使用声驻波的生物反应器的制作方法

在过去的20年中，生物技术的领域已惊人增长。该增长一直归因于许多因素，其中一些因素包括对生物反应器可获得的设备的改进、对生物系统增加的理解以及对材料(例如单克隆抗体和重组蛋白质)与人体的各种系统的相互作用增加的知识。设备的改进已允许用于生物衍生的材料(例如重组蛋白质)的生产的更大体积和更低成本。这在药剂的领域中尤其普遍，在药剂领域中许多类型的新药物治疗的成功一直直接归因于通过基于蛋白质的制造方法大量生产这些材料的能力。在新的基于生物的药剂的制造过程中利用的关键部件之一是生物反应器以及与其相关联的辅助方法。生物反应器领域中生长的区域一直伴随灌注方法。灌注方法与补料分批方法的不同在于灌注方法更低的资金成本和更高的产出。在补料分批方法中，培养物被接种在生物反应器中。在生长周期期间一定新鲜体积的选定营养物的逐渐添加被用于提高生产率和生长。在收获培养物后回收产物。补料分批生物反应器方法由于其简单性并且还由于来自众所周知的发酵过程的残留物而一直是有吸引力的。然而，补料分批生物反应器具有高启动成本，并且总体上具有较大体积以在生长周期结束时获得成本高效的量的产物。在分批完成后，生物反应器必须被清洁和消毒，导致非生产性停机时间。灌注生物反应器处理馈送到生物反应器中的新鲜介质的连续供应，同时持续地移除抑制生长的副产物。利用灌注生物反应器方法可以减少或消除非生产性停机时间。在灌注培养物中实现的细胞密度(30-100百万个细胞/ml)典型地高于对于补料分批模式中实现的细胞密度(5-25百万个细胞/ml)。然而，灌注生物反应器要求细胞保留装置以防止当副产物正在被移除时培养物的逸出。这些细胞保留系统为灌注过程添加一定程度的复杂性，为了成功的操作要求管理、控制和维护。例如细胞保留设备的故障或失效的操作事项先前一直是伴随灌注生物反应器的一个问题。这在过去已限制灌注生物反应器的吸引力。技术实现要素：在各种实施例中，本公开涉及一种用于产生生物分子(例如重组蛋白质或单克隆抗体)以及用将这些期望产物与生物反应器中的细胞培养物分离的系统。总体上，含有细胞和期望产物的流体介质通过或流过过滤装置。在各种其它实施例中，本公开还涉及一种用于生成细胞的系统。在一些实施例中，这种生成的细胞可用于细胞治疗过程中。在这种实施例中，在生物反应器中的宿主流体中培养和扩增期望细胞(例如，t细胞、b细胞或nk细胞)。然后宿主流体流过过滤装置以捕获一些细胞，而剩余的细胞继续被培养在生物反应器中。在一些实施例中，细胞是用于生物农业技术的植物细胞，例如在植物化学物质或昆虫抗性植物的生产中的细胞。在各种实施例中公开的是一种包括生物反应器和过滤装置的系统。生物反应器包括反应容器、搅拌器、馈送入口以及出口。过滤装置包括：流体地连接到生物反应器出口的入口，用于接收来自生物反应器的流体；流体可通过其流动的流动腔室；以及至少一个超声换能器和与所述至少一个超声换能器相对定位的反射器，所述至少一个超声换能器被驱动以在流动腔室中产生多维驻波。用于生物反应器的过滤或捕获装置还可以由流动腔室组成，该流动腔室带有结合到该流动腔室中的一个或更多超声换能器和反射器。反射器与超声换能器相对设置并且超声换能器被电驱动以在流动腔室中形成多维声驻波。流动腔室可以由刚性材料(例如塑料、玻璃或金属容器)制得。可替代地，流动腔室可以是柔性聚合物袋或囊的形式，其能够从生物反应器出口通过外部过滤装置与生物反应器的回收入口之间的再循环路径被密封和移除。该柔性聚合物袋或囊可位于超声换能器与反射器之间使得可以在柔性聚合物袋或囊内部生成多维声驻波。过滤装置可以进一步包括产物出口，期望产物(例如扩增的细胞、病毒、外来体或植物化学物质)通过该产物出口被回收。过滤装置还可以进一步包括用于将流体送回生物反应器的回收出口。多维驻波可以具有属于相同数量级的轴向力分量和横向力分量。生物反应器可以被操作为灌注生物反应器。套管可以从流动腔室可分离。有时，过滤装置进一步包括位于套管与流动腔室之间的护套，该护套被用于调节流动腔室中流体的温度。护套、套管和流动腔室可以彼此可分离并且是一次性的。在各具体实施例中，超声换能器包括可以以较高阶模式形状振动的压电材料。该压电材料可以具有矩形形状。超声换能器可以包括：具有顶端、底端和内部容积的壳体；以及在壳体底端处具有暴露的外部表面和内部表面的晶体，当被电压信号驱动时该晶体能够振动。在一些实施例中，背衬层接触晶体的内部表面，该背衬层由大致上声学透明的材料制得。该大致上声学透明的材料可以是轻木、软木或泡沫。该大致上声学透明的材料可以具有高达1英寸的厚度。该大致上声学透明的材料可以是格栅的形式。在其它实施例中，晶体的外部表面被具有半波长或更小的厚度的耐磨表面材料覆盖，该耐磨表面材料为聚氨酯、环氧树脂或硅树脂涂层。在又一些其它实施例中，晶体不具有背衬层或耐磨层。超声换能器还可以包括是聚合物(例如聚偏二氟乙烯(pvdf))的压电材料。pvdf可以在高达数百兆赫兹范围的较高频率下被激励使得非常小的粒子可以被声驻波捕获。多维驻波可以是三维驻波。反射器可以具有非平面表面。过滤装置的产物出口可以引导到进一步的处理，例如细胞洗涤、细胞浓缩或细胞分级。当回收的产物是生物细胞(例如t细胞、b细胞和nk细胞)时，可以施加这些处理。在某些实施例中，用于产生病毒或外来体的细胞是中国仓鼠卵巢(cho)细胞、ns0杂交瘤细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞或人类细胞。包括上述细胞类型的哺乳动物细胞培养物的使用已被证明是生产/表达当今药剂所要求的重组蛋白质和单克隆抗体的非常有效的方式。在一些实施例中，细胞是产生次级代谢物和重组蛋白质以及其它植物化学物质的植物细胞。以下更具体地描述这些和其它非限制性特征。附图说明以下是附图的简要描述，附图是出于阐述本文中公开的各示例性实施例的目的而不是出于限制本文中公开的各示例性实施例的目的而呈现的。图1示出由超声换能器和反射器生成的单个驻波声波。图2是比较补料分批生物反应器系统与灌注生物反应器系统的图示。图3是示出生物反应器的各种部件的横截面视图。图4示出本公开的声泳过滤装置的一个实施例，其中套管围绕充当流动腔室的管道并且是一次性的。图5示出本公开的声泳过滤装置的另一个实施例，其示出了围绕流动腔室的护套，以及围绕该护套的套管。该套管容纳用于调节通过流动腔室的流体的温度的流体。图6是示出本公开的系统的示意图，其包括带有声泳分离装置的灌注生物反应器以及回收路径。图7是常规超声换能器的横截面图。图8是常规换能器的耐磨板的图片。图9是本公开的超声换能器的横截面图。该换能器内存在气隙，并且不存在背衬层或耐磨板。图10是本公开的超声换能器的横截面图。该换能器内存在气隙，并且存在背衬层和耐磨板。图11是对于在不同频率下驱动的方形换能器的电阻抗幅度对比频率的图形。图12示出对于图11的峰值幅度中的七个从正交于流体流动的方向看的捕获线配置。图13是声压幅度(右手边刻度，以pa为单位)和换能器平面外位移(左手边刻度，以米为单位)的计算机模拟。左手边刻度顶部处的文字读出“×10-7”。左手边刻度的顶部处带有向上指向的三角形的文字读出“1.473×10-6”。左手边刻度的底部处带有向下指向的三角形的文字读出“1.4612×10-10”。右手边刻度的顶部处的文字读出“×106”。右手边刻度的顶部处带有向上指向的三角形的文字读出“1.1129×106”。右手边刻度的底部处带有向下指向的三角形的文字读出“7.357”。三角形示出该图中描绘的对于给定刻度的最大值和最小值。水平轴线是腔室内沿着x轴的位置，以英寸为单位，并且竖直轴线是腔室内沿着y轴的位置，以英寸为单位。图14示出其中存在复合波的晶体的平面内和平面外位移。图15示出用于进行一些示例分离的声泳分离器的分解视图，其具有一个流动腔室。图16示出具有两个流动腔室的堆叠声泳分离器的分解视图。图17是示出对一个实验使用beckmancoulter细胞存活率分析仪从介质移除细胞的效率的图形。图18是示出对另一个实验使用beckmancoulter细胞存活率分析仪从介质移除细胞的效率的图形。图19是其中过滤装置为柔性袋的形式的实施例的图示。具体实施方式通过参考对所期望的实施例和包括在其中的示例的以下详细描述可以更容易地理解本公开。在以下说明书和随后的权利要求书中，将参考许多术语，这些术语应被限定为具有以下含义。尽管为了清楚起见在以下描述中使用了特定术语，但是这些术语仅旨在表示在附图中为了阐述而选择的实施例的具体结构，而不旨在限定或限制本公开的范围。在下面的附图和以下描述中，应当理解，相似附图标记指的是具有相似功能的部件。除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数个指示物。本文中使用术语“包括”作为要求所称部件的存在并且允许其它部件的存在。术语“包括”应被解释为包括术语“由...组成”，其允许仅所称部件的存在，以及可能由所称部件的制造得到的任何杂质。各数值应被理解为包括当被减少到相同数量的有效数字时相同的那些数值，以及与所声明的值差异少于为了确定值在本申请中描述的类型的常规测量技术的实验误差的数值。本文中公开的所有范围包括所列举的端点并且独立地可组合(例如，“从2克至10克”的范围包括端点2克和10克，以及所有中间值)。本文中公开的范围的端点和任何值不限于精确范围或值；它们足够不精确以包括接近这些范围和/或值的值。结合数量使用的修饰语“约”包括所声明的值并且具有由上下文所指示的含义(例如，其至少包括与具体数量的测量相关联的误差的程度)。当在范围的上下文中使用时，修饰语“约”也应被认为公开由两个端点的绝对值限定的范围。例如，“从约2至约10”的范围也公开“从2至10”的范围。应当注意，本文中使用的许多术语是相对术语。例如，术语“上”和“下”在位置上彼此相对，即在给定定向上上部件位于比下部件高的高度处，但是如果装置被翻转则这些术语可以改变。术语“入口”和“出口”是关于给定结构相对于流过它们的流体，例如，流体流过入口进入结构并流过出口从结构出来。术语“上游”和“下游”是相对于流体流过各种部件的方向，即流动流体在流过下游部件之前通过上游部件。应当注意在循环中，第一部件可以被描述为同时在第二部件的上游和下游。本申请引用“相同数量级”。如果较大数除以较小数的商是至少1且小于10的值，则两个数属于相同数量级。术语“病毒”是指仅可在另一活细胞内复制的感染剂，并且否则以由围绕和容纳dna或rna的衣壳形成的病毒粒子的形式存在，并且在一些情况下是围绕衣壳的脂质包膜(lipidenvelope)。术语“外来体”是指囊泡，其具有围绕含有蛋白质、dna和/或rna的流体的芯部的脂质双层。术语“晶体”是指用作压电材料的单晶或多晶材料。生物反应器对于制备生物分子(例如重组蛋白质或单克隆抗体)是有用的。非常通常地，细胞被培养在带有介质的生物反应器容器中以便生产期望产物，并且然后通过从细胞和介质分离来收获期望产物。包括中国仓鼠卵巢(cho)、ns0杂交瘤细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞和人类细胞的哺乳动物细胞培养物的使用已被证明是生产/表达药剂中使用的重组蛋白质和单克隆抗体的非常有效的方式。存在两种通常类型的生物反应器方法：补料分批和灌注。虽然补料分批反应器当前是规范，但主要由于该方法对许多科学家和技术人员的熟悉度，灌注技术正以非常快的速度增长。许多因素有利于灌注生物反应器方法的使用。对于灌注生物反应器的资金和启动成本更低、要求更小的上游和下游容量，并且该方法使用比补料分批方法更小的体积和更少的接种步骤。灌注生物反应器方法还使其更好开发、扩大规模、优化、参数灵敏度研究和验证。灌注生物反应器技术中的最近发展也有利于其使用。控制技术和一般支持设备正在为灌注生物反应器改进，增加灌注过程的稳健性。灌注方法现在可被扩大到具有高达1000升(l)体积的生物反应器。用于灌注生物反应器的更好的细胞保留系统导致比先前已看到的更低的细胞损失和更大的细胞密度。与约2000万个细胞/ml的补料分批细胞密度相比，现在可实现大于5000万个细胞/ml的细胞密度。较低的污染和感染率已经改进了灌注生物反应器的输出。从而，对于灌注过程已产生了收获中更高的产物浓度和更高的产率而没有成本的显著增加。高细胞浓度生物反应器的使用的一个单独方面是在生物反应器运行结束时材料的“脱水”。间质流体从生物反应器污泥的“脱水”或移除对于提高预期的生物反应器产物的回收的效率是重要的。当前，利用带有内部结构的高能离心机(称为盘堆离心机)以在运行结束时从生物反应器污泥移除间质流体。对于盘堆离心机资金成本和操作成本较高。可以在没有与盘堆离心机相关联的高资金和操作成本的情况下执行的从剩余生物反应器污泥移除间质流体的更简单的方法是期望的。另外，过滤或离心的当前方法可破坏细胞、将蛋白质碎片和酶释放到纯化过程中并对纯化系统的下游部分增加负荷。简而言之，本公开涉及多维(例如，三维(3-d))声驻波(多个多维声驻波)从一个或更多压电换能器的生成，其中所述换能器是电或机械激励的使得它们以“鼓膜(drumhead)”或多激励模式(即，多模式位移样式)而不是“活塞”或单激励模式方式移动。通过声驻波生成的该方式，生成比若在压电换能器以“活塞”模式激励的情况下更高的横向捕获力，在“活塞”模式激励的情况下仅生成一个较大的驻波。从而，利用与压电换能器相同的输入功率，与单个平面声驻波相比，多维(例如，3-d)声驻波(多个多维声驻波)可具有更高的横向捕获力。为了受控流动输入功率可调节。这可用于促进生物反应器的内容物的蛋白性流体纯化。从而，本公开涉及包括生物反应器和过滤装置的处理系统，该过滤装置使用声泳用于各种组分的分离。通过结合多维(例如，3-d)驻波的声泳过滤装置的利用，还可以实现维持通量率并最小化多产物系统中的交叉污染风险。通过多维(例如，3-d)声驻波能力的设施的使用，还可以实现其它益处，例如通常在标准操作程序(sop)内详细说明和验证的清洁程序和相关要求。可以消除生物反应器与外部处理之间的交叉污染风险。声泳是一种从流体分散体中移除粒子的低功率、无压降、无堵塞、固态途径：即，其用于实现更典型地用多孔过滤器执行的分离，但是其没有过滤器的缺点。具体地，本公开提供适合于与生物反应器一起使用并且在宏观尺度下操作用于具有高流动速率的流动系统中的分离的过滤装置。声泳过滤装置被设计为产生高强度多维(例如，三维)超声驻波，该超声驻波导致在某个流动速率下比流体拖曳力与浮力或重力的组合效应大的声学辐射力并且可以克服在某个流动速率下流体拖曳力与浮力或重力的组合效应，并且因此能够捕获悬浮相(即细胞)(即，保持悬浮相静止)以允许更多时间用于声波来增加粒子浓度、集聚和/或聚结。换句话说，声驻波(多个声驻波)的辐射力充当防止或阻止目标粒子(例如，生物细胞)穿过驻波(多个驻波)的过滤器。本系统具有产生超声驻波场的能力，该超声驻波场可以捕获具有从0.1mm/s到超过1cm/s的速度范围内的线速度的流场中的粒子。如上所述，驻波的捕获能力可以根据期望改变，例如通过改变流体的流动速率、声学辐射力和声学过滤装置的形状以通过捕获和沉降使细胞保留最大化。该技术为次级相的分离提供在能量成本的显著降低的情况下绿色和可持续的替代方案。对于小如1微米的粒子大小，已经证明了优异的粒子分离效率。超声驻波可用于捕获宿主流体流(例如细胞培养基)中的次级相粒子(例如细胞)，即，保持宿主流体流中的次级相粒子静止。这是与先前途径的重要区别，在先前途径中，粒子轨迹仅通过声学辐射力的影响而改变。离开粒子的声场的散射导致三维声学辐射力，该三维声学辐射力充当三维捕获场。当粒子相对于波长较小时，声学辐射力与粒子体积(例如半径的立方)成比例。声学辐射力与频率和声学对比度因子成比例。声学辐射力还与声能(例如声压幅度的平方)成比例。对于谐波激励，力的正弦空间变化是将粒子驱动到驻波内的稳定位置的原因。当施加在粒子上的声学辐射力强于流体拖曳力与浮力/重力的组合效应时，粒子被捕获在声驻波场内。声学力(即，横向和轴向声学力)对被捕获粒子的作用通过粒子的浓缩、聚集(clustering)、结块(clumping)、集聚(agglomeration)和/或聚结(coalescence)而导致紧密填积的簇的形成，当达到临界大小时，对于比宿主流体重的粒子通过增强的重力连续地沉降或者对于比宿主流体轻的粒子通过增强的浮力而升出。另外，次级粒子间力(例如bjerkness力)有助于粒子集聚。总体上，3-d驻波(多个3-d驻波)过滤系统在这样的电压下操作：使得产生蛋白质的材料(例如中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)，用于重组蛋白质治疗的工业生产的最常见宿主)被捕获在超声驻波中，即，保持在静止位置中。在每个节点平面内，cho细胞被捕获在声学辐射势能的最小值中。大多数生物细胞类型比它们悬浮在其中的介质呈现更高的密度和更低的可压缩性，使得细胞与介质之间的声学对比因子具有正值。作为结果，轴向声学辐射力(arf)驱动生物细胞朝向驻波压力节点。声学辐射力的轴向分量将具有正对比因子细胞驱动到压力节点平面(pressurenodalplanes)，而具有负对比因子的细胞或其它粒子被驱动到压力反节点平面(pressureanti-nodalplanes)。声学辐射力的径向或横向分量是捕获细胞的力。arf的径向或横向分量大于流体拖曳力与重力的组合效应。对于小细胞或乳浊液，拖曳力fd可被表述为：其中，uf和up是流体和细胞速度，rp是粒子半径，μf和μp是流体和细胞的动态速度，并且是动态速度的比率。浮力fb被表述为：为了确定何时细胞被捕获在超声驻波中，可以假设细胞上的力平衡为零，并且因此可以找到对于横向声学辐射力flrf的表述，该表述由下式给出：flrf＝fd+fb。对于已知大小和材料特性的细胞，以及对于给定流动速率，该等式可用于估计横向声学辐射力的大小。用于计算声学辐射力的一个理论模型是基于由gor'kov开发的公式。主声学辐射力fa被定义为场势能u的函数，其中，场势能u被定义为：并且f1和f2是由以下公式定义的单极和双极贡献因子：其中，p是声压，u是流体粒子速度，λ是细胞密度ρp与流体密度ρf的比率，σ是细胞声速cp与流体声速之比cf的比率，vo是细胞的体积，并且<>表示随着波的周期的时间平均。gor'kov的理论受限于相对于流体和粒子中的声场的波长较小的粒子大小，并且该理论也没有考虑流体和粒子的粘度对辐射力的影响。已经开发了用于对粒子的声学辐射力的计算的另外的理论和数值模型，而对相对于波长的粒子大小没有任何限制。这些模型还包括流体和粒子粘度的影响，并且因此是对声学辐射力更准确计算。所实施的模型基于yuriiilinskii和evgeniazabolotskaya的理论工作，如aip会刊，卷474-1，255-258页(2012)中所描述的。已经开发了另外的内部模型(in-housemodels)来计算对于圆柱形物体(例如驻波中被捕获粒子的“冰球(hockeypucks)”，其接近类似于圆柱体)的声学捕获力。由本公开的超声换能器(多个超声换能器)生成的总声学辐射力(arf)的横向力分量是显著的并且足以克服在高达1cm/s的线速度下的流体拖曳力，并且产生紧密填积的簇，并且与总声学辐射力的轴向力分量属于相同的数量级。从而，该横向arf可用于在生物反应器过程继续的同时将细胞保留在生物反应器中。对于灌注生物反应器尤其真实。使用超声换能器和声泳的本公开的过滤装置还可以改进来自生物反应器分批(即生物反应器污泥)的剩余材料的脱水，并且从而减少盘堆式离心机的使用或消除盘堆式离心机的使用。超声换能器和声泳的该使用或应用简化处理并且降低成本。在灌注生物反应器系统中，期望能够将细胞和细胞碎片从流体流(即细胞培养基)中被表达的材料过滤和分离。被表达的材料由生物分子(例如重组蛋白质或单克隆抗体)组成并且是待被回收的期望产物。声泳过滤装置可以以至少两种不同的方式使用。首先，驻波可用于捕获被表达的生物分子并将该期望产物与细胞、细胞碎片和介质分离。然后可以转移和收集被表达的生物分子用于进一步处理。可替代地，驻波可用于捕获细胞培养基中存在的细胞和细胞碎片。具有正对比因子的细胞和细胞碎片移动到驻波的节点(与反节点相对)。在细胞和细胞碎片在驻波的节点处集聚时，还发生细胞培养基的物理清理(scrubbing)，由此更多细胞在它们与早已被保持在驻波内的细胞接触时被捕获。这大体上将细胞和细胞碎片与细胞培养基分离。当驻波中的细胞集聚到质量不再能够被声波保持的程度时，已经被捕获的集聚的细胞和细胞碎片可以通过重力掉落出流体流，并且可以被分离地收集。为了辅助细胞和细胞碎片的该重力沉降，可以中断驻波以允许所有细胞掉落出正被过滤的流体流。该过程对于脱水可以是有用的。被表达的生物分子可以预先已被移除，或保留在流体流(即细胞培养基)中。理想地，超声换能器(多个超声换能器)在流体中生成多维(例如，三维)驻波，该多维驻波在悬浮的粒子上施加横向力以伴随轴向力从而增加声泳过滤装置的粒子捕获能力。文献中公开的典型结果表明，横向力比轴向力小两个数量级。相反，本申请中公开的技术提供与轴向力属于相同数量级的横向力。在本公开中，灌注生物反应器还可用于生成可随后被用于细胞治疗的细胞。在这种类型的过程中，待用于细胞治疗中的生物细胞被培养在生物反应器中并扩增(即通过细胞繁殖增加生物反应器中细胞的数量)。这些细胞可以是：淋巴细胞，例如t细胞(例如，调节性t细胞(tregs)、jurkatt细胞)、b细胞或nk细胞；它们的前体，例如外周血单核细胞(pbmc)；以及类似细胞。然后将含有一些细胞的细胞培养基(也称为宿主流体)送到产生声驻波的过滤装置。一部分细胞被捕获并保持在声驻波中，同时剩余的宿主流体和宿主流体中的其它细胞被返回到生物反应器。随着被捕获的细胞的数量增加，它们形成更大的簇，所述簇将在临界大小下由于重力而掉落出声驻波。簇可以落入声驻波区域外侧(例如在声驻波下方)的产物出口中，从该产物出口可以回收细胞以用于细胞治疗中。仅有一小部分细胞被捕获并经由产物出口从生物反应器移除，并且剩余物继续在生物反应器中繁殖，允许期望细胞的连续生产和回收。在另一个应用中，声驻波用于捕获和保持生物细胞并分离由生物细胞产生的病毒(例如慢病毒)或外来体。在这些实施例中，生物细胞在分离后返回生物反应器以继续病毒或外来体的产生。在这些应用中，本公开的声学过滤装置可充当细胞保留装置。本文中描述的声学细胞保留系统在一定范围的细胞再循环速率下操作，在一定范围的灌注(或介质移除)速率下有效地保留细胞，并且可被调整以通过流体流动速率、换能器功率或频率操纵完全保留或选择性地通过一些百分比的细胞。功率和流动速率全都可以被监控并用作自动化控制系统中的反馈。感兴趣的细胞也可以通过声驻波使用而被保持在外部过滤装置的流动腔室中使得可以非常接近地并且出于改变目标细胞的目的引入其它部分(moieties)。这样的操作会包括t细胞的捕获以及随后具有特定基因剪接的修饰的慢病毒材料的引入使得具有特定基因剪接的慢病毒将转染t细胞并生成嵌合抗原受体t细胞(也称为car-t细胞)。本公开的声学过滤装置被设计成维持高强度三维声驻波。该装置由函数发生器和放大器(未示出)驱动。装置性能由计算机监控和控制。有时由于声流可能期望调制驻波的频率或电压幅度。该调制可以通过幅度调制和/或通过频率调制来完成。还可利用驻波传播的占空比来实现用于材料的捕获的某些结果。换句话说，可以在不同的频率下打开和关闭声束以实现期望的结果。图1示出单个驻波系统100，其由反射板101和超声换能器103构成，该超声换能器103被设定为谐振以便形成驻波102。由换能器103施加典型地在从几百khz到几十khz的范围内的激励频率。在换能器103与反射器101之间产生一个或更多驻波。驻波是在频率和强度上相等并且在相反方向上行进(即从换能器到反射器并返回)的两个传播波的总和。传播波破坏性地相互干扰并且从而生成驻波。虚线105用于指示幅度。节点是波具有最小幅度的点，并且用附图标记107指示。反节点是波具有最大幅度的点，并且用附图标记109指示。图2是比较补料分批生物反应器系统201(左侧)与灌注生物反应器系统202(右侧)的示意图。以左边的补料分批生物反应器开始，该生物反应器210包括反应容器220。细胞培养基通过馈送入口222被馈送到反应容器。搅拌器225用于使介质在整个细胞培养物中循环。在此，搅拌器被描绘为一组旋转叶片，但是可以设想造成循环的任何类型的系统。生物反应器允许种子培养物通过生长/生产周期的生长，在此期间碎片、废物和不可用细胞将在生物反应器中积累并且期望产物(例如生物分子，例如单克隆抗体、重组蛋白质、激素等)也将生产。由于该积累，补料分批方法的反应容器典型地比灌注方法中的反应容器大得多。然后在生产循环结束时收获期望产物。反应容器220还包括用于移除材料的出口224。现在转到右手侧上的灌注生物反应器202，再次，该生物反应器包括带有用于细胞培养基的馈送入口222的反应容器220。搅拌器225用于使介质在整个细胞培养物中循环。反应容器的出口224被流体地连接到过滤装置230的入口232，并连续地将介质(包含细胞和期望产物)馈送到过滤装置。过滤装置230位于反应容器的下游，并将期望产物与细胞分离。过滤装置230具有两个分离的出口：产物出口234和回收出口236。产物出口234将过滤装置230流体地连接到过滤装置下游的容纳容器240，该容纳容器240接收来自过滤装置的期望产物(加上介质)的浓缩流。从该容纳容器240，可以发生进一步处理/纯化以分离/回收期望产物。回收出口236将过滤装置230流体地连接回反应容器220的回收入口226，并用于将细胞和细胞培养基送回反应容器中用于继续的生长/生产。换句话说，在反应容器与过滤装置之间存在流体回路。灌注生物反应器系统202中的反应容器220具有连续的产物产出并且从而可以被制得比补料分批生物反应器系统201小。过滤过程对灌注生物反应器的产出至关重要。不良的过滤过程将仅允许低产出并导致期望产物的低产率。图3是对于本公开的系统有用的通用生物反应器300的横截面视图。如在此示出的，生物反应器包括具有内部容积323的反应容器320。容器的顶部处的馈送入口322用于将细胞培养基馈送到容器中。存在搅拌器325。出口324被示出在容器的底部处。热护套310围绕反应容器，并用于调节细胞/介质的温度。曝气器312位于容器的底部上用于向内部容积提供气体。传感器314被示出在容器的右上方处。泵316被示出用于将细胞培养基馈送到容器中，同时另一个泵318用于将细胞培养基从容器移除。可以存在用于照射内部容积的内部光源，例如当生物反应器用于生长植物细胞时。本公开的灌注系统还使用声泳过滤装置。生物反应器的内容物连续地流过过滤装置以捕获期望产物。图4是声泳过滤装置400的第一实施例。该装置包括流动腔室410，该流动腔室410在此被描绘为圆柱形管道或管。馈送入口412在此被示出在流动腔室的底部处，来自生物反应器的流体通过该馈送入口412被接收。出口414被描绘在流动腔室的顶部处，带有指示流体流动的方向的箭头(附图标记415)。套管420围绕流动腔室。该套管包括彼此相对定位的至少一个超声换能器422和至少一个反射器424。换能器和反射器一起生成一个或更多驻波425，其中反射器以类似的频率和强度将初始传播的波朝向换能器弹回以形成声驻波。特别设想的是，套管可以与流动腔室/管道分离。管道可以被丢弃并用新管道替换。该配置允许过滤装置中的一次性部分，并且从而降低否则用永久性过滤器可能招致的清洁和消毒的成本。应注意，过滤装置可以包括在此未描绘的另外的入口或出口，如先前说明的。图5是声泳过滤装置的第二实施例。在此，过滤装置400还包括位于套管420与流动腔室410之间的护套430。该护套容纳可用于控制通过流动腔室的流体的温度的温度调节流体432。在这方面，通常期望将细胞培养物的温度维持在38℃以下以防止细胞的受损。温度调节流体与通过流动腔室410的细胞培养基/流体完全分离。应注意，由换能器422和反射器424产生的驻波425将穿过护套430和该护套430中的温度调节流体432传播，并且将继续在流动腔室中操作以分离流动腔室中的目标材料。图6示出本公开的一种示例性处理系统，其包括生物反应器610和过滤装置630。该系统被设置用作灌注生物反应器。生物反应器610包括具有馈送入口622、出口624和回收入口626的反应容器620。介质通过添加管道650被添加到馈送入口622中。反应容器的内容物(附图标记605)利用搅拌器625混合。期望产物(例如重组蛋白质、病毒、外来体或另外的细胞)由位于容器620内的细胞连续地产生并且存在于生物反应器的介质中。灌注生物反应器中的产物和细胞通过管道652从反应容器被抽出，并通过入口632进入声泳过滤装置630。在该声泳过滤装置630处，通过多维驻波的使用将期望产物与细胞分离。期望产物可通过产物出口634和管道654被抽离到容纳容器640中。细胞在分离后返回到灌注生物反应器，从过滤装置的回收出口636经过通过管道656到达反应容器的回收入口626，这形成回收路径。由于3-d驻波增加的横向捕获力，声泳装置的3-d驻波允许灌注反应器的高产出。应注意，尽管反应容器出口624被描绘在容器的顶部处并且回收入口626被描绘在容器的底部处，但是如果期望该布置可以颠倒。这可以取决于待获得的期望产物。在另外的实施例中，特别设想过滤装置630是柔性袋或囊的形式。这种过滤装置在图19中示出。柔性袋700的内部容积操作为流动腔室。柔性袋包括入口702和出口704。柔性袋的相对表面可以是刚性的。一个表面包括超声换能器710，并且相对表面包括与该换能器相对的反射器712，使得可以在袋内生成多维声驻波。参考图6和图7，细胞培养基和细胞通过管道652从反应容器被抽出，并通过入口702进入柔性袋700。多维声驻波捕获期望产物(即细胞)。细胞培养基和其它材料通过出口704离开通过管道656返回到反应容器的回收入口626。最终，在袋充满浓缩细胞时，流过袋700的流体停止。然后可以将填充有浓缩细胞的袋从产物出口634与反应容器的回收入口626之间的回收路径取出。然后从袋回收浓缩细胞。在其它实施例中，特别设想在过滤装置630的流动腔室内使用柔性袋或囊用于细胞的捕获。该柔性袋或囊类似于图19的袋700，但没有附接到其上的超声换能器和反射器。细胞培养基和细胞通过管道652从反应容器被抽出，并通过入口632进入声泳过滤装置630。柔性袋本身包含入口和出口，并且声泳过滤装置充当用于袋的壳体。多维声驻波捕获期望产物(即细胞)。细胞培养基和其它材料通过袋的出口离开并通过过滤装置的回收出口636出来通过管道656到达反应容器的回收入口626，这形成回收路径。在柔性袋内，随着被捕获的细胞的数量增加，细胞形成更大的簇，该簇将在临界大小下由于重力而掉落出声驻波。簇掉落到袋的底部。最终，在袋充满浓缩细胞时，流过过滤装置630的流体停止。然后可以移除填充有浓缩细胞的袋并且将新的袋放置在过滤装置630内。参考图6，过滤装置入口632可能会靠近过滤装置630的中间，并且回收出口636可能会位于过滤装置的顶部处，其中浓缩细胞掉落到柔性袋的底部以被收集。将不需要产物出口634或容纳容器640来收集产物，该产物会被收集在柔性袋中，该柔性袋随后从过滤装置630的流动腔室被移除。现在来更详细地描述在声泳过滤装置中使用的超声换能器(多个超声换能器)可能是有帮助的。图7是常规超声换能器的横截面图。该换能器具有在底端处的耐磨板50、环氧树脂层52、陶瓷晶体54(由例如锆钛酸铅(pzt)制成)、环氧树脂层56以及背衬层58。在陶瓷晶体的任一侧上存在电极：正电极61和负电极63。环氧树脂层56将背衬层58附接到晶体54。整个组件被容纳在壳体60中，该壳体60可以由例如铝制成。电气适配器62提供用于电线穿过壳体并连接到附接到晶体54的引线(未示出)的连接。典型地，背衬层被设计为增加阻尼并产生跨越宽范围的频率具有均匀位移的宽带换能器并且被设计为抑制在特定振动本征模式下的激励。耐磨板通常被设计作为阻抗变换器以更好地匹配换能器向其中辐射的介质的特征阻抗。图8是带有气泡64的耐磨板50的照片，在该照片中耐磨板由于振荡压力和加热而已从陶瓷晶体表面被拉开。图9是本公开的超声换能器81的横截面视图，该超声换能器81被用于本公开的声泳过滤装置中。换能器81具有铝壳体82。pzt晶体86限定出换能器的底端，并从壳体的外部露出。晶体在其周边上被位于晶体与壳体之间的小弹性层98(例如硅树脂或类似材料)支撑。换句话说，不存在耐磨层。螺钉(未示出)经由螺纹连接88将壳体的铝顶板82a附接到壳体的本体82b。顶板包括连接器84以将动力传递到pzt晶体86。pzt晶体86的底表面和顶部表面各自被连接到电极(正电极和负电极)，例如银或镍电极。卷绕式电极接头90连接到底部电极并与顶部电极隔离。电能通过晶体上的电极被提供到pzt晶体86，其中卷绕式接头90是接地连接点。注意到，如图5中呈现的晶体86没有背衬层或环氧树脂层。换句话说，在换能器中在铝顶板82a与晶体86之间存在气隙87(即该气隙是完全空的)。在一些实施例中可以提供最小背衬58和/或耐磨板50，如图10中所见。换能器设计可以影响系统的性能。典型的换能器是带有结合到背衬层和耐磨板的陶瓷晶体的分层结构。因为换能器加载有由驻波呈现的高机械阻抗，所以针对耐磨板的传统设计指导(例如，针对驻波应用的半波长厚度或针对辐射应用的四分之一波长厚度)以及制造方法可能不合适。代替地，在本公开换能器的一个实施例中，没有耐磨板或背衬，允许晶体在其具有高q因子的本征模式之一中振动。振动陶瓷晶体/盘直接暴露于流过流动腔室的流体。移除背衬(例如使晶体背靠空气)还允许陶瓷晶体在较高阶模式的振动下振动而几乎没有阻尼(例如，较高阶模态位移)。在具有带有背衬的晶体的换能器中，晶体以更均匀的位移振动，类似活塞。移除背衬允许晶体以非均匀位移模式振动。晶体的模式形状越高阶，晶体就具有越多的节点线。晶体的越高阶模态位移产生越多的捕获线，尽管捕获线与节点的相关性不必要是一对一的，并且在更高的频率下驱动晶体将不必要产生更多的捕获线。在一些实施例中，晶体可以具有最小程度地影响晶体的q因子(例如小于5％)的背衬。背衬可以由大致上声学透明的材料制成，例如轻木、泡沫或软木，其允许晶体以更高阶模式形状振动并维持高q因子，同时仍然为晶体提供一些机械支撑。背衬层可以是实心的，或者可以是具有穿过该层的孔的格栅，使得该格栅以特定的更高阶振动模式遵循振动晶体的节点，在节点位置处提供支撑同时允许晶体的其余部分自由地振动。格栅工作或声学透明材料的目标是在不降低晶体的q因子或与特定模式形状的激励相干扰的情况下提供支撑。通过避免环氧树脂层和耐磨板的阻尼和能量吸收效应，将晶体放置成与流体直接接触也有助于高q因子。其它实施例可以具有耐磨板或耐磨表面以防止含有引线的pzt接触宿主流体。这在例如生物应用(例如分离血液)中可能是期望的。这种应用可能使用耐磨层，例如铬、电解镍或化学镀镍。化学气相沉积也可用于施加聚(对亚二甲苯基)(例如聚对二甲苯)或其它聚合物的层。有机和生物相容性涂层(例如硅树脂或聚氨酯)也可用作耐磨表面。在一些实施例中，超声换能器具有1英寸直径和标称2mhz谐振频率。每个换能器可消耗约28w的功率用于在3gpm的流动速率下的液滴捕获。该功率使用转化为0.25kwh/m3的能量成本。该测量值表明该技术非常低的能量成本。理想地，每个换能器由其自己的放大器供电和控制。在其它实施例中，超声换能器使用方形晶体，例如具有1”×1”尺寸。可替代地，超声换能器可使用矩形晶体，例如具有1”×2.5”尺寸。对每1”×1”换能器横截面积和每英寸声驻波跨度，每个换能器的功耗为10w，以便获得充足的声学捕获力。对于中等规模系统的4”跨度，每个1”×1”方形换能器消耗40w。较大的1”×2.5”矩形换能器在中等规模系统中使用100w。三个1”×1”方形换能器的阵列会消耗总共120w并且两个1”×2.5”换能器的阵列会消耗约200w。紧密间隔的换能器的阵列代表该技术的替代潜在实施例。可根据期望改变换能器大小、形状、数量和位置以生成期望的三维声驻波样式。换能器的大小、形状和厚度确定在激励的不同频率下的换能器位移，这进而影响分离效率。典型地，换能器在厚度谐振频率(半波长)附近的频率下操作。换能器位移中的梯度典型地导致对于细胞/生物分子的更多捕获位置。较高阶模态位移生成在声场中在所有方向上具有强梯度的三维声驻波，由此在所有方向上产生同样强的声学辐射力，导致多条捕获线，其中捕获线的数量与换能器的具体模式形状相关。为了研究换能器位移分布对声学捕获力和分离效率的影响，使用1”×1”方形换能器将实验重复十次，其中除激励频率外所有条件相同。将十个连串的声学谐振频率(在图11上由圆圈数字1-9和字母a表示)用作激励频率。条件是30分钟的实验持续时间、约5微米sae-30油滴的1000ppm油浓度、500ml/min的流动速率以及20w的所施加的功率。使用油滴是因为油比水更致密，并且可以使用声泳与水分离。图11示出方形换能器的作为2.2mhz换能器谐振附近的频率的函数的所测量的电阻抗幅度。换能器电阻抗中的最小值对应于水柱的声学谐振并且表示用于操作的潜在频率。数值建模已表明，换能器位移分布在这些声学谐振频率处显著变化，并且由此直接影响声驻波和所得到的捕获力。由于换能器在其厚度谐振附近操作，因此电极表面的位移基本上是异相的。换能器电极的典型位移不是均匀的并且取决于激励的频率而变化。作为示例，在具有单行捕获的油滴的一个激励的频率下，位移在电极的中间具有单个最大值并且在换能器边缘附近具有最小值。在另一个激励频率下，换能器分布具有多个最大值，导致油滴的多条捕获线。较高阶换能器位移样式导致对于被俘获的油滴较高的捕获力和多条稳定的捕获线。在油-水乳浊液通过换能器时，观察并表征油滴的捕获线。表征涉及跨越流体通道的捕获线的数量的观察和样式，如针对图11中识别的十个谐振频率中的七个的图12中所示。换能器的不同位移分布可以在驻波中产生不同的(更多)捕获线，位移分布中的更多梯度总体上产生更高的捕获力和更多的捕获线。图13是示出与9捕获线样式匹配的压力场的数值模型。该数值模型是二维模型；并且因此仅观察到三条捕获线。在垂直于页面平面的第三维中存在另外两组三条捕获线。在本系统示例中，系统在一定电压下操作使得粒子(即生物分子或细胞)被捕获在超声驻波中，即，保持在静止位置。粒子沿着以半波长间隔开的明确限定的捕获线被收集。在每个节点平面内，粒子被捕获在声学辐射势能的最小值中。声学辐射力的轴向分量将具有正对比因子的粒子驱动到压力节点平面，而具有负对比因子的粒子被驱动到压力反节点平面。声学辐射力的径向或横向分量是捕获粒子的力。因此，对于粒子捕获，该力大于流体拖曳力和重力的组合效应。在使用典型换能器的系统中，声学辐射力的径向或横向分量典型地比声学辐射力的轴向分量小几个数量级。然而，由本公开的换能器生成的横向力可以是显著的，与轴向力分量在相同数量级上，并且在高达1cm/s的线速度下足以克服流体拖曳力。与其中晶体如具有均匀位移的活塞有效地移动的振动的形式相反，通过以较高阶模式形状驱动换能器可以增加横向力。声压与换能器的驱动电压成比例。电功率与电压的平方成比例。换能器典型地是薄压电板，具有z轴上的电场以及z轴上的主位移。换能器典型地在一侧上通过空气(即换能器内的气隙)耦合并且在另一侧上通过细胞培养基的流体耦合。板中生成的波的类型被称为复合波。压电板中复合波的子集类似于泄漏对称(leakysymmetric)(也称为压缩或延伸)lamb波。板的压电性质典型地导致对称lamb波的激励。波是泄漏的因为它们辐射到水层中，这导致在水层中声驻波的生成。lamb波存在于在其表面上具有无应力条件的无限范围的薄板中。因为该实施例的换能器本质上是有限的，所以实际的模态位移更复杂。图14示出跨越板的厚度的平面中位移(x位移)和平面外位移(y位移)的典型变化，平面中位移是跨越板的厚度的偶函数并且平面外位移是奇函数。由于板的有限尺寸，位移分量跨越板的宽度和长度变化。总体上，(m，n)模式是换能器的位移模式，在该位移模式中，换能器位移在宽度方向上存在m个起伏并且在长度方向上存在n个起伏，并且具有如图14中描述的厚度变化。m和n的最大数量是晶体的尺寸与激励的频率的函数。换能器被驱动使得压电晶体以较高阶模式的通式(m，n)振动，其中m和n独立地为1或更大。总体上，换能器将以高于(2，2)的较高阶模式振动。较高阶模式将产生更多的节点和反节点，导致流体层中的三维驻波，该三维驻波由声场中在所有方向上(不仅在驻波的方向上而是还在横向方向上)的强梯度表征。作为后果，声学梯度导致横向方向上较强的捕获力。在各实施例中，驱动换能器的脉冲电压信号可具有正弦、方形、锯齿或三角波形；并且具有500khz至10mhz的频率。脉冲电压信号可以用脉冲宽度调制驱动，该脉冲宽度调制产生任何期望的波形。脉冲电压信号还可具有幅度或频率调制开始/停止能力以消除流(streaming)。换能器(多个换能器)被用于产生压力场，该压力场生成在正交于驻波方向和在驻波方向上均相同数量级的力。当力粗略为相同数量级时，大小0.1微米至300微米的粒子将更有效地朝向集聚的区域(“捕获线”)移动。由于正交声泳力分量中同样大的梯度，存在换能器与反射器之间在驻波方向上不位于规则位置中的“热点(hotspot)”或粒子收集区域。热点位于声学辐射势能的最大值或最小值中。这种热点代表这样的粒子收集位置：其允许在收集期间换能器与反射器之间更好的波传输以及更强的粒子间力，导致更快和更好的粒子集聚。图15和图16是示出声泳分离器的各种部分的分解视图。图15仅具有一个分离腔室，而图16具有两个分离腔室。参照图15，流体通过四端口入口191进入分离器190。提供过渡件192以产生通过分离腔室193的塞状流动(plugflow)。换能器40和反射器194位于分离腔室的相对壁上。然后流体通过出口195离开分离腔室193和分离器。图16具有两个分离腔室193。系统联接器196被放置在两个腔室193之间以将它们接合在一起。已经在中国仓鼠卵巢(cho)细胞的不同系上测试了声泳分离。在一个实验中，使用如图15中描绘的系统分离具有8.09×106个细胞/ml的起始细胞密度、1232ntu的浊度以及粗略为75％的细胞存活率的溶液。换能器为2mhz晶体，在约2.23mhz下运行，消耗24-28瓦。使用25ml/min的流动速率。该实验的结果在图17中示出。在另一个实验中，分离具有8.09×106个细胞/ml的起始细胞密度、1232ntu的浊度以及粗略为75％的细胞存活率的溶液。该cho细胞系具有双模态粒子大小分布(在12μm和20μm大小下)。结果在图18中示出。图17和图18由beckmancoulter细胞存活率分析仪产生。其它测试揭露在将细胞与流体分离时，1mhz和3mhz的频率不如2mhz有效。在10l/h的流动速率下的其它测试中，在超过99％的确认的细胞存活率下99％的细胞被俘获。其它测试在50ml/min(即3l/h)的流动速率下获得3×106个细胞/ml的最终细胞密度，其具有接近100％的存活率并且几乎没有温度升高。在又一些其它测试中，在6l/h的流动速率下获得浊度的95％降低。使用酵母作为用于生物学应用的cho的模拟物执行进一步测试。对于这些测试，在15l/h的流动速率下，测试了各种频率以及功率水平。表1示出测试的结果。表1：在15l/h流动速率下2.5”×4”系统结果频率(mhz)30瓦37瓦45瓦2.221193.981.484.02.228385.578.785.42.235689.185.881.02.24386.7-79.6在生物学应用中，设想系统的所有部分(例如流动腔室、引导到生物反应器或过滤装置以及引导自生物反应器或过滤装置的管件、容纳超声换能器和反射器的套管、温度调节护套，等)可以彼此分离并且是一次性的。避免离心机和过滤器允许在不降低细胞的存活率的情况下cho细胞更好的分离。还可以驱动换能器以产生快速的压力变化以防止或清除由于cho细胞的集聚造成的阻塞。还可以改变换能器的频率以获得对于给定功率的最佳效果。已经参考各示例性实施例描述了本公开。在阅读和理解先前详细描述的基础上，其他人将想到修改和变更。本公开旨在被解释为包括所有这样的修改和变更，只要它们落入所附权利要求或其等同物的范围内。当前第1页12