抗原的结合能力。
通过各种手段产生抗体分子通常是很好理解的。例如，美国专利6331415(Cabilly等人)描述了一种重组生产抗体的方法，其中重链和轻链同时由单个载体或由单个细胞中的两个单独载体表达。Wibbenmeyer等人(1999，Biochim Biophys Acta 1430(2)：191-202)以及Lee和Kwak(2003，J.Biotechnology 101：189-198)描述了使用在分开的宿主细胞培养物中表达的质粒从单独产生的重链和轻链产生单克隆抗体。在例如Harlow等人，ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1988)中提供了与产生抗体相关的各种其它技术。
如果需要，可以对本发明的抗体(例如2F8-G6抗体或其功能变体)进行测序，然后可以将多核苷酸序列克隆到载体中用于表达或繁殖。编码抗体的序列可以保持在宿主细胞的载体中，然后可以扩增宿主细胞并冷冻以供将来使用。在细胞培养物中产生重组单克隆抗体可以通过本领域已知的方法通过从B细胞克隆抗体基因来进行。
另一方面，本发明提供了包含编码本发明重组抗体产生的序列的分离的核酸。
编码抗体的核酸可以具有任何合适的特性并且包含任何合适的特征或其组合。因此，例如，编码抗体的核酸可以是DNA、RNA或其杂交体的形式，并且可以包括非天然存在的碱基、修饰的骨架，例如促进核酸稳定性的硫代磷酸酯骨架，或两者。核酸可有利地掺入本发明的表达盒、载体或质粒中，其包含在靶标宿主细胞中促进期望的表达、复制和/或选择的特征。此类特征的实例包括复制起点组件、选择基因组件、启动子组件、增强子元件组件、聚腺苷酸化序列组件、终止组件等，很多合适的实例是已知的。
本公开内容还提供了包含一种或多种本文所述核苷酸序列的重组DNA构建体。这些重组构建体与载体(比如质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体)连接使用，编码任何公开的抗体的DNA分子插入其中。
使用任何通过培养中的细胞系产生抗体分子的方法产生单克隆抗体，例如培养重组真核(哺乳动物或昆虫)或原核(细菌)宿主细胞。用于制备单克隆抗体的合适方法的实例包括Kohler等人的杂交瘤方法(1975,Nature 256:495-497)和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor，1984，J.Immunol.133:3001；和Brodeur等人,1987,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,(Marcel Dekker,Inc.,New York),pp.51-63)。
使用杂交瘤方法可以鉴定或获得本发明的抗体。在这种方法中，免疫小鼠或其它适当的宿主动物如仓鼠，以引发产生或能够产生特异性结合到用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后使用合适的融合剂如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。
测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合测定法如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)来测定。
然后可以从杂交瘤上清液纯化mAb以进一步测试其与O3b-抗原的特异性结合，和可能的其优先结合O3b-抗原的差异结合亲和力(相对于任何其它O3-或O-抗原)，和工程改造抗体例如，例如用于不同的诊断或治疗目的。
O3b-特异性抗体在某些情况下通过针对单一O3b-抗原进行筛选而出现。为了增加分离差异结合克隆的可能性，通过对不同抗原进行持续筛选，可以应用多种选择性压力。特殊的mAb选择策略以交替方式使用O3b和O3a或O3组分或其它肺炎克雷伯氏菌抗原。
用于鉴定具有所需选择性结合特性的抗体的筛选方法可通过展示技术使用展示抗体序列或其抗原结合序列的文库(例如使用噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞；或在体外展示系统中将核酸信息翻译成相应的(多)肽)。可以基于ELISA、蛋白质印迹法或用流式细胞术(例如使用标准分析)进行表面染色来评估反应性。
分离的抗原可以例如用于从抗体文库(例如酵母展示抗体文库)中选择抗体。
例如，本发明特别提供了O3b特异性抗体，其通过鉴定具有结合O3b-抗原的特异性的抗体的方法获得，例如通过特异性发现选择方案。因此，可以选择包括与O3b靶标显示反应性的抗体的抗体文库用于与靶标反应。
本发明还提供了包含如本文所述的抗体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。这些药物组合物可以根据本发明作为推注或输注或通过连续输注来施用。适合于促进这种施用手段的药物载体在本领域中是公知的。
药学上可接受的载体通常包括生理上与本发明提供的抗体或相关组合物或组合相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的其它实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的任何组合。
在一个这样的方面，抗体可以与适合于期望的施用途径的一种或多种载体组合，抗体可以与例如乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇任意混合，并任选进一步压片或封装用于常规施用。或者，可以将抗体溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。其它载体、佐剂和施用方式在制药领域是众所周知的。载体可以包括控释材料或时间延迟材料，比如单独或与蜡一起使用的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或本领域公知的其它材料。
另外的药学上可接受的载体在本领域中是已知的，并在例如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES中描述。液体制剂可以是溶液剂、乳剂或混悬剂，并且可以包括赋形剂如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
考虑药物组合物，其中配制本发明的抗体和一种或多种治疗活性剂。通过将具有所需纯度的所述免疫球蛋白与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，以冻干制剂或水溶液的形式来制备本发明抗体的稳定制剂用于储存。用于体内施用的制剂特别是无菌的，优选以无菌水溶液的形式。这很容易通过无菌过滤膜或其它方法过滤完成。本文公开的抗体和其它治疗活性剂也可以配制成免疫脂质体，和/或包埋于微胶囊中。
包括本发明抗体的药物组合物的施用可以以各种方式进行，包括口服、皮下、静脉内、鼻内、耳内(intraotically)、透皮、粘膜、局部，例如凝胶、药膏、洗剂、霜剂等，腹膜内、肌内、肺内，例如使用可吸入技术或肺部递送系统，阴道、肠胃外、直肠或眼内。
用于肠胃外给药的示例性制剂包括适合于皮下、肌内或静脉内注射的那些，例如无菌溶液、乳剂或混悬剂。
在一个实施方案中，本发明的抗体是唯一施用给主体的治疗活性剂，例如作为疾病改善或预防的单一疗法。
在另一个实施方案中，将本发明的抗体与混合物(cocktail)中的其它抗体组合，例如组合在混合物或成套试剂盒中，以靶向肺炎克雷伯氏菌，使得该混合物包含施用于主体的多于一种的治疗活性剂，例如作为疾病改善或预防的组合疗法。
此外，本发明的抗体可以与一种或多种其它治疗剂或预防剂组合施用，包括但不限于标准治疗剂，例如抗生素、类固醇和非类固醇炎症抑制剂，和/或其它基于抗体的治疗，例如采用抗菌剂或抗炎剂。
组合疗法特别采用标准方案，例如用于治疗肺炎克雷伯氏菌感染。这可以包括抗生素，例如替加环素(tygecycline)、粘菌素、多粘菌素B及与或不与非β内酰胺抑制剂组合的β内酰胺。
在组合治疗中，抗体可以作为混合物施用，或伴随一种或多种其它治疗方案一起施用，例如可以在伴随治疗之前、同时或之后进行。
本发明的抗体或相应的药物制剂的生物学特性可以在细胞、组织和整个生物体实验中离体表征。如本领域已知的，为了测量药物对抗疾病或疾病模型的治疗的功效，或测量药物的药代动力学、药效学、毒性和其它性质，通常在动物体内对药物进行测试，所述动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和猴。动物可以称为疾病模型。通常在小鼠中测试治疗剂，包括但不限于裸鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。这种实验可以提供有意义的数据，用于确定抗体用作治疗剂或预防剂的潜力，具有适当的半衰期、效应子功能、(交叉)中和活性和/或对主动或被动免疫治疗的免疫应答。任何生物体，优选哺乳动物，可以用于测试。例如由于它们与人类的遗传相似，灵长类动物猴子可以是合适的治疗模型，因此可以用于测试主题试剂或组合物的功效、毒性、药代动力学、药效学、半衰期或其它性质。药物批准最终需要人体试验，因此当然要考虑这些实验。因此，可以在人体中测试本发明的抗体和相应的药物组合物以确定其治疗或预防功效、毒性、免疫原性、药代动力学和/或其它临床特性。
命名为2F8-G6的抗体特别是抗体轻链和/或重链的特征在于生物材料保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(德国微生物菌种保藏中心),Mascheroder Weg 1b/Inhoffenstraβe(因荷夫街)7B,38124Braunschweig(布朗斯维克)(DE)，如本文指出的登记号。
DSM 32059是用包含2F8-G6VH的编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞：大肠杆菌2F8-G6VH＝DSM 32059，保藏日期：2015年6月4日；保藏人：奥地利，维也纳，阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司(Arsanis Biosciences GmbH,Vienna,Austria)。
DSM 32060是用包含2F8-G6VL的编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞：大肠杆菌2F8-G6VL＝DSM 32060；保藏日期：2015年6月4日；保藏人：奥地利，维也纳，阿尔萨尼斯生物科学有限责任公司(Arsanis Biosciences GmbH,Vienna,Austria)。
以下定义的主题被认为是本发明的实施方案：
1.一种分离的抗体，其特异性识别肺炎克雷伯氏菌的脂多糖(LPS)O3b-抗原结构的表位，该表位为并入包含式(I)结构的O3b-抗原中的O3b-表位，包括一种或多种O3b-抗原甘露糖均聚物重复单元，其中式(I)为：
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]n
其中
MeP是磷酸甲酯；和
n为0-50。
2.定义1所述的抗体，其与O3a-表位和/或O3-表位交叉反应，其中
a)O3a-表位并入包含式(II)结构的肺炎克雷伯氏菌的LPS O3a-抗原中，包括一种或多种O3a-抗原甘露糖均聚物重复单元，其中式(II)为：
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
其中m为0-50；
和
b)O3-表位并入包含式(III)结构的肺炎克雷伯氏菌的LPS O3-抗原中，包括一种或多种O3-抗原甘露糖均聚物重复单元，其中式(III)为：
MeP→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→[3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]m
其中m为0-50。
3.定义2所述的抗体，其为泛O3特异性抗体，其特异性结合于O3b-表位并与O3a-表位和O3-表位交叉反应。
4.定义3所述的抗体，其为2F8-G6抗体，或其竞争性结合它的特异性表位，其中2F8-G6抗体的特征在于：
a)并入在保藏材料DSM 32059中的VH；和
b)并入在保藏材料DSM 32060中的轻VL。
5.定义3所述的抗体，其为4D3-A4抗体，或其竞争性结合它的特异性表位，其中所述4D3-A4抗体的特征在于以下任意：
a)6个CDR序列CDR1、2、3、4、5和6分别由SEQ ID 1、2、3、4、5和6鉴定，其中编号是根据Kabat；或CDR1、2、3、4、5和6分别由SEQ ID 7、8、9、10、11和12鉴定，其中编号是根据IMGT；和/或
b)VH和VL序列，其是由SEQ ID 15所鉴定的VH序列和由SEQ ID 16鉴定的VL序列；和/或
c)HC和LC序列，其是由SEQ ID 13鉴定的HC序列和由SEQ ID 14鉴定的LC序列。
6.定义1所述的抗体，其相对于O3a-表位优先结合至O3b-表位，或者其不与O3a-表位交叉反应，其中O3a-表位并入至肺炎克雷伯氏菌的LPS O3a-抗原结构的O3a-抗原重复单元中，其中O3a-抗原重复单元是式(II)的甘露糖均聚物。
7.定义1所述的抗体，其相对于O3-表位优先结合至O3b-表位，或者其不与O3-表位交叉反应，其中O3-表位并入至肺炎克雷伯氏菌的LPS O3-抗原结构的O3-抗原重复单元中，其中O3-抗原重复单元是式(III)的甘露糖均聚物。
8.定义6或7所述的抗体，其不与O3a-表位和O3-表位中的任一个交叉反应。
9.定义1-8中任一项所述的抗体，其不与肺炎克雷伯氏菌的非O3LPS分子的表位交叉反应。
10.定义1-9中任一项所述的抗体，其具有结合O3b-表位的亲和力，Kd小于10-7M，优选小于10-8M，甚至更优选小于10-9M。
11.定义1-10中任一项所述的抗体，其中和表达O3b LPS分子的肺炎克雷伯氏菌菌株的内毒素。
12.定义1-11中任一项所述的抗体，其是全长单克隆抗体、其抗体片段或融合蛋白，所述抗体片段包含至少一个含有结合位点的抗体结构域，所述融合蛋白包含至少一个含有结合位点的抗体结构域，特别地其中所述抗体是包含随机化或人工氨基酸序列的非天然存在的抗体。
13.定义1-12中任一项所述的抗体，其是人、人源化、嵌合或鼠来源的抗体。
14.定义1-13中任一项所述的抗体，其是单克隆抗体。
15.定义1-14中任一项所述的抗体，用于治疗处于有风险患有或患有肺炎克雷伯氏菌感染或定植的主体，包括向主体施用有效量的抗体以限制主体的感染或改善所述感染引起的病情，优选用于治疗或预防任何原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
16.一种包含定义1-14中任一项所述抗体的药物制剂，优选包含肠胃外或粘膜制剂，任选含有药学上可接受的载体或赋形剂。
17.一种定义1-14中任一项所述抗体的用途，用于诊断肺炎克雷伯氏菌感染或定植，或相关疾病比如主体中的原发性和继发性菌血症、肺炎、尿路感染、肝脓肿、腹膜炎或脑膜炎。
18.根据定义17所述的用途，其中所述主体是免疫功能低下或免疫抑制患者，或其接触者。
19.定义1-14中任一项所述抗体的诊断制剂，其在组合物或成套试剂盒中包含所述抗体和另外的诊断试剂，包含以下组分：
a)定义1-14中任一项所述的抗体；和
b)另外的诊断试剂；
c)和任选的固相，以固定所述抗体和诊断试剂中的至少一种。
20.定义19所述的诊断制剂，其中所述另外的诊断试剂是诊断标记或与所述抗体和/或与其抗原结合的抗体的反应产物特异性反应的试剂。
21.一种诊断由肺炎克雷伯氏菌菌株在主体中引起的肺炎克雷伯氏菌感染或定植的方法，包括：
a)提供定义1-14中任一项所述的抗体；和
b)检测所述抗体是否与待测试的主体的生物样品中的O3b-表位特异性免疫反应，从而诊断肺炎克雷伯氏菌感染或定植。
22.定义21所述的方法，其中所述生物样品是体液或组织样品，优选的样品选自由以下组成的组：血液样品、粪便样品、皮肤样品、尿液样品、脑脊髓液和呼吸道样本，比如气管内抽吸物、胸膜液、肺液、鼻拭子或痰，或源自前述任一种样品的肺炎克雷伯氏菌分离物。
23.一种编码定义1-14中任一项所述的抗体的分离的核酸。
24.一种表达盒或质粒，其包含编码序列以表达蛋白质构建体，该蛋白质构建体包含定义1-14中任一项所述的抗体的的VH和/或VL。
25.一种包含定义24的表达盒或质粒的宿主细胞。
26.一种产生定义1-14中任一项所述的抗体的方法，其中权利要求25的宿主细胞在产生所述抗体的条件下培养或维持。
27.一种鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供含有抗体或抗体产生细胞的样品；和
b)评估所述样品中或由所述样品产生的抗体与定义1中所定义的O3b-表位的结合，其中所述抗体与所述表位之间的阳性反应将所述抗体鉴定为候选抗体。
28.一种鉴定候选抗体的方法，包括：
a)提供含有抗体或抗体产生细胞的样品；和
b)评估所述样品中或由所述样品产生的抗体与定义1中所定义的O3b-表位的结合，其中相对于定义2中所定义的O3a-表位和/或O3-表位，或相对于肺炎克雷伯氏菌的任何非O3LPS分子，所述抗体和O3b-表位之间的特异性阳性反应将所述抗体鉴定为候选抗体。
29.一种产生定义1-14中任一项所述的抗体的方法，包括：
a)提供根据定义27或28鉴定的所述候选抗体；和
b)产生单克隆抗体，或候选抗体的人源化或人形式，或其与所述候选抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。
通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明不限于此。
实施例
实施例1：O3血清群的肺炎克雷伯氏菌菌株中不同的O-抗原重复单元大小的鉴定
使用商业LPS纯化试剂盒(Intron)从不同O3菌株纯化LPS(PCM-11O3：K11来自IITD PAN Wroclaw,Polish Collection of Microorganisms(波兰微生物保藏中心)；Kp14、Kp62、Kp18和Kp35来自临床收集物以及无关血清群。通过SDS-PAGE分离～1μg LPS并用Emerald 300脂多糖染色试剂盒(LifeTechnologies)染色。
将从临床样品和商业收集物的菌株获得的LPS分离并染色。有趣的是，如图2所示，LPS模式显示出显著的变异性。可以区分三种不同的类型，其不仅O-抗原的模式长度(即O-抗原亚单元的平均数目)不同，而且“梯阶(ladder-step)”的分离也不同。鉴于在这种典型的梯状结构中，单独的“梯阶”代表单个O-抗原重复单元差异，梯阶之间的距离是重复单元大小的特征。显然，O3血清群内的三种不同LPS分子显示其重复单元的不同大小：泳道2和3>泳道1>泳道4和5。基于此，我们提出了O3血清群存在3种变体，其O-抗原重复单元内的甘露糖分子数目不同。
实施例2：鉴定与所有O3血清型交叉反应的mAb
用107CFU活肺炎克雷伯氏菌原型菌株PCM-11(O3：K11，IITD PAN Wroclaw,Polish Collection of Microorganisms(波兰微生物保藏中心))以2周的间隔静脉内免疫Balb/c小鼠3次。通过标准程序产生小鼠杂交瘤，并选择分泌特异性鼠mAb到来自免疫菌株的纯化的O-多糖的克隆。
将如上所述分离的LPS样品转移至PVDF膜用于免疫印迹。使膜与1μg/ml的鼠mAb和二级HRP标记的山羊抗小鼠IgG反应。印迹通过ECL试剂显现。
选自用PCM-11免疫的小鼠的O3特异性mAb(图3中泳道4)显示出不同的反应性模式。一些由1G6-B8代表的mAb(图3B)主要与免疫菌株反应，但是，与显示不同的染色模式的其它O3菌株的反应少得多(图2和3A)。相比之下，由2F8-G6代表的其它mAb与所有O3变体的反应性相当(图3C)。这些mAb都没有染色任何非O3LPS分子，比如O1、O2和O5(分别为泳道1、2和3)。
这些发现证实，不相像分离模式提示的不同类型确实代表抗原性不同的结构。另一方面，这些不同类型也具有共同的表位，这通过泛O3交叉反应性mAb的选择证实。
实施例3：新型肺炎克雷伯氏菌O抗原的结构表征
将肺炎克雷伯氏菌O3b菌株Kp81(临床分离株)在10L发酵罐中的LB培养基中培养(37℃，12h，200rpm的搅拌，5L/min的气流)，用1％苯酚在60℃下处理2h，离心、洗涤、重新悬浮在水中，并冷冻干燥。肺炎克雷伯氏菌Kp81的LPS通过热苯酚/水法分离并通过透析和超速离心纯化(9)。作为透析和超速离心之间的附加步骤，加入通过玻璃棉过滤器的过滤。通过温和的酸性水解(1.5％CH3COOH，20分钟，100℃)释放O-特异性多糖(O-PS)和不同的寡糖组分。超速离心水溶性多糖和寡糖(6小时，105000×g，4℃)以去除荚膜抗原(K抗原，CPS)的残留物。通过在Bio-Gel P-10(-400目)(Biorad，USA)或HW-40F(Tosoh Bioscience LLC，USA)上的凝胶过滤分离所获得的多糖和寡糖，得到馏分1a、1b、1c、2、3和4。通过NMR谱和/或MALDI-TOF质谱(MS)分析所有馏分，显示馏分1a-c中存在O-PS(图4)。这些馏分含有不同数目的O-PS重复单元(RU)，其连接引物衔接子序列，和具有以下通用结构：Kdo-GlcNAc-Man-[RU]n的外部核心寡糖的共同部分。
对于馏分1a，使用糖和甲基化分析、1H和13C NMR谱和MALDI-TOF MS确定来自菌株Kp81的LPS O-PS的重复单元(RU)的结构。糖和甲基化分析的组合结果证实存在三种主要残基：2-和3-取代的吡喃甘露糖(mannopiranoses)(Manp)。通过解释COSY、TOCSY和NOESY以及HSQC-DEPT、HMBC和HSQC-TOCSY实验，实现了O-PS Kp81 1H和13C共振的完整分配(图7)。1H、13C HSQC-DEPT谱包含三个主要异头质子和碳(残基A、B、C)和次要的自旋系统(残基A’、B’、C’)的信号(图7，表1)。此外，基于存在甲基的两个尖锐质子信号(δH 3.61,3.63；δC53.7ppm)，鉴定了磷酸甲酯(MeP)，具有11.0Hz的JP,H的二重峰，表明其由磷酸基团(P)取代。通过NOESY和HMBC实验观察到相邻糖残基之间的残基间连接(图7)。主要信号集归因于Kp81O-PS生物RU的三糖结构：[→3)-α-D-Manp-(1→2)-α-D-Manp-(1→3)-α-D-Manp-(1→]n([→3)-C-(1→2)-A-(1→3)-B-(1→]n)(图4，插图结构)。1H、31P HMBC谱显示MeP磷酸基团与残基C’的H-3的相关性(α-D-Manp3PMe)。另外，31P、1H HMQC-TOCSY显示MeP磷酸基团与残基C’的H-2、H-3、H-4、H-5的相关性，支持了通过MeP取代C’。此外，鉴定了残基A’(→2)-α-D-Manp)和B’(→3)-α-D-Manp)，并且与C’一起被发现是Kp81O-PS的非还原末端的成分。包含非还原末端的Kp81O-PS的完整结构在图1中给出并且具有以下示意序列：C’-(1→2)-A’-(1→3)-B’-(1[→3)-C-(1→2)-A-(1→3)-B-(1→]n。
使用MALDI-TOF MS确认O-PS Kp81重复单元(Manp的三糖)的分子量。馏分1a、1b、1c的质谱显示归因于不同形式Kdo-GlcNAc-Man-[RU]n的离子簇。([M-H]-，脱水形式，包括庚糖和MeP取代)。这些离子之间的平均单一同位素质量差为486.49Da，并且与基于NMR结果计算的质量匹配--486.42Da。此外，馏分1b的质谱(图5)含有[M-H2O-H]-离子(例如m/z 1227.39,1389.45,1551.52,1713.58,1875.66,2037.73,2199.79,2361.85,2523.90)归因于由MeP-[Man]n构建的O-PS片段。离子之间162Da的质量差归因于Man残基。例如，m/z 1713.58处的离子归因于MeP-[Man]10聚合物。这些片段由天然O-PS的MALDI源内裂解(in-source fragmentation)产生，并且表明每个O-PS存在一个MeP基团。
实施例4：通过LPS-O3交叉反应性mAb的表面结合
通过流式细胞术研究不同甘露聚糖特异性的mAb(图6)对活的克雷伯氏菌菌株的表面染色。将洗涤后的细菌(106CFU)与O3特异性mAb(40μg/ml)反应，随后用2μg/ml Alexa488缀合的山羊抗人IgG二级抗体(Life Technologies)和5μM SYTO-62核酸染色剂(Life Technologies)染色。样品在BD AccuriTM C6流式细胞仪(BD Biosciences)中定量并且使用FCS Express软件版本4(De Novo Software)分析数据。
交叉反应mAb 2F8-G6与所研究的所有O3克雷伯氏菌菌株的表面强烈结合，而与所表达的O-抗原的甘露聚糖结构无关。相比之下，可比较的mAb 1G6-B8仅强烈地对O3a免疫菌株(PCM-11)染色。它微弱地结合到表达O3的菌株Kp14的表面上，而根本不结合表达O3b抗原的菌株Kp82。
因此，流式细胞术分析证实甘露聚糖特异性mAb对相应的活的克雷伯氏菌菌株的表面染色完全由抗原特异性决定，并且不受各种光滑LPS分子的限制。因此，具有广泛特异性的抗体有希望进一步开发作为潜在的抗菌剂。
实施例5：O3型LPS分子的内毒素活性的交叉中和
由于肺炎克雷伯氏菌O3菌株对正常人血清的杀菌作用敏感(图8)，所以预期的治疗性mAb的临床相关作用模式是这种mAb的抗炎潜力。从裂解的细菌释放的内毒素(即LPS分子的脂质A部分)通过其固有受体复合物TLR-4/CD14/MD2的信号传导触发强烈的炎症反应。在基于细胞的体外系统(HEK Blue，InvivoGen)中研究mAb 4D3-A4对由不同肺炎克雷伯氏菌O3型LPS分子引发的信号传导的影响。将通过由细胞表达的人TLR-4复合物的信号传导转化为比色信号。图9显示mAb 4D3-A4可以抑制信号传导，即中和提取的纯化的LPS分子的内毒素效应。重要的是，对于不同的O3亚型观察到剂量依赖性中和，即O3交叉反应性mAb对于抵抗从O3a(来自IITD PAN Wroclaw,Polish Collection of Microorganisms(波兰微生物保藏中心)的PCM-11菌株，图9A)或O3b(来自临床收集物的菌株Kp81临床分离物；图9B)提取的LPS具有同等的潜力。
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