本发明一般地涉及核酸检测，更具体地涉及核酸变体的原位检测。
发明背景
近期的研究显示在早先被认为是相互间的克隆的肿瘤细胞中有显著的异质性(Gerlinger et al.,N.Engl.J.Med.366:883-892,2012)，意味着在肿瘤部位或肿瘤活检物中的单个的癌细胞不是同质性的。特别是，相邻的癌细胞常常在DNA或RNA中具有单核苷酸变异(single nucleotide variations，SNVs)。因而精准医疗需要组织活检物中SNV的原位检测，其中细胞结构和内容物必需在分析之后被基本上保留。细胞中复杂的物理化学结构和压倒性数量的非目标核酸和其他分子代表了“高噪声”环境，这可能产生高背景，并且需要高度特异性和高度敏感性的组合，这是现有的原位核酸检测技术未能实现的。
SNV检测需要一组单独的目标探针(target probes，TP)来捕获单个的信号发生复合物(signal-generating complex，SGC)。然而，在美国专利No.7,709,198和8,658,361中公开的早先描述的“双重-Z(double-Z)”探针设计中，多组TP与目标杂交以提供足够数量的SGCs来产生可检测信号。
因而，需要以单细胞水平原位检测单核苷酸变异或其他核酸变异的方法。本发明满足了这一需求，并且还提供了相关的优势。
发明概述
本发明涉及原位检测样品中目标核酸的核酸变异的方法，包括单核苷酸变异或剪接变体等。所述方法可以包括使所述样品与探针和邻近探针接触，所述探针检测所述核酸变异；使所述样品与前级放大子(pre-amplifiers)接触，所述前级放大子分别结合所述核酸变异探针和邻近探针；使所述样品与协作放大子接触，所述协作放大子结合所述前级放大子；以及使所述样品与标签探针系统接触的步骤，其中这些组分的杂交形成信号发生复合物(SGC)，所述信号发生复合物包含具有所述核酸变异的目标核酸、所述探针和所述放大子；以及原位检测所述样品上来自SGC的信号的步骤。本发明还提供了与检测目标核酸的核酸变异相关的样品、组织玻片和试剂盒。
附图的简要说明
附图1显示了用于目标核酸中单核苷酸变异(SNV)的原位检测的信号发生复合物(SGC)的示范性的结构。所述SGC包括单核苷酸变异探针-SP；邻近探针-NP；SP前级放大子-SPM，其含有多个SP协作锚-SPCA；NP前级放大子-NPM，其含有多个NP协作锚-NPCA；协作放大子-COM；标签探针系统-LPC，其可以包含多个标签放大子-LM，其每一个随后可以结合多个标签探针-LP。
附图2A和2B例示了SP和NP的细节和方向。附图2A和2B详细地显示了SP和NP的结构、位置和方向。附图2A显示，SP包含与含有所述SNV的目标序列互补的目标锚定片段(SPAT)、与所述SP前级放大子(SPM)上的片段互补的前级放大子锚定片段(SPAP)；NP包含目标锚定片段(NPAT)，其与含有SNV的目标上的片段相邻的目标序列互补，与所述NP前级放大子(NPM)上的片段互补的前级放大子锚定片段(NPAP)；以及处在SPAT与SPAP之间或NPAT与NPAP之间的任选的间隔区。附图2B说明了对于目标不同方向的SP和NP以及整个信号发生复合物(SGC)的实例。
附图3A-3C显示了SPM和NPM的不同方向或位置。附图3A和3B显示了SPM和NPM对于SPAP和NPAP的不同方向和位置的两个实例。附图3C中显示的结构与附图3B中显示的相同，其中附图3C反映了核酸分子的灵活性和附图3B中的结构的能力，来提供相互接近的NPCA和SPCA用于结合COM。
附图4A、4B和4C显示了协作杂交中COM结合位点的不同方向。附图4A、4B和4C显示了示范性的结构，其中协作放大子(COM)同时与SPM上的SP协作锚(SPCA)和NPM上的NP协作锚(NPCA)杂交。附图4A和4B描绘了处于相同方向的与SPCA和NPCA杂交的COM上的两个相应片段。附图4B中描述的结构可以认为是附图4A中的结构的特例。在附图4B中，SPCA和NPCA以一定偏移放置。结果，COM上两个相应片段之间的间隔区可以缩短或甚至移除，这可以增强协作杂交效果。附图4C描绘了处于相反方向的与SPCA和NPCA杂交的COM上的两个相应片段。
附图5A和5B显示了示范性的结构，其中两个信号发生复合物(SGCs)被捕获到单核苷酸变异(SNV)上。附图5A描绘了形成并与目标核酸结合的两个SGCs。附图5B描绘了一个SGC的结合，而第二个SGC没有结合。缺乏第二个SGC的结合可能是由于探针接近的问题或目标核酸降解。在所描绘的结构中，可检测信号仍然由与目标核酸结合的一个SGC产生。
附图6A和6B显示了示范性的实施方式，其中分析步骤的数量被降低。分析步骤可以预组装SGC的组分来降低。附图6A显示了实施方式，其中SPM和COM被整合，NPM和COM被整合。在所描绘的实施方式中，利用“分枝”分子，SPM与COM整合，NPM与COM整合。附图6B显示了实施方式，其中SP与SPM整合，NP与NPM整合，COM与LM整合。
附图7A和7B显示了示范性的实施方式，其中协作杂交被移动到SGC内的不同的层。附图7A显示了COM和LM之间的协作杂交形成的SGC。附图7B显示了LM和LP之间的协作杂交形成的SGC。
附图8A和8B显示了示范性的实施方式，在分析期间的SGC组装中加入了超过一个协作杂交步骤。附图8A显示了SPM或NPM分别与SP和TP之间的第一协作杂交。显示了SPM、NPM与COM之间的第二协作杂交。附图8B显示了SP、NP与目标核酸之间的第一协作杂交，以及SPM、NPM与COM之间的第二协作杂交。
附图9A-9C显示了检测目标核酸序列中的特定剪接接点的示范性的实施方式。附图9A显示了示范性的实施方式，其中SPAT跨越剪接接点杂交，也就是说，它与在剪接接点处组合在一起的两个核酸片段都杂交，NPAT与所述核酸片段之一杂交。附图9A显示了示范性的实施方式，其中SPAT与剪接接点处组合在一起的核酸片段之一杂交，NPAT与剪接接点处的另一个核酸片段杂交。附图9C显示了与附图9B中描绘的相似的结构，关于SPAT和NPAT与剪接接点处组合在一起的各个核酸片段的杂交，其中在NPAT和SPAT的互补节段之间也有杂交。
附图10A-10C显示了利用剪接接点检测方法来检测RNA分子、同时避免检测相应DNA的示范性的实施方式。附图10A显示了使用外显子接点桥接目标探针的RNA特异性检测的示范性实施方式。附图10B显示了使用相互协作杂交的目标探针组(核酸变异探针和邻近探针)的RNA特异性检测的示范性实施方式。附图10C显示了使用目标探针组(核酸变异探针和邻近探针)的RNA特异性检测的示范性实施方式。
附图11A、11B和11C显示了检测短序列的示范性的实施方式。
附图12A和12B显示了检测多个目标的示范性的实施方式。附图12A显示了“集中化(pooling)”方法，其中每个目标具有SP-NP配对中的唯一SPAT和NPAT，但是在SGC的其余部分中其他元件是相同的。当存在任何一个目标核酸时检测出共同的信号。附图12B显示了“多路化(multiplexing)”方法，其中每个目标核酸具有唯一的SGC，它为每个目标核酸提供唯一的可识别信号。
附图13显示了在福尔马林固定并石蜡包埋(FFPE)的黑素瘤细胞系的团粒的切片中检测BRAF V660E。分析了关于BRAF的V600E点突变的黑素瘤细胞系阴性(CHL-1，a和a')和阳性(SK-MEL-28，b和b')。细胞与含有野生型检测探针(WDP)的目标探针系统(TPS)(a和b)以及含有BRAF V600E突变检测探针(MDP)的TPS(a'和b')分别杂交。
附图14A和14B显示了各种长度的SPAT的效果。附图14A显示了使用长SPAT有大量的假阳性。附图14B显示了如果SPAT太短，分析的灵敏度低。
附图15A和15B显示了在SPAT中包括修饰碱基的效果。附图15A显示了SPAT中正常碱基的染色结果。附图15B显示了SPAT中使用修饰碱基的改进的结果。
附图16显示了在已知V600E点突变为阴性(a和a')和阳性(b和b')的FFPE结肠癌组织中BRAF V600E的检测。使用靶向野生型BRAF mRNA的探针在两个样品中(a和b)都观察到信号，使用为V600E突变特异性设计的探针仅在突变阳性样品中检出V600E突变mRNA(b')。
附图17A和17B显示了极低丰度和/或降解的RNA目标的检测。附图17A显示了HGF目标RNA的低染色，已知在使用如早先在美国专利No.7,709,198和8,658,361中描述的RNA检测方法的样品中它是非常低丰度和部分降解的。附图17B显示了使用与附图11A中显示的相似的结构对相同目标的改进的染色。
附图18显示了与美国专利Nos.7,709,198和8,658,361中公开的方法相比，在检测非常短的序列方面本发明的示范性的方法的增强的敏感性。在附图18A中，美国专利Nos.7,709,198和8,658,361的检测系统与单独一对目标探针一起使用来检测HeLa细胞团中POLR2A mRNA上的50nt序列。在附图18B中，具有与附图11A中显示的相似的结构的单个SGC被用于检测相同样品类型中的相同目标。
附图19展现了特定剪接接点的原位检测，其可以用于检测特定的剪接变体。已知细胞系H596是META14阳性的，也就是说，MET基因中的外显子14被“跳过”，产生MET RNA中外显子15与外显子13的拼接。细胞系A549是野生型的，在MET RNA中具有所有的外显子12-15。靶向E12/13、E13/14和E14/15剪接接点的探针被用于检测H596和A549细胞的FFPE(福尔马林固定的和石蜡包埋的)细胞团中相应接点的存在。染色图像在附图19中显示，其显示了H596细胞中E13/15的被靶向剪接接点，A549细胞中E14/15的被靶向剪接接点的敏感和特异性的检测，显示了META14剪接变体被正确地鉴定。
发明的详细说明
本发明涉及提供细胞中核酸变体的高敏感性检测的方法。所述方法对于检测核酸变异是有用的，所述核酸变异对疾病状态、疾病进展、对疾病治疗的响应等等具有临床意义。例如，癌症包括肿瘤不是同质的，而是可能含有各种类型的细胞，和/或同一类型但在细胞之间具有不同表达水平的蛋白质和核酸的细胞。在某些情况下，在细胞之间存在核酸变异。这样的核酸变异可以包括但不限于单核苷酸变异、插入和/或删除(indels)、剪接变异、基因重排，等。如本文公开的本发明的方法和组合物可以用于在单细胞水平上检测核酸变体。因而，所述方法提供了一种高敏感性和特异性的分析系统来检测临床样本中的核酸变异，提供了关于单细胞水平上核酸变异表达的更详细可视化的和临床上相关的信息。
如下文更详细地描述的，设计探针来检测核酸变体，例如，单核苷酸变异、插入和/或删除、剪接位点、基因重排等，这样的探针在本文中称为SP。在本发明的实施方式中，所述SP可以是单核苷酸变体(SNV)探针，其可以检测目标核酸中的单核苷酸变异，或更一般地是可以检测涉及超过一个核苷酸的特定核酸变体，也就是多核苷酸变体的探针。这样的多核苷酸变体将包括使用例如CRISPER的方法的微插入、微删除、或超过一个核苷酸的修饰。特别是，目标核酸中的剪接位点或接点可以被认为是特定类型的多核苷酸变体，因为这种接点与接点两侧的核苷酸特异性相关。要理解的是，本文中对SP的说明或本文的SP的附图中的描绘可以应用于任何类型的SP，所述SP被设计为检测SNV或多核苷酸变体例如剪接位点。因而，描述了利用SP检测SNV的本文的说明和附图中的结构可以类似地应用于检测包括间接位点的多核苷酸变体，或其他变体，所述SP被设计以检测多核苷酸变体而不是SNV，所描绘的结构的其余部分适用于检测目标核酸中的多核苷酸变体。类似地，检测剪接位点的本文的说明或附图中的描绘可以应用于检测SNV或多核苷酸变体，差别在于SP是被设计为检测目标核酸中的SNV还是多核苷酸变体，例如剪接位点。因而，本文对SP的说明被理解为适用于检测目标核酸中的核苷酸变体，取决于目标核酸的性质。
本发明提供了在高噪声环境例如肿瘤活检物中对核酸变异的高敏感性和特异性的原位检测。在一个实施方式中，所述核酸变异是单核苷酸变异(SNV)。在附图1中显示了本发明的示范性的实施方式，下文更详细地说明。
(1)SNV探针(SP).如附图1中所示和附图2A中更详细显示的，单核苷酸变异(SNV)探针(SP)包含两个非重叠的区域，目标锚定片段(SPAT)和前级放大子锚定片段(SPAP)，任选地由间隔区或接头序列分隔。SPAT与包含SNV位点的目标核酸序列互补，具有足够的辨别能力来辨别SVN序列中的单碱基改变。设计它的长度和其他参数，以与目标SNV杂交而不与野生型或非目标SNV序列杂交。SPAT的长度一般在约10到20个核苷酸之间，而SPAP的长度一般在约14到28个核苷酸之间。SP探针设计可以容易地扩展到检测1-10,000个碱基的插入和删除(indels)。
(2)邻近探针(HP).还在附图1中显示和在附图2A中更详细显示的，邻近探针(NP)包含两个非重叠的区域，目标锚定片段(NPAT)和前级放大子锚定片段(NPAP)，任选地由间隔区或接头序列分隔。NPAP与邻近SNV的目标核酸的区域互补，长度一般在约12到40个核苷酸之间。NPAP的长度一般在约14到28个核苷酸之间。
NP可以坐落于结合了目标SNV的SP的左侧或右侧(5'或3')。在另一个实施方式中，NP和SP可以在相互关系上和在与信号发生复合物(SGC)的关系上采取不同的5'和3'方向，如附图2中说明的。例如，如附图2B所示，NP可以在3'具有NPAT，SP可以在3'末端具有SPAT(附图2B，左上)，NP可以在5'末端具有NPAT，SP可以在5'末端具有SPAT(附图2B，右上)，NP可以在3'末端具有NPAT，SP可以在5'末端具有SPAT(附图2B，左下)，NP可以在5'末端具有NPAT，SP可以在3'末端具有SPAT(附图2B，右下)。有可能通过在SNV的相邻区域加入多个NPs来进一步增强突变检测的特异性或敏感性。在一个实施方式中，坐落于结合了目标SNV的SP的左侧和右侧(5'或3'，也就是侧翼)的两个NPs可以用于捕获一个或多个SGCs，并产生可检测信号(参见附图5A，显示了SP侧翼的两个NPs)。
NP可以在所采用的杂交条件下与目标核酸的它的互补区域稳定结合。另一方面，SP的SPAT一般是短的(10-20个核苷酸)，以增强它针对非SNV序列辨别SNV的能力。在一个实施方式中，SPAT比NPAT更短，或SPAT的熔解温度比NPAT更低。由于协作杂交效应，短的SP在存在NP的情况下仍然能与含有SNV的目标核酸杂交，也就是说，同时与SP和NP杂交的目标核酸的熔解温度高于与SP或NP单独杂交的目标核酸的熔解温度。协作杂交效应可以通过附图5和8中描绘的目标探针组结构来增强，其中在附图5A中，SP在双侧有两个NPs。在附图8B中，SP和NP具有第三个非重叠片段，它们相互互补。在这些情况下，同时与SP和NP杂交的目标核酸的熔解温度实质地高于与SP或NP单独杂交的目标核酸的熔解温度。当SP与NP与单个目标核酸的相邻区域杂交时产生可检测信号，而当SP和NP不与单个目标核酸的相邻区域杂交时仅有微弱的或不可检测的信号。
(3)SP的前级放大子(SPM).如附图1中显示和附图3中详细显示的，SP的前级放大子(SPM)包含长度约50到500个核苷酸之间的单链核酸。SPM包含多个称为SP协作锚(SPCA)的长度在10到20个核苷酸之间的重复序列。SPM通过杂交与SP连接。SPM包含与SP的前级放大子锚定片段(SPAP)互补的片段，如附图3所示其被设计以按不同位置或方向与SPAP结合。在优选的实施方式中，在SPM中SPCA重复2到20次。
(4)NP的前级放大子(NPM).如附图1中显示和附图3中详细显示的，NP的前级放大子(NPM)包含长度约50到500个核苷酸之间的单链核酸。NPM包含多个称为NP协作锚(SPCA)的长度在10到20个核苷酸之间的重复序列。NPM通过杂交与NP连接。NPM包含与NP的前级放大子锚定片段(NPAP)互补的片段，如附图3所示其被设计以按不同位置或方向与NPAP结合。在优选的实施方式中，在NPM中NPCA重复2到20次。
(5)协作放大子(COM).协作放大子(COM)包含长度约60到900个核苷酸之间的单链核酸。如附图1显示和附图4更详细显示的，COM包含三个非重叠片段，与SP的前级放大子(SPM)的SP协作锚(SPCA)互补的片段，与NP前级放大子(NPM)的NP协作锚(NPCA)互补的片段，以及含有重复节段的片段，每一个重复节段可以与发出检测信号的标签探针系统(LPS)杂交。SPCA和NPCA与COM协作杂交，也就是说，与SPCA和NPCA同时杂交的COM的熔解温度显著高于与SPCA或NPCA单独杂交的COM的熔解温度。也就是说，设置分析中的杂交条件，使得COM不能稳定地单独结合SPCA或NPCA。由于SPM和NPM分别稳定地与SP和NP结合，当且仅当SP和NP都与目标核酸杂交并且相互邻近时COM可以稳定地结合目标序列。由于这样的唯一的结构和定位非特异性地发生是极其不可能的，这种协作杂交显著降低了在高噪声环境中由NPM或SPM的非特异性结合引起的假阳性信号。与SPCA和NPCA互补的两个片段可以按不同的方向与它们杂交，如附图4中描绘的。与LPS杂交的COM的片段一般包含长度约15到30个核苷酸之间的多个重复序列，称为标签放大子锚定片段，能够与LPS杂交。另外，标签放大子锚定片段可以位于与SPCA和NPCA互补的片段的任一侧或两侧。
(6)标签探针系统(LPS).如附图1所示，标签探针系统(LPS)与COM杂交。标签探针系统(LPS)包含多个放大子，其是包含一片段的核酸，所述片段可以与COM的互补重复序列杂交。所述放大子还包含可以与标签探针(LP)杂交的多个重复序列。所述标签探针包含核酸，所述核酸包含可以与所述放大子的互补重复序列杂交的片段。标签探针还包含可检测标签。因而标签探针系统提供了与放大子结合的多个标签探针，以及可以结合COM的多个放大子。
更详细地，LPS包含多个标签放大子(LM)和多个标签探针(LP)，其中每个LM包含一片段，所述片段可以与COM的标签放大子锚定片段结合。LM还包含多个标签探针锚定片段。每个LP包含可检测标签以及与LM的标签探针锚定片段杂交的片段。当在组分之间发生杂交时，形成信号发生复合物(SGC)。SGC包含具有单核苷酸变异的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP(参见附图1)。
本发明提供了高特异性和敏感性的分析，从而可以在高噪声样品中进行核酸变异的原位检测，包括SNV、多核苷酸变体例如剪接位点和其他变体。如附图1中说明的，SGC提供了对目标核酸中SNV的非常敏感和特异性的检测。如附图1中进一步说明的，如果LPS杂交上的COM与细胞的成分非特异性结合，可能产生假信号。然而，如本文描述的，本发明的协作杂交的性质提供了高敏感性和特异性，因为在与实际目标结合时产生的信号大于非特异性地结合的COM的信号。如上所述，SPCA在SPM中重复至少2次，NPCA在NPM中重复至少2次。这样的结构提供了实际目标的可检测信号，其至少2倍大于非特异性结合的COM的信号。如本文描述的，通过提高SPM中SPCA重复的数量和NPM中NPCA重复的数量，与实际目标结合的COM-LPS之间的差异信号可以进一步提高(也参见附图1)。一般地，SPM中SPCA重复的数量将与NPM中NPCA重复的数量相同，从而COM可以与SPM和NPM两者协作地杂交。因此，与非特异性结合相比LPS与实际目标的结合之间的差异信号可以被提高，以提供信噪比的更大增加，从而为原位检测单个细胞中的单核苷酸变异提供了更高特异性和更高敏感性的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了原位检测目标核酸的核酸变异例如单核苷酸变异的方法。在本发明的实施方式中，提供的是原位检测固定和透性化细胞的样品中目标核酸的单核苷酸变异的方法。所述方法可以包括步骤：(A)使所述样品与单核苷酸变异探针(SP)和邻近探针(NP)接触，其中所述SP包含目标锚定片段(SPAT)和预扩增子锚定片段(SPAP)，所述目标锚定片段可以与包含单核苷酸变异的目标核酸区域特异性杂交，以及其中所述NP包含目标锚定片段(NPAT)和预扩增子锚定片段(NPAP)，所述目标锚定片段可以与邻近所述SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(B)使所述样品与SP前级放大子(SPM)和NP前级放大子(NPM)接触，其中所述SPM包含可以与所述SP结合的片段并包含两个或更多个SP协作锚(SPCA)，以及其中所述NPM包含可以与所述NP结合的片段并包含两个或更多个NP协作锚(NPCA)；(C)使所述样品与协作放大子(COM)接触，其中所述COM包含与所述SPCA互补的第一片段、与所述NPCA互补的第二片段、以及包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(D)使所述样品与标签探针系统(LPS)接触，其中所述LPS包含多个标签放大子(LM)和多个标签探针(LP)，其中每个LM包含可以与所述COM的标签放大子锚定片段结合的片段、以及多个标签探针锚定片段，其中每个LP包含可检测标签、以及与LM的所述标签探针锚定片段杂交的片段，其中前述的杂交形成信号发生复合物(SGC)，所述信号发生复合物包含具有单核苷酸变异的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM、多个LP；和(E)原位检测所述样品上来自所述SGC的信号。
如本文描述的，本发明的方法一般涉及核酸变异的原位检测。核酸的原位检测方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，US2008/0038725；US 2009/0081688；Hicks et al.,J.Mol.Histol.35:595-601(2004))。如本文使用的，“原位杂交”或“ISH”是指一种类型的杂交，其使用直接或间接标记的互补DNA或RNA链，例如探针，来结合和定位样品中、特别是组织的部分或区段(原位)中特定的核酸，例如DNA或RNA探针类型可以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链互补RNA(sscRNA)、信使RNA(mRNA)、microRNA(miRNA)、核糖体RNA、线粒体RNA和/或合成的寡核苷酸。术语“荧光原位杂交”或“FSH”是指一种利用荧光标签的ISH。术语“显色原位杂交”或“CISH”是指一种使用显色标签的ISH。ISH、FISH和CISH方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Stoler,Clinics in Laboratory Medicine 10(l):215-236(1990)；In situ hybridization.A practical approach,Wilkinson,ed.,IRL Press,Oxford(1992)；Schwarzacher and Heslop-Harrison,Practical in situ hybridization,BIOS Scientific Publishers Ltd,Oxford(2000))。
对于细胞中核酸目标的原位检测，任选地在目标探针杂交之前细胞被固定和透性化。固定和透性化的细胞可以便于将核酸目标维持在细胞中，并允许目标探针、标签探针、放大子、前级放大子等进入细胞。任选地洗涤细胞来除去未捕获在核酸目标上的材料。细胞可以在各种步骤的任何一个之后洗涤，例如，在目标探针与核酸目标杂交之后以除去未结合的目标探针，在前级放大子、放大子和/或标签探针与目标探针杂交之后，和/或类似的。固定和透性化细胞用于核酸原位检测的方法，以及杂交、洗涤和检测目标核酸的方法也是本领域公知的(参见，例如，US 2008/0038725；US 2009/0081688；Hicks et al.,J.Mol Histol.35:595-601(2004)；Stoler,Clinics in Laboratory Medicine 10(l):215-236(1990)；In situ hybridization.A practical approach,Wilkinson,ed.,IRL Press,Oxford(1992)；Schwarzacher and Heslop-Harrison,Practical in situ hybridization,BIOS Scientific Publishers Ltd,Oxford(2000))。
如本文使用的，术语“多个”被理解为是指两个或更多个。因而，多个可以指例如，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、55个或更多个、60个或更多个、65个或更多个、70个或更多个、75个或更多个、80个或更多个、85个或更多个、90个或更多个、95个或更多个、100个或更多个、110个或更多个、120个或更多个、130个或更多个、140个或更多个、150个或更多个、160个或更多个、170个或更多个、180个或更多个、190个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、600个或更多个、700个或更多个、800个或更多个、900个或更多个、or 1000个或更多个、或甚至更多的数量，如果是特定的用途所希望的。
在本发明的一个实施方式中，所述方法可以用于检测目标核酸的单核苷酸变异。这样的单核苷酸变异(SNV)可以是点突变或单核苷酸多态性(SNP)。在本发明的方法的实施方式中，含有样品的细胞与单核苷酸变异探针(SP)和邻近探针(NP)接触。SP包含目标锚定片段(SPAT)，所述目标锚定片段可以与包含单核苷酸变异的目标核酸区域特异性杂交。如本文使用的，可以与包含SNV的目标核酸区域“特异性杂交”的SP是指，SP可以与含有SNV的目标核酸特异性杂交，而不与在SNV位置具有不同核苷酸的核酸杂交。因而，SP可以区分含有SNV的核酸和不含SNV的核酸。要理解的是本发明的方法和组合物中使用的SP被设计以使得在使用的分析条件下，所述SP可以与含有特定核苷酸例如SNV的目标核酸特异性杂交，而不与在该位置含有不同核苷酸的核酸序列，例如野生型核酸序列杂交。因而，选择SP以具有期望长度的SPAT，适合于在原位杂交分析使用的温度和缓冲液下展现与含有SNV的目标核酸的特异性杂交。SPAT的长度可以选择为足够短，使得它在没有NP结合的情况下不能保持与目标核酸稳定结合。一般地，SPAT的长度是相对短的，例如，长度约10到20个核苷酸，但是取决于使用的分析条件可以稍微更短或更长，例如，长度约9到21个核苷酸。因而，一般地，SPAT的长度可以是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸。
在所述SP中，与目标核酸上的核苷酸变异互补的碱基可以处于SP的SPAT内的任何位置，但是一般地靠近SPAT的中心。重要的是所述SP能够区分具有所述核苷酸变异的目标核酸与不含有所述核苷酸变异的野生型或其他序列。所述SP应当提供良好的敏感性和特异性。为了实现这一点，SP与具有核苷酸变异的核酸的结合和SP与野生型或不含核苷酸变异的其他序列的结合之间的熔解温度差异(“dTm”)应当被最大化。可以选择SPAT之内与核苷酸变异互补的碱基的位置以最大化dTm。这可以通过利用本领域已知的熔解温度计算算法来进行(参见，例如，SantaLucia,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:1460-1465(1998))。此外，已知人工修饰的碱基，例如锁核酸(LNA)或桥连核酸(BNA)以及天然发生的2'-O-甲基RNA增强互补的配对之间的结合强度(Petersen and Wengel,TrendsBiotechnol.21:74-81(2003)；Majlessi et al.,Nucl.Acids Res.26:2224-2229(1998))。这些修饰的碱基可以策略上导入SP的SPAT中，以进一步提高dTm，来增强SP的检测敏感性和特异性。
一种方法是使得SP的SPAT中的所有碱基都为修饰的核苷酸(LNA，BNA或2’-O-甲基RNA)。由于每个修饰的碱基都可以提高熔解温度，SPAT的长度可以充分地缩短，这使得SP对单碱基差异更为敏感。做为选择，仅有与目标核酸中的核苷酸变异互补的碱基被转换为修饰的核苷酸。由于修饰的碱基与它的互补物之间的结合强度更强，SP与目标核酸中核苷酸变异的结合和与野生型或不含核苷酸变异的序列的结合之间的熔解温度(dTm)的差异提高。又一个实施方式是在SPAT中围绕与目标核酸中的核苷酸变异互补的碱基使用三个修饰的碱基(例如，三个LNA、BNA或2'-O-甲基RNA碱基，或两种或三种不同的修饰碱基的组合)。
SP还包含前级放大子锚定片段(SPAP)。SPAP与SP前级放大子(SPM)的片段互补，提供了SPM对结合了目标核酸的SP的结合。SPAP具有一定长度，其提供了在所使用的分析条件下SP与SPM之间的稳定杂交。因而，SPAP一般比SPAT更长，例如，长度约14到28个核苷酸，但是取决于使用的分析条件可以稍微更短或更长，例如，长度约10到30个核苷酸。因而，一般地，SPAP的长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
SP任选地可以包括SPAT和SPAP之间的间隔区。因而，要理解的是，SP可以没有SPAT和SPAP之间的间隔区。然而，一般地，SP将具有SPAT和SPAP之间的间隔区。这样的结构允许目标核酸距离所形成的SGC有期望的空间隔离。SPAT与SPAP之间的间隔区长度一般是1到10个核苷酸，但要理解的是如果需要，间隔区可以更长。因而，SPAT与SPAP之间的任选的间隔区的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在特定的实施方式中，所述间隔区的长度是5个核苷酸。
在本发明的实施方式中，所述样品还与邻近探针(NP)接触。NP包含目标锚定片段(NPAT)，其可以与邻近SP的结合位点的目标核酸区域杂交。邻近SPAT结合位点的目标核酸区域可以是直接相邻的，也就是说，它可以在SPAT结合位点和NPAT结合位点之间没有缺口地结合。然而，一般地，在SPAT结合位点和NPAT结合位点之间有1到几个核苷酸的缺口，例如，1到50个核苷酸的缺口，这样的结合位点仍将被认为是与目标核酸结合SP和NP的邻近的结合位点。
选择NP以具有期望长度的NPAT，适合于在原位杂交分析所使用的温度和缓冲液下展现与邻近SPAT结合位点的目标核酸的特异性杂交。由于NP不必辩别单核苷酸变异，NPAT可以比SPAT相对更长以提供稳定性，例如，长度约16到30个核苷酸，但是取决于使用的分析条件可以稍微更短或更长，例如，长度约12到40个核苷酸。因而，一般地，NPAT的长度可以是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸。
NP还包含前级放大子锚定片段(NPAP)。NPAP与NP前级放大子(NPM)的片段互补，提供了NPM对结合了目标核酸的NP的结合。NPAP具有一定长度，其提供了在所使用的分析条件下NP与NPM之间的稳定杂交。因而，NPAP的长度一般是约14到28个核苷酸，但是取决于所使用的分析条件可以稍微更长或更短，例如，长度约10到30个核苷酸。因而，一般地，NPAP的长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
NP任选地可以包括NPAT和NPAP之间的间隔区。因而，要理解的是，NP可以没有NPAT和NPAP之间的间隔区。然而，一般地，NP将具有NPAT和NPAP之间的间隔区。这样的结构允许目标核酸距离所形成的SGC有期望的空间隔离。NPAT与NPAP之间的间隔区长度一般是1到10个核苷酸，但要理解的是如果需要，间隔区可以更长。因而，NPAT与NPAP之间的任选的间隔区的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在特定的实施方式中，所述间隔区的长度是5个核苷酸。
在本发明的方法的实施方式中，样品与SP前级放大子(SPM)和NP前级放大子(NPM)接触。SPM包含可以通过SPAP与SP结合的片段。因而，SPM的片段与SP的SPAP互补。如本文公开的，SPAP一般具有一定长度，其提供了在所使用的分析条件下SP与SPM之间的稳定杂交。因而，与SPAP互补的SPM的片段的长度一般是约14到28个核苷酸，但是取决于SPAP的长度和所使用的分析条件可以稍微更短或更长，例如，长度约10到30个核苷酸。因而，一般地，所述片段与SPAP互补，长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
SPM还包含两个或更多个SP协作锚(SPCA)。SPCA提供了协作放大子(COM)的结合位点。SPCA的长度一般被选择为足够短，使得它在没有COM与NPM的NPCA结合的情况下将不会保持与COM稳定结合(参见附图1)。一般地，SPCA的长度是相对短的，长度约10到20个核苷酸。因而，一般地，SPCA的长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在特定的实施方式中，SPCA的长度是14个核苷酸。
NPM包含可以通过NPAP与NP结合的片段。因而，NPM的片段与NP的NPAP互补。如本文公开的，NPAP一般具有一定长度，其提供了在所使用的分析条件下NP与NPM之间的稳定杂交。因而，与NPAP互补的NPM的片段的长度一般是约14到28个核苷酸，但是取决于NPAP的长度和所使用的分析条件可以稍微更短或更长，例如，长度约10到30个核苷酸。因而，一般地，所述片段与NPAP互补，长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
NPM还包含两个或更多个NP协作锚(NPCA)。NPCA提供了协作放大子(COM)的结合位点。NPCA的长度一般被选择为足够短，使得它在没有COM与SPM的SPCA结合的情况下将不会保持与COM稳定结合(参见附图1)。一般地，NPCA的长度是相对短的，长度约10到20个核苷酸。因而，一般地，NPCA的长度可以是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。在特定的实施方式中，NPCA的长度是14个核苷酸。
SPM或NPM可以任选地包括SPCA或NPCA之间的间隔区。因而，要理解的是，SPM可以没有SPCA之间的间隔区，NPM可以没有NPCA之间的间隔区。然而一般地，SPM和NPM将具有SPCA和NPCA之间的间隔区。SPCA与NPCA之间的任选地间隔区长度一般是1到10个核苷酸，但要理解的是如果需要，间隔区可以更长。因而，SPACs与NPCA之间的任选的间隔区的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在特定的实施方式中，所述间隔区的长度是5个核苷酸。要理解的是，任意SPM的SPCA与NPM的NPCA之间的间隔区的使用是独立的，SPCA和NPCA之间的间隔区的长度是独立的。例如，如果NPM含有4个NPCA，将有3个可选的间隔区，这些间隔区不必具有相互间相同的长度，也就是说，长度是独立的。
如本文描述的，分别地，SPM和NPM可以被设计以含有两个或更多个SPCA和NPCA。为了提高与SGC相关的信号，SPCA和NPCA的数量可以提高(参见附图1)。可以选择SPCA和NPCA以得到期望的信号强度或提高信噪比。如附图1所示，每个SPCA和NPCA可以结合COM，其随后结合标签探针系统(LPS)。分别提高SPM和NPM上SPCA和NPCA的数量，将引起与目标核酸结合的标签探针系统(LPS)数量的相应提高。在本发明的方法中通过协作杂交可以结合核酸目标的每个COM提高了超越相对于COM与细胞成分的非特异性结合的目标特异性信号(参见附图1)。SPM和NPM配对中SPCA和NPCA的数量一般在配对之间是相同的，一般具有配对之间的相同间隔，以及一般具有每个配对2到20个SPCA和NPCA，然而要理解的是如果需要可以使用更高的数量。因而，SPM和NPM一般将分别具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个SPCA和NPCA。
在本发明的方法的实施方式中，所述样品与协作放大子(COM)接触。所述COM包含与所述SPCA互补的第一片段、与所述NPCA互补的第二片段、以及包含多个标签放大子锚定片段的第三片段。如本文描述和在附图1中显示的，COM提供了SPM与NPM之间的协作杂交,SPM和NPM分别通过SP和NP结合目标核酸。COM的协作杂交结构提供了额外的特异性和更大的信噪比，因为标签探针系统(LPS)将不会结合目标核酸，除非COM与SPM和NPM都结合。如上文讨论的，通过分别提高SPM和NPM上的SPCA和NPCA的数量，提供了信号的进一步提高。通过进一步在复合物特异性结合目标核酸时使之发生多个协作杂交反应，增强了多个COM的协作杂交(参见附图1)。
COM还包含第三片段，其包含多个标签放大子锚定片段。所述标签放大子锚定片段与标签放大子(LM)的片段互补。COM与标签放大子(LM)的结合一般是稳定的杂交。因而，标签放大子锚定片段通常是一定长度，其提供了在所使用的分析条件下COM与LM之间的稳定杂交。标签放大子锚定片段的长度一般约20到28个核苷酸，但是取决于所使用的分析条件可以稍微更短或更长，例如长度约15到30个核苷酸。因而，一般地，标签放大子锚定片段的长度可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
根据分析的所需特征选择COM的长度。如上文所述，COM将含有与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，以及包含多个标签放大子锚定片段的第三片段。标签放大子锚定片段提供了标签放大子(LM)的结合位点。如附图4所示，COM可以任选地含有独立地位于所述第一、第二和/或第三片段之间的间隔区。间隔区的长度以及第二和第二片段沿着SPCA和NPCA的方向可以选择，以最大化协作杂交效果。分别如附图4A、4B和4C所示，COM的第一和第二片段可以按相同或不同方向与SPCA和NPCA杂交。间隔区的长度通常和独立地是1到10个核苷酸。因而，取决于SGC的结构，COM的第一、第二和/或第三片段之间的间隔区的长度一般可以独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
修饰的碱基例如LNA或BNA可以用于SPCA、NPCA或COM中它们的互补序列中，其提高碱基与它的互补碱基之间的结合强度，容许SPM与COM之间、或NPM与COM之间的杂交熔解温度的提高，或降低锚定片段的长度(参见，例如，Petersen and Wengel,Trends Biotechnol.21:74-81(2003)；美国专利No.7,399,845)。更重要的是，这种方法实质上提高了单独的SPM-COM或NPM-COM杂交与SPM-NPM-COM协作杂交的熔解温度之间的差异。这种差异对于增强本发明的分析中的信噪比是重要的，因为与COM和SPM/NPM配对的结合相比，COM与单独的SPM或NPM的结合显著更不稳定。这确保了SGC仅当存在目标的情况下特异性缔合时才可被组装。
类似地，COM的第三片段含有多个标签放大子锚定片段。所述标签放大子锚定片段还可以任选地和独立地具有它们之间的间隔区。因而，标签放大子锚定片段之间的间隔区的长度可以独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、8或10个核苷酸。因此，取决于第一、第二和第三片段的长度，COM的长度一般将是约60到900个核苷酸。
在本发明的方法的实施方式中，所述样品与标签探针系统(LPS)接触。LPS包含多个标签放大子(LM)。每个LM包含可以与COM的标签放大子锚定片段结合的片段。LM还包含多个标签探针锚定片段。LM与标签探针(LP)的结合一般是稳定的杂交。因而，标签探针锚定片段通常是一定长度，其提供了在所使用的分析条件下LM与LP之间的稳定杂交。标签探针锚定片段的长度一般约15到28个核苷酸，但是取决于所使用的分析条件可以稍微更短或更长，例如长度约12到30个核苷酸。因而，一般地，标签探针锚定片段的长度可以是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
如本文描述的，为了进一步提高与SGC相关的信号，可以提高与COM结合的LM的数量(参见附图1)。可以选择LM的数量以得到希望的信号强度或提高的信噪比。如附图1所示，多个LM可以通过标签放大子锚定片段与COM结合。提高COM上标签放大子锚定片段的数量将提高与COM结合的LM的数量。这随之将引起与目标核酸结合的标签探针的数量相应提高。与COM结合的LM的数量一般是2到20个，然而要理解的是如果需要，可以使用更高的数量。因而，COM一般将具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个标签放大子锚定片段，提供了每个COM上对2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个LM的结合。
LPS还包含多个标签探针(LP)。每个LP包含一个或更多个可检测标签和与LM的标签探针锚定片段杂交的片段。如本文使用的，“标签”是便于检测分子的部分。本发明的情境中通用的标签包括荧光的、发光的、散射光的、和/或比色的标签。适合的标签包括酶、和荧光的或生色的部分，以及放射性核素、底物、辅助因子、抑制剂、化学发光部分、磁颗粒、稀土金属，等。在本发明的特定实施方式中，所述标签是酶。示范性的酶标签包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等，以及各种蛋白酶。其他标签包括但不限于荧光团、二硝基苯酚(DNP)，等。标签是本领域技术人员公知的，例如，在Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996)和美国专利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中描述的。许多标签是商业上可获得的，可以用于本发明的方法和分析，包括可检测的酶/底物组合(Pierce,Rockford IL；Santa Cruz Biotechnology,Dallas TX；Invitrogen,Carlsbad CA)。在发明的特定实施方式中，酶可以利用生色的或荧光的底物来产生可检测信号，如本文描述的。本文描述了示范性的标签。
可以利用多种酶或非酶标签的任一种，只要酶活性或非酶标签可以分别被检测。由此酶产生可检测信号，其可以被利用来检测目标核酸。特别有用的可检测信号是生色的或荧光的信号。因而，用作标签的特别有用的酶包括生色底物或荧光底物有效的那些酶。这样的生色底物或酶底物可以通过酶促反应转化为可容易检测的生色产物或荧光产物，其可以使用显微术或光谱学容易地检测和/或定量。这样的酶是本领域技术人员公知的，包括但不限于辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶，等(参见Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996))。具有公知的生色底物或荧光底物的其他酶包括各种肽酶，其中可以利用生色的或荧光的肽底物来检测蛋白水解裂解反应。使用生色或荧光底物在细菌诊断中也是公知的，包括但不限于使用α-和β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、6-磷酸-β-D-半乳糖苷6-磷酸半乳糖水解酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、淀粉酶、神经氨酸酶、酯酶、脂肪酶，等(Manafi et al.,Microbiol.Rev.55:335-348(1991))，这类具有已知的生色或荧光底物的酶可以容易地适用于本发明的方法。
产生可检测信号的各种生色或荧光底物是本领域技术人员公知的和商业上可获得的。可用于产生可检测信号的示范性的底物包括但不限于用于辣根过氧化物酶的3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、氯萘酚(4-CN)(4-氯-1-萘酚)、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、o-苯二胺二盐酸盐(OPD)，和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)；用于碱性磷酸酶的5-溴-4-氯-3-吲哚-1-磷酸(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、Fast Red(Fast Red TR/AS-MX)和p-硝基苯基磷酸(PNPP)；用于β-半乳糖苷酶的1-甲基-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃半乳糖苷；用于β-葡糖苷酶的2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷；等等。示范性的荧光底物包括但不限于，用于碱性磷酸酶的4-(三氟甲基)伞形基磷酸；用于磷酸酶的4-甲基伞形酮基磷酸双(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、4-甲基伞形酮基磷酸双(环己基铵)和4-甲基伞形酮基磷酸酯；用于辣根过氧化酶的QuantaBluTM和QuantaRedTM；用于β-半乳糖苷酶的4-甲基伞形酮基β-D-吡喃半乳糖苷，Fluorescein di(β-D-吡喃半乳糖苷)和萘并荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)；用于β-葡糖苷酶的3-乙酰伞形基β-D-吡喃葡萄糖苷和4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃葡萄糖苷；和用于α-半乳糖苷酶的4-甲基伞形酮酰-α-D-吡喃半乳糖苷。例如，在美国公开2012/0100540中也描述了用于产生可检测信号的示范性的酶和底物。各种可检测酶底物，包括生色底物或荧光底物是公知的和商业上可获得的(Pierce,Rockford IL；Santa Cruz Biotechnology,Dallas TX；Invitrogen,Carlsbad CA；42Life Science；Biocare)。一般地，底物被转变为形成沉淀的产物，所述沉淀沉积在目标核酸的位置。其他示范性的底物包括但不限于HRP-Green(42Life Science)、Betazoid DAB、Cardassian DAB、Romulin AEC、Bajoran Purple、Vina Green、Deep Space BlackTM、Warp RedTM、Vulcan Fast Red和Ferangi Blue，来自Biocare(Concord CA；biocare.net/products/detection/chromogens)。
生物素-抗生物素蛋白(或生物素-链霉抗生物素蛋白)是公知的信号放大系统，基于的事实是两个分子相互间具有极高的亲和力，一个抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白分子可以结合四个生物素分子。抗体广泛用于免疫组织化学和ISH中的信号放大。酪胺信号放大(TSA)是基于过氧化物酶活性沉积大量的半抗原化酪胺分子。酪胺是一种酚类化合物。在存在少量过氧化氢的情况下，被固定的辣根过氧化物酶(HRP)将标记的底物转化成短寿命的、极度活跃的中间体。被活化的底物分子任何非常快地与过氧化物酶结合位点的位置上或附近的富含电子的蛋白质部分，例如酪氨酸反应并共价结合。这样，与酪胺轭合的大量额外的半抗原分子可以原位导入杂交位点。随后，沉积的酪胺-半抗原分子可以直接或间接地可视化。例如，在美国公开2012/0100540中更详细地描述了这样的检测系统。
本文描述的实施方式可以利用酶，使用适当的生色或荧光底物来产生可检测信号。要理解的是，作为选择，标签探针可以具有与标签探针的核酸部分直接偶联的可检测标签。示范性的可检测标签是本领域公知的，包括但不限于生色或荧光的标签(参见Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996))。作为标签有用的示范性的荧光团包括但不限于罗丹明衍生物，例如，四甲基罗丹明、罗丹明B、罗丹明6G、磺酰罗丹明B、德克萨斯红(磺酰罗丹明101)、罗丹明110、及其衍生物，例如四甲基罗丹明-5-(或6)、丽丝胺罗丹明B，等；7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)；荧光素及其衍生物；萘类，例如，丹酰基(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)；香豆素衍生物，例如，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、7-二乙氨基-3-[(4'-(碘乙酰基)氨基]苯基]-4-甲基香豆素(DCIA)、Alexa fluor染料(Molecular Probes)等；4，4-二氟-4-硼杂-3a，4α-二氮杂-s-引达省(BODIPYTM)及其衍生物(Molecular Probes；Eugene Oreg)；芘类和磺化的芘类，例如Cascade Blue及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸，等；吡啶基恶唑衍生物和dapoxyl衍生物(Molecular Probes)；Lucifer Yellow(3,6-二磺酸酯-4-氨基萘二甲酰亚胺)及其衍生物；CyDyeTM荧光染料(Amersham/GE Healthcare Life Sciences；Piscataway NJ)，等等。示范性的发色团包括但不限于，酚酞、孔雀绿、硝基芳香类，例如，硝基苯基、偶氮染料、dabsyl(4-二甲氨基偶氮苯-4'-磺酰基)，等等。
公知的方法，例如，显微术、血细胞计数(质量血细胞计数，CyTOF)或光谱学可以用于显现与各自的目标核酸缔合的生色的或荧光的可检测信号。一般地，如果在同一分析中使用不同的标签，生色底物或荧光底物，或者生色或荧光标签可以用于特定的分析，从而可以使用单一类型的工具用于同一样品中的目标核酸的检测。
如本文描述的，为了进一步提高与SGC相关的信号，可以提高与LM结合的LP的数量(参见附图1)。可以选择LP的数量以得到希望的信号强度或提高的信噪比。如附图1所示，多个LP可以通过标签探针锚定片段与LM结合。提高LM上标签探针锚定片段的数量将提高与LM结合的LP的数量。这引起与目标核酸结合的标签探针的数量的提高。与LM结合的LP的数量一般是2到20个，然而要理解的是如果需要，可以使用更高的数量。因而，LM一般将具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个标签探针锚定片段，提供了每个LM上对2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个LP的结合。
当上文描述的组分杂交时，形成信号发生复合物(SGC)。SGC包含具有所述核苷酸变异的目标核酸，例如，单核苷酸变异、多核苷酸变异、剪接位点、插入/删除、重排，等，SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM以及多个LP。一旦形成SGC，可以从样品上的SGC检测出原位信号。在组装各个组分之后，在向样品添加下一层组分之前可以任选地洗涤样品来除去未结合的组分。
修饰的碱基，例如LNA或BNA，可以用于SGC的选定组分的锚定片段中，其提高了碱基与它的互补碱基的结合强度，容许降低锚定片段的长度(参见，例如Petersen and Wengel,Trends Biotechnol.21:74-81(2003)；美国专利No.7,399,845)。扩展了天然的4字母表的人工碱基，例如，Artificially Expanded Genetic Information System(AEGIS；Yang et al.,Nucl.Acids Res.34(21):6095-6101(2006))可以掺入SGC的相互作用的组分中的结合位点(例如，SPAP-SPM、NPAP-NPM、SPCA-COM、NPCA-COM以及LP-LM杂交位点)。这些人工碱基可以提高相互作用的组分的特异性，这随后可以容许更低严格度的杂交反应以产生更高的信号。
有用的是使用在SP的每一侧有NP的结构，如附图5所示。这样的结构提供了将两个SGCs俘获到目标核酸，所述目标核酸含有核苷酸变体，例如SNV、多核苷酸变体、剪接位点、插入/删除、重排，等。这样的结构另外可以用于加倍信号。作为选择，它还可以用于增强分析的健壮性。例如，如附图5B所示，如果由于不充分的透性化，一个NP的接近被阻挡，或如果对目标核酸的结合位点由于RNA降解而损失，仍然可以通过与另一个NP结合的SGC来产生可检测信号。
在本发明的实施方式中，本发明的方法检测的核酸可以是细胞样品中存在的任何核酸，包括但不限于，RNA，包括信使RNA(mRNA)、micro RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA等，或DNA，等。在特定的实施方式中，所述核酸是RNA。
在本发明的进一步的实施方式中，固定的和透性化的细胞被固定在组织玻片上。用于固定在组织玻片上的固定和透性化细胞的方法是本领域公知的，如本文所公开的。
如本文公开的，本发明基于构建与目标核酸结合的信号发生复合物(SGC)以检测细胞中目标核酸的存在。用于构建SGC的元件通常包含核酸，从而利用核酸杂交反应来将SGC的组分结合到目标核酸上。选择合适的区域、设计与目标核酸结合的特异性和选择性试剂，特别是特异性和选择性结合目标核酸的寡核苷酸或探针，或SGC的其他组分的方法是本领域技术人员公知的(参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999))。利用目标核酸区域的适当选择、以及合适长度的结合试剂，如寡核苷酸或探针，可以实现需要的特异性，这样的选择方法是本领域技术人员公知的。因而，本领域的技术人员将容易理解，并可以容易地确定适当的试剂，例如寡核苷酸或探针，其可以用于相对于其他目标核酸靶向一个特定的目标核酸，或提供对SGC的组分如SP、NP、SPM、NPM、COM、LM和LP的结合。
如本文公开的，本发明的方法的步骤，通过所述步骤组分组装成与目标核酸结合的SGC，可以以任何顺序同时地或次序地进行，只要可以检测目标核酸。在某些情况下，可能希望的是减少分析步骤的数量，例如，减少杂交和洗涤步骤的数量。减少分析步骤的数量的一种方式是在与细胞接触之前预先组装SGC的某些或全部组分。这种预先组装可以通过在接触目标核酸之前使SGC的某些或所有组分杂交来进行。还可能的是通过化学合成预先制造SGC的某些部分来整合SGC的多个组分来减少分析步骤。一个示范性的实施方式在附图6A中描绘。附图6A显示了利用预先制造的具有“分枝”结构的放大子分子整合SPM与COM以及NPM与COM。在这个描绘的实施方式中，SPM和NPM使用核酸“分枝”来连接COM，而不同于附图6A中描绘的SPCA或NPCA。在这种情况下，在LM与SPM-COM分枝分子的COM结合时发生协作杂交。
附图6B中描绘了另一个实施方式。附图6B显示了SP和NP与SMP和NPM的分别整合，通过将SP和NP延伸到包括SPCA和NPCA的更长序列。SGC然后可以与COM、LM和LP组装，如附图1中描绘的，COM结合到延伸的SP和NP的SPCA和NPCA，如附图6B描绘的。做为选择，SGC可以按附图6B中描绘的结构组装，其中COM和LM通过使用如上文描述的“分枝”结构整合。LM作为分枝的核酸与COM连接，而不是如附图1中描绘的通过标签放大子锚定片段的方式来结合。在这个描绘的实施方式中，协作杂交在COM-LM分枝分子的COM与延伸的SP和NP之间发生，延伸的SP和NP分别含有SPCA和NPCA。
在原位分析期间大的分子更加倾向于非特异性地结合或陷入细胞基质。这是使用“分枝”分子的潜在缺点，“分枝”分子为原位检测提供了大的分子。然而，本文公开的本发明的方法克服了这一问题，因为单个的大的放大分子不能单独形成SGC。例如，在附图6A显示的实施方式中，在不存在它的配对(与目标核酸结合的SP和NP)的情况下不能形成SGC，因此不会产生噪音或假阳性信号。在附图6B中，虽然如果非特异性地结合，单个“分枝”大分子可以产生背景噪声，可以调节真信号的强度水平，使得与目标核酸结合的标签的数量大于带有结合的标签探针的COM-LM分枝分子的数量，如本文描述的(例如，提高延伸的SP和TP上的SPCA和NPCA的数量)。
因而，要理解的是，如果需要，可以包括中间组分，从而一个组分与另一个的结合通过化学连接来预先组装。例如，在另一个实施方式中，LM可以是包含许多标签的大的预先制造的分子。在又另一个实施方式中，COM+LPS(COM/LM/LP)可以作为单个大分子化学合成。使用这样的预先制造的大分子可以有效地减少分析步骤的数量。制造这样的核酸结构，包括上文讨论的和附图6A和6B中显示分枝核酸结构的方法是本领域公知的(参见，例如，美国专利No.5,635,352和5,681,697，通过引用合并在本文中)。
如本文公开的，各组分通常相互间直接结合。对于含有组分的核酸来说，结合反应通常是通过杂交。对于杂交反应来说，组分之间的结合是直接的。如果需要，可以包括中间组分，从而一个组分与另一个的结合是间接的，例如，中间组分含有桥接两个其他组分的互补的结合位点。
要理解的是，本发明可以按任何希望的顺序进行，只要变体目标核酸被检测出。因而，在本发明的方法中，用SP、NP、SPM、NPM、COM和/或LPS接触细胞的步骤可以按任何希望的顺序进行，可以顺序地进行，或可以同时进行，或某些步骤可以顺序进行而其他步骤同时进行，如所需要的，只要目标核酸被检测出。进一步理解的是，本文公开的实施方式可以与本文公开的其他实施方式独立地组合，如所需要的，以利用各种结构、组分大小、分析条件、分析敏感性，等。
本发明的方法和相关的组合物利用了协作杂交来在核酸目标的原位检测中提高特异性和降低背景，在其中复杂的物理化学环境和存在压倒性数量的非目标分子产生了高噪声。附图1说明了示范性的实施方式，其中通过COM与SPM和NPM的结合提供了协作杂交。使用这样的协作杂交方法，两个或更多COM的结合仅在复合物与目标核酸结合时发生。如附图1所示，这容许该方法通过提高可以与目标核酸结合的COM的数量被容易地修改以提供期望的信噪比(也就是说，通过提高分别在SPM和NPM上的SPCA和NPCA的数量)。
在另一个实施方式中，协作杂交也可以应用于SGC的其他组分。例如，LM与COM的结合可以是稳定的反应，如本文描述的，或者该结合可以被配置以需要协作杂交。在这种情况下，设计LM，使得LM含有与分离的COM结合的两个片段。这种结构将类似于COM与SPM和NPM的关系，但是作为替代LM将结合COM-1和COM-2。LM和COM被设计以具有适当的互补片段，如同附图7A中描绘的COM、SPM和NPM一样，以提供协作杂交。
类似地，对于LP与LM的结合，可以利用另一层协作杂交。在这种情况下，设计LP，使得LP含有与分离的LM结合的两个片段。这种结构将类似于COM与SPM和NPM的关系，但是作为替代LP将结合LM-1和LM-2。LP和LM被设计以具有合适的互补片段，如同附图7B中描绘的COM、SPM和NPM一样，以提供协作杂交。
因而，检测目标核酸变异的方法可以利用协作杂交，用于提供了与目标核酸特异性结合的SGC的检测系统中任何一个或所有组分之间的结合反应。组分的数量以及哪些组分应用协作杂交可以根据期望的分析条件、要分析的样品类型、期望的分析敏感性等来选择。协作杂交结合反应的任何一个或组合可以用于提高分析的敏感性和特异性。
附图8描绘了SGC结构的两个实例，其在复合物的超过两种组分之间使用协作杂交。在附图8A描绘的结构中，必须发生两个协作杂交步骤以构建稳定SGC支架。在描绘的结构中，SP的侧翼是两个NPs。第一协作杂交在SPM/NPM和SP和与目标核酸结合的两个NPs之间发生。第二协作杂交在COM和SPM/NPM之间发生。由于协作杂交增强了特异性和信噪比，如本文描述的，两个协作杂交步骤可以进一步提高高噪声环境下的分析健壮性。附图8B显示了使用两个协作杂交步骤来改善特异性的不同方法。在这个实施方式中，第一协作杂交在SP和NP之间发生，其中SP和NP被设计以具有互补的节段。在这种结构下，SP和NP具有三个片段，第一片段含有SPAT或NPAT，其结合目标核酸(附图8B中标为“T”)，第二片段含有各自的NP或SP的互补序列(附图8B中标为“P”)，第三片段含有SPAP或NPAP，其可以结合COM(附图8B中标为“L”)。SP和NP与目标核酸并且彼此协作地杂交，以使目标探针集(SP和NP)和目标核酸形成稳定的支架。然后SPM和NPM分别单独地杂交在SP和NP上，COM与SP和NP协作地杂交。
如本文描述的，可以选择各个组分的结构来提供期望的稳定结合反应或协作杂交结合反应。为了理解这一点，即使本文将结合反应举例为稳定的或不稳定反应，任何这些结合反应可以被修改，按照期望的，只要检测出目标核酸。进一步理解的是，所述结构可以取决于要使用的分析和杂交条件被改变和选择。一般地，如果希望结合反应是稳定的，组分之间的互补核酸序列的片段通常在16到30个核苷酸的范围内，或更大。如果希望结合反应是相对不稳定的，例如当采用协作杂交结合反应时，组分之间的互补核酸序列的片段通常在10到18个核苷酸的范围内。要理解的是，取决于分析中采用的条件，对于稳定杂交或不稳定杂交，核苷酸长度可以稍微更短或更长。进一步要理解的是，如本文公开的，修饰的核苷酸例如LNA或BNA可以用于提高修饰碱基处的结合强度，从而容许降低结合片段的长度。因而要理解的是，对于与其他核酸片段互补的核酸片段的长度，如果需要，本文描述的长度可以进一步降低。例如，已知microRNA具有约22nt的短序列。为了使用SP-NP配对，一定数量的修饰的核苷酸，例如LNA或BNA可以掺入SPAT和/或NPAT中以降低它们的长度，从而一个或更多个SGCs可以在目标microRNA上组装。
通过选择分析中采用的组分和结合反应的数量，可以进一步提高分析敏感性。如本文描述的，除了提供一个或更多个协作杂交结合反应之外，可以通过增加分别在SPM和NPM上的SPCA和NPCA的数量来增加信号。SPCA和NPCA的提高的数量提供了与目标核酸结合的提高数量的COM。类似地，信号还可以通过提高COM上标签放大子锚定片段的数量来提高。标签放大子锚定片段的数量提高提供了与COM结合的LM的数量提高。进一步的，可以通过提高LM上标签探针锚定片段的数量来提高信号。标签探针锚定片段的数量提高提供了与LM结合的LP的数量提高。要理解的是，任何这些提高信号的选择可以按期望的应用。类似地和取决于应用，通过适当地降低如上所述的锚定片段的数量，可以降低信号。因而，本发明提供了修改分析的组分结构的很大灵活度，以提供对目标核酸的非常敏感的检测。做为选择，还可以通过消除一层这类中间放大分子来降低信号水平。例如，多个LP可以直接结合COM，消除LM。另一方面，还可以通过增加一层或多层这样的中间放大分子来提高信号水平。
如本文描述的，本发明涉及构建围绕目标核酸的SGC，所述目标核酸含有核苷酸变体，例如，SNV、多核苷酸变体、剪接位点或其他核酸变异。SGC至少包含SP，其可以特异性和敏感性地结合目标核酸的核苷酸变体，例如SNV、多核苷酸变体、剪接位点、或其他核酸变异，并且具有足够的辨别力，从而所述SP不结合非目标核酸，例如，非SNV序列、非多核苷酸变体序列、非剪接序列，等。一旦SP伴随着NP与目标核酸的SNV结合，大的SGC被组装，具有多层放大组分，例如SPM/NPM、COM和它们顶部的LM，提供了大量的LP构建在SGC中产生足够的信号供检测。这样的信号可以在成像系统中呈现为清楚的“点”。例如，如果每个SPM/NPM配对可以带有A1数量的COM分子，每个COM可以结合A2数量的LM分子，每个LM可以结合A3数量的LP分子，SGC中LP的总数是A1×A2×A3。考虑到A1、A2和A3可能各自高达20或以上，SGC中LP的总数可以达到8,000和更高。对于本发明，染色图像中的“点”区分性地呈现了细胞中的目标核酸，所述目标核酸含有核苷酸变体例如SNV、多核苷酸变体、剪接位点、或其他核苷酸变异。SGC中需要的最少数量的LPS由检测仪器的敏感性以及每个LP可以产生的信号数量来决定。在LP包含荧光染料的一个实施方式中，SGC中的LP的最少数量是至少800个、至少1200个、至少1500个、至少2000个、至少2500个或至少3000个，以产生足够的信号以被仪器检测。在另一个实施方式中，LP包括另外的信号放大，如本文描述的。SGC中所需的LP的最小数量可以降低到至少300个、至少600个、至少1000个或至少1500个。SGC支架的某些组分可能非特异性结合或陷入细胞中，这可能“集中”一定数量的LP并产生假阳性信号。本发明的一个重要方面是SGC结构中构建的协作杂交机制，从而SGC支架内非特异性结合的或陷入细胞中的任何一个组分不能产生可检测信号，或至少仅有可被系统区分为背景噪声的弱信号。例如，如果协作杂交在COM和SPM+NPM之间建立，当COM分子非特异性结合或陷入时产生最大水平的噪声，假信号水平是A2×A3个LP。该分析的理论信噪比是A1(＝A1×A2×A3/A2×A3)。如果协作杂交在LM和COM之间建立，如附图6A和7A所示，当LM陷入时产生最大假信号水平，为A3数量的LP。该分析的理论信噪比变为A1×A2。类似地，附图7B中显示的结构的分析信噪比是A1×A2×A3。在特定的实施方式中，这种理论信噪比是至少2、4、7、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200。
如早先描述的，需要具有更多重复的更长的分子，来提高SGC产生的信号。然而，更大的分子可能更难以透入细胞基质到达它的杂交位点，当它们非特异性地陷入细胞结构时更难被洗出，从而产生背景噪声。另外，更大的分子的生产也是更贵的。因而重要的是找到每一层放大之内的最佳大小。在一个实施方式中，A1是相对大的，因为如上所述，SPM或NPM的单独非特异性结合将不会产生假信号，更大的A1产生更高的信噪比。在该发明的一个实施方式中，A1在4到20的范围内。在另一个实施方式中，A1优选地在6到16的范围内。任选地，A2相对更小，因为单个COM的非特异性结合或陷入可能导致A2×A3个LP的装配，产生相同水平的背景噪声。在一个实施方式中，A2在3到15的范围内。在另一个实施方式中，A2优选地在5到12的范围内。任选地，相比A2，A3可以是相对大的，因为LM分子的非特异性结合或陷入将产生与A3成比例的相对低水平的噪声。另一种方法是在SGC中增加一个或更多个额外的放大层，以降低单个层中分子的长度。
在另一个实施方式中，本发明提供了固定和透性化的细胞的样品，包含(A)至少一个固定和透性化的细胞，其含有具有单核苷酸变异的目标核酸；(B)包含目标锚定片段(SPAT)的单核苷酸变异探针(SP)，所述目标锚定片段与包含单核苷酸变异的目标核酸区域杂交，和包含目标锚定片段(NPAT)的邻近探针(NP)，所述目标锚定片段与邻近SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(C)与SP杂交的SP前级放大子(SPM)，其中所述SPM包含多个SP协作锚(SPCA)，以及与NP杂交的NP前级放大子(NPM)，其中所述NPM包含多个NP协作锚(NPCA)；(D)多个协作放大子(COM)，其每一个与SPM和NPM杂交，其中每个COM包含与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(E)多个标签放大子(LM)，每一个与COM的标签放大子锚定片段杂交，其中LM包含多个标签探针锚定片段；和(F)多个标签探针(LP)，每一个与LM的标签探针锚定片段杂交，其中所述LP包含可检测标签；其中上述杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有单核苷酸变异的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP，以及其中所述SGC提供可检测的和可与背景噪声区分的信号。
在另一个实施方式中，本发明提供了组织玻片，包含(A)具有固定于其上的多个固定和透性化细胞的玻片，包含至少一个固定和透性化的细胞，所述细胞含有具有单核苷酸变异的目标核酸；(B)包含目标锚定片段(SPAT)的单核苷酸变异探针(SP)，所述目标锚定片段与包含单核苷酸变异的目标核酸区域杂交，和包含目标锚定片段(NPAT)的邻近探针(NP)，所述目标锚定片段与邻近SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(C)与SP杂交的SP前级放大子(SPM)，其中所述SPM包含多个SP协作锚(SPCA)，以及与NP杂交的NP前级放大子(NPM)，其中所述NPM包含多个NP协作锚(NPCA)；(D)多个协作放大子(COM)，其每一个与SPM和NPM杂交，其中每个COM包含与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(E)多个标签放大子(LM)，每一个与COM的标签放大子锚定片段杂交，其中LM包含多个标签探针锚定片段；和(F)多个标签探针(LP)，每一个与LM的标签探针锚定片段杂交，其中所述LP包含可检测标签；其中上述杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有单核苷酸变异的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP，以及其中所述SGC提供可检测的和可与背景噪声区分的信号。
在又一个实施方式中，本发明提供了试剂盒，用于原位检测固定和透性化细胞的样品中目标核酸的单核苷酸变异，包含(A)用于透性化细胞的至少一种试剂；(B)一组包含单核苷酸变异探针(SP)的目标杂交探针，所述单核苷酸变异探针包含目标锚定片段(SPAT)，所述目标锚定片段能够与包含单核苷酸变异的目标核酸区域杂交，和，包含目标锚定片段(NPAT)的邻近探针(NP)，所述目标锚定片段能够与邻近SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(C)一组包含SP前级放大子(SPM)的前级放大子，所述SP前级放大子包含能够与所述SP杂交的片段，其中所述SPM包含多个SP协作锚(SPCA)，以及，包含能够与所述NP杂交的片段的NP前级放大子(NPM)，其中所述NPM包含多个NP协作锚(NPCA)；(D)多个协作放大子(COM)，其能够与SPM和NPM杂交，其中所述COM包含与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(E)标签放大子(LM)，其能够与所述COM的标签放大子锚定片段杂交，其中所述LM包含多个标签探针锚定片段；和(F)标签探针(LP)，其能够与所述LM的标签探针锚定片段杂交，其中所述LP包含可检测标签；其中，在与包含细胞的固定和透性化细胞的样品接触时，所述细胞含有具有单核苷酸变异的目标核酸，其中上述(B)-(F)的组分形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有单核苷酸变异的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP，以及其中所述SGC提供可检测的和可与背景噪声区分的信号。所述试剂盒的组分任选地可以位于容器中，任选地可以提供使用所述试剂盒的说明。
如本文公开的，本发明提供了检测核酸变异例如单核苷酸变异(SNVs)的方法。由于所述SP具有敏感性和特异性来检测目标序列中的单核苷酸变异，要理解的是，类似的原理可以应用于检测目标核酸或短序列中涉及超过一个核苷酸的其他变异，例如，RNA剪接变体、插入、删除、基因重排和microRNAs。因而，虽然例举的是检测作为单核苷酸变异的SNV，要理解的是，所述方法可以应用于其他类型的核酸变异。例如，可以采用本发明来检测独特的接点J，其由剪接在一起的核酸序列的两个片段形成。如附图9中描绘的，SP-NP探针组可以被设计具有跨越接点(附图9A)、或定位NPAT和SPAT之间的接点(附图9B)的SPAT。附图9C描绘了与附图8B类似的另一个设计，其中SPAT被缩短，NP和SP都具有彼此互补的片段。这样，SP仅当NP存在于相邻位置时与目标稳定杂交。做为选择，NPAT或者NPAT和SPAT两者可以在这种设计中被缩短以实现相同的效果。在附图9描绘的所有三种设计中，当且仅当目标中的两个片段在接点处剪接在一起时，SP仅可以紧邻NP稳定杂交形成SGC并产生可检测信号。
检测两个核酸片段的剪接的能力有许多应用。在转录或RNA剪接的情况下，基因被转录成RNA，其通过RNA剪接被加工，除去内含子，并产生具有连续的外显子提供编码序列的mRNA。某些基因经历选择性剪接，其可能天然发生或在疾病状态下发生。对于选择性剪接的基因来说，不同的外显子被剪接在一起，产生不同的序列。与检测SNV一样，本发明的方法可以容易地应用于检测选择性剪接的mRNA。如本文描述的，所述方法基于使用特异于目标核酸的探针，所述探针检测核酸变异。对于SNV来说，所述变异是单核苷酸的，而对于选择性剪接的基因来说，序列变异可以包括许多不同的核苷酸，也就是不同的序列，作为两个外显子之间不同的结合的结果。在这种情况下，SP探针可以被设计以跨越变体阶段序列，优选地将接点置于靠近SPAT的中心。做为选择，变体接点可以置于NPAT和SPAT之间。
除了检测剪接变体之外，本发明的方法可以用于检测基因重排。公知的是许多癌症的特征在于基因重排，其中致癌基因被活化，或生长阻抑物被钝化。类似于转录/RNA剪接，基因重排引起与非重排基因的序列偏差。当被转录时，mRNA也含有作为融合转录产物的序列变异。与检测RNA剪接一样，本发明的方法可以容易地应用于检测基因重排或融合转录产物。例如，SP探针可以被设计以跨越重排的DNA或融合转录产物中的变体接点序列，优选地将接点置于靠近SPAT的中心。做为选择，变体接点可以置于NPAT和SPAT之间。可以采用类似的策略来检测插入和删除。例如，插入或删除的点可以置于SPAT之内，优选的靠近SPAT的中心。做为选择，插入或删除的点可以置于NPAT和SPAT之间。
按照与检测剪接变体和基因重排的类似方式，本发明的方法可以用于特异性检测RNA而不检测同一细胞中的相应DNA。附图10A显示了不同的方法，其中SP上的SPAT桥跨两个邻近外显子的接点。由于mRNA中彼此邻近的外显子，SP可以紧邻NP结合目标核酸，提供目标核酸上SGC的装配。由于DNA中广泛分隔开的外显子，SP不能结合目标核酸，因而不能形成SGC，导致缺乏信号。
另一个实施方式在附图10B中示出。在这个实施方式中，SP和NP互相间有协作杂交，如附图8所示，SP和NP仅当它们与目标核酸和彼此同时杂交时可以稳定结合到目标核酸。SP和NP不能结合DNA，因为SP和NP结合位点不像mRNA中是邻近的。如附图10B中所示，SP和NP被设计以在外显子接合的位置结合分离的外显子。SP和NP仅能与mRNA目标稳定结合，因为SP和NP结合的外显子仅在mRNA中是邻近的。因而，在mRNA上可以形成稳定的SGC，产生可检测信号。在DNA的情况下，SP和NP不能稳定结合目标核酸，因为各自的SP和NP结合位点在DNA中不是邻近的。在这种情况下，不能形成SGC(参见附图10B)。另一种实施方式在附图10C中示出，其中外显子的剪接接点置于SP和NP之间。如附图10A、10B和10C所示，外显子在DNA中是分离的，但在mRNA中被剪接在一起，形成mRNA中独特的接点，这可以使用附图9中描绘的方法容易地检测。由于外显子在DNA中是分离的，稳定的SP-NP组不能彼此邻近地杂交；不能形成SGC，不产生可检测的信号，如附图10C所示。
在又一个实施方式中，本发明提供了一种原位检测固定和透性化细胞的样品中剪接的目标核酸的方法，包括(A)使所述样品与剪接位点探针(SP)和邻近探针(NP)接触，其中所述SP包含可以与包含所述剪接位点的目标核酸区域特异性杂交的目标锚定片段(SPAT)和前级放大子锚定片段(SPAP)，以及其中所述NP包含可以与邻近所述SP的结合位点的目标核酸区域杂交的目标锚定片段(NPAT)和前级放大子锚定片段(NPAP)；(B)使所述样品与SP前级放大子(SPM)和NP前级放大子(NPM)接触，其中所述SPM包含可以结合所述SP的片段并包含两个或更多个SP协作锚(SPCA)，和其中所述NPM包含可以结合所述NP的片段并包含两个或更多NP协作锚(NPCA)；(C)使所述样品与协作放大子(COM)接触，其中所述COM包含与所述SPCA互补的第一片段、与所述NPCA互补的第二片段、和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(D)使所述样品与标签探针系统(LPS)接触，其中所述LPS包含多个标签放大子(LM)和多个标签探针(LP)，其中每个LM包含可以结合所述COM的标签放大子锚定片段的片段以及多个标签探针锚定片段，其中每个LP包含可检测标签和与LM的所述标签探针锚定片段杂交的片段，其中上述杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有所述剪接位点的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP；以及(E)原位检测所述样品上来自所述SGC的信号。在一个实施方式中，所述SPAT可以与两个剪接的核酸片段之一特异性杂交。在另一个实施方式中，所述SPAT可以与两个剪接的核酸片段两者特异性杂交。
在另一个实施方式中，本发明提供了固定和透性化细胞的样品，包含(A)含有剪接的目标核酸的至少一个固定和透性化的细胞；(B)包含目标锚定片段(SPAT)的剪接位点探针(SP)，所述目标锚定片段与包含所述剪接位点的目标核酸区域杂交，和包含目标锚定片段(NPAT)的邻近探针(NP)，所述目标锚定片段与邻近SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(C)与SP杂交的SP前级放大子(SPM)，其中所述SPM包含多个SP协作锚(SPCA)，以及与NP杂交的NP前级放大子(NPM)，其中所述NPM包含多个NP协作锚(NPCA)；(D)多个协作放大子(COM)，其每一个与SPM和NPM杂交，其中每个COM包含与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(E)多个标签放大子(LM)，每一个与所述COM的标签放大子锚定片段杂交，其中所述LM包含多个标签探针锚定片段；和(F)多个标签探针(LP)，每一个与所述LM的标签探针锚定片段杂交，其中所述LP包含可检测标签；其中上述杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有剪接位点的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP，以及其中所述SGC提供可检测的和可与背景噪声区分的信号。
在另一个实施方式中，本发明提供了组织玻片，包含(A)具有固定于其上的多个固定和透性化细胞的玻片，包含至少一个固定和透性化的细胞，所述细胞含有剪接的目标核酸；(B)包含目标锚定片段(SPAT)的剪接位点探针(SP)，所述目标锚定片段与包含所述剪接位点的目标核酸区域杂交，和包含目标锚定片段(NPAT)的邻近探针(NP)，所述目标锚定片段与邻近SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(C)与SP杂交的SP前级放大子(SPM)，其中所述SPM包含多个SP协作锚(SPCA)，以及与NP杂交的NP前级放大子(NPM)，其中所述NPM包含多个NP协作锚(NPCA)；(D)多个协作放大子(COM)，其每一个与所述SPM和所述NPM杂交，其中每个COM包含与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(E)多个标签放大子(LM)，每一个与所述COM的标签放大子锚定片段杂交，其中所述LM包含多个标签探针锚定片段；和(F)多个标签探针(LP)，每一个与所述LM的标签探针锚定片段杂交，其中所述LP包含可检测标签；其中上述杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有剪接位点的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP，以及其中所述SGC提供可检测的和可与背景噪声区分的信号。
在又一个实施方式中，本发明提供了一种用于原位检测固定和透性化细胞的样品中剪接的目标核酸的试剂盒，包括(A)用于透性化细胞的至少一种试剂；(B)一组目标杂交探针，其包含包含目标锚定片段(SPAT)的剪接位点探针(SP)，所述目标锚定片段能够与包含所述剪接位点的目标核酸区域杂交，和包含目标锚定片段(NPAT)的邻近探针(NP)，所述目标锚定片段能够与邻近SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(C)一组包含SP前级放大子(SPM)的前级放大子，所述SP前级放大子包含能够与SP杂交的片段，其中所述SPM包含多个SP协作锚(SPCA)，以及，包含与NP杂交的片段的NP前级放大子(NPM)，其中所述NPM包含多个NP协作锚(NPCA)；(D)多个协作放大子(COM)，其能够与所述SPM和所述NPM杂交，其中所述COM包含与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(E)标签放大子(LM)，其能够与所述COM的标签放大子锚定片段杂交，其中所述LM包含多个标签探针锚定片段；和(F)标签探针(LP)，其能够与所述LM的标签探针锚定片段杂交，其中所述LP包含可检测标签；其中，在与包含细胞的固定和透性化细胞的样品接触时，所述细胞含有具有剪接位点的目标核酸，其中上述(B)-(F)的组分形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有剪接位点的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP，以及其中所述SGC提供可检测的和可与背景噪声区分的信号。
先前描述的原位核酸检测方法难以检测短于300到150个碱基的核酸序列。在本发明中，由于检测信号可以用单个SGC产生，SPAT和NPAT的组合长度可以短至20个碱基，本发明的方法可以容易地适用于检测短的或实质上破裂的核酸序列，例如microRNA、微插入或微删除。对于检测短的或实质上破裂的核酸序列，类似于本文描述的SP-NP的目标探针(TP)集被设计以与目标核酸上的邻近的非重叠区域杂交，类似于含有SP和NP的目标探针基的功能，如本文描述的。一般地，与目标核酸结合的目标探针的片段TPAT，类似于SPAT和NPAT，具有相同或相似的长度。如果目标序列更长，可以与多个SGC一起使用多个TP集，如附图11中所示。这种情况下使用多个SGCs以提高检测敏感性、或提高检测健壮性，因为在目标上成功形成的多个SGCs的任一个可以产生可检测信号。这样的结构在检测长的、但是高度降解的核酸目标方面是有用的。TP的许多集可以被设计以互补于目标核酸的非重叠区域。由于目标核酸处于高度降解状态，仅有有限数量的短片段是可接近的。只要一个TP配对可以与目标序列成功地杂交，就可以产生可检测信号。附图11描绘了三种示范性的结构。在附图11A中，SGC中有一个TP配对。可以容纳的SGCs的最大数量必需是至少多倍长度的SPAT+NPAT。在附图11B中，一个SGC的至少一个TP含有结合目标核酸的非重叠区域的两个TPAT片段，类似于SP和NP在单个探针中的整合。在附图11B中描绘的结构中，相比附图11A显示的结构，同样长度的目标序列内SGCs的最大数量可以提高，改善了检测的敏感性和/或健壮性。附图1到8中显示的所有的单个SGC结构和组分方向选择可以类似地扩展到多SGC场景以检测更长的目标序列。例如，附图11C描绘了与附图8A所示的类似结构的多SGCs，此时考虑了核酸分子的空间灵活性。
在许多应用中，非常希望的是在同一分析中检测多个目标。本发明提供了两种不同的方法来满足这一要求。第一种方法是集中化(pooling)，其中，如附图12A所示，为每一个目标组装SGC，其中对每个目标提供独特的NPAT和SPAT，在针对每个目标的不同NP和SP集之间NPAP和SPAP是相同的。这容许SGC的所有其他组分，也就是NPM、SPM、COM和LPS是所有SGCs相同的。当多个目标的任何一个存在于样品中时，所述集中化提供了一个可检测信号，当一组目标提供相同或相似的生物学或临床功用时是非常有用的。第二种方法是多路化(multiplexing)，其中，如附图12B所示，为每个目标组装SGC，每个SGC的组分对于该SGC是唯一的，这些组分的序列被设计以确保不同的SGCs之间没有交叉杂交。由于每个SGC中的标签探针(LP)具有独特的、可区分的标签，对于每个目标的存在可以检测出不同的、独特可区分的信号。多路化方法在不同的目标提供不同的生物学或临床功用的应用中是有用的。要理解的是，集中化和多路化方法可以组合使用来检测多组目标。
在另一个实施方式中，本发明提供了原位检测固定和透性化细胞的样品中的目标核酸的方法，其中所述目标核酸的长度是300个或更少的碱基。这样的方法可以包括步骤(A)使所述样品与一组目标探针(TP)接触，其中所述组包含至少两个目标探针，其中每个TP包含可以与目标核酸区域特异性杂交的目标锚定片段(TPAT)以及前级放大子锚定片段(TPAP)，其中所述组包含可以结合所述目标核酸的邻近的非重叠区域的TP的配对；(B)使所述样品与一组TP前级放大子(TPM)接触，其中所述组包含至少一对TPM，其中每个TPM包含可以结合TP的配对的一个成员的片段，所述TP的配对结合所述目标核酸的相邻区域，以及其中每个TPM包含两个或更多个TP协作锚(TPCAs)；(C)使所述样品与协作放大子(COM)接触，其中所述COM包含与TPM配对的一个成员的TPCA互补的第一片段，与TPM配对的第二成员的TPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(D)使所述样品与标签探针系统(LPS)接触，其中所述LPS包含多个标签放大子(LM)和多个标签探针(LP)，其中每个LM包含可以结合所述COM的标签放大子锚定片段的片段以及多个标签探针锚定片段，其中每个LP包含可检测标签和与LM的所述标签探针锚定片段杂交的片段，其中上述杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含所述目标核酸、至少一对TP、至少一对TPM、多个COM、多个LM和多个LP；和(E)原位检测所述样品上来自所述SGC的信号。
在特定的实施方式中，所述目标探针组包含剪接位点探针SP和邻近探针NP。所述SP包含能够与含有剪接位点J的目标核酸区域和另一个区域杂交的SPAT，能够与所述SP前级放大子(SPM)上的片段杂交的SPAP。所述NP包含能够与目标核酸区域和另一个区域杂交的NPAT，所述目标核酸区域邻近于与SPAT杂交的区域，能够与所述NP前级放大子(NPM)上的片段杂交的NPAP。所述SPM和NPM另外分别包含一个或更多个SPCA和NPCA的片段。提供了一个或更多个协作放大子COM，其中每一个包含与所述SPCA互补的第一片段、与所述NPCA互补的第二片段、以及包含多个标签放大子锚定片段的第三片段。当且仅当所述NPCA和SPCA一起紧密存在，每个COM可以稳定地附着NPM和SPM，使得它与NPCA和SPCA协作地杂交。提高了能够与所述COM的标签放大子锚定片段杂交的多个标签放大子(LM)，其中所述LM包含多个标签探针锚定片段。提供了能够与所述LM的标签探针锚定片段杂交的多个标签探针(LP)，其中所述LP包含可检测标签。所述SPM、NPM、COM、LM和LP形成信号发生复合物(SGC)，其含有充足数量的能被检测的标签。每个SGC可以在成像系统中显现为信号点。如果不存在特定的剪接阶段，也就是说，两个目标片段没有被剪接在一起，SP将不会与NP邻近地杂交，SPM将不会靠近NPM而存在，这将不容许COM稳定地捕获在目标上，将不会形成SGC；因而不能检测到信号。
在一个实施方式中，本发明提供了一种原位检测固定和透性化细胞的样品中的核苷酸变异的方法，包括：(A)使所述样品与核苷酸变异探针(SP)和邻近探针(NP)接触，其中所述SP包含可以与包含所述核苷酸变异的目标核酸区域特异性杂交的目标锚定片段(SPAT)和前级放大子锚定片段(SPAP)，以及其中所述NP包含可以与邻近所述SP的结合位点的目标核酸区域杂交的目标锚定片段(NPAT)和前级放大子锚定片段(NPAP)；(B)使所述样品与SP前级放大子(SPM)和NP前级放大子(NPM)接触，其中所述SPM包含可以结合所述SP的片段并包含两个或更多个SP协作锚(SPCA)，和其中所述NPM包含可以结合所述NP的片段并包含两个或更多NP协作锚(NPCA)；(C)使所述样品与协作放大子(COM)接触，其中所述COM包含与所述SPCA互补的第一片段、与所述NPCA互补的第二片段、和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(D)使所述样品与标签探针系统(LPS)接触，其中所述LPS包含多个标签放大子(LM)和多个标签探针(LP)，其中每个LM包含可以结合所述COM的标签放大子锚定片段的片段以及多个标签探针锚定片段，其中每个LP包含可检测标签和与LM的所述标签探针锚定片段杂交的片段，其中上述杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有所述核苷酸变异的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP；以及(E)原位检测所述样品上来自所述SGC的信号。
在另一个实施方式中，本发明提供了固定和透性化细胞的样品，包含(A)至少一个固定和透性化细胞，其含有具有所述核苷酸变异的目标核酸；(B)包含目标锚定片段(SPAT)的核苷酸变异探针(SP)，所述目标锚定片段与包含所述核苷酸变异的目标核酸区域杂交，和，包含目标锚定片段(NPAT)的邻近探针(NP)，所述目标锚定片段与邻近所述SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(C)与SP杂交的SP前级放大子(SPM)，其中所述SPM包含多个SP协作锚(SPCA)，以及与NP杂交的NP前级放大子(NPM)，其中所述NPM包含多个NP协作锚(NPCA)；(D)多个协作放大子(COM)，其每一个与所述SPM和所述NPM杂交，其中每个COM包含与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(E)多个标签放大子(LM)，每一个与所述COM的标签放大子锚定片段杂交，其中所述LM包含多个标签探针锚定片段；和(F)多个标签探针(LP)，每一个与所述LM的标签探针锚定片段杂交，其中所述LP包含可检测标签；其中上述杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有所述核苷酸变异的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP，以及其中所述SGC提供可检测的和可与背景噪声区分的信号。
在另一个实施方式中，本发明提供了组织玻片，包含：(A)具有固定于其上的多个固定和透性化细胞的玻片，包含至少一个固定和透性化的细胞，所述细胞含有具有所述核苷酸变异的目标核酸；(B)包含目标锚定片段(SPAT)的核苷酸变异探针(SP)，所述目标锚定片段与包含所述核苷酸变异的目标核酸区域杂交，和，包含目标锚定片段(NPAT)的邻近探针(NP)，所述目标锚定片段与邻近所述SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(C)与所述SP杂交的SP前级放大子(SPM)，其中所述SPM包含多个SP协作锚(SPCA)，以及与所述NP杂交的NP前级放大子(NPM)，其中所述NPM包含多个NP协作锚(NPCA)；(D)多个协作放大子(COM)，其每一个与所述SPM和所述NPM杂交，其中每个COM包含与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(E)多个标签放大子(LM)，每一个与所述COM的标签放大子锚定片段杂交，其中所述LM包含多个标签探针锚定片段；和(F)多个标签探针(LP)，每一个与所述LM的标签探针锚定片段杂交，其中所述LP包含可检测标签；其中上述杂交形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有所述核苷酸变异的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP，以及其中所述SGC提供可检测的和可与背景噪声区分的信号。
在又一个实施方式中，本发明提供了一种用于原位检测固定和透性化细胞的样品中目标核酸的核苷酸变异的试剂盒，包括：(A)用于透性化细胞的至少一种试剂；(B)一组包含核苷酸变异探针(SP)的目标杂交探针，所述核苷酸变异探针包含目标锚定片段(SPAT)，所述目标锚定片段能够与包含所述核苷酸变异的目标核酸区域杂交，和，包含目标锚定片段(NPAT)的邻近探针(NP)，所述目标锚定片段与邻近所述SP的结合位点的目标核酸区域杂交；(C)一组包含SP前级放大子(SPM)的前级放大子，所述SP前级放大子包含能够与SP杂交的片段，其中所述SPM包含多个SP协作锚(SPCA)，以及，包含与NP杂交的片段的NP前级放大子(NPM)，其中所述NPM包含多个NP协作锚(NPCA)；(D)多个协作放大子(COM)，其能够与所述SPM和所述NPM杂交，其中所述COM包含与所述SPCA互补的第一片段，与所述NPCA互补的第二片段，和包含多个标签放大子锚定片段的第三片段；(E)标签放大子(LM)，其能够与所述COM的标签放大子锚定片段杂交，其中所述LM包含多个标签探针锚定片段；和(F)标签探针(LP)，其能够与所述LM的标签探针锚定片段杂交，其中所述LP包含可检测标签；其中，在与包含细胞的固定和透性化细胞的样品接触时，所述细胞含有具有所述核苷酸变异的目标核酸，上述(B)-(F)的组分形成信号发生复合物(SGC)，其包含具有所述核苷酸变异的目标核酸、SP、NP、SPM、NPM、多个COM、多个LM和多个LP，以及其中所述SGC提供可检测的和可与背景噪声区分的信号。在上文描述的本发明的实施方式的特定实施方式中，所述核苷酸变异选自由单核苷酸变异、多核苷酸变异、剪接位点、插入、删除、重排等构成的组。
要理解的是，在本文提供的本发明的定义之内也提供了实质上不影响本发明的各个实施方式的活性的修改。因而，以下实施例预期例举本发明而不是限制本发明。
实施例1
检测点突变
这个实施例描述了本发明在检测组织样品中的点突变方面的两个示范性的应用。
附图13显示了在固定和石蜡包埋的(FFPE)黑素瘤细胞系团粒的切片中检测BRAF mRNA。分析BRAF的V600E点突变的黑素瘤细胞系阴性(CHL-1，a和a')和阳性(SK-MEL-28，b和b')。细胞分别与含有野生型检测探针(WDP，序列：gagatttcA*ctgtagc，A*是BNA修饰碱基)(a和b)的目标探针系统(TPS)，以及含有BRAF V600E突变检测探针(MDP，序列：gagatttcT*ctgtagc，T*是BNA修饰碱基)杂交。使用了与附图1中所显示的基本上类似的SGC结构。靶向野生型BRAF的探针的信号仅在野生型细胞中观察到(a)，而V600E突变仅在带有V600E MDP的V600E阳性细胞中检出(b')。
附图14显示了不同长度的SPATs的作用，其中使用基本上类似于附图1所示的SGC结构。在附图14A中，CHL-1细胞(无V600E突变)与具有22核苷酸(nt)SPAT的V600E突变探针杂交，显示了假阳性信号。因而，附图14A显示了使用长SPAT的高数量的假阳性。在附图14B中，含有V600E突变的SK-MEL-28细胞与15nt SPAT V600E突变探针杂交，显示了特异性的信号。因而，附图14B显示了使用更短SPAT具有更高的特异性。
附图15显示了在SPAT中包括修饰碱基的效果，其中使用基本上类似于附图1所示的SGC结构。在附图15A中，SK-MEL-28细胞(含有V600E突变)与具有正常碱基的16nt SPAT V600E探针杂交。附图15A显示了SPAT中正常碱基的染色结果。在附图15B中，SK-MEL-28细胞与含有与突变互补的单个修饰的BNA碱基的16nt SPAT V600E突变探针杂交，显示了具有更多信号(点)的改善的敏感性。附图15B显示了SPAT中使用修饰碱基的改善的结果。
附图16显示了在已知V600E点突变为阴性(a和a')和阳性(b和b')的2种FFPE结肠癌组织中检测BRAF mRNA，其中使用与附图1所示的基本上类似的SGC结构。虽然使用靶向野生型BRAF mRNA的探针在两种样品中都观察到信号(a和b)，使用为V600E突变特异性设计的探针，V600E突变mRNA仅在突变阳性样品中检测到(b')。第二种样品中WDP信号的存在表明它具有杂合的BRAF V600E突变。在附图16显示的实施例中设计的所有SNV探针中，在SPAT中与突变位点互补的位置掺入了单个BNA修饰碱基。
附图17显示了极低丰度和降解的RNA的检测。目标是HGF mRNA，它的长度超过1000nt，但是已知以极低水平表达。此外，已知该RNA在这个样品中至少部分地降解，该样品是肺癌的福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织切片。附图17A显示了使用美国专利Nos.7,709,198和8,658,361中描述的方法以及含有30对TP的目标探针集的染色图像。由于低表达和部分RNA降解的组合，检测敏感性是低的。附图17B显示了使用30对TP和与附图11A所示相类似的SGC结构，利用本发明的方法的改进的染色。
附图18表明，与先前公开的方法相比，本文公开的发明在检测短核酸目标方面提供了增强的性能。在附图18A中，使用美国专利No.7,709,198和US8,658,361中公开的检测系统，用单独一对目标探针，来检测Hela细胞团中POLR2A mRNA上大约50nt的序列。附图18A(a)呈现了使用POLR2A目标探针产生的信号。附图18A(a')呈现了使用针对一种负控制基因dapB的目标探针产生的背景水平。在附图18B中，具有附图11A中所示类似结构的单个SGC被用于检测同一样品类型中的同一目标。附图18B(b)呈现了使用靶向POLR2A mRNA的同一序列的一个TP配对产生的信号。附图18A(b')呈现了靶向一种负控制基因dbpB产生的背景水平。
先前公开的方法中以及附图18B中显示的方法中的目标探针具有相同的结构，也就是说，每个探针包含与目标序列结合的片段、以及与放大系统的成员结合的另一个片段。在先前公开的方法中，这一成员是前置放大子/放大子(也就是说，配对中的两个目标探针结合同一前置放大子/放大子分子)。在附图18B中使用的本发明的具体实施方式中，探针对的一个成员结合NPM，另一个结合SPM。两种方法中探针对的目标结合序列是相同的。差异存在于另一个片段中。在先前公开的方法中，所述另一个片段(结合前级放大子/放大子)是短的，从而前级放大子/放大子不稳定地结合配对上的单个探针。当且仅当目标探针对的两个成员相互邻近存在时，前级放大子/放大子将以稳定的方式协同地结合两个特征。在本发明的方法的这个特定实施方式中，另一个节段是更长的，用于NPM或SPM稳定地结合NP和SP。在SP-SPM或NP-NPM之间不发生协作杂交。附图18B中显示的这个特定实施例中，本发明的方法中的协作杂交在COM和SPM+NPM之间发生。
附图19展现了特定剪接接点的原位检测，其可以用于鉴定特定的剪接变体。已知细胞系H596是META14阳性的，也就是说，MET基因中的外显子14被“跳过”，导致MET RNA中外显子15与外显子13剪接。细胞系A549是野生型的，MET RNA中具有全部外显子12-15。靶向剪接接点E12/13、E13/14和E14/15的探针被用于检测H596和A549细胞的FFPE(福尔马林固定和石蜡包埋的)细胞团中相应接点的存在。染色图像在附图19中示出，其显示了H596细胞中目标剪接接点E13/15以及A549细胞中E14/15的敏感和特异性的检出，显示META14剪接变体被正确地鉴定。
这些结果证明，利用协作杂交的方法可以用于在原位分析中检测目标核酸中的单核苷酸变异。
整个本申请中引用了多种公开物。这些公开物的公开内容通过引用完全合并在本申请中，以更完整地描述本发明所述领域的现状。虽然已经参考上文提供的实施例描述或本发明，要理解的是可以进行各种修改而不背离本发明的精神。