本发明涉及具有美白及抗氧化活性的新型酚酸类衍生化合物及其用途。
背景技术：
女性喜欢像白玉的白净皮肤，并将其作为美的重要标准，因此，积极开发用于治疗皮肤色素异常沉着和满足美容需求的美白剂。
人类肤色根据黑色素、胡萝卜素、血红素的量而决定，其中黑色素对肤色的影响最大，因此抑制黑色素形成为开发美白剂的核心课题。
黑色素为具有黑色色素和蛋白质的复合体形态的酚类高分子物质，通过色素细胞内存在的酪氨酸酶的作用，从酪氨酸经过复杂的过程而生成，起到紫外线阻断作用，是保护皮肤细胞的非常重要且必须的物质。
但是，皮肤受到外部刺激，例如紫外线、环境污染或压力等时，就会生成过多的黑色素，以没能排出到皮肤外的状态传达到角质形成细胞(keratinocyte)，积累在皮肤表皮层，不但会引起痣、雀斑、以及老人斑等严重的美容上问题，而且也会促进皮肤老化，诱发皮肤癌。
抑制黑色素形成的方法大体已知有：还原已生成黑色素的脱色方法和抑制黑色素形成酶-酪氨酸酶的活性的方法，使用为黑色素还原而利用的生育酚或维生素类等的美白剂的情况，已知黑色素的脱色效果非常小，因此人们关注通过阻碍酪氨酸酶的活性来抑制黑色素生成的阻碍剂。
在以往的化妆品领域中，作为美白成分使用了例如，曲酸(Kojic acid)、熊果苷(Arbutin)等抑制酪氨酸酶的酶活性的物质、氢醌(Hydroquinone)、维生素C(L-Ascorbic acid)和这些的衍生物、以及各种植物提取物。但是，处方系中的稳定性差而分解、着色或产生异味，生物体等级上的功能、效果不明、以及安全性问题等，从而目前其使用受限。另外，尽管曲酸吸附酪氨酸酶的活性部位的铜离子，阻碍酶活性，但是混合在化妆品时，存在不稳定性等问题。维生素C及其衍生物由于容易氧化的不稳定性，难以作为化妆品原料使用，氢醌虽然对皮肤的美白效果卓越，但是具有诱发过敏的性质、对黑色素生成细胞的毒性、对皮肤的永久脱色化等对皮肤刺激大，最近被认定为致癌物质而禁止使用，不同国家按不同浓度受限许可。另外，熊果苷是在氢醌上结合吡喃葡萄糖苷(Glucopyranoside)的衍生物，其具有使用氢醌时出现的副作用小、对人体无毒性、抑制黑色素的合成的作用，因此已公开有作为黑色素沉着增多的皮肤疾病的治疗剂所利用，但是具有被皮肤酶分解一部分的缺点。因此，目前急需开发出即使使用少量也能性能优异且副作用小的安全的替代美白剂。
一方面，皮肤由于活性氧对皮肤的酶性、非酶性抗氧化防御系破坏而损伤蛋白质、基质、DNA等细胞成分(Kor.J.Biotechnol.Bioeng.2005,20(1),40-45)，这些细胞成分的损伤是意味着氧化性相关疾病、即皮肤老化、皱纹、色素沉着等的生成。
抗氧化能力的核心为通过除去活性氧来阻止身体内细胞的氧化或老化作用的作用，因此利用抗氧化活性物质的活性氧消除能力与皮肤保护能力相关。另外，已知黑色素通过位于表皮的基底层的黑素细胞(Melanocyte)合成，由活性氧等而引起的炎症介质物质就会诱导并促进黑素细胞中的黑色素生成，因此抗氧化物质即使不显示直接的美白效果，也会与色素沉着的抑制效果相关。
在这样的观点，抗氧化剂与自由基反应，从而可以用于由自由基引起的氧化导致的细胞损伤的防止目的。广泛使用于食品或药品等的合成抗氧化剂可举出丁基羟基苯甲醚(BHA，Butylated hydroxyanisole)、丁基羟基甲苯(BHT，Butylated hydroxytoluene)、没食子酸丙酯(PG，Propyl galate)、叔丁基氢醌(TBHQ，Teritiarybutyl hydroquinone)等，已知将这些以高浓度投入到实验动物时，就会诱发肝脏肥大症或显示致癌性。特别是，关于丁基羟基甲苯，通过多种研究结果得知，在实验动物的肝脏增加微粒体酶活性(microsomal enzyme activity)，因此对于这些酚类合成抗氧化剂的安全性提出争议，目前法律上规定限制其使用量(Brannen AL,J.Amer.Oil Chem.Soc.,52,pp59-63,1975；Ito N et al.,J.Natl.Cancer Inst.,70,p343,1983；Chan KM et al.,J.Food.Sci.,58,pp1-4,1993)。为此，为了开发出抗氧化效果高、安全且经济性的植物性天然抗氧化剂而进行了很多研究(Larson RA,Phytochemistry,27,pp969-978,1988)。最近以天然物质为对象的研究很活跃，天然物中含有的二次代谢产物为生理活性物质而成为主要关注点，特别是对于抗氧化物质的研究活跃进行，目前为止已知的天然抗氧化物质可举出生育酚(tocopherol)类、类黄酮(flavonoid)类、棉酚(gossypol)、芝麻酚(sesamol)、谷维素(oryzanol)以及维生素C等(Huson B et al.,Food Chem.,19,pp537-541,1987；Frankel,E.N.Food Chem.,57,p51,1996；Giese J,Food Technol.,5,pp73-81,1996；Pszcczola DE,Food Tech.,55,pp51-59,2001)。其中，生育酚(tocopherol)和L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)作为天然抗氧化剂深受喜爱，生育酚安全性高，但是单独使用时存在氧化反应阻止能力低(Halliwell B et al.,FASEB J.,2,pp2867-2870,1988)且价格高的缺点。
因此，为了预防包括由氧化导致的损伤而引起的老化的多种症状和疾病，目前需要开发出能替代的抗氧化物质。
技术实现要素：
技术课题
本发明的目的是提供具有皮肤美白活性的新型化合物。
另外，本发明的另外目的是提供具有抗氧化活性的新型化合物。
课题解决手段
为解决本发明的上述以往技术的问题点，
提供由下述化学式1表示的化合物、其异构体或其盐。
【化学式1】
式中，
n为0或1；
X为NH或S；
Y为碳数C1至C2的烷基；
R1为碳数C1至C8的羟烷基、碳数C1至C8的羟芳基、碳数C1至C8的羟烷基芳基、胺基或酰胺基；
R2为H或碳数C1至C3的烷基；以及，
R3为H或甲基。
另外，本发明提供由下述化学式2表示的化合物、其异构体或其盐。
【化学式2】
式中，
R2为H或碳数C1至C3的烷基；
R3为H或甲基；以及，
R4为苯甲基、羟甲基或羟乙基。
此外，本发明提供由下述化学式3表示的化合物、其异构体或其盐。
【化学式3】
式中，
R2为H或碳数C1至C3的烷基；
R3为H或甲基；以及，
R5为胺基、碳数C1至C3的酰胺基。
另外，本发明提供化合物、其异构体、或其盐，其特征在于，上述化合物为(S)-乙基-3-苯基-2-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺)丙酸酯；(R)-乙基-2-氨基-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯；(R)-甲基-2-乙酰胺基-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯；(S)-甲基-3-羟基-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯或(2S，3R)-甲基-3-羟基-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丁酸酯。
此外，本发明提供作为有效成分含有本发明的化合物、其异构体或其盐的皮肤美白用组合物。
另外，本发明提供作为有效成分含有本发明的化合物、其异构体或其盐的氧化相关症状或疾病的预防或治疗用抗氧化组合物。
此外，本发明提供组合物，其特征在于，上述氧化相关症状或疾病为选自皮肤老化、皱纹生成以及皮肤色素沉着中的一种以上。
另外，本发明提供化妆品组合物，相对于组合物总重量，含有0.01-10重量％的本发明的化合物、其异构体或其盐。
发明效果
本发明涉及的化合物由于具有抑制酪氨酸酶和黑色素生成的皮肤美白活性，能够有效使用于皮肤美白用药学组合物或化妆品，而且由于具有抗氧化活性，能够有效使用于皮肤老化等的预防或治疗。
附图说明
图1是本发明实施例化合物的抗氧化效果测定结果图。
图2是本发明实施例化合物的酪氨酸酶活性阻碍效果测定结果图。
图3是本发明实施例化合物的黑色素生成抑制效果测定结果图。
具体实施方式
下面详细说明本发明。
本发明为由下述化学式1表示的化合物、其异构体或其盐。
【化学式1】
式中，
n为0或1；
X为NH或S；
Y为碳数C1至C2的烷基；
R1为碳数C1至C8的羟烷基、碳数C1至C8的羟芳基、碳数C1至C8的羟烷基芳基、胺基或酰胺基；
R2为H或碳数C1至C3的烷基；以及，
R3为H或甲基。
上述化学式1的化合物，其特征在于，以天然存在的酚酸类中的没食子酸(Gallic Acid)和丁香酸(Syringic Acid)为主骨架与氨基酸反应而得到的衍生化合物。由于将天然存在且物质毒性已知的物质作为合成主要原料来设计且合成，所以合成的酚酸类衍生化合物在通过代谢或分解作用而脱离结合时生成的分解物质的药理和毒性机制很清楚，具有在利用合成衍生化合物时容易确保安全性的优点。
出于这样的观点，氨基酸的种类也优选使用在人体能够代谢或使用的氨基酸或必需氨基酸等，对此举例有丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、硒代半胱氨酸、缬氨酸、色氨酸、酪氨酸等，在合成容易性的方面或功能及效果方面，优选半胱氨酸(包含乙酰基取代)、苯丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸。
上述化学式1的化合物可以通过如下述反应式图示的例示来合成。
【反应式1】
在这里，上述反应式中，1)是为下一个反应将羟基利用乙酰基保护基来取代的步骤；2)是将苯甲酸的羧酸部分活性化，与氨基酸反应，合成复合化合物的步骤；3)是将乙酰基脱保护化成羟基，合成酚酸类衍生化合物的步骤。
通常，氨基酸残基(amino acid residue)是指除了通过肽结合的胺基的H和羧基的OH来生成的H2O之外的部分，但是，本发明中的氨基酸残基(amino acid residue)是氨基酸的反应性官能团与没食子酸或丁香酸反应后留下的氨基酸由来残留结构，根据氨基酸的种类，可形成多种结构，也可以含有未反应的反应性官能团。为此，根据氨基酸的种类，通过氨基酸与没食子酸或丁香酸的组合，可生成多种物质。特别是，根据用于合成的氨基酸的亲核性(Nucleophilic)取代反应基团的不同，可包含硫或胺。
具体地说，由上述化学式1表示的化合物、其异构体或其盐可以为由下述化学式2或下述化学式3表示的化合物、其异构体或其盐。
【化学式2】
式中，
R2为H或碳数C1至C3的烷基；
R3为H或甲基；以及，
R4为苯甲基、羟甲基或羟乙基。
【化学式3】
式中，
R2为H或碳数C1至C3的烷基；
R3为H或甲基；以及，
R5为胺基、碳数C1至C3的酰胺基。
更具体地说，由上述化学式2或化学式3表示的化合物、其异构体或其盐可举出，(S)-乙基-3-苯基-2-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺)丙酸酯；(R)-乙基-2-氨基-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯；(R)-甲基-2-乙酰胺基-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯；(S)-甲基-3-羟基-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯或(2S，3R)-甲基-3-羟基-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丁酸酯。
本发明的化合物、其异构体或其盐由于能够抑制黑色素生成及酪氨酸酶，也可用作皮肤美白用途，而且由于具有优异的抗氧化效果，也可用作氧化相关症状或疾病的预防或治疗用途。上述氧化相关症状或疾病可以为皮肤老化、皱纹生成、皮肤色素沉着症、各种炎症性疾病、老年性退行性疾病、银屑病、湿疹等，特别是皮肤老化、皱纹或皮肤色素沉着症。
本发明的化合物、其异构体或其盐优选可以用于制备化妆品组合物，也可以用于制备药学组合物或健康功能性食品，但并不限定其用途。
在化妆品组合物的情况，可以制备为本领域中通常制备的任何剂型，例如，可以剂型化为溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、乳膏、乳液、粉末、油、粉底、乳液粉底、蜡基底和喷雾剂等，但并不限定于此。更详细地，可制备为防晒霜、柔肤水、收敛水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜、面膜、喷雾剂或散粉的剂型，本发明的化合物、其异构体或其盐以组合物总重量为基准含有0.01至10重量％。当不足0.01重量％时，显示效果不明显，当超过10重量％时，也可能在制剂安全性和保存稳定性方面差。
在药学组合物的情况，根据各种常规方法，可剂型化为粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、悬浮液、乳剂、糖浆、气雾剂等口服型剂型、外用剂、栓剂以及无菌注射溶液形态使用。另外，可以进一步包含药学组合物制备中常用的适当的载体、赋形剂或稀释剂。本发明中可使用的载体、赋形剂或稀释剂可举出：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸钠、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或矿物油等。
在健康功能性食品的情况，可以以粉末、颗粒、片剂、胶囊剂、糖浆、饮料的形态提供，上述健康食品除了有效成分为本发明涉及的化合物之外，与其他食品或食品添加物一起使用，可以根据通常方法适当使用。有效成分的混合量根据其使用目的例如预防、健康或治疗的处理而适当决定。
上述健康食品的种类没有特别限定，例如可举出：肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、零食类、饼干类、比萨、方便面、其他面条类、口香糖类、包括冰淇淋类的乳制品、各种汤、饮水、茶、饮料、酒精饮料以及维生素复合剂等。
下面举出实施例进一步详细说明本发明。这里需要明确的是：这些实施例只是为了进一步详细说明本发明，并不是通过这些来限制权利范围。
实施例
实施例1
(S)-乙基-3-苯基-2-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺)丙酸酯的制备
(1)(S)-乙基-3-苯基-2-(3,4,5-三乙酰氧基苯甲酰胺)丙酸酯的制备
在100ml的烧瓶中加入3,4,5-三乙酰氧基苯甲酸(3.55g)，加入二氯甲烷(12mL)和DMF(0.1mL)后，在低温(5℃)搅拌。在此滴加草酰氯(1.7mL)。在室温搅拌6小时，将溶液减压浓缩，得到3,4,5-三乙酰氧基苯甲酰氯。
在100ml的烧瓶中加入(S)-苯基丙氨酸乙酯盐酸盐(2.75g)和二氯甲烷(12mL)以及二异丙基乙胺(6.2mL)，在低温(5℃)搅拌。在此滴加将在之前反应中得到的3,4,5-三乙酰氧基苯甲酰氯溶解于二氯甲烷(10mL)的溶液。在室温搅拌3小时，减压浓缩反应液。将生成的固体溶解于乙酸乙酯(50mL)中，用水、碳酸氢钠饱和水溶液、饱和盐水洗涤。有机溶液层利用无水硫酸镁干燥、过滤后，减压浓缩溶液，之后利用柱色谱分离，得到白色固体4.43g(78％)。
(2)(S)-乙基-3-苯基-2-(3,4,5-三羟基苯甲酰胺)丙酸酯的制备
从(1)中得到的(S)-乙基-3-苯基-2-(3,4,5-三乙酰氧基苯甲酰胺)丙酸酯(2.83g)溶解在乙醇(6mL)中，加入盐酸溶液(1,4-二氧六环4M溶液，10mL)。在室温搅拌8小时，减压浓缩后，利用柱色谱分离，得到目标物1.9g(92％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.35(t,J＝6.8Hz,3H),3.10-3.17(m,2H),4.07-4.13(m,2H),4.90-4.95(m,2H),6.83(s,2H),7.01-7.20(m,5H),7.14(d,J＝7.2Hz,1H),7.65-7.25(br,3H)；[α]20.0D＝-42.97(c＝1,CH3OH)；FT-IR(Neat)3358.43cm-1,2983.34cm-1,1728.87cm-1,1601.59cm-1,1514.81cm-1,1444.42cm-1,1324.86cm-1,1274.72cm-1,1203.36cm-1,1092.48cm-1,1034.62cm-1,862.99cm-1,748.25cm-1,701.96cm-1；MS(ESI):m/z＝346.1[M+H]+
实施例2
(R)-乙基-2-氨基-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯的制备
(1)(R)-乙基-2-氨基-3-(4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯的制备
在100ml的烧瓶中加入4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸(4.8g)，加入二氯甲烷(20mL)和DMF(0.1mL)后，在低温(5℃)搅拌。在此滴加草酰氯(2.4mL)。在室温搅拌6小时，将溶液减压浓缩，得到4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰氯。
在100ml的烧瓶中加入(R)-N-乙酰半胱氨酸乙酯(3.6g)和二氯甲烷(20mL)以及二异丙基乙胺(10mL)，在低温(5℃)搅拌。在此滴加将在之前反应中得到的3,4,5-三乙酰氧基苯甲酰氯溶解于二氯甲烷(20mL)的溶液。在室温搅拌3小时，减压浓缩反应液。将生成的固体溶解于乙酸乙酯(150mL)中，用水、碳酸氢钠饱和水溶液、饱和盐水洗涤。有机溶液层利用无水硫酸镁干燥、过滤后，减压浓缩溶液，之后利用柱色谱分离，得到白色固体6.8g(87％)。
(2)(R)-乙基-2-氨基-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯的制备
从(1)中得到的(R)-乙基-2-氨基-3-(4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯(3.0g)溶解在乙醇(7mL)中，加入水合肼(0.8mL)。在室温搅拌4小时，减压浓缩。将生成的固体溶解于乙酸乙酯(50mL)中，用水、碳酸氢钠饱和水溶液、饱和盐水洗涤。有机溶液层利用无水硫酸镁干燥、过滤后，减压浓缩溶液，之后利用柱色谱分离，得到目标物2.0g(83％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.35(t,J＝6.8Hz,3H),3.09-3.22(m,2H),3.96(s,6H),4.25-4.37(m,2H),5.03-5.05(m,1H),5.86(s,1H),6.95(d,J＝6.4Hz,1H),7.09(s,2H)；[α]22.3D＝-4.80(c＝1,CH3OH)；FT-IR(KBr)3364.21cm-1,3302.5cm-1,2996.84cm-1,2977.55cm-1,2963.09cm-1,2931.27cm-1,2834.85cm-1,2570.65cm-1,1724.05cm-1,1648.84cm-1,1609.31cm-1,1509.03cm-1,1458.89cm-1,1421.28cm-1,1368.25cm-1,1347.03cm-1,1322.93cm-1,1304.61cm-1,1284.36cm-1,1245.79cm-1,1224.58cm-1,1213.97cm-1,1193.72cm-1,1120.44cm-1,764.64cm-1,752.10cm-1,720.28cm-1；MS(ESI):m/z＝329.9[M+H]+
实施例3
(R)-甲基-2-乙酰胺基-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯的制备
(1)(R)-甲基-2-乙酰胺基-3-(4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯的制备
在100ml的烧瓶中加入4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸(3.6g)，加入二氯甲烷(15mL)和DMF(0.1mL)后，在低温(5℃)搅拌。在此滴加草酰氯(1.6mL)。在室温搅拌6小时，将溶液减压浓缩，得到4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰氯。
在100ml的烧瓶中加入(R)-N-乙酰半胱氨酸甲酯(2.7g)和二氯甲烷(15mL)以及二异丙基乙胺(4mL)，在低温(5℃)搅拌。在此滴加将在之前反应中得到的3,4,5-三乙酰氧基苯甲酰氯溶解于二氯甲烷(15mL)的溶液。在室温搅拌3小时，减压浓缩反应液。将生成的固体溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用水、碳酸氢钠饱和水溶液、饱和盐水洗涤。有机溶液层利用无水硫酸镁干燥、过滤后，减压浓缩溶液，之后利用柱色谱分离，得到白色固体4.4g(73％)。
(2)(R)-甲基-2-乙酰胺基-3-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯的制备
从(1)中得到的(R)-甲基-2-氨基-3-(4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯(2.4g)溶解在甲醇(10mL)中，加入水合肼(0.7mL)。在室温搅拌8小时，减压浓缩。将生成的固体利用水和己酸洗涤、分离，得到目标物1.4g(74％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ1.84(s,3H),3.21(dd,J＝8.4,13.6Hz,1H),3.48(dd,J＝4.8,13.6Hz,1H),3.64(s,3H),3.81(s,6H),4.43-4.48(m,1H),7.15(s,2H),8.47(d,J＝8.0Hz,1H),9.57(s,1H)；[α]20.2D＝-4.39(c＝1,CH3OH)；FT-IR(KBr)3497.27cm-1,3285.14cm-1,3068.19cm-1,2958.27cm-1,2934.16cm-1,2837.74cm-1,1749.12cm-1,1641.13cm-1,1614.13cm-1,1541.81cm-1,1511.92cm-1,1457.92cm-1,1421.28cm-1,1402.0cm-1,1378.85cm-1,1326.79cm-1,1311.36cm-1,1282.43cm-1,1255.43cm-1,1223.61cm-1,1189.86cm-1,1143.58cm-1,1106.94cm-1,998.95cm-1,851.42cm-1,834.06cm-1,772.35cm-1,690.39cm-1；MS(ESI):m/z＝357.8[M+H]+
实施例4
(S)-甲基-3-羟基-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯的制备
(1)(S)-甲基-3-羟基-2-(4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯的制备
在100ml的烧瓶中加入4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸(2.4g)，加入二氯甲烷(10mL)和DMF(0.1mL)后，在低温(5℃)搅拌。在此滴加草酰氯(1.2mL)。在室温搅拌6小时，将溶液减压浓缩，得到4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰氯。
在100ml的烧瓶中加入(S)-丝氨酸甲酯(1.55g)和二氯甲烷(15mL)以及三乙胺(2.8mL)，在低温(5℃)搅拌。在此滴加将在之前反应中得到的3,4,5-三乙酰氧基苯甲酰氯溶解于二氯甲烷(10mL)的溶液。在室温搅拌3小时，减压浓缩反应液。将生成的固体溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用水、1M盐酸水溶液、碳酸氢钠饱和水溶液、饱和盐水洗涤。有机溶液层利用无水硫酸镁干燥、过滤后，减压浓缩溶液，之后利用柱色谱分离，得到白色固体2.5g(73％)。
(2)(S)-甲基-3-羟基-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯的制备
从(1)中得到的(S)-甲基-3-羟基-2-(4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丙酸酯(1.4g)溶解在甲醇(8mL)中，加入水合肼(0.4mL)。在室温搅拌4小时，减压浓缩。将生成的固体用水和己酸洗涤，得到目标物0.85g(69％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ3.65(s,3H),3.77-3.82(m,8H),4.50-4.54(m,1H),5.07(t,J＝6.0Hz,1H),7.22(s,2H),8.44(d,J＝6.8Hz,1H),8.99(s,1H)；[α]20.2D＝-4.39(c＝1,CH3OH)；FT-IR(KBr)3472.20cm-1,3281.29cm-1,3172.33cm-1,3034.44cm-1,3017.09cm-1,3001.66cm-1,2975.62cm-1,2948.63cm-1,2907.16cm-1,2844.49cm-1,1749.12cm-1,1634.38cm-1,1606.41cm-1,1536.99cm-1,1509.99cm-1,1470.46cm-1,1451.17cm-1,1424.17cm-1,1375.0cm-1,1348.0cm-1,1314.25cm-1,1294.0cm-1,1241.93cm-1,1227.47cm-1,1187.94cm-1,1141.65cm-1,1120.44cm-1,1059.69cm-1,1027.87cm-1,972.91cm-1,849.49cm-1,777.17cm-1；MS(ESI):m/z＝299.9[M+H]+
实施例5
(2S，3R)-甲基-3-羟基-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丁酸酯的制备
(1)(2S，3R)-甲基-3-羟基-2-(4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丁酸酯的制备
在100ml的烧瓶中加入4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸(2.64g)，加入二氯甲烷(11mL)和DMF(0.1mL)后，在低温(5℃)搅拌。在此滴加草酰氯(1.2mL)。在室温搅拌6小时，将溶液减压浓缩，得到4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰氯。
在100ml的烧瓶中加入(S)-苏氨酸甲酯(1.87g)、二氯甲烷(10mL)、四氢呋喃(10mL)、以及三乙胺(3.2mL)，在低温(5℃)搅拌。在此滴加将在之前反应中得到的3,4,5-三乙酰氧基苯甲酰氯溶解于二氯甲烷(11mL)的溶液。在室温搅拌3小时，减压浓缩反应液。将生成的固体溶解于乙酸乙酯(100mL)中，用水、1M盐酸水溶液、碳酸氢钠饱和水溶液、饱和盐水洗涤。有机溶液层利用无水硫酸镁干燥、过滤后，减压浓缩溶液，之后利用柱色谱分离，得到白色固体2.45g(66％)。
(2)(2S，3R)-甲基-3-羟基-2-(4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丁酸酯的制备
从(1)中得到的(2S，3R)-甲基-3-羟基-2-(4-乙酰氧基-3,5-二甲氧基苯甲酰基硫代)丁酸酯(2.1g)溶解在甲醇(10mL)中，加入水合肼(0.6mL)。在室温搅拌3小时，减压浓缩。将生成的固体溶解于乙酸乙酯(50mL)中，用水、碳酸氢钠饱和水溶液、饱和盐水洗涤。有机溶液层利用无水硫酸镁干燥、过滤后，减压浓缩溶液，之后利用柱色谱分离，得到目标物1.4g(76％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ1.30(d,J＝6.4Hz,3H),2.50-3.00(br,1H),3.80(s,3H),3.91(s,6H),4.44-4.46(m,1H),4.82(d,J＝9.2,1H),5.98-6.03(br,1H),7.01(d,J＝9.2Hz,1H),7.11(s,2H)；[α]21.2D＝-4.45(c＝1,CH3OH)；FT-IR(Neat)3366.14cm-1,2975.62cm-1,2844.49cm-1,1742.37cm-1,1640.16cm-1,1604.48cm-1,1542.7cm-17,1508.06cm-1,1459.85cm-1,1423.21cm-1,1339.32cm-1,1214.93cm-1,1158.04cm-1,1116.58cm-1,1014.37cm-1,912.17cm-1,863.95cm-1,758.85cm-1,696.18cm-1；MS(ESI):m/z＝313.9[M+H]+
【试验例1】-酚酸类衍生化合物的抗氧化效果
对于在上述实施例中说明的衍生化合物，通过测定对1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基的消除活性，测定对自由基的抗氧化能力，作为阳性对照群使用抗坏血酸(Ascorbic acid)。
试验所需的1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH))自由基是从Sigma Chemical Co.(USA)购买，而作为对照物质使用的L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)是从Sigma(USA)购买。
在96-培养容器中分别注入溶解于甲醇的0.2mM DPPH溶液100μl和各种浓度的合成化合物100μl后，在室温反应10分钟，然后在517nm测定吸光度。
将测得的吸光度和化合物的浓度的关系利用图1的图标表示。
如图1所示，大部分的实施例化合物与抗坏血酸比较，显示低的活性，但是实施例1的化合物与作为对照群的抗坏血酸比较，显示高的活性。
因此，可确认本发明涉及的酚酸类衍生化合物具有强有力的抗氧化能力，由此显示出作为氧化相关疾病、即皮肤老化、皱纹改善、皮肤色素沉着抑制等用途的可使用性。
【试验例2】-酚酸类衍生化合物对细胞内酪氨酸酶的活性阻碍效果
对于上述实施例中合成的化合物，测定细胞内的抑制酪氨酸酶生成的效果。
细胞实验中所用的胎牛血清(Fetal bovine serum(FBS))的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM))是从Gibco(USA)购买使用，细胞株使用从韩国细胞株银行购买的小鼠源性B16F10(黑色素瘤细胞)。使用添加有10％的FBS(Gibco)和1％的抗生素抗真菌药(antibiotic-antimycotic(Gibco))的DMEM(Gibco)，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，以3～4天为间隔，进行传代培养。将已培养的B16F10细胞以0.05％胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA分离，于24-孔板(well plate)中以相同数(1.0×105cells/well)接种后，16小时后换成无血清培养基。进一步培养6小时后，用α-MSH(100nM)和试验药物处理，培养3天。结束3天培养后，利用凉的磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline(PBS))缓冲液洗涤两次，然后用200μl的添加有蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的RIPA缓冲液(50nM Tris-HCl,150nM NaCl,2％NP-40,0.5％脱氧胆酸钠,0.1％SDS,pH 7.4)进行处理，使细胞破裂。将回收的裂解液在4℃的条件下，以13000rpm的速度离心分离30分钟，只收集蛋白质存在的上层液。收集的上层液通过考马斯亮蓝法(bradford assay)来定量蛋白质。将200μg/ml的蛋白质198μl和2mg/ml的L-DOPA 2μl反应后，利用阻断光的烹饪箔包裹，在37℃、CO2的培养箱中反应1小时。之后，在405nm测定吸光度值。
以细胞内酪氨酸酶活性率(％)＝试剂群/对照群(黑色素生物合成相关因子的处理)*100计算，作为对照群使用熊果苷(Arbutin)。其结果示于图2。
如图2所示，实施例化合物与熊果苷比较，显示高的酪氨酸酶活性阻碍效果。从而，为了确认酚酸类衍生化合物是否也抑制酪氨酸酶活性且影响黑色素生成，进一步进行细胞内黑色素生成量的确认实验。
*【试验例3】-酚酸类衍生化合物对黑色素生成阻碍效果
对于上述实施例中合成的化合物，将细胞内的黑色素生成抑制效果利用Chang and Chen方法进行测定(Chang and Chen,「Inhibitory effect of homochlorcyclizine on melanogenesis inα-melanocyte stimulating hormone-stimulated mouse B16melanoma cells」,Archives of Pharmacal Research January 2012,Volume 35,Issue 1,pp 119-127)。
细胞实验中所用的胎牛血清(Fetal bovine serum(FBS))的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM))是从Gibco(USA)购买使用，细胞株使用从韩国细胞株银行购买的小鼠源性B16F10(黑色素瘤细胞)。使用添加有10％的FBS(Gibco)和1％的抗生素抗真菌药(antibiotic-antimycotic(Gibco))的DMEM(Gibco)，在37℃、5％CO2的培养箱中培养，以3～4天为间隔，进行传代培养。将已培养的B16F10细胞以0.05％胰蛋白酶(Trypsin)-EDTA分离，于24-孔板(well plate)中以相同数(2.0×104cells/well)接种后，24小时后，用α-MSH(100nM)和试验药物处理，培养3天。结束3天培养后，利用1N NaOH处理，在80℃反应1小时，溶解细胞中包含的黑色素，在405nm测定吸光度，从而测定黑色素的量。作为阳性对照群，使用曲酸(Kojic acid)和熊果苷(arbutin)。其结果示于图3。
如图3所示，实施例化合物与熊果苷比较，显示高的酪氨酸酶活性阻碍效果。另外，也确认比曲酸更高活性的实施例化合物。因此，可知本发明所说明的酚酸类衍生化合物抑制黑素生成，具有美白效果。