本发明涉及一种dna聚合酶变体。
背景技术：
dna聚合酶作为用于基因工程的试剂为一种有用的酶，并且已广泛用于核酸扩增方法、dna测序、核酸标记、定点诱变等。另外，已开发出各种适合于pcr方法或全基因组扩增(下文也可称为wga)(其为一种核酸扩增方法)的dna聚合酶，并且可市售得自各公司。
目前已知的dna聚合酶基于其氨基酸序列的相似性分为7个家族(a、b、c、d、e、x和y)。其中，属于a家族(也称为poli型酶)和b家族(也称为α型酶)的dna聚合酶已作为用于基因工程的试剂可市售得到。
属于a家族的酶的实例包括来自栖热水生菌(thermusaquaticus)的poli(其可在下文描述为taq聚合酶)、来自嗜热脂肪土芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)的poli(其可在下文描述为bst聚合酶)和来自嗜热栖热菌(thermusthermophilus)的poli(其可在下文描述为tth聚合酶)。
属于a家族的dna聚合酶的特征包括强dna链延伸活性、许多酶不具有3’→5’外切核酸酶活性(校正活性，下文也描述为3’→5’外切活性)、具有tdt(末端脱氧核苷酸转移酶)活性等。另外，存在具有或不具有链置换活性的酶，并且taq聚合酶不具有链置换活性，但是bst聚合酶的大片段具有该活性。已知tth聚合酶为同样组合具有逆转录活性的dna聚合酶。
链置换活性(下文也描述为sd活性)为复制新dna链的同时自身解离用作模板的双链dna的氢键的活性。链置换dna聚合酶具有一些特征，即聚合酶因其性质而不需要将模板双链dna解离，使得dna合成可在恒温下实施，并且由于dna的二级结构其不太可能抑制合成。
链置换dna聚合酶经常用于等温核酸扩增反应。等温核酸扩增反应包括链置换dna延伸反应(链置换扩增，其可在下文描述为sda，非专利文献1和2)、滚环扩增(其可在下文描述为rca，非专利文献3)、交叉引物等温扩增(crossprimingamplification)(其可在下文描述为cpa，非专利文献4)、环介导的等温扩增(其可在下文描述为lamp，非专利文献5)、ican(等温和嵌合引物起始的核酸扩增，其可在下文描述为ican，专利文献1和2)方法等。
属于b家族来自phi29噬菌体的dna聚合酶(其可在下文描述为φ29聚合酶)具有非常强的链置换活性。该酶已用于按照滚环扩增实施模板dna的复制。可市售得到的产品实例为templiphi和genomiphi(两者由gehealthcare制造)。
为了以高特异性实施等温核酸扩增方法，有必要将引物在高温条件下序列特异性地退火至模板dna。bst聚合酶为具有链置换活性的热稳定dna聚合酶，但是该聚合酶具有约63℃的最佳温度并且在68℃或更高温度下失活。φ29聚合酶具有在20℃-37℃的中温区显示活性并通过在65℃下加热10分钟而失活的特征。因此，这些聚合酶不能用于其中模板dna通过热变性解离的扩增核酸的反应。
作为提供有链置换活性并且缺乏外切活性的热稳定taq聚合酶的变体，sd聚合酶(由bioron制造，wo2014/161712)已可市售得到。然而，使用sd聚合酶的pcr扩增效率与来自嗜热高温球菌(thermococcuslitoralis)的常规ventdna聚合酶或来自激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)的pfu聚合酶相当。
因此，期望一种具有高热稳定性、能够有效复制模板dna的长链且优选地具有强链置换活性的dna聚合酶。
现有技术参考文献
专利文献
专利文献1：日本专利公报第3433929号
专利文献2：日本专利公报第4128074号
非专利文献
非专利文献1：nucleicacidsres.,20(7),1691-6,(1992)
非专利文献2：procnatlacadsciu.s.a.,89(1),392-6,(1992)
非专利文献3：procnatlacadsciu.s.a.,92(10),4641-5,(1995)
非专利文献4：scirep.,2,246,(2012),doi:10.1038/srep00246
非专利文献5：nucleicacidsres.,28(12),e63,(2000)。
技术实现要素：
发明要解决的问题
本发明的一个目的是提供一种具有高热稳定性，优选地具有强链置换活性，并且能够有效复制长链模板dna的dna聚合酶。
解决问题的手段
本发明人比较和分析了属于a家族的dna聚合酶之间的氨基酸序列。结果，本发明人已经阐明，在缺乏5’→3’外切核酸酶活性的dna聚合酶的模板dna结合位点，通过引入氨基酸取代以增加位点的总电荷，可产生具有高链置换活性的dna聚合酶，从而完成了本发明。
具体地说，本发明的第一发明涉及一种具有氨基酸取代以增加属于a家族的dna聚合酶的氨基酸序列中模板dna结合位点处的总电荷且不具有5’→3’外切核酸酶活性的dna聚合酶，或者与该dna聚合酶的氨基酸序列具有95%或更高序列同一性的dna聚合酶。
在本发明的第一发明中，“增加总电荷的氨基酸”包括例如选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丝氨酸和丙氨酸的氨基酸。
在本发明的第一发明中，“dna聚合酶的模板dna结合位点”包括(不旨在将本发明限制于)例如含有对应于序列表的seqidno:1显示的taqdna聚合酶的氨基酸序列的第685-687位氨基酸的氨基酸残基的位点。
在本发明的第一发明中，具有“取代的氨基酸序列”的dna聚合酶为例如具有一个或多个选自以下的取代的dna聚合酶：
(1)用精氨酸或丝氨酸取代对应于taqdna聚合酶的氨基酸序列的第685位脯氨酸的氨基酸，
(2)用精氨酸取代对应于taqdna聚合酶的氨基酸序列的第686位酪氨酸的氨基酸，和
(3)用精氨酸、赖氨酸或丙氨酸取代对应于taqdna聚合酶的氨基酸序列的第687位谷氨酸的氨基酸。具体地说，包括含有序列表的seqidno:40-48中任一个显示的氨基酸序列的dna聚合酶。
在本发明的第一发明中，“属于a家族的dna聚合酶”优选地为热稳定dna聚合酶。
而且，在本发明的第一发明中，“属于a家族的dna聚合酶”可为源自栖热菌属(thermus)细菌的dna聚合酶。
进一步地，在本发明的第一发明中，“属于a家族的dna聚合酶”优选地为与属于a家族的野生型dna聚合酶的氨基酸序列相比具有n-末端区域缺失的dna聚合酶，其包括(但不特别限于)具有n-末端区域缺失的taqdna聚合酶，优选地为从n-末端缺失289个氨基酸残基的taqdna聚合酶，和从n-末端缺失280个氨基酸残基的taqdna聚合酶。在本说明书中，作为属于a家族的dna聚合酶，与属于野生型a家族的dna聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性相关的n-末端区域缺失的dna聚合酶也为优选的实例。
本发明的第二发明涉及一种含有编码本发明第一发明的dna聚合酶的核苷酸序列的核酸。核酸的实例包括(但不特别限于)编码上述第一发明的dna聚合酶的核酸，该核酸含有序列表的seqidno:5-9和20-23中任一个显示的核苷酸序列。优选dna聚合酶具有链置换活性。
本发明的第三发明涉及一种含有本发明第二发明的编码dna聚合酶的核酸的载体。优选dna聚合酶具有链置换活性。
本发明的第四发明涉及一种含有本发明第三发明的载体或本发明第二发明的核酸的转化体。
本发明的第五发明涉及一种用于产生dna聚合酶的方法，其特征在于，培养本发明第四发明的转化体，并从所培养的细胞收获dna聚合酶。优选dna聚合酶具有链置换活性。
本发明的第六发明涉及一种用于产生dna分子的方法，包括将本发明第一发明的dna聚合酶与模板dna一起温育。在本发明的第六发明中，用于产生dna分子的方法可为聚合酶链式反应或等温核酸扩增反应。优选dna聚合酶具有链置换活性。
本发明的第七发明涉及一种含有本发明第一发明的dna聚合酶的试剂盒。优选dna聚合酶具有链置换活性。
发明效果
本发明提供一种具有高热稳定性、能够有效复制模板dna的长链且优选地具有强链置换活性的dna聚合酶。
附图说明
图1为纯化的dna聚合酶的sds-page结果。
图2-1为引物延伸活性的结果。
图2-2为引物延伸活性的结果。
图3为凝胶移位测定(gelshiftassay)的结果。
图4为琼脂糖凝胶电泳的结果。
图5为碱性琼脂糖凝胶电泳的结果。
图6为碱性琼脂糖凝胶电泳的结果。
具体实施方式
在本发明中，术语“链置换活性”指的是用于复制新dna链的同时自身解离用作模板的双链dna的氢键的活性。本发明的优选dna聚合酶具有链置换活性，并且具有例如与已知具有链置换活性的已知dna聚合酶相同水平或更强的链置换活性。
在本发明中，短语“增加总电荷”指的是在给定位点取代之后每个氨基酸残基的总电荷大于在该位点取代之前每个氨基酸残基的总电荷的情况。尽管不旨在将本发明限制于此，但是例如在取代之前具有脯氨酸-酪氨酸-谷氨酸(3个残基)的氨基酸序列的情况下，总电荷为0+0+(-1)=-1。如果该氨基酸序列被精氨酸-精氨酸-精氨酸取代，则总电荷为(+1)+(+1)+(+1)=+3。在该取代中，该位点处的总电荷从-1变为+3，从而称总电荷增加。
细节将在下文给出。
1.本发明的dna聚合酶及编码其的核酸
本发明的第一实施方案涉及一种dna聚合酶，其为具有氨基酸取代以增加属于a家族的dna聚合酶的氨基酸序列中模板dna结合位点处的总电荷且没有5’→3’外切核酸酶活性的dna聚合酶，和与上述dna聚合酶的氨基酸序列具有95%或更高序列同一性且具有相同水平活性的dna聚合酶。优选dna聚合酶具有链置换活性。在这里，本文使用的术语“序列同一性”指的是在假定dna聚合酶的氨基酸序列中除了模板dna结合位点以外的氨基酸序列为100%的情况下的序列同一性，并且所述dna聚合酶与dna聚合酶的氨基酸序列具有优选地为95%或以上，和更优选地为100%的序列同一性。
在本发明第一实施方案的一个优选方面，dna聚合酶可在模板dna结合位点处具有通过氨基酸取代而增加的总电荷，并且可混合存在该位点处在取代之前和之后其电荷没有改变的氨基酸残基和其电荷增加的氨基酸残基。总电荷的增加通过从带负电荷的氨基酸取代成不带电荷的氨基酸或带正电荷的氨基酸以及从不带电荷的氨基酸取代成带正电荷的氨基酸来实现。在本发明中，具有较大数目的电荷增加的氨基酸残基的dna聚合酶优于该数目的不带电荷的氨基酸残基，并且该位点处的所有氨基酸残基电荷增加的dna聚合酶更为优选。例如，该位点处的所有氨基酸残基被带正电荷的碱性氨基酸取代的dna聚合酶，以及进一步地该位点处的所有氨基酸残基被带最高电荷的精氨酸取代的dna聚合酶，在本发明中为优选的。
作为属于a家族的dna聚合酶的模板dna结合位点，与模板dna结合的位点可从聚合酶的构象选择。例如，在序列表的seqidno:1显示的taq聚合酶中，模板dna结合位点可特定为含有对应于聚合酶的氨基酸序列的第685-687位氨基酸的氨基酸残基的位点，但不特别限于此。
在本发明第一实施方案的一个优选方面，取代的氨基酸序列为例如具有一个或多个选自以下的取代，并且优选地具有链置换活性的dna聚合酶：
(1)从对应于野生型taqdna聚合酶的氨基酸序列的第685位脯氨酸的氨基酸取代为精氨酸或丝氨酸，
(2)从对应于野生型taqdna聚合酶的氨基酸序列的第686位酪氨酸的氨基酸取代为精氨酸，和
(3)从对应于野生型taqdna聚合酶的氨基酸序列的第687位谷氨酸的氨基酸取代为精氨酸、赖氨酸或丙氨酸。
本发明的dna聚合酶具有没有5’→3’外切核酸酶活性的特征。许多属于a家族的dna聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活性，但是可通过按照已知方法缺失该活性以用于本发明。例如，已知转导助于5’→3’外切核酸酶活性的氨基酸残基的突变比如取代或缺失，或者缺失对上述活性重要的结构域的方法。
期望本发明的dna聚合酶为具有热稳定性的聚合酶，但不将本发明特别限制于此。热稳定dna聚合酶可用于在高温条件下反应，该条件进而可削弱dna的碱基对键，在包括热变性dna的pcr方法中是有利的自不待言，在等温核酸扩增方法中也是有利的。通过利用属于a家族的嗜热微生物的dna聚合酶产生的本发明dna聚合酶为特别优选的实施方案。本文使用的术语具有热稳定性指的是(但不特别限于)，例如当dna聚合酶在90℃下保持30分钟时残留活性为100%或者当在95℃下保持30分钟时残留活性为75%或更多的性质。
在taqdna聚合酶或源自栖热菌属细菌(例如嗜热栖热菌(thermusthermophilus)、黄栖热菌(thermusflavus)等)的其他热稳定dna聚合酶中，5’→3’外切核酸酶活性结构域位于n-末端区域，使得本发明的dna聚合酶可通过将上述氨基酸取代引入到dna聚合酶的n-末端缺失产物的模板dna结合位点产生。例如，描述在本说明书的实施例中的从n-末端缺失280个氨基酸残基的taqdna聚合酶(klentaq)和从n-末端缺失289个氨基酸残基的taqdna聚合酶(taq大片段)对于本发明为优选的。例如，含有选自序列表的seqidno:40-48的氨基酸序列且优选地具有链置换活性的dna聚合酶被包括作为本发明的dna聚合酶(具体地说为dna聚合酶变体)。具有序列表的seqidno:44显示的氨基酸序列的dna聚合酶作为本发明的dna聚合酶特别优选。进一步地，在本发明的另一个实施方案中，taqdna聚合酶中的第117位谷氨酸残基被丙氨酸残基取代、第119位天冬氨酸残基被丙氨酸残基取代、第142位天冬氨酸残基被丙氨酸残基取代或者进一步地第144位天冬氨酸残基被丙氨酸残基取代的5’→3’外切核酸酶缺失产物可与本发明组合。
在本发明第一实施方案的一个更优选方面，为了增强本发明dna聚合酶的性质，可进一步引入除了上述那些以外的氨基酸取代。例如，日本专利公报第4193997号中描述的突变(增加taq聚合酶的第742位谷氨酸和第743位丙氨酸的电荷总数的突变)可引入到本发明的dna聚合酶中，但不旨在将本发明限制于此。已经公开了日本专利公报第4193997号中描述的dna聚合酶变体被公开具有提高的延伸活性，使得可预计本发明dna聚合酶的延伸活性通过进一步转导突变而进一步增强。
或者，在本发明的第一实施方案中，为了增强dna聚合酶的性质，聚合酶可为与具有某些功能的分子融合的dna聚合酶。上述“具有某些功能的分子”的实例包括对dna具有亲和力的肽或多肽，或者与参与dna合成的蛋白相互作用的肽或多肽。本文使用的短语“与具有某些功能的分子融合的dna聚合酶”可称为“融合多肽”，并且该融合多肽也包括在dna聚合酶中。
pcna(增殖细胞核抗原)为一种形成称为“滑动钳”的环状结构的均聚物，其加速dna合成反应。pcna从酵母到人类为高度保守的，并且在真核细胞中，pcna在细胞分裂、dna复制、修复、细胞周期调控或复制后修饰比如dna甲基化和染色质重塑中起重要作用。pcna与除了dna聚合酶或rfc(复制因子c)以外的各种蛋白形成复合物，并参与dna的修复或复制或者其他基因控制功能。已知在人体中，至少12种蛋白与pcna结合。每种蛋白经pip盒(pcna相互作用蛋白盒)与pcna结合，使得蛋白将被保留在dna链上。
许多属于a家族的dna聚合酶不与pcna相互作用。然而，通过向本发明的dna聚合酶加入pcna结合性肽，可改善dna合成反应中的反应速率或延伸能力。
短语“pcna结合性肽”不受特别限制，只要该肽具有结合pcna的能力。肽的实例包括含有pip盒的肽，其为存在于各种pcna结合性蛋白中的肽。pip盒为存在于与pcna相互作用的蛋白中的氨基酸序列，其用于经pcna将该蛋白保留在dna链上。已知在嗜热细菌中参与dna复制等的蛋白(例如复制因子c大亚基等)具有pip盒。在本发明中，优选的pip盒的实例包括由至少8个氨基酸组成的寡肽，用a1-a2-a3-a4-a5-a6-a7-a8表示，其中a1为谷氨酰胺残基，a2和a3中的每一个为任何氨基酸残基，a4为选自亮氨酸残基、异亮氨酸残基和甲硫氨酸残基的氨基酸残基，a5和a6中的每一个为任何氨基酸残基，a7为苯丙氨酸残基或色氨酸残基，和a8为选自苯丙氨酸残基、色氨酸残基或亮氨酸残基的氨基酸残基。尤其优选的实例包括序列表的seqidno:52显示的包括8个氨基酸qatlfdfl的实例。进一步地，在本发明中，肽可为含有9个氨基酸的寡肽，其中上述8个氨基酸的寡肽在其n-末端侧进一步含有赖氨酸残基。
进一步地，用于本发明的pip盒包括源自嗜热细菌产生的蛋白的那些，但不特别限于此。实例优选地包括源自嗜热细菌的复制因子c大亚基的pip盒，并且更优选地包括源自激烈火球菌的复制因子c大亚基的pip盒。或者，其可为具有与上述那些基本相同的活性水平的功能等同物。
另外，这些pip盒可在本发明的融合多肽内存在多个。融合多肽中含有的pip盒数目的实例包括(但不特别限于)1-6，并且优选地为2-4。这多个pip盒可每个具有彼此不同的氨基酸序列，只要它们发挥其作用。另外，在多个pip盒本身之间，例如可插入其他氨基酸序列，例如后面所述的接头肽。
进一步地，“接头肽”可存在于上述pip盒的c-末端侧。术语构成本发明融合多肽的“接头肽”指的是插入在本发明的融合多肽中融合在一起的多肽之间或肽和多肽之间以避免对其功能或折叠的抑制的肽。接头肽的长度包括(但不特别限于)3-100个氨基酸，优选地为5-50个氨基酸的肽。构成接头肽的氨基酸种类不受特别限制，并且最好避免其本身形成复杂构象的接头，并且广为使用富含具有相对小侧链的氨基酸(例如丝氨酸或甘氨酸)的肽。
在n-末端区域添加上述pip盒的本发明dna聚合酶为优选的，但不旨在将本发明限制于此。当使用在n-末端区域添加上述pip盒的本发明dna聚合酶时，使用含有pcna的液体反应混合物，但不旨在将本发明限制于此。作为上述pcna，可使用已知的pcna或其变体，并且优选地使用热稳定pcna或其变体。实例为(但不特别限于)源自激烈火球菌的pcna或源自极端嗜热古生菌(thermococcuskodakarensis)的pcna等。进一步地，变体pcna也可用于本发明的各种实施方案，包括用于扩增本发明核酸的组合物等。可用于本发明的优选变体pcna的实例为wo2007/004654中描述的变体pcna，具体地说变体pcna具有其中激烈火球菌的pcna的第82位、第84位、第109位、第139位、第143位或第147位氨基酸残基被另一种氨基酸取代的序列。在本发明尤其优选的实施方案中，实例为具有其中第143位氨基酸残基天冬氨酸被精氨酸取代(d143r)的序列的变体pcna。
本发明的第二实施方案为编码本发明第一实施方案的dna聚合酶的核酸。优选地，核酸可为编码含有选自序列表的seqidno:40-48的氨基酸序列的dna聚合酶的核酸。更优选地，核酸为含有选自序列表的seqidno:5-9和20-23的核苷酸序列的核酸。尤其优选地，核酸为含有序列表的seqidno:9显示的核苷酸序列的核酸。优选dna聚合酶具有链置换活性。
编码本发明第一实施方案的dna聚合酶的核酸不受特别限制，只要该核酸为编码可在待使用的宿主中表达并具有dna聚合酶活性的蛋白的密码子，并且可优化密码子以使其可表达或增加其表达水平。优选按照本领域通常使用的方法实施优化。顺便提及，当实施密码子优化时，必要的是不引起编码的氨基酸序列的改变。
本发明第二实施方案的核酸可进一步含有编码亲和标签以促进表达的多肽纯化的核酸。本发明第二实施方案的核酸为例如编码组氨酸(his)标签、谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签、麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、由8个氨基酸残基(trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys)组成的strep(ii)标签等的核酸，但不旨在将本发明限制于此。添加标签的位置可为编码本发明dna聚合酶的核酸的5’-末端侧和/或3’-末端侧之一，并且标签可适当地添加在不会妨碍表达和标签功能的位置。在这里，优选标签为可在表达的融合蛋白的纯化阶段切割的标签。可切割标签为例如含有编码用于切割融合多肽的蛋白酶(比如xa因子、prescission蛋白酶、凝血酶、肠激酶或tev蛋白酶(烟草蚀纹病毒蛋白酶))的识别序列的核酸的标签，但不旨在将本发明限制于此。
本发明的第三实施方案为含有本发明第二实施方案的核酸的载体。用于插入本发明第二实施方案的核酸的载体不受特别限制，只要该载体为本领域通常使用的表达载体。可使用能够在宿主细胞中自我复制的载体或能够掺入到宿主染色体内的载体。作为上述载体，例如可使用质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。作为质粒载体，适合于待使用的宿主的质粒，例如源自大肠杆菌(escherichiacoli)的质粒、源自芽孢杆菌属(bacillus)细菌的质粒和源自酵母的质粒，为本领域技术人员熟知的，并且其中许多为可市售得到的。在本发明中可使用这些已知质粒或其修饰形式。作为噬菌体载体，例如，可使用λ噬菌体(例如charon4a、charon21a、embl3、embl4、λgt10、λgt11、λzap)等，并且作为病毒载体，可使用例如动物病毒比如逆转录病毒或痘苗病毒或昆虫病毒比如杆状病毒(baculovirus)。携带在表达载体上的启动子可依宿主而选择，例如在大肠杆菌中，可使用源自大肠杆菌的启动子、噬菌体等，比如trp启动子、lac启动子、pl启动子或pr启动子或其修饰产物，但不旨在限于上述那些。进一步地，可利用其中组合有源自噬菌体的启动子和rna聚合酶基因的表达系统(例如pet表达系统等)。进一步地，酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞用作宿主的异源蛋白表达系统已被大量构建，并且已可市售得到。在dna聚合酶比如本发明融合多肽的产生中，可使用这些表达系统。
本发明的第四实施方案为含有本发明第三实施方案的载体或本发明第二实施方案的核酸的转化体。用本发明第三实施方案的载体转化的宿主或引入有本发明第二实施方案的核酸的宿主不受特别限制，只要该宿主为本领域通常使用的宿主。作为宿主细胞，可使用原核细胞、酵母、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等中的任一种，只要该宿主能够表达dna聚合酶比如本发明的融合多肽。
当原核细胞用作宿主细胞时，例如属于埃希氏菌属(escherichia)的细菌比如大肠杆菌、属于芽孢杆菌属(bacillus)的细菌比如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、属于假单胞菌属(pseudomonas)的细菌比如恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、属于根瘤菌属(rhizobium)的细菌比如苜蓿根瘤菌(rhizobiummeliloti)可用作宿主细胞。可用于产生异源蛋白的大肠杆菌为本领域技术人员熟知的，并且其中许多可市售得到(例如大肠杆菌bl21、大肠杆菌xl1-blue、大肠杆菌xl2-blue、大肠杆菌dh1、大肠杆菌jm109、大肠杆菌hb101等)。而且，已知芽孢杆菌属细菌的枯草芽孢杆菌mi114、枯草芽孢杆菌207-21等或短芽孢杆菌属(brevibacillus)细菌的千叶短芽孢杆菌(brevibacilluschoshinensis)等作为用于产生异源蛋白的宿主。这些宿主细胞可与合适的表达载体组合，并用于产生dna聚合酶比如本发明的融合多肽。
用于将表达载体引入到宿主中的方法不受特别限制，只要该方法能够将核酸引入到宿主中，并且例如可使用利用钙离子的方法、电穿孔法、原生质球法、乙酸锂法等。用于将重组载体引入到昆虫细胞中的方法不受特别限制，只要该方法能够将dna引入到昆虫细胞中，并且例如可使用磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法等。噬菌体载体或病毒载体感染宿主细胞按照视这些载体而定的方法实施，由此可获得表达dna聚合酶(比如本发明的融合多肽)的转化体。
本发明的第五实施方案为一种用于产生dna聚合酶的方法，其特征在于，培养本发明第四实施方案的转化体，并从所培养的细胞收获dna聚合酶。优选dna聚合酶具有链置换活性。培养条件不受特别限制，只要培养条件适合于待使用的表达载体、宿主等。尽管不旨在将本发明限制于此，但例如当用pet载体转化大肠杆菌时，将转化体接种到lb培养基，并使转化体经受例37℃下的振荡培养。在培养液的od达到0.2-0.3的点，向其中加入iptg。为了诱导预期蛋白的表达，使混合物经受例如37℃下的振荡培养2-5小时，或者在37℃表达水平低的情况下，使混合物经受15-30℃下的振荡培养2-24小时，并且优选地在20-25℃下振荡培养4-5小时，或者为了进一步提高表达水平优选地在20-25℃下振荡培养10-20小时。将培养液离心，洗涤得到的细菌细胞，之后使洗涤过的产物经受超声破碎，由此可获得本发明的dna聚合酶。因为破碎物含有大量污染物，因此期望实施本领域中使用的纯化方法，例如包括适当组合硫酸铵沉淀法、阴离子交换柱、阳离子交换柱、凝胶过滤柱、亲和色谱柱、透析等的纯化。
2.使用本发明dna聚合酶扩增核酸的方法
使用本发明dna聚合酶扩增核酸的方法可用于产生dna分子。用于扩增本发明核酸的上述方法的实例为用于产生dna分子的方法，包括将本发明的dna聚合酶与模板dna一起温育，但不旨在将本发明限制于此。在这里，优选dna聚合酶具有链置换活性。该方法可进一步含有引物。引物可为一种或多种成员。另外，引物可为特异性引物、随机引物或其混合物。引物的种类可视目的适当选择。用于产生dna分子的方法可为本领域通常使用的方法。上述用于扩增本发明核酸的方法可用于例如聚合酶链式反应或等温核酸扩增反应，但不旨在将本发明限制于此。
当实施利用本发明dna聚合酶的反应时，制备通常含有二价金属盐(镁盐等)、dntp(脱氧核苷三磷酸)、用于保持ph的缓冲组分等的液体反应混合物。构成二价金属盐的二价金属离子的实例包括镁离子、锰离子和钴离子。适合于每种dna聚合酶及其浓度的二价金属离子在本领域为已知的。二价金属离子可以盐比如氯化物、硫酸盐或乙酸盐的形式提供。本发明组合物中二价金属离子浓度的实例为例如0.5-20mm，但不将本发明特别限制于此。datp、dctp、dgtp和dttp或其衍生物中的至少一种成员用作dntp。优选地使用datp、dctp、dgtp和dttp这4种的混合物。
当使用引物实施dna合成时，使用具有与用作模板的核酸的核苷酸序列互补的序列并在使用的反应条件下与用作模板的核酸杂交的寡核苷酸作为引物。从杂交特异性的观点来看，引物的链长优选地为6个核苷酸或者更多，并且更优选地为10个核苷酸或者更多，和从合成寡核苷酸的观点来看，链长优选地为100个核苷酸或者更少，并且更优选地为30个核苷酸或者更少。上述寡核苷酸可例如通过已知方法化学合成。另外，寡核苷酸可为源自生物样品的寡核苷酸，并且例如寡核苷酸可通过从由天然样品制备的dna的限制性内切核酸酶消化物分离来制备。
本发明的dna聚合酶在双链核酸作为模板的等温条件下的dna合成中特别有用，因为聚合酶具有优良的链置换活性。如以下实施例3中所述，具有长链长度的dna可在微生物基因组dna作为模板的等温条件下合成。具有长链长度的dna可用作用于基因组分析或基因组编辑的dna。
此外，用于扩增本发明核酸的方法可与实时检测技术组合。在实时检测中，与扩增反应同时，使用嵌入剂或荧光标记探针，随着时间的推移检测扩增产物。嵌入剂包括sybr(注册商标)greeni和其他核酸结合染料，并且荧光标记探针包括cycleave(注册商标)探针或分子信标探针等。
3.本发明试剂盒
本发明的试剂盒为一种含有本发明dna聚合酶的试剂盒。在这里，优选dna聚合酶具有链置换活性。除了本发明的dna聚合酶之外，试剂盒可进一步含有用于上述反应的引物、反应需要的试剂比如二价金属盐、dntp、缓冲液或无菌水、用于阳性对照的天然或人工模板dna及作为容器的灭菌管，但不旨在将本发明限制于此。进一步地，含有组合物的试剂盒也包括在本发明中，该组合物只能通过混合本发明的dna聚合酶、二价金属盐、dntp、缓冲组分等并在使用时加入模板dna和水(无菌水等)来使用。
进一步地，本发明的试剂盒可含有嵌入剂或荧光标记探针。嵌入剂包括sybr(注册商标)greeni和其他核酸结合染料，并且荧光标记探针包括cycleave(注册商标)探针或分子信标探针等。
实施例
本发明将通过说明性实施例在下文更具体地描述，但不旨在将本发明的范围限制于这些实施例。
实施例1具有sd活性的taq聚合酶的制备
(1)聚合酶变体质粒的制备
注意到taq聚合酶(genbank编号:aaa27507)的氨基酸序列的p685-e687区域，并制备了以下列出的变体。具体地说，制备了pet24a质粒(由merckmillipore制造)，其中插入了具有序列表的seqidno:4显示的核苷酸序列的taq大片段(从n-末端缺失289个氨基酸残基的taqdna聚合酶，可在下文表示为taqlf)。该质粒称为pet-taqlf质粒。定点突变使用quickchange定点诱变试剂盒(由agilentbiotechnologies制造)基于该质粒引入。
另外，在taq55-taq59变体中，以上述pet-taqlf质粒作为模板dna，用表1中列出的用于诱变的引物组的组合实施定点突变。制备时的pcr条件使得实施14个反应循环，其中一个循环为95℃30秒、55℃60秒和68℃8分钟。在反应终止之后，用1μl液体反应混合物转化大肠杆菌jm109菌株(由takarabioinc.制造)，并将转化体铺展在lb-卡那霉素平板上。从形成的菌落纯化质粒，并且分析核苷酸序列以证实获得了预期序列。
表1
进一步地，基于taq59变体制备了taq62-taq65变体。具体地说，在taq62变体中实施了3次定点突变，用于诱变的seqidno:24和25的组合、seqidno:26和27的组合或seqidno:28和29的组合的引物组列于表2中，实施例1(1)中描述的pet28-taqlf质粒作为模板dna。而且，在taq63-taq65变体中，以与taq62中相同的方式，用表2中列出的用于诱变的引物组实施了定点突变。诱变和纯化与上述程序相同。
表2
(2)变体taq聚合酶的产生和纯化
变体taq聚合酶的产生以下列方式实施。使用实施例1(2)中制备的变体质粒，按照说明书转化大肠杆菌bl21-codonplus-ril菌株(由agilentbiotechnologies制造)。
在该培养液的od600达到0.2-0.3的点，向其中加入iptg(由wakopurechemicalindustries,ltd.制造)以使最终浓度为1mm。使混合物经受在25℃下的振荡培养14小时以诱导预期蛋白基因的表达，并将培养液离心(5000×g,10分钟)以收获细菌细胞。获得的细菌细胞用pbs溶液(150mmnacl,20mmna2hpo4,和2mmnah2po4,ph7.5)洗涤。将细菌细胞悬浮于溶液a[50mmtris-hcl,ph8.0,1mmedta,和1mm苯甲基磺酰氟(pmsf)(由wakopurechemicalindustries,ltd.制造)]中，并通过在冰上超声处理来破碎细菌细胞。将破碎物离心(23700×g,4℃,10分钟)，并将其上清液在80℃下热处理20分钟且离心(23700×g,4℃,10分钟)。向得到的上清液中加入氯化钠以使最终浓度为1m，向该溶液加入5%聚乙烯亚胺溶液(由sigma-aldrich制造)以使最终浓度为0.15%(w/v)，并且之后使得混合物在冰上静置30分钟。将硫酸铵加入到通过离心(23700×g,4℃,10分钟)得到的上清液中以提供80%饱和溶液。离心(23700×g,4℃,10分钟)之后，使沉淀物溶解于溶液b[50mmtris-hcl,ph8.0,和1m(nh4)2so4]中，将溶液施加于用溶液b平衡的疏水柱hitrapbutylff5ml(由gehealthcare制造)，并通过从1m到0m的硫酸铵的浓度梯度洗脱蛋白。使用透析用纤维素管，用溶液c[50mmtris-hcl,ph8.0,和50mmnacl]透析洗脱的流分，将溶液施加于用溶液c平衡的亲和柱hitrapheparinhp1ml(由gehealthcare制造)，并通过从50mm到1m的氯化钠的浓度梯度洗脱蛋白。用溶液c透析洗脱的流分，最后将溶液应用于阴离子交换柱hitrapqhp1ml(由gehealthcare制造)，并通过从50mm到0.5m的氯化钠的浓度梯度洗脱蛋白。使得到的蛋白经受12%sds-page，并按照常规方法实施cbb染色以检查纯度。按照上述方法使taq5-taq59和taq62-65经受蛋白产生和纯化。结果显示在图1中。
如图1所示，证实产生的蛋白显示单一条带并且蛋白被纯化。另外，获得的变体taq55-59和62-65的氨基酸序列以序列表的seqidno:40-48显示。
(3)引物延伸活性
为了测量野生型和变体taqlf的引物延伸活性，其中在5’末端用[γ-32p]atp放射性标记的55nt寡核苷酸(m13-pri55,seqidno:49)退火至2961nt的环状单链dna[pbluescriptiisk(+)(由agilentbiotechnologies制造)]的引物-dna(primed-dna)用作底物dna。
将野生型taqlf或变体taqlf混合在20μl液体反应混合物d[20mmtris-hcl,ph8.8,10mmkcl,3.5mmmgcl2,0.1mg/mlbsa,0.1%tween20,5nm引物-dna和0.25mmdntp]中以使浓度为10nm，并使混合物在72℃下反应2.5分钟或10分钟。将2微升反应终止液[300mmnaoh,6mmedta,18%ficoll400,0.15%溴甲酚绿和0.24%二甲苯蓝]加入到8μl每种反应混合物中以终止反应。将该反应混合物施加于0.8%碱性琼脂糖凝胶，并在碱性溶液[50mmnaoh和1mmedta]中进行电泳。电泳之后，将凝胶干燥，并使干燥的凝胶暴露于成像板(由fujifilm制造)。合成的dna使用typhoontrio+(gehealthcare)检测。野生型和每种变体taq聚合酶的引物延伸活性的结果显示在图2-1和图2-2中。
如图2-1所示，taqlfwt在反应2.5分钟时已为对应于一轮模板的3.2kb，并且在反应10分钟时检测到3.8kb的强条带和6kb位置的弱条带。
另一方面，taq55在反应2.5分钟时延伸至3.4kb。在10分钟时发现直到4.3kb位置的强条带和直到7kb位置的弱条带。
taq56在反应2.5分钟时延伸至4.3kb。在10分钟时发现直到6.5kb位置的强条带和直到9kb位置的弱条带。
taq57在反应2.5分钟时延伸至6.5kb。在10分钟时发现直到10kb或更多的位置的强条带。
taq58在反应2.5分钟时延伸至7.0kb。在10分钟时发现直到10kb或更多的位置的强条带。
taq59在反应2.5分钟时延伸至8.0kb。在10分钟时发现直到10kb或更多的位置的强条带。
taqlfwt的模板dna结合位点的序列为pye，并且其电荷为-1。taq55的电荷为0，taq56的电荷为+1，taq57和taq58的电荷为+2，和taq59的电荷为+3。从这种情况可见，随着电荷变正，延伸活性变得更大，而且sd活性增加。
进一步地，为了增加延伸活性，研究了taq59和taq62-taq65。评估方法与上述方法相同。具体地说，如图2-2所示，对于其中变体taq59的e742位或e742和a743位的氨基酸被带正电荷的那些氨基酸突变的taq62-taq65，发现链置换活性的改善高于taq59。从以上可证实，通过组合对应于taqdna聚合酶的模板dna结合位点的685-687位氨基酸序列的取代和其他位点的氨基酸序列的取代，可改善链置换活性。
实施例2按照凝胶移位法测量与引物-dna的结合能力
使用凝胶移位测定检查变体taq聚合酶和引物-dna的亲和力。测量以下列方式实施。
首先，在5’-末端用32p放射性标记的27nt单链dna(d27,seqidno:50)退火至未标记的49nt单链dna(49n,seqidno:51)的dna用作底物dna，用于测量dna结合能力。将dna聚合酶蛋白加入到含有2nm底物dna的10μl溶液e[20mmtris-hcl,ph8.8,10mmnacl,5mmmgcl2,14mm2-巯基乙醇,0.1mg/mlbsa和5%(v/v)甘油]中，以使浓度为0.6-400nm，并将混合物在40℃下保持5分钟。使液体dna-酶混合物经受1%琼脂糖凝胶，并在0.1×tae溶液[4mmtris碱，2mm乙酸和0.1mmedta]中进行电泳。电泳终止之后，将凝胶干燥，并使干燥的凝胶暴露于成像板。typhoontrio+用于检测标记的dna。
凝胶移位测定的结果如图3所示。
根据先前的结果[frontmicrobiol.,5,461,(2014),doi:10.3389/fmicb.2014.00461]，野生型taq聚合酶和引物-dna的表观解离常数kd值为400nm。
另一方面，对于taq55-taq59变体，在区域中的电荷为+2的taq57和taq58中，taq57没有显示移位条带，但是引物-dna的量因添加400nm蛋白而减少。在taq58中，在25nm蛋白的量出现移位条带，并且表观kd值为100nm。
接下来，在电荷为+3的taq59中，在25nm蛋白处出现清晰的移位条带，并且在400nm处发现两步移位。表观kd值为40nm。
从以上结果可见，在引物延伸活性和凝胶移位之间存在相关性。
实施例3使用taq59聚合酶扩增基因组dna
(1)与已知taqdna聚合酶的比较
使用pfu基因组dna作为模板，用实施例1中制备的taq59实施dna扩增。液体反应混合物的组成为8nmtaq59聚合酶、x1sd缓冲液、0.5mmdntp、10ngpfu基因组dna、10μmpd(n)6和0.25mg/mlbsa。(a)在50℃下实施反应6小时，或(b)以99个反应循环实施反应，其中一个循环为30℃60秒和68℃60秒。而且，具有序列表的seqidno:1显示的氨基酸序列的野生型taqdna聚合酶、具有序列表的seqidno:3显示的氨基酸序列的taqdna聚合酶大片段和具有sd活性的可市售得到的产品sd-聚合酶(由bioron制造)用作对照样品。
将形成的产物用0.7%琼脂糖凝胶分离，并用sybr(注册商标)goldnucleicacidgelstain(由thermofisherscientific制造)染色。结果如图4所示。
如图4(a)和(b)所示，在每种条件下，野生型taqdna聚合酶、taqdna聚合酶大片段和sd聚合酶均不能获得扩增条带，但是本发明的taq59可在被施加的孔和凝胶的边界处获得条带。
接下来，使用碱性琼脂糖凝胶分析形成的产物。
首先，在(a)50℃和(b)70℃的两种延伸温度模式下实施分析。反应在20μl含有32nm聚合酶、20mmtris-hcl(ph8.8)、10mmkcl、3.5mmmgcl2、0.1%tween20、0.5mmdntp、10ngpfu基因组dna、10μmpd(n)6和0.25mg/mlbsa的液体反应混合物中实施60个循环，其中一个循环为40℃10秒、50℃1分钟和50℃或70℃5分钟。使得到的产物经受0.8%碱性琼脂糖凝胶电泳，并用sybr(注册商标)greeniinucleicacidgelstain(由takarabioinc.制造)染色。结果如图5所示。
如图5所示，野生型taqdna聚合酶和taqdna聚合酶大片段在50℃的延伸温度下几乎不显示任何dna扩增，但是发现本发明的taq59在23.1kb标记物和孔之间显示出高分子dna的扩增。
在70℃的延伸温度下，野生型taqdna聚合酶至在至23kb的宽范围内扩增dna。另一方面，taq大片段不扩增dna。对于taq59，在23.1kb标记物和孔之间发现了高分子dna的扩增。如上所述，可见本发明的dna聚合酶具有高热稳定性。进一步地，可见本发明的dna聚合酶甚至可有效复制长链长度为23kb或者更长的dna。
接下来，用1-32nm范围内的taq59浓度实施dna扩增。
反应组成为20mmtris-hcl(ph8.8)、10mmkcl、3.5mmmgcl2、0.1%tween20、0.5mmdntp、10ngpfu基因组dna、10μmpd(n)6和0.25mg/mlbsa。反应在50℃下实施6小时。使形成的产物([0082])经受0.8%碱性琼脂糖凝胶电泳，并用sybr(注册商标)greeniinucleicacidgelstain染色。结果如图6所示。
如图6所示，条带密度在1-8nm的taq59浓度下变得与酶浓度成比例地浓缩，并且条带密度在等于或大于上述范围的密度下保持在给定水平。条带的位置低于孔。
(2)与phi29dna聚合酶的比较
将本发明的taq59与可市售得到的phi29dna聚合酶进行比较。该实验中使用的phi29dna聚合酶由newenglandbiolabs制造(商品名：phi29dna聚合酶)，并且已知具有非常强的链置换活性。
在反应中，使用20μl含有50mmtris-hcl(ph7.5)、10mm(nh4)2so4、10mmmgcl2、4mmdtt、0.5mmdntp、10ngpfu基因组dna、10μmpd(n)6和0.25mg/mlbsa的液体反应混合物。将上述可市售得到的聚合酶以10u的量加入到液体反应混合物中，并且反应在30℃下实施18小时。使形成的产物和[0082]的形成的产物经受0.8%碱性琼脂糖凝胶电泳，并用sybr(注册商标)greeniinucleicacidgelstain染色。结果如图6所示。
如图6所示，用phi29dna聚合酶在23kb标记物和孔之间扩增dna。另一方面，可证实与phi29dna聚合酶相比，本发明的taq59的扩增产物的量大。从这种情况可证实，具有链置换活性的本发明dna聚合酶比phi29dna聚合酶更适合于基因组扩增。如上所述，可见本发明的dna聚合酶具有强链置换活性。
工业实用性
具有链置换活性的本发明dna聚合酶具有高热稳定性，能够有效复制模板dna的长链，并且具有强链置换活性，从而使其可有效复制模板dna的长链。具有链置换活性的dna聚合酶可用于广泛领域，比如基因工程、生物学、医学和农业。
序列表自由文本
seqidno:1：taqdna聚合酶野生型的氨基酸序列
seqidno:2：taqdna聚合酶野生型的核苷酸序列
seqidno:3：taqdna聚合酶大片段的氨基酸序列
seqidno:4：taqdna聚合酶大片段的核苷酸序列
seqidno:5：dna聚合酶变体taq55的核苷酸序列
seqidno:6：dna聚合酶变体taq56的核苷酸序列
seqidno:7：dna聚合酶变体taq57的核苷酸序列
seqidno:8：dna聚合酶变体taq58的核苷酸序列
seqidno:9：dna聚合酶变体taq59的核苷酸序列
seqidno:10：诱变引物taqpya-5
seqidno:11：诱变引物taqpya-3
seqidno:12：诱变引物taqpyk-5
seqidno:13：诱变引物taqpyk-3
seqidno:14：诱变引物taqprk-5
seqidno:15：诱变引物taqprk-3
seqidno:16：诱变引物taqsrk-5
seqidno:17：诱变引物taqsrk-3
seqidno:18：诱变引物taqrrr-5
seqidno:19：诱变引物taqrrr-3
seqidno:20：dna聚合酶变体taq62的核苷酸序列
seqidno:21：dna聚合酶变体taq63的核苷酸序列
seqidno:22：dna聚合酶变体taq64的核苷酸序列
seqidno:23：dna聚合酶变体taq65的核苷酸序列
seqidno:24：诱变引物taqayr-5
seqidno:25：诱变引物taqayr-3
seqidno:26：诱变引物taqrrr-5
seqidno:27：诱变引物taqrrr-3
seqidno:28：诱变引物aa5
seqidno:29：诱变引物aa3
seqidno:30：诱变引物taqayr-5
seqidno:31：诱变引物taqayr-3
seqidno:32：诱变引物taqrrr-5
seqidno:33：诱变引物taqrrr-3
seqidno:34：诱变引物ha5
seqidno:35：诱变引物ha3
seqidno:36：诱变引物hk5
seqidno:37：诱变引物hk3
seqidno:38：诱变引物rr5
seqidno:39：诱变引物rr3
seqidno:40：dna聚合酶变体taq55的氨基酸序列
seqidno:41：dna聚合酶变体taq56的氨基酸序列
seqidno:42：dna聚合酶变体taq57的氨基酸序列
seqidno:43：dna聚合酶变体taq58的氨基酸序列
seqidno:44：dna聚合酶变体taq59的氨基酸序列
seqidno:45：dna聚合酶变体taq62的氨基酸序列
seqidno:46：dna聚合酶变体taq63的氨基酸序列
seqidno:47：dna聚合酶变体taq64的氨基酸序列
seqidno:48：dna聚合酶变体taq65的氨基酸序列
seqidno:49：55nt寡核苷酸m13-pri55
seqidno:50：27nt寡核苷酸d27
seqidno:51：49nt寡核苷酸49n
seqidno:52：激烈火球菌rfc-lpip-盒的氨基酸序列
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<220>
<223>诱变引物taqpya-3
<400>11
gaaggcctgggcctccgcgtaagggatggctagctcctgg40
<210>12
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物taqpyk-5
<400>12
ccaggagctagccatcccttacaaggaggcccaggccttc40
<210>13
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物taqpyk-3
<400>13
gaaggcctgggcctccttgtaagggatggctagctcctgg40
<210>14
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物taqprk-5
<400>14
ccaggagctagccatccctcgcaaggaggcccaggccttc40
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<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物taqprk-3
<400>15
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<213>人工序列
<220>
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<400>16
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>17
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>18
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<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>19
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<210>20
<211>1635
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>dna聚合酶变体taq62的核苷酸序列
<400>20
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cgcctcgaggccgaggtcttccgcctggccggccaccccttcaacctcaactcccgggac600
cagctggaaagggtcctctttgacgagctagggcttcccgccatcggcaagacggagaag660
accggcaagcgctccaccagcgccgccgtcctggaggccctccgcgaggcccaccccatc720
gtggagaagatcctgcagtaccgggagctcaccaagctgaagagcacctacattgacccc780
ttgccggacctcatccaccccaggacgggccgcctccacacccgcttcaaccagacggcc840
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ccgcttgggcagaggatccgccgggccttcatcgccgaggaggggtggctattggtggcc960
ctggactatagccagatagagctcagggtgctggcccacctctccggcgacgagaacctg1020
atccgggtcttccaggaggggcgggacatccacacggagaccgccagctggatgttcggc1080
gtcccccgggaggccgtggaccccctgatgcgccgggcggccaagaccatcaacttcggg1140
gtcctctacggcatgtcggcctaccgcctctcccaggagctagccatccgtcgccgtgag1200
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ttcaacatgcccgtccagggcaccgccgccgacctcatgaagctggctatggtgaagctc1440
ttccccaggctggaggaaatgggggccaggatgctccttcaggtccacgacgagctggtc1500
ctcgaggccccaaaagagagggcggaggccgtggcccggctggccaaggaggtcatggag1560
ggggtgtatcccctggccgtgcccctggaggtggaggtggggataggggaggactggctc1620
tccgccaaggagtga1635
<210>21
<211>1635
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>dna聚合酶变体taq63的核苷酸序列
<400>21
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gggggccgggtccaccgggcccccgagccttataaagccctcagggacctgaaggaggcg180
cgggggcttctcgccaaagacctgagcgttctggccctgagggaaggccttggcctcccg240
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ggggtggcccggcgctacggcggggagtggacggaggaggcgggggagcgggccgccctt360
tccgagaggctcttcgccaacctgtgggggaggcttgagggggaggagaggctcctttgg420
ctttaccgggaggtggagaggcccctttccgctgtcctggcccacatggaggccacgggg480
gtgcgcctggacgtggcctatctcagggccttgtccctggaggtggccgaggagatcgcc540
cgcctcgaggccgaggtcttccgcctggccggccaccccttcaacctcaactcccgggac600
cagctggaaagggtcctctttgacgagctagggcttcccgccatcggcaagacggagaag660
accggcaagcgctccaccagcgccgccgtcctggaggccctccgcgaggcccaccccatc720
gtggagaagatcctgcagtaccgggagctcaccaagctgaagagcacctacattgacccc780
ttgccggacctcatccaccccaggacgggccgcctccacacccgcttcaaccagacggcc840
acggccacgggcaggctaagtagctccgatcccaacctccagaacatccccgtccgcacc900
ccgcttgggcagaggatccgccgggccttcatcgccgaggaggggtggctattggtggcc960
ctggactatagccagatagagctcagggtgctggcccacctctccggcgacgagaacctg1020
atccgggtcttccaggaggggcgggacatccacacggagaccgccagctggatgttcggc1080
gtcccccgggaggccgtggaccccctgatgcgccgggcggccaagaccatcaacttcggg1140
gtcctctacggcatgtcggcctaccgcctctcccaggagctagccatccgtcgccgtgag1200
gcccaggccttcattgagcgctactttcagagcttccccaaggtgcgggcctggattgag1260
aagaccctggaggagggcaggaggcgggggtacgtggagaccctcttcggccgccgccgc1320
tacgtgccagacctagaggcccgggtgaagagcgtgcggcatgcggccgagcgcatggcc1380
ttcaacatgcccgtccagggcaccgccgccgacctcatgaagctggctatggtgaagctc1440
ttccccaggctggaggaaatgggggccaggatgctccttcaggtccacgacgagctggtc1500
ctcgaggccccaaaagagagggcggaggccgtggcccggctggccaaggaggtcatggag1560
ggggtgtatcccctggccgtgcccctggaggtggaggtggggataggggaggactggctc1620
tccgccaaggagtga1635
<210>22
<211>1635
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>dna聚合酶变体taq64的核苷酸序列
<400>22
atgagccccaaggccctggaggaggccccctggcccccgccggaaggggccttcgtgggc60
tttgtgctttcccgcaaggagcccatgtgggccgatcttctggccctggccgccgccagg120
gggggccgggtccaccgggcccccgagccttataaagccctcagggacctgaaggaggcg180
cgggggcttctcgccaaagacctgagcgttctggccctgagggaaggccttggcctcccg240
cccggcgacgaccccatgctcctcgcctacctcctggacccttccaacaccacccccgag300
ggggtggcccggcgctacggcggggagtggacggaggaggcgggggagcgggccgccctt360
tccgagaggctcttcgccaacctgtgggggaggcttgagggggaggagaggctcctttgg420
ctttaccgggaggtggagaggcccctttccgctgtcctggcccacatggaggccacgggg480
gtgcgcctggacgtggcctatctcagggccttgtccctggaggtggccgaggagatcgcc540
cgcctcgaggccgaggtcttccgcctggccggccaccccttcaacctcaactcccgggac600
cagctggaaagggtcctctttgacgagctagggcttcccgccatcggcaagacggagaag660
accggcaagcgctccaccagcgccgccgtcctggaggccctccgcgaggcccaccccatc720
gtggagaagatcctgcagtaccgggagctcaccaagctgaagagcacctacattgacccc780
ttgccggacctcatccaccccaggacgggccgcctccacacccgcttcaaccagacggcc840
acggccacgggcaggctaagtagctccgatcccaacctccagaacatccccgtccgcacc900
ccgcttgggcagaggatccgccgggccttcatcgccgaggaggggtggctattggtggcc960
ctggactatagccagatagagctcagggtgctggcccacctctccggcgacgagaacctg1020
atccgggtcttccaggaggggcgggacatccacacggagaccgccagctggatgttcggc1080
gtcccccgggaggccgtggaccccctgatgcgccgggcggccaagaccatcaacttcggg1140
gtcctctacggcatgtcggcctaccgcctctcccaggagctagccatccgtcgccgtgag1200
gcccaggccttcattgagcgctactttcagagcttccccaaggtgcgggcctggattgag1260
aagaccctggaggagggcaggaggcgggggtacgtggagaccctcttcggccgccgccgc1320
tacgtgccagacctagaggcccgggtgaagagcgtgcggcataaagccgagcgcatggcc1380
ttcaacatgcccgtccagggcaccgccgccgacctcatgaagctggctatggtgaagctc1440
ttccccaggctggaggaaatgggggccaggatgctccttcaggtccacgacgagctggtc1500
ctcgaggccccaaaagagagggcggaggccgtggcccggctggccaaggaggtcatggag1560
ggggtgtatcccctggccgtgcccctggaggtggaggtggggataggggaggactggctc1620
tccgccaaggagtga1635
<210>23
<211>1635
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>dna聚合酶变体taq65的核苷酸序列
<400>23
atgagccccaaggccctggaggaggccccctggcccccgccggaaggggccttcgtgggc60
tttgtgctttcccgcaaggagcccatgtgggccgatcttctggccctggccgccgccagg120
gggggccgggtccaccgggcccccgagccttataaagccctcagggacctgaaggaggcg180
cgggggcttctcgccaaagacctgagcgttctggccctgagggaaggccttggcctcccg240
cccggcgacgaccccatgctcctcgcctacctcctggacccttccaacaccacccccgag300
ggggtggcccggcgctacggcggggagtggacggaggaggcgggggagcgggccgccctt360
tccgagaggctcttcgccaacctgtgggggaggcttgagggggaggagaggctcctttgg420
ctttaccgggaggtggagaggcccctttccgctgtcctggcccacatggaggccacgggg480
gtgcgcctggacgtggcctatctcagggccttgtccctggaggtggccgaggagatcgcc540
cgcctcgaggccgaggtcttccgcctggccggccaccccttcaacctcaactcccgggac600
cagctggaaagggtcctctttgacgagctagggcttcccgccatcggcaagacggagaag660
accggcaagcgctccaccagcgccgccgtcctggaggccctccgcgaggcccaccccatc720
gtggagaagatcctgcagtaccgggagctcaccaagctgaagagcacctacattgacccc780
ttgccggacctcatccaccccaggacgggccgcctccacacccgcttcaaccagacggcc840
acggccacgggcaggctaagtagctccgatcccaacctccagaacatccccgtccgcacc900
ccgcttgggcagaggatccgccgggccttcatcgccgaggaggggtggctattggtggcc960
ctggactatagccagatagagctcagggtgctggcccacctctccggcgacgagaacctg1020
atccgggtcttccaggaggggcgggacatccacacggagaccgccagctggatgttcggc1080
gtcccccgggaggccgtggaccccctgatgcgccgggcggccaagaccatcaacttcggg1140
gtcctctacggcatgtcggcctaccgcctctcccaggagctagccatccgtcgccgtgag1200
gcccaggccttcattgagcgctactttcagagcttccccaaggtgcgggcctggattgag1260
aagaccctggaggagggcaggaggcgggggtacgtggagaccctcttcggccgccgccgc1320
tacgtgccagacctagaggcccgggtgaagagcgtgcggcgccgcgccgagcgcatggcc1380
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tccgccaaggagtga1635
<210>24
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>24
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<210>25
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>25
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<210>26
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>26
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<210>27
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物taqrrr-3
<400>27
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<210>28
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>28
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<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>29
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<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
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<400>30
cctctacggcatgtcggcctaccgcctctcccaggagctagc42
<210>31
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物taqayr-3
<400>31
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<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物taqrrr-5
<400>32
cccaggagctagccatccgtcgccgtgaggcccaggccttcattg45
<210>33
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物taqrrr-3
<400>33
caatgaaggcctgggcctcacggcgacggatggctagctcctggg45
<210>34
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物ha5
<400>34
cgggtgaagagcgtgcggcatgcggccgagcgcatggcc39
<210>35
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物ha3
<400>35
ggccatgcgctcggccgcatgccgcacgctcttcacccg39
<210>36
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物hk5
<400>36
cgggtgaagagcgtgcggcataaagccgagcgcatggcc39
<210>37
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物hk3
<400>37
ggccatgcgctcggctttatgccgcacgctcttcacccg39
<210>38
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物rr5
<400>38
cgggtgaagagcgtgcggcgccgcgccgagcgcatggcc39
<210>39
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>诱变引物rr3
<400>39
ggccatgcgctcggcgcggcgccgcacgctcttcacccg39
<210>40
<211>544
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>dna聚合酶变体taq55的氨基酸序列
<400>40
metserprolysalaleugluglualaprotrpproproproglugly
151015
alaphevalglyphevalleuserarglysglupromettrpalaasp
202530
leuleualaleualaalaalaargglyglyargvalhisargalapro
354045
gluprotyrlysalaleuargaspleulysglualaargglyleuleu
505560
alalysaspleuservalleualaleuarggluglyleuglyleupro
65707580
proglyaspaspprometleuleualatyrleuleuaspproserasn
859095
thrthrprogluglyvalalaargargtyrglyglyglutrpthrglu
100105110
glualaglygluargalaalaleusergluargleuphealaasnleu
115120125
trpglyargleugluglyglugluargleuleutrpleutyrargglu
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valgluargproleuseralavalleualahismetglualathrgly
145150155160
valargleuaspvalalatyrleuargalaleuserleugluvalala
165170175
glugluilealaargleuglualagluvalpheargleualaglyhis
180185190
propheasnleuasnserargaspglnleugluargvalleupheasp
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gluleuglyleuproalaileglylysthrglulysthrglylysarg
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serthrseralaalavalleuglualaleuargglualahisproile
225230235240
valglulysileleuglntyrarggluleuthrlysleulysserthr
245250255
tyrileaspproleuproaspleuilehisproargthrglyargleu
260265270
histhrargpheasnglnthralathralathrglyargleuserser
275280285
seraspproasnleuglnasnileprovalargthrproleuglygln
290295300
argileargargalapheilealaglugluglytrpleuleuvalala
305310315320
leuasptyrserglnilegluleuargvalleualahisleusergly
325330335
aspgluasnleuileargvalpheglngluglyargaspilehisthr
340345350
gluthralasertrpmetpheglyvalproargglualavalasppro
355360365
leumetargargalaalalysthrileasnpheglyvalleutyrgly
370375380
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alaglnalapheilegluargtyrpheglnserpheprolysvalarg
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alatrpileglulysthrleuglugluglyargargargglytyrval
420425430
gluthrleupheglyargargargtyrvalproaspleuglualaarg
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vallysservalargglualaalagluargmetalapheasnmetpro
450455460
valglnglythralaalaaspleumetlysleualametvallysleu
465470475480
pheproargleugluglumetglyalaargmetleuleuglnvalhis
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aspgluleuvalleuglualaprolysgluargalaglualavalala
500505510
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<210>41
<211>544
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>dna聚合酶变体taq56的氨基酸序列
<400>41
metserprolysalaleugluglualaprotrpproproproglugly
151015
alaphevalglyphevalleuserarglysglupromettrpalaasp
202530
leuleualaleualaalaalaargglyglyargvalhisargalapro
354045
gluprotyrlysalaleuargaspleulysglualaargglyleuleu
505560
alalysaspleuservalleualaleuarggluglyleuglyleupro
65707580
proglyaspaspprometleuleualatyrleuleuaspproserasn
859095
thrthrprogluglyvalalaargargtyrglyglyglutrpthrglu
100105110
glualaglygluargalaalaleusergluargleuphealaasnleu
115120125
trpglyargleugluglyglugluargleuleutrpleutyrargglu
130135140
valgluargproleuseralavalleualahismetglualathrgly
145150155160
valargleuaspvalalatyrleuargalaleuserleugluvalala
165170175
glugluilealaargleuglualagluvalpheargleualaglyhis
180185190
propheasnleuasnserargaspglnleugluargvalleupheasp
195200205
gluleuglyleuproalaileglylysthrglulysthrglylysarg
210215220
serthrseralaalavalleuglualaleuargglualahisproile
225230235240
valglulysileleuglntyrarggluleuthrlysleulysserthr
245250255
tyrileaspproleuproaspleuilehisproargthrglyargleu
260265270
histhrargpheasnglnthralathralathrglyargleuserser
275280285
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290295300
argileargargalapheilealaglugluglytrpleuleuvalala
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leuasptyrserglnilegluleuargvalleualahisleusergly
325330335
aspgluasnleuileargvalpheglngluglyargaspilehisthr
340345350
gluthralasertrpmetpheglyvalproargglualavalasppro
355360365
leumetargargalaalalysthrileasnpheglyvalleutyrgly
370375380
metseralahisargleuserglngluleualaileprotyrlysglu
385390395400
alaglnalapheilegluargtyrpheglnserpheprolysvalarg
405410415
alatrpileglulysthrleuglugluglyargargargglytyrval
420425430
gluthrleupheglyargargargtyrvalproaspleuglualaarg
435440445
vallysservalargglualaalagluargmetalapheasnmetpro
450455460
valglnglythralaalaaspleumetlysleualametvallysleu
465470475480
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530535540
<210>49
<211>55
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>55nt寡核苷酸m13-pri55
<400>49
tcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattc55
<210>50
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>27nt寡核苷酸d27
<400>50
agctatgaccatgattacgaattgctt27
<210>51
<211>49
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>49nt寡核苷酸49n
<400>51
agctaccatgcctgcacgaattaagcaattcgtaatcatggtcatagct49
<210>52
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>激烈火球菌rfc-lpip-盒的氨基酸序列
<400>52
lysglnalathrleupheasppheleulyslys
1510