本发明涉及γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(γ-amaninamide)(1；x＝0、1或2)，γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(γ-amaninamidicacid)(2；x＝0、1或2)，和γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(γ-amaninamidichydroxamicacid)(3；x＝0、1或2)，γ-鹅膏菌素(γ-amanitin)的新型衍生物(4)，及其合成方法和新型结构单元。
背景技术：
鹅膏毒素是由8个氨基酸组成的环肽，发现于鬼笔鹅膏(amanitaphalloides)蕈类中(见图1)。鹅膏毒素特异性抑制哺乳动物细胞的dna-依赖性rna聚合酶ii，并且由此还抑制受影响细胞的转录和蛋白生物合成。细胞内转录的抑制导致生长和增殖的停止。尽管不是共价连接，但是鹅膏菌素与rna聚合酶ii之间的络合是非常紧密的(kd＝3nm)。将鹅膏菌素从酶上解离是一个非常缓慢的过程，因而使得受影响的细胞不可能恢复。当转录抑制持续太久时，细胞将经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。
已经在1981年通过使用与色氨酸(trp)(氨基酸4，见图1)吲哚环连接的连接体经由重氮化将抗thy1.2抗体与α-鹅膏菌素偶联而开发了鹅膏毒素作为细胞毒性部分用于肿瘤治疗的用途(davis&preston,science213(1981)1385-1388)。davis&preston确定了连接的位置为7’位。morris&venton同样证明了7’位取代产生了衍生物，其保持了细胞毒活性(morris&venton,int.j.peptideproteinres.21(1983)419-430)。
专利申请ep1859811a1(2007年11月28日公开)描述了轭合物，其中β-鹅膏菌素的鹅膏毒素氨基酸1的γc-原子直接(即无连接体结构)与白蛋白或者单克隆抗体hea125、okt3或pa-1偶联。此外，这些轭合物显示了对乳腺癌细胞(mcf-7)、伯基特淋巴瘤细胞(raji)和t淋巴瘤细胞(jurkat)的增殖具有抑制作用。虽然建议使用连接体，包括包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等元件的连接体，但是实际上并没有给出这样的结构，且没有提供更多的细节，例如在鹅膏毒素上的连接位点。
专利申请wo2010/115629和wo2010/115630(都于2010年10月14日公开)描述了轭合物，其中抗体，例如抗epcam抗体，如人源化抗体huhea125，通过(i)鹅膏毒素氨基酸1的γc-原子、(ii)鹅膏毒素氨基酸4的6’c-原子或(iii)鹅膏毒素氨基酸3的δc-原子与鹅膏毒素偶联，每种情况下直接偶联或通过抗体与鹅膏毒素之间的连接体偶联。所建议的连接体包含例如酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等的元件。另外，这些轭合物显示了对乳腺癌细胞(mcf-7细胞系)、胰腺癌(capan-1细胞系)、结肠癌(colo205细胞系)和胆管癌(oz细胞系)的增殖具有抑制作用。
可以从收集的鬼笔鹅膏蕈类子实体或从纯培养物中(zhangp,chenz,huj,weib,zhangz,andhuw,productionandcharacterizationofamanitintoxinsfromapurecultureofamanitaexitialis,femsmicrobiollett.2005nov15；252(2):223-8.epub2005sep15)分离出鹅膏毒素(amatoxin)。然而，可以获得的鹅膏毒素的量相当低(从天然子实体中，约0.3-3mg/g干物质，从纯培养物中，约10％)并且进一步修饰天然存在的鹅膏毒素变体的灵活性受到了限制(参见[003]和[005]中讨论的参考文献和本文引用的参考文献)。
或者，可以使用担子菌(muraokas和shinozawat.,effectiveproductionofamanitinsbytwo-stepcultivationofthebasidiomycete,galerinafasciculatagf-060,jbioscibioeng.2000；89(1):73-6；报道的产量约为5mg/l培养物)或a.fissa(guoxw,wanggl,andgongjh,cultureconditionsandanalysisofamanitinsonamanitaspissa,weishengwuxuebao.2006jun；46(3):373-8；报道的产量为约30μg/l培养物)由发酵获得鹅膏毒素。同样，产量低，并且进一步修饰天然存在的鹅膏毒素变体的灵活性也受到了限制。
最后，通过部分或全部合成制备了鹅膏毒素(例如zanottig,
值得注意的是，zanotti等人，1989(上述引文)报道了生物学上无活性的s-脱氧-γ(r)-羟基-异亮氨酸-三羟鹅膏毒肽酰胺的合成，而活性对映体的合成显然没有成功。
此外，zhao等人(上述引文)报道了从4(s)-4-羟基异亮氨酸开始合成γ-三羟鹅膏毒肽酰胺衍生物。然而，作者发现，所得到的γ-三羟鹅膏毒肽酰胺衍生物的毒性可忽略不计，因此不再进一步开发这种基于γ-三羟鹅膏毒肽酰胺的结构。
虽然使用全合成途径来合成鹅膏毒素可以为治疗用途所需的更大量的鹅膏毒素供应提供了选择，并且可以通过使用适当的原料作为结构单元而提供各种新型α-或β-鹅膏毒素变体的构建，然而过去所追求的方法受到以下事实的限制：基本的结构单元，γ,δ-二羟基异亮氨酸或其合成子不能作为纯的非对映异构体获得。尽管wo2014/009025描述了γ,δ-二羟基异亮氨酸的新型合成子及其用于合成鹅膏毒素的用途，但是这种方法是昂贵的且大量耗费劳动力。
发明目的
因此，仍然非常需要一种合成鹅膏毒素的成本有效且稳健的方式。特别地，强烈需要基于α和β-鹅膏菌素的鹅膏毒素轭合物的替代物，迄今为止尚未发现完全令人满意的合成通路。
发明概述
本发明基于如下出乎意料的观察：容易获得的(2s,3r,4s)-l-4-羟基异亮氨酸(5)
可以通过正交保护策略保护，并且可以以γ-羟基异亮氨酸作为氨基酸3用于鹅膏毒素的合成。
因此，在一个方面，本发明涉及一种化合物，其是(2s,3r,4s)-l-4-羟基异亮氨酸(结构5)的衍生物，具有结构(2s,3r,4s)-ch3-ch(or1)-ch(ch3)-ch(nhr2)-c(＝o)or3(结构6)，其中r1和r3在可以切割r2的条件下稳定，且r1和r2在可以切割r3的条件下稳定，特别地，其中r1是烷酰基(alkanoyl)，特别是乙酰基或ch3coch2co-，r2是fmoc，且r3是苄基或叔丁基。
在第二方面，本发明涉及合成结构6(2s,3r,4s)-ch3-ch(or1)-ch(ch3)-ch(nhr2)-c(＝o)or3的化合物的方法，包括以下步骤：(a)使结构5的化合物与铜或硼络合，特别是与9-硼双环[3,3,1]壬烷(9-bbn)络合；(b)用化合物r1’-c(＝o)-x酰化4-羟基，其中x是离去基团，特别地其中r1'是烷基，特别是c1-6-烷基，特别是甲基；(c)切割金属络合物；(d)用r2基团，特别是fmoc基团保护α-氨基；和(e)用r3基团，特别是苄基或叔丁基保护羧基。
方案1(6*：结构6，其中r1＝me；r2＝fmoc；r3＝苄基)：
在第三方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含结构6的化合物和用于合成鹅膏毒素或其前体的至少一种另外的试剂。
在第四方面，本发明涉及一种用于合成鹅膏毒素或其前体分子的方法，包括以下步骤：(a1)将保护基团r2从结构6(2s,3r,4s)-ch3-ch(or1)-ch(ch3)-ch(nhr2)-c(＝o)or3的化合物上切割下来，以及(a2)使脱保护的6的变体与根据步骤(a1)获得的游离氨基偶联成活化的羟脯氨酸变体、其受保护的变体或其合成子(synthon)，特别是选自7、8和l的结构的化合物。
在第五方面，本发明涉及γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)、和γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)。
在第六方面，本发明涉及γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)与靶结合部分的轭合物，特别地，其中所述靶结合部分是抗体或包含至少功能性抗原结合结构域的抗体片段，其中所述轭合物任选地包含连接体部分，所述连接体部分一侧与所述γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)中存在的位置或官能团连接，另一侧与所述靶结合部分中存在的位置或官能团连接。
在第七方面，本发明涉及γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)与连接部分的轭合物，所述连接部分一侧与所述γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)中存在的位置或官能团连接，并且所述连接部分进一步包含这样的位置或官能团：该位置或官能团可以直接或间接连接至靶结合部分中存在的位置或官能团，特别地其中所述靶结合部分是抗体或包含至少功能性抗原结合结构域的抗体片段。
附图说明
图1示出了不同鹅膏毒素的结构式。粗体数字(1～8)标明形成鹅膏毒素的八个氨基酸的标准编号。还示出了氨基酸1、3和4中原子的标准命名(分别为希腊字母α至γ、希腊字母α至δ和从1’至7’的数字)。
图2示出了化合物1的合成方案(步骤(a)至(g))。
图3示出了用■：γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1)(ec50:9.710-7m)；▲：γ-鹅膏菌素(4)(ec50:2.710-7m)处理的skov3细胞的生存力。
图4示出了化合物hdp30.1485的nmr谱：(a)1hnmr(500mhz,氯仿-d)；(b)13cnmr(126mhz,cdcl3)。
发明详述
在下面详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于本文所描述的特定的方法、程序和试剂，因为它们可以发生变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另外说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
优选地，本文所用的术语如“amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms:(iupacrecommendations)”，leuenberger,h.g.w,nagel,b.和
除非上下文中另外要求，否则整篇说明书以及其后的权利要求书中，词语“包含(comprise、comprises、comprising)”将被理解为意指包含所陈述的整数、组成或步骤或者整数或步骤的组，而任何附加的整数、组成或步骤或者整数、组成或步骤的组也可以任选地存在，包括不存在附加的整数、组成或步骤或者整数、组成或步骤的组的实施方案。在后面的实施方案中，术语“包含”和“由...组成”的使用一致。
本说明书文本中引用了若干文献。本文所引用的文献中的每一个(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、技术说明书、genbank登陆号序列提交等)，无论上文或下文中，以各专利法允许的程度通过引用将全文并入本文。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权先于依赖于先前发明的此类公开内容。
现在将进一步描述本发明。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非有明确的相反说明，否则如此定义的每个方面可以与任意其他一个或多个方面组合。特别地，被指示为优选或有利的任何特征可以与被指示为优选或有利的任何其他一个或多个特征组合。
本发明基于如下出乎意料的观察：容易获得的(2s,3r,4s)-l-4-羟基异亮氨酸(5)
可以通过正交保护策略保护，并且可以以γ-羟基异亮氨酸作为氨基酸3用于鹅膏毒素的合成。
α-鹅膏菌素的氨基酸3是γ,δ-二羟基异亮氨酸(cas55399-94-5)，其在自然界中基本上仅存在于α-和β-鹅膏菌素中。正确对映体形式的γ,δ-二羟基异亮氨酸的合成是复杂且昂贵的。
相反，胡芦巴(fenugreek)(胡芦巴(trigonellafoenum-graecum))中存在大量(干燥种子中0.6％)的(2s,3r,4s)-l-4-羟基异亮氨酸(cas55399-93-4；结构5)，其每年商业化生产数百吨。因此，化合物5可商购获得。
因此，在一个方面，本发明涉及一种(2s,3r,4s)-l-4-羟基异亮氨酸(结构5)的衍生物，其具有结构(2s,3r,4s)-ch3-ch(or1)-ch(ch3)-ch(nhr2)-c(＝o)or3(结构6)，其中r1和r3在可以切割r2的条件下稳定，且r1和r2在可以切割r3的条件下稳定，特别地其中r1是烷酰基，特别是乙酰基或ch3coch2co-，r2是fmoc，且r3是苄基或叔丁基。
如本文所用的，化合物的“化学衍生物”(或简短表述为：“衍生物”)是指具有与化合物相似的化学结构但还含有化合物中不存在的至少一个化学基团和/或缺少化合物中存在的至少一个化学基团的物种。衍生物所比较的化合物被称为“母体”化合物。通常，“衍生物”可在一个或多个化学反应步骤中由母体化合物产生。
到目前为止，尚未使用化合物5成功合成鹅膏毒素，因为化合物5容易形成内酯形式(结构9)，其不再具有反应性。
在特定的实施方案中，r2可以通过用碱，特别是仲胺或叔胺处理而切割，并且r1和r3在所述条件下是稳定的。
在特定的此类实施方案中，r2是fmoc基团。在特定的此类实施方案中，选择性切割r2的条件选自：
-20％哌啶的dmf溶液(1:4)，3至5分钟；
-1至5％dbu/dmf；
-20％哌啶和1-5％dbu的dmf溶液；
-吗啉/dmf(1:1)；
-哌啶/dmf(1:4)，45℃；
-0.1mhobt的哌啶/dmf溶液(1:4)；
-bu4n+f的dmf和其他四烷基氟化铵溶液；和
-2％hobt、2％六亚甲基亚胺、25％n-甲基吡咯烷的dmso/nmp1:1溶液。
在特定的实施方案中，r3可以通过氢化切割，并且r1和r2在所述条件下是稳定的。
在特定的此类实施方案中，r3是苄基。在特定的此类实施方案中，选择性切割r3的条件是在室温常压下用pd/c(10％)氢化4小时。
在特定的实施方案中，r3可以通过弱酸处理切割，并且r1和r2在所述条件下是稳定的。
在特定的此类实施方案中，r3是叔丁基。在特定的此类实施方案中，选择性切割r3的条件选自用hcl的乙酸溶液或用三氟乙酸处理。
在本发明的上下文中，基团rx在如下情况是稳定的：其中另一保护基团ry被切割超过90％、特别是超过95％，与此同时，少于10％、特别是少于5％的所述基团rx被切割。
在第二方面，本发明涉及合成结构6(2s,3r,4s)-ch3-ch(or1)-ch(ch3)-ch(nhr2)-c(＝o)or3的化合物的方法，包括以下步骤：(a)使结构5的化合物与铜或硼络合，特别是与9-硼双环[3,3,1]壬烷(9-bbn)络合；(b)用化合物r1’-c(＝o)-x酰化4-羟基，其中x是离去基团，特别地其中r1'是烷基，特别是c1-6烷基，特别是甲基；(c)切割金属络合物；(d)用r2基团，特别是fmoc基团，保护α-氨基；和(e)用r3基团，特别是苄基或叔丁基，保护羧基。在特定的实施方案中，x选自cl、br和-o-c(＝o)-r。
在第三方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含结构6的化合物和用于合成鹅膏毒素或其前体的至少一种另外的试剂。
方案1(6*：结构4，其中r1＝me；r2＝fmoc；r3＝苄基)：
在本发明的上下文中，术语“鹅膏毒素”包括如从鹅膏菌属分离的并且在wieland,t.和faulstichh.(wielandt,faulstichh.,crccritrevbiochem.5(1978)185-260)中描述的由8个氨基酸组成的所有环肽，并且还包括其所有化学衍生物；还有其所有的半合成类似物；还有其根据天然化合物(环形，8个氨基酸)的基本结构从结构单元构建的所有的合成类似物，还有含有非羟基化氨基酸而不是羟基化氨基酸的的所有合成或半合成的类似物，还有其中硫醚亚砜部分被硫化物、砜或者被不同于硫的原子例如碳原子(如在鹅膏菌素的卡巴类似物(carba-analogue)中的)代替的所有合成或半合成的类似物，在每个实例中任何这样的衍生物或类似物通过抑制哺乳动物rna聚合酶ii而具有功能活性。
功能上，鹅膏毒素被定义为抑制哺乳动物rna聚合酶ii的肽或缩肽。优选的鹅膏毒素是具有能够与上文所定义的连接体分子或靶结合部分发生反应的官能团(例如羧基、氨基、羟基、硫醇或硫醇捕获基团)的那些。特别适于本发明的轭合物的鹅膏毒素是如图1所示的α-鹅膏菌素、β-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素、ε-鹅膏菌素、三羟鹅膏毒肽(amanin)、三羟鹅膏毒肽酰胺(amaninamide)、二羟鹅膏毒肽酰胺(amanullin)、二羟鹅膏毒肽羧酸(amanullinacid)、γ-三羟鹅膏毒肽和γ-三羟鹅膏毒肽酰胺，以及其盐、化学衍生物、半合成类似物和合成类似物。用于本发明的特别优选的鹅膏毒素是γ-三羟鹅膏毒肽、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺、γ-鹅膏菌素和ε-鹅膏菌素，特别是γ-三羟鹅膏毒肽和γ-三羟鹅膏毒肽酰胺。
在本发明的上下文中，术语“用于合成鹅膏毒素或其前体的另外的试剂”特别包括选自以下的任意试剂：(i)基于适当保护的和/或活化的氨基酸的化合物，其对应于形成鹅膏毒素的八个氨基酸骨架结构的剩余的七个氨基酸中的任意一个，包括与固体支持物偶联的氨基酸；(ii)适当保护和/或活化的预形成的二肽或多肽结构单元，其对应于鹅膏毒素的八个氨基酸骨架结构的部分，包括与固体支持物偶联的这种结构单元；(iii)活化、脱保护、偶联、合成和/或修饰根据(i)或(ii)的试剂或由化合物6与根据(i)或(ii)的任意试剂反应得到的产物所需的辅助试剂。
在特定实施方案中，所述至少一种另外的试剂选自以下列表：
(i)树脂，特别是选自以下组的树脂：merrifield树脂；rink-amid树脂；和thp树脂；
(ii)受保护的羟脯氨酸，特别是芴基甲氧基羰基(fmoc)保护的o-烯丙基羟脯氨酸(fmochypoall)；
(iii)受保护的天冬酰胺，特别是fmoc保护的n-三苯甲基天冬酰胺(fmoc(n-tri)asnoh)；
(iv)受保护的cys-trp二肽，特别是具有-sh和-oh保护基团的fmoc保护的cys-trp二肽(fmoccys(s-2-((o-no2ph)so2trp-o-allyl))]oh)；
(v)受保护的甘氨酸，特别是fmoc保护的甘氨酸(fmocgly)；
(vi)受保护的异亮氨酸，特别是fmoc保护的异亮氨酸(fmocile)；
(vii)肽偶联试剂，特别是选自下组的肽偶联试剂：o-(苯并三唑-1-
基)-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐(tbtu)；六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷鎓(pybop)；和o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hatu)；和
(viii)叔胺，特别是n,n-二异丙基乙胺(dipea)。
在第四方面，本发明涉及一种用于合成鹅膏毒素或其前体分子的方法，包括以下步骤：(a1)使保护基团r2从结构6的化合物上切割下来，以及(a2)使脱保护的6的变体与根据步骤(a1)获得的游离氨基偶联成活化的羟脯氨酸变体、其受保护的变体或其合成子(synthon)，特别是选自7、8和l的结构的化合物，其中l是预先加载羟脯氨酸的树脂，例如四氢吡喃基(thp)树脂。
在本发明的上下文中，术语“合成子”是指在化学反应中作为或可以作为特定目标化合物的合成等同物的化合物。该定义包括如下化合物：其中在所述化学反应中使用的条件下为不稳定的或反应性的目标化合物的部分被适当的保护基保护或掩蔽，所述保护基可在所述化学反应后被切割。
在本发明该方面的特定实施方案中，所述方法还包括如图2中所示的步骤(b)至(g)中的一步或多步。
在特定实施方案中，剩余的氨基酸通过n-末端合成策略偶联。
在特定实施方案中，所述方法是基于固相的合成，其另外包括以下步骤：
(b)fmocn-脱保护和g(由化合物6与树脂l的反应在步骤(a)中获得)与fmoc-(n-tri)asn-oh；fmoccys(s-2-((o-no2ph)so2trp-o-allyl))]oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh偶联的迭代循环，以产生化合物h：
(c)h的o-烯丙基-和n-fmoc脱保护，然后环化，以产生化合物i(b环闭合)：
(d)2-硝基芳基磺酰胺n-脱保护并从树脂中分离出i，以产生化合物j：
(e)j的溶液相环化，产生γ-三羟鹅膏毒肽酰胺衍生物k：
在另一方面，本发明涉及用于在溶液中合成γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)和γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)或其衍生物，或其前体分子的方法。
在特定实施方案中，x选自1和2，特别是1。
在某些实施方案中，此类方法另外包含一个或多个以下步骤：
(b)fmocn-脱保护和m(由化合物6与化合物7或化合物8的反应在步骤(a)中获得)与fmoc-(n-tri)asn-oh；fmoc-(s-tri)cys-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-gly-oh和n-boc-hpioh1[1zanotti,giancarlo；birrchristian；wielandtheodor；internationaljournalofpeptide&proteinresearch18(1981)162-8]偶联的迭代循环，以产生化合物n；
(c)n-三苯甲基和s-三苯甲基、o-叔丁基和n-叔丁氧基羰基保护基的酸性脱保护并通过savige-fontana反应(savige&fontana,intjpeptproteinres.15(1980)102-12)原位闭环，得到化合物j。
在第五方面，本发明涉及γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)和γ-羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)。
在特定实施方案中，x选自1和2，特别是1。
在一个具体实施方案中，化合物1、2或3的纯度大于90％，特别是大于95％。
在本发明的上下文中，术语“纯度”是指存在的化合物1、2或3的总量。例如，纯度大于90％意味着在1mg包含化合物1的组合物中，存在大于90％，即大于900μg的化合物1。剩余部分，即杂质，可包括未反应的原料和其他反应物、溶剂、切割产物和/或副产物。
在一个具体实施方案中，纯度大于90％的包含选自化合物1、2或3的化合物的组合物分别包含大于100mg的化合物1、2或3。因此，明确排除了可能存在于复杂的天然鹅膏毒素混合物中，例如来自蘑菇提取物，或复杂的合成混合物，例如作为副产品的痕量化合物1、2或3。
在第六方面，本发明涉及γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)或γ-羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)与靶结合部分的轭合物，特别地，其中所述靶结合部分是抗体或其抗原结合片段，其中所述轭合物任选地包含连接体部分，所述连接体部分一侧与所述γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)或γ-羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)中存在的位置或官能团连接，另一侧与所述靶结合部分中存在的位置或官能团连接。
在一个具体实施方案中，x选自1和2，特别是1。
如本文所用的，术语“靶结合部分”是指能够与靶分子或靶表位特异性结合的任何分子或分子的一部分。在本申请的上下文中，优选的靶结合部分是(i)抗体或其抗原结合片段；(ii)抗体样蛋白；和(iii)核酸适配体。适于在本发明中使用的“靶结合部分”典型地具有40000da(40kda)或更高的分子量。
如本文所用的，如果第一化合物(例如抗体)与第二化合物(例如抗原，诸如靶蛋白)具有100μm或更小，优选地50μm或更小，优选地30μm或更小，优选地20μm或更小，优选地10μm或更小，优选地5μm或更小，更优选地1μm或更小，更优选地900nm或更小，更优选地800nm或更小，更优选地700nm或更小，更优选地600nm或更小，更优选地500nm或更小，更优选地400nm或更小，更优选地300nm或更小，更优选地200nm或更小，甚至更优选地100nm或更小，甚至更优选地90nm或更小，甚至更优选地80nm或更小，甚至更优选地70nm或更小，甚至更优选地60nm或更小，甚至更优选地50nm或更小，甚至更优选地40nm或更小，甚至更优选地30nm或更小，甚至更优选地20nm或更小以及甚至更优选地10nm或更小的解离常数，则其被认为与所述第二化合物“特异性结合”。
在本申请的上下文中，术语“靶分子”和“靶表位”分别是指分别与靶结合部分特异性结合的抗原和抗原的表位。优选地，靶分子是肿瘤相关抗原，尤其是一种或多种肿瘤细胞类型的表面上以与非肿瘤细胞的表面相比增加的浓度和/或不同的空间构型存在的抗原或表位。优选地，所述抗原或表位存在于一种或多种肿瘤细胞类型的表面，但是不存在于非肿瘤细胞的表面。在特定的实施方案中，靶结合部分与her-2/neu或上皮细胞粘附分子(epcam)的表位特异性结合。在其他的实施方案中，所述抗原或表位优先在参与自身免疫性疾病的细胞上表达。在特定的这些实施方案中，靶结合部分与il-6受体(il-6r)的表位特异性结合。
如本文所用的，术语“抗体或其抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。因此，术语“其抗原结合片段”是指至少包含功能性抗原结合结构域的抗体片段。还包括的是通过包括例如噬菌体展示的技术选择的与靶分子例如与靶蛋白her-2/neu或epcam特异性结合的免疫球蛋白样蛋白。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚类的免疫球蛋白分子。适于在本发明中使用的“抗体和其抗体结合片段”包括但不限于多克隆的、单克隆的、单价的、双特异性的、杂合的(heteroconjugate)、多特异性的、人的，人源的(特别是cdr移植的)、去免疫的或嵌合的抗体，单链抗体(例如scfv)，fab片段，f(ab')2片段，由fab表达文库产生的片段，双体或四体(holligerp.等人，procnatlacadsciusa.90(1993)6444-8)，纳米抗体，抗独特型(抗-id)抗体(包括例如针对本发明的抗体的抗-id抗体)以及上文中任一种的表位结合片段。
在一些实施方案中，抗原结合片段是本发明的人抗原结合抗体片段并且包括但不限于fab、fab'和f(ab')2、fd、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(dsfv)以及包含vl或vh结构域的片段。包括单链抗体的抗原结合抗体片段可以包括单独的一个或多个可变结构域或一个或多个可变结构域与下列中的全部或部分的组合：铰链区、cl、ch1、ch2和ch3结构域。本发明还包括的是还包含一个或多个可变结构域与铰链区、cl、ch1、ch2和ch3结构域的任何组合的抗原结合片段。
可用于本发明的抗体可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体来自于人、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、豚鼠或兔)，鸡，猪，绵羊，山羊，骆驼，牛，马，驴，猫或犬来源。特别优选的是抗体是人或鼠来源。如本文所用，“人抗体”包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，以及包括从人免疫球蛋白文库或从为一种或多种人免疫球蛋白转基因且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体，例如如kucherlapati&jakobovits的美国专利第5,939,598号所描述的。
术语“抗体样蛋白”是指已经工程化(例如通过环的诱变)以与靶分子特异性结合的蛋白。通常，这样的抗体样蛋白包含在两端与蛋白支架连接的至少一个可变的肽环。这一双重结构限制将抗体样蛋白的结合亲和性大大增加至与抗体相当的水平。可变肽环的长度通常由10至20个氨基酸组成。支架蛋白可以是具有良好溶解特性的任何蛋白。优选地，支架蛋白是小的球状蛋白。抗体样蛋白包括但不限于亲合体(affibody)、抗运载蛋白(anticalin)和经设计的锚蛋白重复蛋白(参见binz等人，natbiotechnol.2005,1257-68)。抗体样蛋白可来源于大型突变体文库，例如从大型噬菌体展示文库淘选的，并且可类似于常规抗体进行分离。同样，抗体样结合蛋白可以通过球状蛋白中表面暴露残基的组合诱变获得。
术语“核酸适配体”是指已通过体外选择或selex(指数级富集配体的系统进化)的多轮重复而工程化以与靶分子结合的核酸分子(参见brody和gold，jbiotechnol.74(2000)5-13)。核酸适配体可以是dna或rna分子。适配体可含有修饰，例如修饰的核苷酸，诸如2’-氟取代的嘧啶。
在本发明的上下文中，“连接体”是指连接两个组成部分的结构，该组成部分的每一个与连接体的一个末端连接。在连接体是键的情况下，鹅膏毒素与抗体的直接键合能减小鹅膏毒素与rna聚合酶ii相互作用的能力。在特定的实施方案中，连接体增加两个组成部分之间的距离并缓解这些组成部分之间的空间干扰，例如在本实例中在抗体与鹅膏毒素之间。在特定的实施方案中，连接体主链上具有1～30个原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个原子)的连续链，即，连接体的长度被定义为由鹅膏毒素部分和抗体之间原子或键的数量测量的最短的连接，其中连接体主链的一侧已经与鹅膏毒素反应而另一侧可以与抗体反应或已经与抗体反应。在本发明的上下文中，连接体优选地是c1-20亚烷基、c1-20杂亚烷基、c2-20亚烯基、c2-20杂亚烯基、c2-20亚炔基、c2-20杂亚炔基、环亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、亚芳烷基(aralkylene)或杂亚芳烷基(heteroaralkylene)基团，它们任选地被取代。连接体可含有一个或多个结构元件，例如甲酰胺、酯、醚、硫醚、二硫化物、脲、硫脲、烃部分等。连接体还可含有这些结构元件中的两个或更多个的组合。这些结构元件中的每一个可在连接体中存在不止一次，例如两次、三次、四次、五次或六次。在某些实施方案中，连接体可包含二硫键。应当理解的是连接体必须在单个步骤或两个或更多个后续步骤中与鹅膏毒素和抗体连接。为了这一目的，连接体将带有两个基团，优选地在近端和远端，其可(i)与有待连接的组成部分中的一个中存在的基团(优选地鹅膏毒素或靶结合肽上的活化基团)形成共价键或(ii)其被活化或可以被活化以与鹅膏毒素上的基团形成共价键。相应地，优选的是化学基团位于连接体的远端和近端，其可以是该偶联反应的结果，例如酯、醚、氨基甲酸酯(urethane)、肽键等。
在特定的实施方案中，连接体l是独立地选自c、o、n和s的1～20个原子的直链，特别是2～18个原子，更特别是5～16个原子，以及甚至更特别是6～15个原子的直链。在特定的实施方案中，直链中至少60％的原子是c原子。在特定的实施方案中，直链中的原子通过单键连接。
在特定的实施方案中，所述连接体l是包含1至4个选自n、o和s的杂原子的亚烷基、杂亚烷基、亚烯基、杂亚烯基、亚炔基、杂亚炔基、环亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、亚芳烷基或杂亚芳烷基基团，其中所述连接体任选地被取代。
术语“亚烷基”是指具有1至20个碳原子的二价直链饱和烃基团，包括具有1至10个碳原子的基团。在某些实施方案中，亚烷基基团可以是低级亚烷基基团。术语“低级亚烷基”是指具有1至6个碳原子、在某些实施方案中1至5或1至4个碳原子的亚烷基基团。亚烷基基团的实例包括但不限于亚甲基(-ch2-)、亚乙基(-ch2-ch2-)、亚正丙基、亚正丁基、亚正戊基和亚正己基。
术语“亚烯基”是指具有2至20个碳原子的二价直链基团，其中碳碳键中的至少一个是双键而其他的键可以是单键或另外的双键。本文中，术语“亚炔基”是指具有2至20个碳原子的基团，其中碳碳键中的至少一个是三键，而其他的键可以是单键、双键或另外的三键。亚烯基基团的实例包括亚乙烯基(-ch＝ch-)、1-亚丙烯基、2-亚丙烯基、1-亚丁烯基、2-亚丁烯基、3-亚丁烯基等。亚炔基的实例包括亚乙炔基、1-亚丙炔基、2-亚丙炔基等等。
如本文所用的，“环亚烷基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中该环具有3～12个碳原子但是没有杂原子，并且其中该环是完全饱和的，而术语“环亚烯基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中该环具有3～12个碳原子但是没有杂原子，并且其中该环是至少部分不饱和的(但是不包括任何亚芳基环)。环亚烷基的实例包括但不限于环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基和环亚庚基。环亚烯基的实例包括但不限于环亚戊烯基和环亚己烯基。
如本文所用的，术语“杂环亚烷基”和“杂环亚烯基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环，其中该环具有3～约12个碳原子，并且其中该环由碳原子和至少一个杂原子、具体地独立地选自由n、o和s组成的组的至少一个杂原子组成，其中，杂环亚烷基是指完全饱和的环，杂环亚烯基是指至少部分不饱和的环(但是不包括任何亚芳基或杂亚芳基环)。
术语“亚芳基”意指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环或环体系，其中该环或环体系具有3～20个碳原子但是没有杂原子，该环或环体系由如“4n+2”π电子规则定义的芳香族部分组成，包括亚苯基。
如本文所用的，术语“杂亚芳基”是指作为任何稳定的单环或多环体系的一部分的二价环或环体系，其中该环或环体系具有3～20个原子，该环或环体系由如“4n+2”π电子规则定义的芳香族部分组成并且含有碳原子和一个或多个氮、硫和/或氧杂原子。
在本发明的上下文中，术语“取代的”意指连接体的主链中存在的一个或多个氢被来自所标示的一个或多个基团的选择取代，只要不超过所标示的原子的正常化合价或被取代的基团的合适的原子的化合价，并且取代导致稳定的化合物。如本文所定义的，术语“任选地取代的”意指连接体是未取代的或被如本文所定义的一个或多个取代基取代的。当取代基是酮(或氧代，即，＝o)基团、硫代或亚氨基基团或类似基团时，连接体主链原子上的两个氢被代替。示例性的取代基包括例如烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、酰基、芳酰基、杂芳酰基、羧基、烷氧基、芳氧基、酰氧基、芳酰氧基(aroyloxy)、杂芳酰氧基(heteroaroyloxy)、烷氧基羰基、卤素、(硫代)酯、氰基、磷酰基、氨基、亚氨基、(硫代)酰氨基、巯基(sulfhydryl)、烷基巯基、酰基巯基、磺酰基、硫酸根、磺酸根、氨磺酰基、磺酰氨基、硝基、叠氮基、卤代烷基(包括全氟烷基(例如三氟甲基))、卤代烷氧基、烷基硫烷基(alkylsulfanyl)、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、芳基砜氨基(arylsulfonoamino)、磷酰基、磷酸根、膦磷酸根、亚膦酸根、烷基羧基、烷基羧基酰胺、氧代、羟基、巯基(mercapto)、氨基(任选被例如烷基、芳基、或杂芳基单取代或二取代)、亚氨基、甲酰胺、氨甲酰(任选由例如烷基、芳基、或杂芳基单取代或二取代)、脒基、氨基磺酰基、酰基氨基、芳酰基氨基、(硫代)脲基、(芳基硫代)脲基、烷基(硫代)脲基、环烷基(硫代)脲基、芳氧基、芳烷氧基、或-o(ch2)n-oh、-o(ch2)n-nh2、-o(ch2)ncooh、-(ch2)ncooh、-c(o)o(ch2)nr、-(ch2)nn(h)c(o)or或n(r)s(o)2r，其中n是1-4而且r独立地选自氢、-烷基、-烯基、-炔基、-环烷基、-环烯基、-(c-连接的杂环烷基)、-(c-连接的杂环烯基)、-芳基和-杂芳基，允许具有多种程度的取代。本领域技术人员应当理解的是，如果适合，那么取代基例如杂环烷基、芳基、杂芳基、烷基等或功能基团例如-oh、-nhr等自身可被取代。本领域技术人员还应当理解的是，适合时，取代的部分本身可被取代。
在特定的实施方案中，所述连接体l包含选自下列部分中的一个的部分：二硫(-s-s-)、醚(-o-)、硫醚(-s-)、胺(-nh-)、酯(-o-c(＝o)-或-c(＝o)-o-)、甲酰胺(-nh-c(＝o)-或-c(＝o)-nh-)、氨基甲酸酯(-nh-c(＝o)-o-或-o-c(＝o)-nh-)和脲部分(-nh-c(＝o)-nh-)。
在本发明的特定的实施方案中，所述连接体l包含若干选自下列的m基团：亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、杂亚烷基、杂亚烯基、杂亚炔基、杂环亚烷基、亚芳基、杂亚芳基、亚芳烷基以及杂亚芳烷基基团，其中，每个基团可任选地被独立地取代，连接体还包含若干独立选自下列部分中的一种的n部分：二硫(-s-s-)、醚(-o-)、硫醚(-s-)、胺(-nh-)、酯(-o-c(＝o)-或-c(＝o)-o-)、甲酰胺(-nh-c(＝o)-或-c(＝o)-nh-)、氨基甲酸酯(-nh-c(＝o)-o-或-o-c(＝o)-nh-)和脲部分(-nh-c(＝o)-nh-)，其中m＝n+1。在特定的实施方案中，m是2且n是1，或m是3且n是2。在特定的实施方案中，连接体包含2或3个未取代的亚烷基基团以及1或2个分别连接未取代的亚烷基基团的二硫、醚、硫醚、胺、酯、甲酰胺、氨基甲酸酯或脲部分。
在特定的实施方案中，直链中的c原子独立地是任选取代的亚甲基基团(-ch2-)的部分。在这样特定的实施方案中，任选的取代基独立地选自卤素和c1-6烷基，特别是甲基。
在特定的实施方案中，所述连接体l是稳定的连接体。
在本发明的上下文中，术语“稳定的连接体”是指(i)在酶的存在下，和(ii)在细胞内还原环境中稳定的连接体。
在特定的实施方案中，稳定的连接体不含(i)可被酶切割的子结构，和/或(ii)二硫基。在该特定的实施方案中，连接体具有多达12个原子，特别是2至10个，更特别是4至9个，最特别是6至8个原子的长度。
在特定的其他实施方案中，所述连接体是可切割连接体。
在本发明的上下文中，术语“可切割连接体”是指(i)可被酶切割的连接体，或(ii)可还原连接体(reduciblelinker)。
在本发明的上下文中，术语“可还原连接体”是指在细胞内还原环境中可以被切割的连接体，特别是含有二硫基，导致被细胞内还原环境内化后与靶向抗体轭合的毒素货物的细胞内释放的连接体(见shen等人，j.biol.chem.260(1985)10905–10908)。在特定的实施方案中，可还原连接体包含如下部分：
其中r1至r4独立地选自h和甲基。
在其他特定的实施方案中，所述连接体是可切割连接体，特别是(i)可被酶切割的连接体，或(ii)可还原连接体，特别是包含二硫基的连接体。在该特定的实施方案中，该可切割连接体具有多达20个原子，特别是6至18个，更特别是8至16个，最特别是10至15个原子的长度。
在特定实施方案中，可切割连接体包含结构l1-l*-l2
其中l1是连接l*与鹅膏毒素的连接体的一部分，特别地，其中l1通过-nh-
或-o-基团，特别是–c(＝o)-nh-、–c(＝o)-nh-o-或–c(＝o)-o-基团，连接至
l*，并且
其中l2是连接l*与靶结合部分的连接体的一部分，特别地，其中l1通过
–(ch2)m-部分连接至l*，其中m是选自1至8，特别是1至5的整数，或
通过–(ch2ch2o)n-部分连接至l*，其中n是选自1至3，特别是1至2的
整数。
在特定实施方案中，l*具有以下结构
在特定实施方案中，所述连接体存在并且其一侧连接至γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)中选自以下的位置：
(i)在化合物1的情况下，鹅膏毒素氨基酸1的γc-原子上的酰胺基的氮
原子(酰胺键)；
(ii)在化合物2的情况下，鹅膏毒素氨基酸1的γc-原子上的酸基的氧原
子(酯键)；
(iii)在化合物3的情况下，鹅膏毒素氨基酸1的γc-原子上的异羟肟酸基
团的氧原子；
(iv)鹅膏毒素氨基酸3的δc-原子上的羟基的氧原子，特别是通过酯键、醚键或氨基甲酸酯键；或者
(v)鹅膏毒素氨基酸4的6'c-原子；和
(vi)氨基酸4的环氮。
在特定的实施方案中，所述连接体存在并且其另一侧通过脲部分连接至靶结合部分(…-连接体-nh-c(＝o)-nh-靶结合部分)。在特定的此类实施方案中，脲部分由最初存在于靶结合部分中的伯胺(例如赖氨酸侧链的氨基)与氨基甲酸衍生物...-连接体-nh-c(o)-z的反应产生，其中z是可以被伯胺取代的离去基团。
在特定的其他实施方案中，所述连接体存在并且其另一侧通过硫醚部分连接至靶结合部分(…-连接体-s-靶结合部分)。在特定的此类实施方案中，硫醚部分由最初存在于靶结合部分中的硫醇基团(例如半胱氨酸侧链的硫醇基团)与硫醇反应性基团的反应产生。
在本发明的上下文中，术语“硫醇反应性基团”是指与抗体的游离半胱氨酸的硫醇基团选择性地反应的基团，特别是在6.0至8.0范围内的ph值，更特别的是在6.5至7.5范围内的ph值。具体地，术语“选择性地”是指包含硫醇反应性基团的分子与包含至少一个游离半胱氨酸残基的抗体的偶联反应的少于10％是与抗体的非半胱氨酸残基(例如赖氨酸残基)的偶联反应，特别地少于5％，更特别地少于2％。
在特定的实施方案中，由硫醇基团与硫醇反应性基团的偶联产生的部分选自：硫醇取代的乙酰胺；硫醇取代的琥珀酰亚胺；硫醇取代的琥珀酰胺酸；硫醇取代的杂芳基，特别是硫醇取代的苯并噻唑，硫醇取代的苯基四唑和硫醇取代的苯基恶二唑；和二硫化物，其中一个硫原子源自抗体的半胱氨酸残基。在特定的实施方案中，由硫醇基团与硫醇反应性基团的偶联产生的部分是硫醇取代的琥珀酰亚胺。
在第七方面，本发明涉及γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)与连接部分的轭合物，所述连接部分一侧与所述γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)或γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)中存在的位置或官能团连接，并且所述连接部分进一步包含这样的位置或官能团：该位置或官能团可以直接或间接与靶结合部分中存在的位置或官能团连接，特别地其中所述靶结合部分是抗体或至少包含功能性抗原结合结构域的抗体片段。
在一个具体实施方案中，x选自1和2，特别是1。
在特定实施方案中，可以直接或间接与靶结合部分中存在的位置或官能团连接的所述位置或官能团，是氨基甲酸衍生物-nh-c(o)-z，其中z是可以被靶结合部分的亲核基团取代、特别是被靶结合部分的伯胺取代的离去基团。
在特定的实施方案中，在一侧与连接体连接并且可以直接或间接与靶结合部分中存在的位置或官能团连接的所述位置或官能团，是硫醇反应性基团。在特定的实施方案中，硫醇反应性基团选自碘乙酰胺，马来酰亚胺，在3位具有离去基团、特别是选自-br和取代的硫醇(参见，例如，us9,295,729)的离去基团的马来酰亚胺，在4位具有离去基团、特别是选自-br和取代的硫醇(参见，例如，us9,295,729)的离去基团的1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮，甲基磺酰基苯并噻唑，甲基磺酰基苯基四唑，甲基磺酰基苯基恶二唑(参见toda等人，angew.chem.int.ed.engl.,52(2013)12592-6)和5-硝基-吡啶-2-基-二硫化物(…-l-s-s-(5-硝基-吡啶-2-基)。
在特定的实施方案中，一侧与连接体连接并且可以直接或间接与靶结合部分中存在的位置或官能团连接的所述位置或官能团，是可以与存在于一个靶结合部分中或两个靶结合部分中的两个硫醇基团反应的部分。在特定的实施方案中，硫醇反应性基团是在3和4位具有两个离去基团的马来酰亚胺，特别地选自3,4-二溴马来酰亚胺、3,4-双(芳硫基)-马来酰亚胺，特别是3,4-二苯硫基-马来酰亚胺和3,4-双(杂芳硫基)-马来酰亚胺，特别是3,4-双(2-吡啶基-硫烷基)-马来酰亚胺，和。在特别的其他实施方案中，硫醇反应性基团是在4和5位具有两个离去基团的1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮，特别地选自4,5-溴-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮、4,5-双(芳硫基)-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮，特别是4,5-二苯硫基-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮，和4,5-双(杂芳硫基)-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮，特别是4,5-双(2-吡啶基-硫烷基)-1,2-二氢哒嗪-3,6-二酮。
在特定实施方案中，可以直接或间接与靶结合部分中存在的位置或官能团连接的位置或官能团不是乙炔基，或更一般地，不是炔基，或者不是可以在1,3-偶极环加成反应(点击化学反应)中与1,3偶极子反应的基团。
在另一方面，本发明涉及本发明的鹅膏毒素，特别是选自γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)和γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)的鹅膏毒素，或者涉及本发明的鹅膏毒素与靶结合部分的轭合物，其用作药物的用途。
在另一方面，本发明涉及本发明的鹅膏毒素，特别是选自γ-三羟鹅膏毒肽酰胺(1；x＝0、1或2)、γ-三羟鹅膏毒肽酰胺酸(2；x＝0、1或2)和γ-三羟鹅膏毒肽酰胺异羟肟酸(3；x＝0、1或2)的鹅膏毒素，或者本发明的鹅膏毒素与靶结合部分的轭合物，其用于治疗患者的癌症，特别地其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、胰腺癌、胆管癌、结直肠癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肾癌、恶性黑色素瘤、白血病和恶性淋巴瘤。
如本文所用的，疾病或病症的“治疗(treat、treating、treatment)”指完成下列中的一项或多项：(a)降低病症的严重度；(b)限制或预防所治疗的一种或多种病症的特征症状的发展；(c)抑制所治疗的一种或多种病症的特征症状的恶化；(d)限制或预防之前曾患有一种或多种病症的患者的一种或多种病症的复发；和(e)限制或预防之前曾具有一种或多种病症的症状的患者中症状的复发。
如本文所用的，治疗可包括向患者施用根据本发明的轭合物或药物组合物，其中“施用”包括体内施用以及直接离体施用于组织，例如静脉移植。
在特定的实施方案中，使用治疗有效量的本发明的轭合物。
“治疗有效量”是足以达到预期目的的治疗剂的量。给定的治疗剂的有效量会随着诸如所述剂的性质、施用途径、接受所述治疗剂的动物的大小和物种以及施用目的等因素而变化。每个个体案例的有效量可由本领域技术人员根据本领域中已经确立的方法凭经验来确定。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的鹅膏毒素，或本发明的鹅膏毒素与靶结合部分的轭合物，其还包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、吸附剂和/或防腐剂。
“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理结构批准或列在美国药典或其他公认的药典中用于动物并且更具体地在人中使用的。
在特定的实施方案中，药物组合物以全身施用的药物的形式使用。这包括胃肠外的，其尤其包括注射剂和输注剂。注射剂可配制为安瓶的形式或所谓的随时可用的(ready-for-use)注射剂(例如随时可用的注射器或一次用注射器)以及除此之外配制在用于多次回收的可穿刺烧瓶(puncturableflask)中。注射剂的施用可以是皮下注射(s.c.)、肌肉注射(i.m.)、静脉注射(i.v.)或皮内注射(i.c.)的形式。特别是，将各自适合的注射制剂生产为晶体悬浮液、溶液、纳米颗粒或胶体分散系统例如水溶胶是可能的。
注射制剂还可被生产为浓缩物，其可用水性等张稀释剂溶解或分散。也可以等张溶液、脂肪乳液、脂质体制剂和微乳液的形式制备输注剂。与注射剂相似，输注制剂也可以用于稀释的浓缩物的形式制备。可注射制剂还可以以恒定输注的形式应用于住院病人和流动治疗中，例如通过微型泵。
可以向胃肠外药物制剂中加入例如白蛋白、血浆、膨胀剂(expander)、表面活性物质、有机稀释剂、影响ph值的物质、络合物质或聚合物质，特别是影响本发明的靶结合部分毒素轭合物对蛋白或聚合物的吸附的物质，或者它们也可以为了减少本发明的靶结合部分毒素轭合物对材料像注射工具或封装材料(例如塑料或者玻璃)的吸附而加入。
包含靶结合部分的本发明的鹅膏毒素可在胃肠外制剂中与微载体或纳米颗粒结合，像例如与基于聚(甲基)丙烯酸酯、聚乳酸酯、聚乙醇酸酯、聚氨基酸或聚醚型聚氨酯的精细分散的颗粒结合。胃肠外制剂还可以被改造为贮库制剂(depotpreparation)，例如基于“多个单位原则(multipleunitprinciple)”(如果本发明的靶结合部分毒素轭合物在药物中被分别以精细分散的、分散的或悬浮的形式或作为晶体的悬浮液引入)或者基于“单个单位原则(singleunitprinciple)”(如果本发明的靶结合部分毒素轭合物被包封在制剂中，例如在随后被植入的片剂或棒(rod)中)。这些单个单位和多个单位制剂形式的植入物或贮库药物经常由所谓的生物可降解的聚合物像例如乳酸和乙醇酸的聚酯、聚醚型聚氨酯、聚氨基酸、聚(甲基)丙烯酸酯或多糖组成。
在配制为胃肠外制剂的本发明的药物组合物生产期间加入的佐剂和载体优选为无菌水(经灭菌的水)，影响ph值的物质像例如有机或无机酸或碱以及其盐，调节ph值的缓冲物质，用于等张化的物质像例如氯化钠、碳酸氢钠、葡萄糖和果糖，表面活性剂(tenside)和表面活性剂(surfactant)，以及乳化剂像例如聚氧乙烯山梨糖醇的脂肪酸偏酯(例如
当在优选的实施方案中将本发明的药物组合物配制为悬浮液时，加入防止本发明的靶结合部分毒素轭合物沉积的增稠剂或确保沉积物重悬性的表面活性剂和聚电解质和/或络合物形成剂像例如edta。也可获得活性成分与多种聚合物的络合物。这样的聚合物的实例是聚乙二醇、聚苯乙烯、羧甲基纤维素、
实施例
在下文中，通过非限制性实例更加详细地解释了本发明：
1.(2s,3r,4s)-2-((((9h-芴-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-乙酰氧基-3-甲基戊酸苄基酯hdp30.1485的合成
1.1(2s,3r,4s)-4-乙酰氧基-3-甲基-戊酸复合物hdp30.1409的合成
步骤1.1.1：
在氩气下，将4.47g(18.3mmol)9-硼双环[3.3.1]壬烷(9-bbn)二聚体加入到120ml无水甲醇中。将混合物加热回流30分钟，直至9-bbn完全溶解。将澄清溶液冷却至50℃，并加入4.86g(33.0mmol)(2s,3r,4s)-2-氨基-4-羟基-3-甲基-戊酸。将所得悬浮液再加热3小时，在此期间气体逸出停止，悬浮液变成澄清的均匀溶液。将甲醇溶液在冰浴中冷却，滤出结晶产物，得到5.65g色谱纯的(硅胶；正己烷/乙酸乙酯/甲醇(10/10/1)，茚三酮)氨基酸-硼复合物。将滤液蒸发至干，剩余的残余物在硅胶上用正己烷至正己烷/乙酸乙酯/甲醇(10/10/1)的梯度纯化，得到另外量的1.73g氨基酸-硼复合物。总产量为7.38g(收率84％)。
ms(esi+)实测：268.09[mh]+；计算：267.20(c14h26bno3)
步骤1.1.2：
将该复合物溶于360ml无水thf和吡啶(7.38ml(91.3mmol)的混合物中。室温下，加入1.85ml(25.9mmol)乙酰氯。搅拌4小时后，加入吡啶(7.38ml(91.3mmol))和乙酰氯(1.85ml(25.9mmol))。继续搅拌4小时，过滤反应混合物，蒸发至干。将残留物在硅胶上用正己烷至乙酸乙酯的梯度通过快速色谱纯化，得到4.34g(59％)o-乙酰基硼复合物hdp30.1409的白色结晶块。ms(esi+)实测：310.07[mh]+；计算：309.21(c16h28bno4)
ms(esi+)实测：332.13[m+na]+；计算：332.21(c16h28bnnao4)
1hnmr(500mhz,甲醇-d4)δ5.08(dq,j＝9.6,6.2hz,1h),3.85(d,j＝2.8hz,1h),2.30(dqd,j＝9.8,7.0,2.7hz,1h),2.02(s,3h),1.95–1.70(m,8h),1.65(dt,j＝19.0,7.4hz,2h),1.49–1.40(m,2h),1.27(d,j＝6.2hz,3h),1.07(d,j＝7.1hz,3h),0.53(s,2h).
13cnmr(126mhz,甲醇-d4)δ175.83,172.02,72.88,57.55,49.51,40.79,32.76,32.55,32.25,31.93,25.52,25.22,21.15,18.61,13.02.
1.2(2s,3r,4s)-2-((((9h-芴-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-乙酰氧基-3-甲基戊酸酯hdp30.1427的合成
将4.14g(13.4mmol)hdp30.1409悬浮在35ml甲醇中。加入210ml氯仿，将澄清溶液在23℃下搅拌24小时。真空蒸发氯仿和甲醇，将残余物再溶于新制备的甲醇/氯仿(35ml/210ml)混合物中。将溶液加热至50℃保持6小时并蒸发至干。剩余的残余物用700ml乙醚处理并搅拌60分钟。滤出所得悬浮液，并将白色固体真空干燥。将固体重悬于90ml1,4-二恶烷和65ml丙酮中。加入60ml0.8mnahco3水溶液。立刻用5.24g(15.5mmol)n-(芴基-9-甲氧基羰基氧基)-琥珀酰亚胺(fmocosu)处理两相混合物。
将混合物在氩气下在室温下搅拌17小时，并用5％柠檬酸酸化。将水相用乙醚萃取3次。将合并的醚相用水洗涤3次并用硫酸钠干燥。粗品酸通过硅胶色谱用含有1％乙酸的chcl3至含有1％乙酸的chcl3/meoh(40/1)的混合物的梯度纯化。蒸发产物馏分，得到2.48g(收率45％)hdp30.1427，呈白色结晶块。
ms(esi+)实测：412,23[mh]+；计算：411.17(c23h25n6)
1hnmr(500mhz,氯仿-d)δ7.77(d,j＝7.6hz,2h),7.61(t,j＝6.7hz,2h),7.44–7.37(m,2h),7.32(tdd,j＝7.5,2.8,1.2hz,2h),5.54(d,j＝9.3hz,1h),4.93–4.84(m,1h),4.50(dd,j＝9.2,3.1hz,1h),4.44–4.33(m,2h),4.25(t,j＝7.4hz,1h),2.51–2.41(m,1h),2.04(s,3h),1.26(d,j＝6.0,hz3h),1.04(d,j＝7.0hz,3h).
13cnmr(126mhz,cdcl3)δ176.26,171.23,156.48,143.77,143.59,141.24,127.70,127.06,125.12,71.22,67.36,55.93,47.04,41.21,21.11,18.43,14.27.
1.3化合物6((2s,3r,4s)-2-((((9h-芴-基)甲氧基)羰基)-氨基)-4-乙酰氧基-3-甲基戊酸苄基酯(hdp30.1485))的合成
用225ml0.03m苯基重氮甲烷的甲苯溶液处理2.47g(6.00mmol)hdp30.1427在120ml无水甲醇中的溶液1小时。苯基重氮甲烷溶液根据zhou等人，j.am.chem.soc.,131(2009)11734-11743制备。在n2释放停止后，将反应混合物在氩气下再搅拌一小时。通过tlc(sio2，正己烷/乙酸乙酯(1/1))监测反应进程，并在完成后蒸发至干。残余物通过硅胶色谱用正己烷至乙酸乙酯的梯度纯化。合并纯馏分并蒸发至hdp30.1485的白色固体。
产量:2.41g(80％)
ms(esi+)实测：524.43[m+na]+；计算：524.22(c30h31nano6)
1hnmr(500mhz,氯仿-d)δ7.76(d,j＝7.5hz,2h),7.61(t,j＝7.3hz,2h),7.44–7.27(m,9h),5.53(d,j＝9.3hz,1h),5.18(s,2h),4.92–4.82(m,1h),4.50(dd,j＝9.3,3.4hz,1h),4.37(qd,j＝10.6,7.4hz,2h),4.24(t,j＝7.4hz,1h),2.44(ddt,j＝13.5,10.0,5.0hz,1h),1.98(s,3h),1.23(d,j＝6.2hz,3h),0.99(d,j＝7.0hz,3h).
13cnmr(126mhz,cdcl3)δ171.56,170.84,156.49,143.88,143.66,141.22,135.18,128.64,128.24,127.65,127.05,125.16,119.91,76.71,70.99,67.30,67.14,56.18,47.08,41.19,21.05,18.28,14.22.
2.hdp30.0287的合成
2.1hdp30.0081(trnh-gly-ile-ome)的合成
将1.59g(5.00mmol)n-三苯甲基甘氨酸和0.91g(5.00mmol)l-异亮氨酸-甲酯盐酸盐悬浮在25ml无水二氯甲烷中，并用0.87ml(5.00mmol)n-乙基-二异丙胺(dipea)处理。将0.77g(5.00mmol)n-羟基苯并三唑水合物(hobtxh2o)加入到澄清溶液中。用氩气冲洗反应混合物。然后在室温下加入5.00ml1m的二环己基碳二亚胺(dcc)的二氯甲烷溶液。几分钟后，澄清溶液变得混浊。将反应混合物在氩气下在室温下搅拌20小时。滤出结晶的不溶性二环己基脲并用二氯甲烷洗涤。在旋转蒸发器上蒸发二氯甲烷相，将半固体残余物溶于25ml乙酸乙酯中。滤出不溶的另外的二环己基脲，蒸发乙酸乙酯溶液，得到黄色油状物，将其在硅胶柱上用chcl3至chcl3/meoh(40/1)的梯度纯化。真空蒸发馏分，得到2.07g(93％)hdp30.0081，呈白色泡沫状。
ms(esi+)实测：445.43[mh]+；计算：444.24(c28h32n2o3)
2.2hdp30.0083(trnh-gly-ile-oh)的合成
用26ml2m的lioh水溶液处理5.40g(12.15mmol)trnh-gly-ile-ome在50ml甲醇中的溶液。将所得悬浮液在环境温度和氩气下搅拌20小时。最后，将澄清溶液蒸发至干。将剩余的残余物分配在100mlchcl3和100ml5％柠檬酸水溶液的混合物之间。用水和盐水洗涤chcl3相，用mgso4干燥。蒸发溶剂后，获得纯的hdp30.0083，呈无色油状物，其在真空中固化成白色泡沫(3.50g，67％)。
ms(esi+)实测：431,48[mh]+；计算：430.23(c27h30n2o3)
2.3hdp30.0084(trnh-gly-ile-gly-ome)的合成
将7.20g(16.70mmol)hdp30.0083trnh-gly-ile-oh和2.10g(16.70mmol)甘氨酸甲酯盐酸盐悬浮在125ml无水二氯甲烷中。加入2.85ml(16.70mmol)n-乙基-二异丙胺(dipea)后，加入2.57g(16.70mmol)n-羟基苯并三唑水合物(hobtxh2o)并用氩气冲洗反应混合物。在室温下加入3.46g(16.70mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)，并将反应混合物在室温和氩气下搅拌24小时。滤出不溶的二环己基脲并用二氯甲烷洗涤。在旋转蒸发器上蒸发二氯甲烷相，将粗残余物(12.43g)溶于30ml氯仿中。滤出不溶的二环己基脲，并在硅胶柱上用chcl3至chcl3/meoh(40/1)的梯度纯化氯仿溶液。真空蒸发产物馏分，得到3.55g(42％)的白色固体。
ms(esi+)实测：501.29[mh]+；计算：501.26(c30h35n3o4)
ms(esi+)实测：524.33[m+na]+；计算：524.26(c30h35n3nao4)
2.4hdp30.0089(h2n-gly-ile-gly-ome)的合成
将2.03g(4.05mmol)hdp30.0084trnh-gly-ile-gly-ome溶于110ml无水二氯甲烷中。加入三氟乙酸(1.50ml)，将黄色溶液在室温和氩气下搅拌4小时。将胶凝反应混合物用50ml甲醇处理并再搅拌1小时。将无色澄清溶液蒸发至干，将剩余残余物用100ml乙醚搅拌过夜。滤出白色固体并真空干燥。
1.40g(71％)h2n-gly-ile-gly-omextfa的白色固体
ms(esi+)实测：260.23[mh]+；计算：259.15(c11h21n3o4)
2.5hdp30.0263(bochpi-gly-ile-gly-ome)的合成
在环境温度下，向2.27g(5.33mmol)bochpi(1-boc-l-3a-羟基-1,2,3,3a,8,8a-六氢吡咯并[2,3-b]-吲哚-2-羧酸(droste,h.,wieland,t.,liebigsannalenderchemie11(1987)901-10；和savige,w.e.,aust.j.chem.1975,2275-2287))在50ml无水二甲基甲酰胺中的溶液中，加入1.96g(5.26mmol)h2n-gly-ile-gly-ome(hdp30.0089)、1.83ml(10.49mmol)n-乙基-二异丙胺(dipea)和2.74g(5.27mmol)pybop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷鎓)。将反应混合物在室温和氩气氛下搅拌14小时，用150ml氯仿稀释。有机溶液用5％柠檬酸(1x)、饱和nahco3溶液(1x)和水(3x)萃取，用mgso4干燥，过滤并蒸发至干。固体残余物在硅胶柱上纯化，以chcl3至chcl3/meoh(10/1)的梯度为洗脱液。得到hdp30.0263，呈白色固体。产量：1.79g(60％)。ms(esi+)实测：562.34[mh]+；计算：561.28(c27h39n5o8)
ms(esi+)实测：584.41[m+na]+；计算：584.28(c27h39n5nao8)
2.6hdp30.0287(bochpi-gly-ile-gly-oh)的合成
用550μl的2mlioh水溶液处理280.5mg(0.50mmol)bochpi-gly-ile-gly-ome(hdp30.0263)在7.5ml无水甲醇中的溶液。将反应混合物在环境温度和氩气下搅拌3小时。完成后，用500μl乙酸(tlc(sio2)：chcl3/meoh/1％acoh)淬灭反应并蒸发至干。将残余物在硅胶用含有1％acoh的chcl3至含有1％acoh的chcl3/meoh(9/1)的梯度纯化。产量：225mg(82％)。
s(esi+)实测：548.10[mh]+；计算：547.26(c26h37n5o6)
ms(esi+)实测：570.30[m+na]+；计算：570.26(c26h37n5nao6)
ms(esi+)实测：1095.10[2m+h]+
3.γ-三羟鹅膏毒肽酰胺hdp30.1790的合成
3.1hdp30.1788的合成
将2000mg(4.88mmol)fmocn-hyp(otbu)oh溶于35ml无水乙酸乙酯中，并用溶于5ml乙酸乙酯的904mg(4.91mmol)五氟苯酚和溶于5ml乙酸乙酯的1112mg(5.39mmol)二环己基碳二亚胺(dcc)处理。在室温下和氩气下搅拌20小时后，滤出沉淀的尿素并用乙酸乙酯洗涤。蒸发有机溶剂，剩余的高粘度无色油状物在高真空下干燥。产量：2.45g(87％)。足够纯的产物无需进一步纯化即可用于下一步骤。
ms(esi+)实测：576.23[mh]+；计算：575.17(c30h26f5no5)
3.2hdp30.1502的合成
路线a
将815.0mg(1.63mmol)hdp30.1485溶于35ml无水二甲基甲酰胺中。加入473μl(4.55mmol)二乙胺后，将反应混合物在室温和氩气下搅拌2.5小时。用旋转蒸发器在35℃和40mmhg下真空除去过量的二乙胺(在真空中放置1小时)。然后用1870.0mg(3.25mmol)hdp30.1788fmocn-pro(otbu)-o5fph和283.0μl(1.63mmol)n-乙基-二异丙胺(dipea)处理二甲基甲酰胺溶液。将反应混合物在氩气下搅拌。19小时后，将溶液用氯仿稀释，并用5％柠檬酸(1x)和水(3x)洗涤。用硫酸钠干燥后，蒸发挥发物，将残余物在硅胶上用正己烷至乙酸乙酯的线性梯度纯化。收集产物馏分，蒸发溶剂，得到白色固体。产量：83.0mg(8％)。
路线b(ueki等人，chem.lett.1993,721-724)：
向溶于24ml无水二甲基甲酰胺中的2.41g(4.80mmol)hdp30.1485中，加入8.31ml(47.87mmol，10.0当量)1-辛硫醇和3.03g(11.59mmol，2.4当量)四丁基氟化铵水合物。超声处理1分钟后，立即加入6.6g(28.8mmol)双-(1-甲基-1h-四唑-5-基)二硫化物。将黄色溶液超声处理3分钟，并用3.01ml(17.28mmol)n-乙基二异丙胺(dipea)和溶于24ml无水二甲基甲酰胺的3.21g(5.59mmol)hdp30.1788处理。在环境温度和氩气下搅拌30分钟后，将反应混合物用50ml5％nahco3水溶液稀释。用乙酸乙酯萃取混合物，有机相用水洗涤3次。用硫酸钠干燥后，蒸发有机溶剂，剩余的黄色油状物在高真空下干燥。产量：12.1g。将粗物质在硅胶上用正己烷至乙酸乙酯的线性梯度纯化。收集产物馏分，蒸发溶剂，得到白色固体。产量1.50g(49％)。
ms(esi+)实测：671.31[mh]+；计算：670.33(c39h46n2o8)
ms(esi+)实测：693.50[m+na]+；计算：693.33(c39h46n2nao8)
3.3hdp30.1170(fmocnh-cys(str)-asn(nhtr)-oh)的合成
向2085mg(5.57mmol)h2n-asn(nhtr)oh在75ml无水二甲基甲酰胺中的溶液中，加入3798mg(5.56mmol)fmocnh-cys(str)onhs和3000μln,n-乙基-二异丙胺(dipea)。将反应混合物在室温和氩气下搅拌。22小时后，将混合物用氯仿稀释，并用5％柠檬酸水溶液(1x)和水(3x)萃取。将有机溶剂用mgso4干燥并蒸发。固体残余物通过柱色谱纯化，使用含有1％acoh的chcl3至含有acoh的chcl3/meoh(40/1)的梯度作为洗脱液。收集产物的纯馏分并蒸发至干，得到3010mg(53％)白色晶体。
ms(esi+)[m+na]+实测：964.21；计算：964.34(c60h51n3nao6s)
ms(esi+)[2m+h]+实测：1882.43；计算：1883.71(c120h103n6o12s2)
ms(esi+)[2m+na]+实测：1904.79；计算：1905.69(c120h102n6nao12s2)
3.4hdp30.1668的合成
将213.0mg(0.32mmol)hdp30.1502溶于11ml无水二甲基甲酰胺中。加入93.0μl(0.89mmol)二乙胺后，将反应混合物在氩气下搅拌5小时。用旋转蒸发器在35℃和35mmhg下真空除去过量的二乙胺(在真空中放置1小时)。二甲基甲酰胺溶液用299.1mg(0.32mmol)hdp30.1170fmocnh-cys(str)-asn(nhtr)-oh、165.4(0.32mmol)pybop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷鎓)和55.3μl(0.32mmol)n-乙基-二异丙胺(dipea)处理。将反应混合物在氩气下搅拌17小时，然后用氯仿稀释。用5％柠檬酸(1x)和水(3x)洗涤有机溶剂。用硫酸钠干燥后，蒸发挥发物，残余物在硅胶柱上用正己烷至乙酸乙酯的梯度纯化。收集产物馏分并蒸发至白色固体。产量：249mg(57％)hdp30.1668。
ms(esi+)实测：1372.15[mh]+；计算：1371.60(c84h85n5o11s)
ms(esi+)实测：1394.73[m+na]+；计算：1394.60(c84h85n5nao11s)
3.5hdp30.1606的合成
将248.0mg(0.18mmol)hdp30.1668溶于8ml无水二甲基甲酰胺中。加入52.6μl(0.51mmol)二乙胺后，将反应混合物在室温和氩气下搅拌4.5小时。用旋转蒸发器在37℃和37mmhg下真空除去过量的二乙胺(真空放置1小时)。然后用98.9mg(0.18mmol)hdp30.0287bochpi-gly-ile-gly-oh、94.1(0.18mmol)pybop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷鎓)和31.5μl(0.18mmol)n-乙基-二异丙胺(dipea)处理二甲基甲酰胺溶液，并在氩气下搅拌17小时。用氯仿稀释dmf溶液，并用5％柠檬酸(1x)和水(3x)洗涤。用硫酸钠干燥后，蒸发挥发物，残余物(398.0mg)在硅胶柱上用chcl3至chcl3/meoh(15/1)的线性梯度纯化。收集产物馏分，蒸发溶剂，得到白色固体(228.2mg(75％))。
ms(esi+)实测：1679.28[mh]+；计算：1678.78(c95h110n10o16s)
ms(esi+)实测：1701.68[m+na]+；计算：1701.78(c95h110n10nao16s)
3.6hdp30.1607的合成
将228.1mg(0.14mmol)hdp30.1606溶于10ml三氟乙酸(tfa)中。将澄清溶液在氩气下搅拌5小时并蒸发至干(旋转蒸发器，35℃)。将残余物用甲醇(3x)蒸发以除去痕量的三氟乙酸。剩余的残余物(254.2mg)通过rp18hplc(lunatm10μ，250x21mm，
ms(esi+)实测：1021.53[mh]+；计算：1020.44(c48h64n10o13s)
ms(esi+)实测：1043.63[m+na]+；计算：1043.44(c48h64n10nao13s)
3.7hdp30.1676的合成
将12.3mg(12.06μmol)hdp30.1676溶于4ml乙醇和0.2ml乙酸的混合物中。加入25mgpd/c(10％)后，向反应烧瓶中充入氢气。在常温常压下进行氢化。4小时后，tlc对照(sio2：chcl3/meoh/h2o(65/25/4))显示脱苄基化完成。滤除催化剂，将反应混合物蒸发至干。粗产物通过rp18hplc(lunatm10μ,250x21mm,
ms(esi+)实测：931.48[mh]+；计算：930.39(c41h58n10o13s)
ms(esi+)实测：953.59[m+na]+；计算：953.39(c41h58n10nao13s)
3.8hdp30.1679的合成
将32.6mg(35.0μmol)seco-肽hdp30.1676溶于36ml无水二甲基甲酰胺(dmf)中，随后在室温和氩气氛下用54.7mg(105.1μmol)pybop(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷鎓)、16.09mg(105.1μmol)n-羟基苯并三唑水合物(hobtxh2o)和36.6μl(210.0μmol)n-乙基-二异丙胺(dipea)处理。将反应混合物在环境温度和氩气下搅拌23小时。在高真空(0.26mmhg，39℃)下除去挥发物，并通过rp18hplc(lunatm10μ,250x21mm,
ms(esi+)实测：913.44[mh]+；计算：912.38(c41h56n10o12s)
ms(esi+)实测：935.58[m+na]+；计算：935.38(c41h56n10nao12s)
3.9hdp30.1790的合成
将11.0mg(12.1mmol)hdp30.1679溶于1800μl7摩尔的氨的无水甲醇溶液中。将反应烧瓶用氩气冲洗，密封并在室温下搅拌48小时。将反应混合物蒸发至干，剩余的残余物(13.9mg)通过rp18hplc(lunatm10μ,250x21mm,
ms(esi+)实测：871.51[mh]+；计算：870.37(c39h54n10o11s)
ms(esi+)实测：893.69[m+na]+；计算：893.37(c39h54n10nao11s)