空气基质数字微流控(DMF)装置的制作方法

本申请要求于2015年6月5日提交的美国临时专利申请62/171,772, “DEVICES AND METHODS FOR REACTION HYDRATION”的优先权，并且通过引用方式将其全部内容并入本文中。

通过引用并入

通过引用的方式将在本说明书中提及的所有公开和专利申请的全部内容并入本文中，其程度如同每个单独的公开或专利申请被明确地和单独地指出以通过引用的方式并入一样。

技术领域

本申请大体上涉及数字微流控(DMF)装置和方法。特别地，本文中所描述的装置和方法涉及当在空气中使用DMF时补充液滴。

背景技术：

近年来，已致力于使化学和生物化学反应自动化和小型化。芯片实验室(lab-on-a-chip)和生物芯片设备在科学研究应用以及潜在的定点护理应用方面已经引起了的许多关注，因为它们执行具有小的反应体积的高度重复的反应步骤，从而节省了材料和时间。尽管传统的生物芯片类型设备利用微米或纳米尺寸的通道和与生物芯片耦合的对应的微型泵、微型阀和微型通道来操控反应步骤，但这些额外的部件增加了微流控设备的成本和复杂性。

所出现的数字微流控技术(DMF)已成为广泛用于生物和化学应用的强大的制备技术。DMF能够在不需要泵、阀门或复杂的管阵列的情况下，对多种样本和试剂(包括固体、液体和刺激性化学物质)进行实时、精确和高度灵活的控制。在DMF中，纳升至微升体积的离散液滴从贮存器被分配到涂覆有疏水绝缘体的平坦表面上，其中通过将一连串的电势施加到嵌入式电极阵列来对它们进行操控(运送、分裂、合并、混合)。复杂的反应系列可以单独使用DMF或使用其中DMF与基于通道的微流控集成的混合系统来执行。混合动力系统提供了极好的多功能性，在概念上，每个反应步骤可以以最适合它的微流控类型(microfluidics format)执行。

对于许多应用来说，在开放式表面上执行DMF是最方便的，使得液滴周围的基质是环境空气。然而，空气基质类型(air-matrix format)的使用需要考虑液滴蒸发，尤其是当液滴长时间经受高温时。在一些实例中，蒸发被认为是期望的特性，因为它可以促进感兴趣溶质的浓缩和分离。然而，在生物化学的环境中，因为酶反应通常对反应物浓度的变化高度敏感，故蒸发常常限制空气基质DMF的效用。很大程度上是因为这个原因，研究人员试图将油基质DMF用于生物化学应用，尽管包括以下的诸多缺点： 1)整合垫片或制造结构以包含油的复杂性的增加；2)进入周围的油中的反应物的不需要的液-液萃取；3)与油混溶性液体(例如，诸如乙醇的有机溶剂)不相容；以及4)高效的热量损耗，这破坏了局部加热并经常使温度敏感反应混乱。

另一种策略是将空气基质DMF设备放置在封闭的加湿室中，但是这经常导致DMF表面上的不希望的凝结、难以进入设备和/或进入设备受限以及需要额外的实验室空间和基础设施。可以通过将反应液滴从空气基质 DMF设备转移到微毛细管中来避免这些问题，在那里它们可以在专用的芯片外模块中被加热而没有蒸发问题，然而，这引入了增加的微毛细管接口并且要与外围模块协调而使空气基质DMF设备的设计和制造复杂化。

将会非常有利的具有这样一种空气基质DMF设备，其避免即使在液滴被加热或暴露于其他蒸发条件下的蒸发难题，而不需要从基质移除液滴，同时确保保持合适的浓度和总体动力。本文中描述包括系统和设备的装置和方法可以解决上面所提出的问题。

技术实现要素：

本实用新型涉及空气基质数字微流控(DMF)装置和相关方法，其通过协调向被空气基质DMF装置操控的液滴(例如，反应液滴)施加附加的流体(例如，再水合)，使得即使在增加蒸发条件(例如，升高温度、降低湿度等)时使蒸发最小化。例如，在空气基质DMF装置中，可以用在受控的温度和体积下的介质(例如，反应试剂)补充反应液滴，以确保反应混合物在整个反应过程中保持适当的浓度和活性。

典型的DMF装置可以包括由气隙分开的平行板，板中的一个(通常为底板)可以包含单独可控电极的图案化阵列，并且相对的板(例如，顶板)可以包括连续接地电极。可选择地，可以在与致动/高压电极相同的板上设置一个或更多个接地电极。板的在气隙中的表面可以包括具有疏水性材料的介电绝缘体以降低表面的润湿性并且增加液滴与控制电极之间的电容。液滴可以在板之间的气隙空间中被操控并且可以包括或可以使用一种或更多种起始材料或任何反应试剂。该气隙可以被分成区域，因为板的一些区域可以包括对该区域局部的加热/冷却(例如，通过珀尔帖(Peltier) 设备、电阻加热、与该区域热接触的对流加热/冷却等)。还可以在一个或更多个局部区域上提供检测(包括成像或其他基于传感器的检测)；在一些变型中，可以在全部或大部分反应区域(气隙空间)上提供成像。

因此，本文中所描述的任何DMF装置可以包括与那个区域热连通(包括与板和/或与致动电极并且因此与板相接触)的一个或一系列热区或区域。

致动电极能够使气隙内的液滴移动。致动电极可以将气隙内的工作区域分成离散区域，使得每个电极对应于单位区域。在本文中提供的实例中，这些单位区域被示出为与电极形状和尺寸相对应的相对均匀的尺寸和形状(例如，正方形)，应当理解的是，它们可以是任何适当的形状和/或尺寸(例如，包括非正方形形状，诸如圆形、椭圆形、矩形、三角形、六边形等，包括不规则形状并且还包括形状和/或尺寸的任意组合)。各自对应于单个电极的单位区域可以以功能(热、电等)和/或结构进行分组以形成包括冷却/加热区域(热区)、成像区域等的区域。热区可以被加热或冷却至执行期望的反应所需的温度。可使用热电元件(例如，珀尔帖设备、电阻加热器、对流加热器等)和/或温度检测器(例如。电阻式温度检测器、 RTD等)来在DMF设备上提供加热或冷却以及温度的检测。该装置还可以包括不同区域之间的隔热(热隔绝)分离区域，包括使一个热区与另一个隔热的热空隙。

本文中所描述的方法和装置通常可以在DMF设备上增加液滴中的反应水合作用，因此不需要加湿室或材料(例如，油)或专用室来防止或限制蒸发。相反，允许反应流体(例如，溶剂、水、介质等)的蒸发，并且当达到适当的触发阈值时，将代替添加的经处理的(例如，加热过的)反应流体自动添加至液滴。本文中所描述的方法和装置可以允许在温度范围 (例如但不限于4-95℃)和培养时间(incubation time)(例如但不限于至少一个小时)内使用空气基质DMF执行生物化学反应。在一个实施方式中，本实用新型使用预加热的溶剂液滴及时补充反应体积。通过这种方法，反应体积和温度在生化反应过程中可以保持相对恒定(分别≤20％和≤1℃的变化)。因此，这可以使得能够使用空气基质DMF设备来执行多种生物化学反应，并且特别地是使用空气基质DMF来执行对包括从基因表达分析工作流中提取的那些的多核苷酸的扩增和检测(例如，RNA断裂、第一链cDNA合成和PCR)。令人惊讶的是，本发明人已经发现所得到的反应产物本质上与通过常规的小试规模法(bench-scale method)所产生的反应产物别无二致。

本文中所描述的DMF装置可以包括用于在整个反应过程中补充反应试剂的机构。在一些变型中，DMF设备可以包括连接到用于输送所执行的反应所需的补充试剂或其他溶液的端口和对应管的通孔。在一些变型中，可能存在用于在反应过程的不同步骤补充不同的试剂的一个以上的端口或多个管连接器。

在一些实例中，可以监测反应的蒸发。检测可以是可视的或者可以通过自动化手段。自动化手段包括光学检测(例如，相机)、比色、检测电特性的变化等等。

例如，本文中所描述的是在空气基质数字微流控(DMF)装置上的反应液滴中补充溶剂以校正或调节反应液滴的蒸发的方法。例如，在空气基质数字微流控(DMF)装置上补充反应液滴以校正蒸发的方法可以包括：监测空气基质DMF装置的气隙区域中的反应液滴以确定反应液滴的体积何时下降到小于阈值，其中反应液滴包含溶剂和反应试剂；将补充液滴引入到空气基质DMF的气隙区域中，其中补充液滴由溶剂组成；将补充液滴的温度调节到反应液滴的温度；并且在反应液滴的体积下降到小于阈值后，当补充液滴的温度与反应液滴的温度相匹配时使补充液滴与反应液滴相结合。

一般而言，空气基质DMF装置可以指其中由DMF装置操控的液滴被空气(或任何其他气体)基质包围的DMF装置的任何非液体接口。空气基质也可以并且可互换地称为“气体基质”DMF装置，因为气体不一定是空气，尽管通常可以是空气。如本文中所使用的，术语溶剂可以统称为溶质被溶解、悬浮或浸入其中以形成液滴的任何液体。在一些变型中，溶剂可以是水。一般而言，溶剂是通过蒸发而损失的液滴的液体部分。

在空气基质数字微流控(DMF)装置上在反应期间补充反应液滴以校正反应液滴中的蒸发的方法可以包括：监测空气基质DMF装置的气隙区域中的反应液滴以确定何时反应液滴的体积下降至小于阈值，其中反应液滴包括溶剂和反应试剂；将补充液滴引入到空气基质DMF的气隙区域中，其中补充液滴由溶剂组成；将补充液滴的温度调节到反应液滴的温度；并且在反应液滴的体积下降到小于阈值后，在补充液滴的温度与反应液滴的温度匹配时，通过向DMF装置的电极施加能量来移动反应液滴和补充液滴中的一个或两个以使两者结合在一起，从而使反应液滴与补充液滴相结合。向致动电极施加能量通过DMF装置的电介质层中的偶极子与液滴中的极性分子之间的电润湿和/或静电和/或其它电动力使与致动电极相邻 (例如，在其之下或之上)的液滴移动。

例如，在空气基质数字微流控(DMF)装置上在反应期间补充反应液滴以校正蒸发的方法可以包括：监测空气基质DMF装置的气隙区域中的反应液滴以确定何时反应液滴的体积下降至小于初始体积的30％，其中反应液滴包括溶剂和反应试剂；通过在形成气隙区域的一个或两个板中的孔将补充液滴引入到空气基质DMF的气隙区域中，其中补充液滴由溶剂组成；将补充液滴移动到与反应液滴相邻的区域；将补充液滴的温度调节至反应液滴的温度；并且在反应液滴的体积下降到小于阈值后，当补充液滴的温度与反应液滴的温度相匹配时使补充液滴与反应液滴相结合。

在这些方法中的任何一种中，结合可以包括通过将能量施加到DMF 的(例如，相邻的，诸如在液滴之上或之下的)电极以移动液滴来将补充液滴移动到反应液滴。如将在本文中详细描述的，DMF装置可以自动监测反应液滴以确定何时体积已下降到小于预定水平(例如，初始体积的10％、15％、20％、30％、35％、40％、50％等)，并且制备补充液滴以及将反应液滴与已被加热并且以其他方式制备用于与反应液滴相结合的补充液滴相结合。

本发明人已经发现，通常，重要的是，以本文中所描述的方式添加补充液滴以避免中断正在由DMF执行的反应液滴中正在进行的反应，例如，添加不处于(例如，与它被添加至其中的反应液滴的温度相匹配的)正确温度下的补充液滴会中断反应。添加补充液滴太早(例如，在大量蒸发发生之前)或太晚(在大量蒸发发生之后)可能中断反应。例如，本文中所描述的DMF装置可以自动确定反应液滴何时已损失10％与55％之间(例如，在10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％等的下限值与15％、 17％、20％、22％、25％、27％、30％、33％、35％、37％、40％、45％、 50％、55％等的上限值之间，其中上限值大于下限值，诸如15％至35％等)的体积。另外，补充液滴的体积可以被缩放或调节以便不中断反应。例如，补充液滴的体积可以近似等于由反应液滴损失的溶剂的体积(在5％、 10％、15％、20％、25％、30％内)。

一般而言，空气基质DMF装置可以随着蒸发发生以正在进行的方式多次(例如，补充单个反应液滴)和/或针对多个液滴(例如，同时监测多个液滴)执行这些方法中的任一种。这些方法在反应液滴被加温或加热的情况下会特别有用。

在本文中所描述的任何方法中，监测可包括确定随着蒸发的发生，反应液滴尺寸的变化。例如，监测可包括使反应液滴成像并且确定反应液滴的尺寸(例如，气隙内的尺寸和/或保持液滴的单位单元(unit cell)的数量等)的变化。因此，监测反应液滴可以包括光学监测反应液滴。可选择地或另外地，监测可以包括检测由于例如伴随蒸发的反应液滴的体积减小引起的电特性的变化。例如，监测可以包括检测与反应液滴(包括反应液滴在上面的一个或更多个单位单元)相邻的电极中的电容变化。监测可以包括基于反应液滴相对于空气基质DMF装置的两个或更多个致动电极的位置的变化来确定反应液滴尺寸的变化。

如上文所提及的，例如由于蒸发而使反应液滴的尺寸和/或体积减小超过阈值(例如，10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％、27％、30％、 33％、35％、37％、40％、50％等)会触发(包括自动触发)控制器，以传送适当体积的经预处理的(例如，温度匹配的)补充液滴并且使它与反应液滴相结合。因此，在一些变型中，用于触发试剂补充的阈值水平是30％或更多的反应液滴体积的损失。

如所提及的，由于在快速(4-10分钟)的时间范围内可能发生大量的蒸发，所以在此描述的方法在反应液滴被加温或加热时可能特别有用。因此，在此描述的任何方法可以包括在空气基质DMF装置的气隙区域的热区中加热反应液滴的步骤。

一般而言，将补充液滴引入到反应液滴的步骤可以包括通过DMF移动反应液滴和补充液滴中的一个或两个。补充液滴可以来自补充流体(例如，溶剂)的贮存器。具体地，会是有益的是，使补充流体通过第一或第二(例如，上面的或下面的)板输送到气隙区域中，包括引入来自穿过空气基质DMF装置的形成气隙区域的两个板中的一个的孔的补充液滴。如在下面更详细的描述，通过致动电极中的一个或更多个形成孔。

补充液滴的体积可以配置为防止反应液滴的过度稀释，这可能干扰反应液滴进行的任何反应。例如，补充液滴的体积可以在反应液滴体积的约 10％至约55％之间(例如，约10％至约50％之间、约15％至约40％之间、约20％和约40％之间等)。

补充液滴的温度可以根据需要进行调整。例如，补充液滴的温度可以通过使补充液滴移动到调节反应液滴的温度的相同热区或者移动到与反应液滴和/或调节反应液滴的温度的热区温度匹配的第二热区。例如，调节补充液滴的温度可以包括将补充液滴保持在与反应液滴相邻并且与反应液滴下方的区域热连通的区域。类似地，调节补充液滴的温度可以包括将补充液滴保持在热区并且调节热区的温度以匹配反应液滴的温度。

在本文中所描述的任何方法中，通过调节与补充液滴和/或反应液滴相邻的表面的电润湿以一起驱动液滴，可以移动和/或驱动液滴(反应液滴) 以进行组合。

本文中还描述了被配置为在反应液滴中补充溶剂以校正蒸发的空气基质数字微流控(DMF)装置。这些装置中的任何一个可以包括：具有第一疏水层的第一板；具有第二疏水层的第二板；形成在第一疏水层与第二疏水层之间的气隙；与第一疏水层相邻的多个致动电极，其中每个致动电极限定气隙内的单位单元；一个或更多个接地电极，其从多个第一疏水层跨气隙与第二疏水层相邻；与所述第一板相邻的热调节器，其中热调节器形成包括多个相邻单位单元的热区，其中热调节器被配置为加热和/或冷却热区内的反应液滴；传感器，其被配置为检测气隙内的反应液滴的体积变化；以及控制器，其与传感器通信并且被配置为检测反应液滴的体积变化低于阈值并且：将补充液滴引入到气隙中；调节补充液滴的温度以匹配反应液滴的温度；并且当补充液滴的温度与反应液滴的温度匹配时使补充液滴与反应液滴相结合。

被配置为在反应液滴中补充溶剂以校正蒸发的空气基质数字微流控 (DMF)装置可以包括：第一板，其具有第一疏水层；第二板，其平行于第一板并具有第二疏水层；气隙，形成在第一疏水层与第二疏水层之间；多个致动电极，与所述第一疏水层相邻，其中每个致动电极限定气隙内的单位单元；一个或更多个接地电极，其与从第一疏水层跨过气隙的第二疏水层相邻；热调节器，其与第一板邻近，其中热调节器形成包括多个相邻单位单元的热区，其中热调节器被配置为加热和/或冷却热区内的反应液滴；传感器，其被配置为检测热区内的反应液滴的体积的变化；孔，通过第一板延伸到气隙中，其中该孔延伸穿过致动电极并且被配置为连接至溶剂源；以及控制器，其与传感器通信并且被配置为检测反应液滴的体积变化低于阈值并且：通过孔将补充液滴引入到气隙中；调节补充液滴的温度以匹配反应液滴的温度；并且当补充液滴温度与反应液滴温度匹配时使补充液滴与反应液滴相结合。

本文中所描述的装置和使用它们的方法中的任何一种可以包括孔，补充流体(例如，诸如水的溶剂)可以通过孔被输送到气隙中。该孔可以穿过致动电极；这可以允许控制器控制液滴从孔排出和/或离开孔的分配。例如，孔可以穿过单位单元内的第一板，并且通常可以被配置为连接到(或可以连接到)溶剂源以在气隙内形成补充液滴。因此，任何装置可以包括通过第一板延伸到气隙中的孔，其中孔延伸通过致动电极并且被配置为连接到溶剂源以在气隙内形成补充液滴。在一些变型中，孔穿过第二板并且可以延伸通过接地电极。在一些变型中，孔不穿过电极(接地电极或致动电极)，而是与电极相邻或被电极部分包围。

该孔可以通过管适配器连接到补充流体源，管适配器被配置为耦接到该孔以形成补充液滴。例如通过控制器可以使用和控制阀来调节补充液滴的分配。

本文中所描述的装置和使用它们的任何方法可以包括与热区热连通的电阻式温度检测器。温度检测器可以是热敏电阻器等。一般而言，温度检测器可以用于提供用于调节热区(和/或单个的单位单元或单元组)的温度的控制反馈。

本文中所描述的装置和使用它们的任何方法可以包括被配置为容纳反应组分的一个或一系列试剂贮存器。这些贮存器可用于提供可与空气基质DMF装置内的一个或更多个反应液滴相结合的额外的反应组分(例如，酶、引物等)的液滴。

可以通过使用在空气基质DMF的热区之间和/或至少部分地在热区周围的一个或更多个热空隙区域来增强空气基质DMF装置的一个或更多个热区的热调节。热空隙区域可以包括切口或开放区域(间隙)。例如，这些装置中的任何一个可以包括与热区相邻并且配置为防止或减少热区与热区外部的单位单元之间的热能传递的至少一个热空隙。例如，空气基质 DMF可以包括被配置为耦接至孔以形成补充液滴的管适配器。

可以使用任何适当的热调节器(例如，加热器和/或冷却器)。例如，热调节器可以是热电加热器，诸如珀尔帖设备、珀耳帖热泵、固态致冷器或热电冷却器(TEC)。热调节器可以与温度传感器相集成或者温度传感器可以是单独的。例如，温度传感器可以是电阻式温度检测器(RTD)。

如上文所提及的，本文中所描述的空气基质DMF装置通常可以被配置为检测液滴的体积(例如，尺寸)的变化。因此，这些装置中的任何一个可以包括一个或更多个传感器，用于基于成像(例如，视觉传感器)检测液滴体积、电特性的变化(例如，通过包括一个或更多个致动电极的电极或单独电极所检测到的电容和/或电阻的变化)等。例如，装置可以包括被配置为检测反应液滴的体积变化的传感器，其中传感器包括光学传感器。该装置可以被配置为检测装置中任何地方(例如，一个或更多个传感器可以遍布在整个气隙区域之上)或装置的一个或更多个子区域(特别是一个或更多个热区)中的液滴尺寸的变化。例如，该装置可以包括电传感器，该电传感器被配置为通过检测一个或更多个致动电极与一个或更多个接地电极之间的电特性来检测反应液滴的体积的变化。检测电特性变化的传感器可以被集成到控制器中或者它可以是一个或更多个单独的专用传感器。当传感器被配置为使用致动电极时，它可以包括确定一个或更多个致动电极与大地之间的电阻率和/或电容变化的电路、逻辑和/或两者；电特性随时间的变化可以指示液滴体积的变化。在一些变型中，液滴可以跨越多个单位单元，并且每个单元的致动电极与大地之间的电负载、电阻和/ 或电容可以清楚地指示液滴何时缩小，使得它被包含在更少的单位单元内。在其他变型中，液滴尺寸的减小可能导致电特性的变化，该电特性的变化可以(基于反应液滴的组分的电特性)与(例如，与初始时间值相比较的) 相对值和/或绝对值比较/相关联以确定何时液滴的尺寸减小量大于阈值。阈值还可以基于相对值(例如，原始液滴尺寸的百分比)或绝对值(例如，从2μL减小到1.4μL等)。一般而言，这些装置可以包括控制器，该控制器被配置为基于来自传感器的输入检测反应液滴的体积的变化。如所提及，控制器可以被配置为控制与补充流体源流体连通的阀和/或可以使用DMF 驱动补充液滴的分配(例如，通过向一个或更多个致动电极施加能量以调节电润湿并且从补充流体的贮存器释放/移动适当尺寸的补充液滴)。在一些变型中，控制器可以被配置为通过向DMF的致动电极施加能量驱动补充液滴和/或反应液滴的移动来使补充液滴与反应液滴相结合。

本申请的实施方式还包括以下方面：

1)一种空气基质数字微流控(DMF)装置，其被配置为在反应液滴中补充溶剂以校正蒸发，所述装置包括：

第一板，其具有第一疏水层；

第二板，其具有第二疏水层；

气隙，其形成在所述第一疏水层与所述第二疏水层之间；

多个致动电极，其与所述第一疏水层相邻，其中，每个致动电极限定所述气隙内的单位单元；

一个或更多个接地电极；

热调节器，其中所述热调节器在所述气隙中形成包括多个相邻单位单元的热区，其中所述热调节器还被配置为当所述反应液滴在所述热区内时加热和/或冷却所述反应液滴；

传感器，其被配置为检测所述气隙内的反应液滴的体积的变化；以及

控制器，其与所述传感器通信并且被配置为检测所述反应液滴的体积变化至小于阈值并且使补充液滴与所述反应液滴相结合。

2)一种空气基质数字微流控(DMF)装置，其被配置为在反应液滴中补充溶剂以校正蒸发，所述装置包括：

第一板，其具有第一疏水层；

第二板，其具有第二疏水层；

气隙，其形成在所述第一疏水层与所述第二疏水层之间；

多个致动电极，其与所述第一疏水层相邻，其中，每个致动电极限定所述气隙内的单位单元；

一个或更多个接地电极；

热调节器，其中所述热调节器形成包括多个相邻单位单元的热区，其中所述热调节器还被配置为加热和/或冷却所述热区内的所述反应液滴；

传感器，其被配置为检测所述气隙内的所述反应液滴的体积的变化；以及

控制器，其与所述传感器通信并且被配置为检测所述反应液滴的体积变化至小于阈值并且：将补充液滴引入到所述气隙中；调节所述补充液滴的温度以匹配所述反应液滴的温度；并且当所述补充液滴的温度与所述反应液滴的温度匹配时使所述补充液滴与所述反应液滴相结合。

3)一种空气基质数字微流控(DMF)装置，其被配置为在反应液滴中补充溶剂以校正蒸发，所述装置包括：

第一板，其具有第一疏水层；

第二板，其平行于所述第一板并且具有第二疏水层；

气隙，其形成在所述第一疏水层与所述第二疏水层之间；

多个致动电极，其与所述第一疏水层相邻，其中，每个致动电极限定所述气隙内的单位单元；

一个或更多个接地电极，其与所述多个致动电极中的一个或更多个致动电极相邻；

热调节器，其中所述热调节器形成包括多个相邻单位单元的热区，其中所述热调节器还被配置为加热和/或冷却所述热区内的所述反应液滴；

传感器，其被配置为检测所述热区内的所述反应液滴的体积的变化；

孔，其通过所述第一板延伸至所述气隙中，其中所述孔至少部分地被来自所述多个致动电极的致动电极包围并且被配置为连接至溶剂源；以及

控制器，其与所述传感器通信并且被配置为检测所述反应液滴的体积变化至小于阈值并且：通过所述孔将补充液滴引入到所述气隙中；调节所述补充液滴的温度以匹配所述反应液滴的温度；并且当所述补充液滴的温度与所述反应液滴的温度匹配时使所述补充液滴与所述反应液滴相结合。

4)根据1)或2)的装置，还包括单位单元内的通过第一板的孔，所述孔被配置为连接到溶剂源以在所述气隙内形成补充液滴。

5)根据1)或2)的装置，还包括通过所述第一板延伸到所述气隙中的孔，其中，所述孔延伸穿过致动电极并且被配置为连接至溶剂源以在所述气隙内形成补充液滴。

6)根据1)、2)和3)的装置，还包括与所述热区热连通的温度检测器。

7)根据1)、2)和3)的装置，还包括被配置为容纳反应组分的一系列试剂贮存器。

8)根据1)、2)和3)的装置，还包括与所述热区相邻并且被配置为防止或减少所述热区与所述热区外的单位单元之间的热能传递的至少一个热空隙。

9)根据3)、4)和5)的装置，包括被配置为耦接至所述孔以形成所述补充液滴的管适配器。

10)根据1)、2)和3)的装置，其中，所述热调节器包括热电加热器。

11)根据1)、2)和3)的装置，其中，被配置为检测所述反应液滴的体积的变化的所述传感器包括光学传感器。

12)根据1)、2)和3)的装置，其中，被配置为检测所述反应液滴的体积的变化的所述传感器包括电传感器，所述电传感器被配置为检测一个或更多个致动电极与所述一个或更多个接地电极之间的电特性。

13)根据1)、2)和3)的装置，其中，所述控制器被配置为基于来自所述传感器的输入检测所述反应液滴的体积的变化。

14)根据1)、2)和3)的装置，其中，所述控制器被配置为控制与补充流体的源流体连通的阀。

15)根据1)、2)和3)的装置，其中，所述控制器被配置为通过向所述DMF装置的致动电极施加能量来移动所述气隙内的所述补充液滴、所述反应液滴或所述补充液滴与所述反应液滴来使所述补充液滴与所述反应液滴相结合。

尽管本文中描述的大多数设备是包括形成气隙的两个平行板的空气基质DMF装置，但是这些技术(方法和装置)中的任何技术(方法和装置)可以被采用作为单板空气基质DMF装置的一部分。在这种情况下，该装置包括单个板并且可以在单个(例如，第一)板上方敞开到空气；“气隙”可对应于板上方的区域，其中一个或更多个液滴可在单板上行进。一个或更多个接地电极可定位为与每个致动电极相邻(例如，紧挨着)，例如，在单个板的下方。该板可以涂覆有疏水层(并且额外的电介质层可以位于疏水层与电极之间)。用于校正蒸发的方法和装置会特别适合于这种单板空气基质DMF装置。

附图说明

在所附的权利要求中具体阐述了本实用新型的新颖的特征。通过参考阐述了其中利用本公开的原理的示例性实施方式的下文的详细描述和附图将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：

图1A是从顶部透视图看的空气基质数字微流控(DMF)装置的一个实例的示意图。

图1B示出通过热调节区域(热区)截取的穿过图1A中所示的空气基质DMF装置的一部分的截面的放大图。

图1C示出了穿过图1A的空气基质DMF装置的区域的第二截面的放大图；这个区域包括穿过底板和致动电极的孔并且被配置使得补充液滴可以从孔(其连接到溶剂贮存器，溶剂贮存器在此实例中被示出为所附接的注射器)输送到空气基质DMF装置的气隙中。

图1D-1H示出了图1A-1C的空气基质DMF装置的气隙区域的时间序列图像(分别为图1D至图1H)，从而说明了如本文中所描述的使用补充液滴来补充反应液滴的方法。

图2是示出在不同的温度下持续30分钟保持(2μL的)反应体积所需的补充液滴的数目(每个均近似为0.5μL)的图表。

图3A-3C示出了与常规方法相比，使用高温空气基质DMF来检测 RNA断裂。图3A示出了断裂前总RNA的尺寸分布的曲线，并且图3B和 3C比较了与图3C中的常规(管)方法相比的图3B中的使用本文中所描述的空气基质DMF方法(利用受控的再水化)的断裂后曲线。使用2100 生物分析仪(Agilent,Santa Clara,CA)上的RNA Nano 6000芯片进行断裂尺寸测量。

图4A是如本文中所描述的利用使用受控再水化的空气基质DMF(左侧)或利用常规方法(右侧)执行第一链cDNA合成的图形比较。使用qPCR 测量第一链cDNA产量。每个柱表示来自三个独立的第一链cDNA合成反应的产物的阈值循环(Ct)测量值的平均值±标准差。使用学生t检验 (Student’s t-test)(未配对、双尾、不等方差)计算P值。

图4B示出了使用本文中所描述的利用受控再水化的空气基质DMF (顶部)和常规技术(底部)产生的双链cDNA库的产量和尺寸分布曲线的比较。使用2100生物分析仪(Agilent，Santa Clara CA)上的高灵敏度 DNA测定芯片进行断裂尺寸测量。

图5示出了使用本文中所描述的利用受控再水化的空气基质DMF和常规技术的多核苷酸(DNA)扩增的比较。如凝胶电泳结果中所示，使用本文中所描述的利用受控再水化的空气基质DMF通过PCR产生的样本具有正确的尺寸和近似相同的量。噬菌体M13mp18基因组DNA作为模板，并引物被设计成产生200bp的PCR产物。

图6示出了通过针对三种不同的温度进行热成像的热控区域的温度曲线。

图7示出了如本文中所描述的空气基质DMF装置的一部分的实例的底视图，示出了集成热电(TEC)冷却器/加热器、温度传感器(电阻式温度检测器，RTD)和用于使补充液滴经由通孔引入到气隙区域中的微毛细管接口。

图8示出了热区随时间变化的温度循环轨迹的实例。

图9示出用于检测空气基质DMF的一个或更多个单位单元中的液滴的电特性(例如，随着液滴蒸发电特性的变化)的检测电路的实例。

图10示出了随着液滴蒸发由感测电路检测到的电特性的变化，其可以如本文中所描述的由空气基质DMF装置用来控制反应液滴的补充。

具体实施方式

本文中描述的是空气基质数字微流控(DMF)系统，其可以用于对往返于基于通道的微流控模块的样本和试剂的多路处理和路由，这些微流控模块专门执行所有其他所需功能。空气基质DMF集成了具有不匹配的输入/输出要求的基于通道的微流控模块，而无需管和微型阀的复杂网络。这些装置(包括系统和设备)可以在不会导致大量的蒸发的温度和持续时间下操作，因为它们在气隙中被执行而不需要油或加湿，否则这会增加成本和复杂性；这些设备和方法不需要DMF设备中的反应液滴的加湿室和/或油封装(并且可以在没有加湿室和/或油封装的情况下被明确执行)。令人惊讶的是，从本文中所描述的方法的初步结果示出了更高的产量和纯度，特别是在执行多聚核苷酸的扩增和/或杂交时。

如本文中所使用的，术语“热调节器”(或在一些示例中为热电模块或TE调节器)可以指代热电冷却器或珀耳帖冷却器并且是用作小型热泵的基于半导体的电子部件。通过向TE调节器施加低压DC电力，热量会从一侧穿过结构移动到另一侧。从而热调节器的一个面可以被冷却，同时相对的面被同时加热。热调节器可以被用于加热和冷却，使它非常适合用于精确的温度控制应用。可以使用的其他热调节器包括电阻加热和/或再循环加热/冷却(其中水、空气或其他流体热介质通过具有与气隙的全部或一个区域热连通的热交换区域的通道(例如，通过形成气隙的板)再循环)。

如本文中所使用的，术语“温度传感器”可以包括电阻式温度检测器 (RTD)并且包括可以用于测量温度的任何传感器。RTD可以通过将RTD 元件的电阻与温度相关联来测量温度。大多数RTD元件由缠绕在陶瓷或玻璃芯上的一条细缠绕线组成。RTD元件可以由纯的材料制成，典型地为铂、镍或铜或已经表征热特性的合金。材料具有随着温度变化的可预测的电阻变化并且它是被用于确定温度的可预测的变化。

如本文中所使用的，术语“数字微流控”可以指代基于离散液滴的显微操作的“芯片实验室”系统。对可以在装置上被运送、存储、混合、反应、加热和/或分析的离散的流体包(试剂、反应组分)执行数字微流控处理。数字微流控可以采用更高程度的自动化并且通常使用更少的物理部件，诸如泵、管、阀门等。

如本文中所使用的，术语“循环阈值”可以指在荧光信号超过阈值水平(即，超过背景信号)使得它可以被检测到所需的聚合酶链式反应(PCR) 测定中的循环次数。

本文中所描述的空气基质DMF装置可以由多层材料构成，该多层材料可以包括印刷电路板(PCB)、塑料、玻璃等。多层PCB与传统的单层器件(例如，玻璃上的铬或ITO)相比会是有利的，因为电连接可以占据与致动电极不同的层，从而为液滴致动提供更多的空间并且简化电子部件在芯片上的集成。

DMF装置可以是适合于感兴趣的特定反应步骤的任何尺寸或形状。此外，DMF设备的布局和特定部件还可以根据感兴趣的反应而改变。虽然本文中所描述的DMF装置可以主要描述位于一个平面(其可以与液滴移动所在的气隙的平面相同)上的样本和试剂贮存器，但是可以想到的是，样本和/或试剂贮存器相对于彼此和/或气隙可以位于不同的层上并且它们可以彼此流体连通。

图1A示出空气基质DMF装置100的布局的实例。通常，空气基质 DMF装置包括多个单位单元191，该多个单位单元彼此相邻并且通过具有与接地电极102相对的单个致动电极106来限定；各单位单元可以具有任何适当的形状，但是通常会具有相同的近似表面积。在图1A中，单位单元是矩形的。液滴(例如，反应液滴)安置在第一板153与第二板151(在图1A-1C中被示出为顶板和底板)之间的气隙内。整个空气基质DMF装置可具有任何适当的形状和厚度。图1B是通过图1A中所示的空气基质DMF的热区的截面的放大图，示出了DMF设备的层(例如，形成底板的层)。通常，DMF设备(例如，底板)包括可以包括形成在印刷电路板(PCB) 材料上的层的多个层；这些层可以包括保护性覆盖层、绝缘层和/或支撑层 (例如，玻璃层、接地电极层、疏水层；疏水层、电介质层、致动电极层、 PCB、热控制层等)。本文中所描述的空气基质DMF装置还包括样本和试剂贮存器以及用于补充试剂的机构。

在图1A-1C中所示的实施例中，在这种情况下是玻璃或其他顶板材料的顶板101提供支撑并且保护下面的层免受外部微粒的影响并且为在 DMF设备内发生的反应提供一定程度的隔离。因此，顶板可以限制/夹住板之间的液滴，这与(没有板的)开放式空气基质DMF装置相比可以增强电场。上板(本实例中的第一板)可以包括接地电极并且可以是透明或半透明的；例如，第一板的基板可以由玻璃和/或透明塑料形成。与基板(例如，玻璃)相邻并位于其下面的是用于DMF电路的接地电极(接地电极层102)。在一些情况下，接地电极是连续的涂层；可选择地，可以使用多个例如相邻的接地电极。接地电极层下方是疏水层103。疏水层103用于减少表面的润湿并且有助于将反应液滴保持在一个内聚单元(cohesive unit) 中。

在图1A-1C中被示出为下板或底板151的第二板可以包括限定单位单元的致动电极。在这个实例中，与第一板一样，面向板之间的气隙104的最外层也包括疏水层103。形成疏水层的材料在两个板上可以是相同的或者它可以是不同的疏水材料。气隙104提供其中反应液滴最初被容纳在样本贮存器中并且被移动用于运行一个或更多个反应步骤以及用于保持用于各种反应步骤的各种试剂的空间。与第二板上的疏水层103相邻的是电介质层105，该电介质层可以增加液滴与电极之间的电容。与电介质层105 相邻并且位于电介质层105下面的是包含致动电极(致动电极层106)的 PCB层。如所提及的，致动电极可以形成各单位单元。致动电极可以被通电以将DMF设备内的液滴移动到不同的区域，使得各种反应步骤可以在不同的条件下(例如，温度、与不同的试剂相结合等)进行。支撑基板107 (例如，PCB)(在图1B和1C中)可以与致动电极层106相邻并在该致动电极层下面以为这些部件提供支撑和电连接，这些部件包括致动电极、连接它们的迹线(其可以是绝缘的)和/或包括热调节器155(示出为TEC)、温度传感器、一个或更多个光学传感器等的附加控制元件。用于控制致动电极的操作和/或控制向反应液滴施加补充液滴的一个或更多个控制器195 可以连接但是与第一板153和第二板151分离，或者它可以形成在第二板上和/或由第二板支撑。在图1A-1C中，第一板被示出作为顶板并且第二板为底板；这个方向可以被反转。还示出了溶剂(补充流体)的源或贮存器197通过管198而连接到第二板中的孔。

如所提及的，气隙104提供可以发生反应步骤的空间，从而提供可以容纳试剂并且可以例如通过混合、加热/冷却、与试剂(酶、标记等)相组合来处理试剂的区域。在图1A中，气隙104包括样本贮存器110和一系列试剂贮存器111。样本贮存器还可以包括用于将初始反应液滴引入DMF 设备的样本装载特征。样本装载可以从上方、从下方或从侧面装载并且可以基于正在进行的反应的需要而是独特的。图1A中所示的样本DMF设备包括六个样本试剂贮存器，其中每个试剂贮存器包括用于将各试剂引入相应贮存器中的开口或端口。试剂贮存器的数量可以根据所执行的反应而变化。样本贮存器110和试剂贮存器111通过反应区112流体连通。反应区 112与致动电极层106电连通，其中致动电极层106位于反应区112的下方。

致动电极106在图1A中被描绘为网格(grid)或单位单元。在其他实施例中，致动电极基于反应的需要可以处于完全不同的图案或排列中。致动电极被配置为将液滴从DMF设备的一个区域移动到另一个区域或更多个区域。可以通过切换致动电极的电压来控制液滴的运动并且在某种程度上控制液滴的形状。可以通过以受控的方式顺序地对电极进行通电和断电来使一个或更多个液滴沿着致动电极的路径移动。在所示出的DMF装置的实例中，一百个致动电极(形成大约一百个单位单元)与七个贮存器(一个样本贮存器和六个试剂贮存器)连接。致动电极可以由任何适当的导电材料制成，例如，铜、镍、金或其组合。

由致动电极形成的全部或一些单位单元可以与至少一个热调节器(例如，TEC 155)和至少一个温度检测器/传感器(RTD 157)热连通。在所示出的实例中，致动电极与均包括热电加热器/冷却器155和电阻式温度检测器(RTD)157的四个热区相集成；可以使用更少或更多的热区。图7 示出了具有附接到第二(底)板的热调节器和温度传感器的空气基质DMF 设备的底部表面的示例。每个热调节器和温度传感器附着至底板。图7还示出了热导管通过管道使热量穿过底部DMF板传导至一组六个致动电极，其在用于每个热区的这六个致动电极上方在气隙中形成热区。可以独立于其他设备控制设备的四个热区115中的每一个，使得可以同时保持四个不同的芯片上的温度。这些区中的每一个可以通过形成在第二板的基板中的 (图1A中所示的)热空隙114与设备的其余部分热隔离。热空隙114可以在不同热区115之间提供隔热和隔离。液滴温度的快速变化可以通过从一个热区到另一个热区穿过气隙的传输和/或通过控制单个热区的温度来实现。通常，热区的温度可以被精确地控制。例如，由RTD在第二板的背面上测量的与使用插入到液滴中的微细热电偶(fine-gauge thermocouple) 测量的它对应热区内的液滴的温度差，并且结果为3℃(±0.5℃)。差异主要是跨PCB基板的温度下降的函数而不是环境温度的函数。为了解决这个温度差，可以将补偿因子结合到热区温度设置的程序设计中，以确保区域局部化的液滴达到期望的温度。

在图6中示出了热区(例如，热调节器和温度传感器)的操作的另一个实例。图6示出了在4.3℃(顶部)、42℃(中部)和65℃(底部)的三个不同温度下的热区中和热区周围的表面温度的曲线。从(通过热图像的中间区域得到的)温度曲线可以看出，对于所有的三个温度，该温度最接近热区中心的期望温度。图8示出了随时间变化的温度周期的轨迹。如所示出的，空气基质DMF装置能够在(方框中的)热区上保持合理的恒定温度，并且在热区之外迅速下降。

与本文中所描述的装置(其是空气基质DMF)相比，现有技术的DMF 装置通常使用油浸DMF技术来解决特别是在加热时蒸发的问题。在一些情况下，液滴被包裹在油或水/油外壳中。当将反应液滴浸入油中时为在加热期间的液滴蒸发提供帮助，稍后必须执行另外的步骤和机制以从液滴去除油。那些使用油浸的技术还必须确保油不会干扰后续的反应步骤。因此，在气体/空气环境中执行大多数反应将是优选的。

相比之下，如本文中所描述的使用控制器在一个或更多个反应液滴中补充溶剂可以不使用油来防止溶剂蒸发，尤其是在需要高温和/或长的培养时间的操作期间(例如，对于水滴的≥65℃并持续≥1分钟)。为了抵消蒸发，本文中所描述的空气基质DMF装置和方法允许温度受控的生物化学反应，其中具有受控体积和温度的预处理的(例如，溶剂的)补充液滴当被控制器触发时被周期性地添加以补充反应液滴。通常，随着反应液滴的体积由于蒸发量大于阈值而开始降低时，具有受控体积的补充液滴被分配到DMF装置的气隙中，并且(例如，通过匹配反应液滴的温度、与一种或更多种试剂相结合等)被处理并被运送以与反应液滴相结合/合并。这被示出在图1D-1H中。

图1D-1H示出描绘了补充方法的一个实例以对蒸发进行说明一系列图像。在图1D中，反应液滴112被保持在最左边的第一热区115内。在右侧看到一个孔(通孔116)。控制器可以监测反应液滴112的体积。在一些变型中，该装置在由控制器检测到的体积减小而被触发时，可以通过该孔“预装载”来自溶剂的贮存器的补充液滴；可选择地，可以根据需要分配补充液滴。可以通过孔116引入补充液滴。如所提及的，孔可以穿过第一板或第二板延伸到气隙中。

一旦被引入到气隙104中，控制器可以通过任何适当的方式，包括光学地(例如对液滴成像)、通过确定液滴的边界(例如，表面)来检测液滴的尺寸来监测气隙中的液滴的体积(例如，尺寸)，并且计算总体尺寸和/或液滴相对于单元单位的数量和位置的尺寸或范围。例如，该装置可以包括相机和/或透镜，其被配置为对在气隙中的一个或更多个液滴成像(例如，通过一个或两个板的)，测量液滴的尺寸(例如，面积)并且将所测量的尺寸与可以基于(可以是预设的或者可以是从早期的测量导出的)基线的阈值进行比较。因此，控制器可以包括图像处理硬件、软件和/或固件 (例如，逻辑)以确定液滴尺寸和/或将液滴或液滴尺寸与基线进行比较。当液滴的尺寸(作为体积的代表)已经降低了阈值量时，控制器可以通过将受控体积的溶剂移动到相同的热区或与反应液滴的温度曲线匹配的热区，从而允许补充液滴达到反应液滴的温度来准备溶剂的补充液滴，并且然后，一旦温度大致匹配，则将两者结合起来。例如，致动电极可以被激活以移动反应液滴附近的补充液滴。在将补充液滴与反应液滴合并之前，可将补充液滴的温度调节至反应液滴的温度。

如在图1E中所示，补充液滴可以从孔116(“通孔”)释放。图1C和 7示出了穿过第二板(底板)直到气隙104的孔的实施例。在图1C中，底板安装有毛细管和管件(fitting)以将毛细管固定到通孔116。图7示出了空气基质DMF装置的实例的底部表面，示出了可以如何连接管件705与管703。在这个实例中，管703可以连接到孔并且因此通过管件705流体连接到气隙并且还连接到溶剂贮存器(在图7中不可见)。一个或更多个溶剂贮存器可以经由适当的管连接到通孔通道/孔。在一些变型中，还可以使用(由控制器控制的)阀。

如图1F和1G中所示，空气基质DMF装置的控制器可以将溶剂的补充液滴185从分配源(孔116)移动(箭头188)到与反应液滴相同的热区，如图1G中所示。一旦到达那里，控制器可以允许液滴停留在那里直到它已经与反应液滴的温度近似平衡(例如，1秒、2秒、5秒、7秒、8秒、9 秒、10秒、12秒、15秒、20秒、30秒、45秒、1分钟等)。之后，如在图1H中所示。控制器可以使溶剂的液滴与含有形成反应混合物的溶剂和溶质的反应液滴相结合)。在图1H中示出了补充的反应液滴112'。这个过程可以根据需要经常重复进行。

如本文中所描述的将一个或更多个补充液滴与反应液滴温度进行温度匹配是十分有效的，并且发明人已经发现，它使得在合并时对反应液滴中正在进行的反应的影响最小化，出人意料地促进了反应动力学的一致性。通常，当如本文中所描述的反应液滴与补充液滴结合时，反应液滴中的温度变化导致反应液滴温度的≤1℃的变化。表1示出了四种不同温度下的温度下降和补充后所得到的反应液滴的温度的变化。

表1

在一些实例中，为了最小化可能不利地影响反应动力学的溶质浓度的变化，在损失了它初始(目标)体积的15-20％时用溶剂补充反应液滴。使用这个方法，2μL的反应液滴在宽的温度范围(例如，35-95℃)上保持大致恒定的体积(≤20％的变化)。在图2中示出了示出在相同时间段上反应体积(柱条，左侧的刻度)和用于维持该体积的补充液滴数量(虚线，右侧的刻度)的变化性的曲线图。对于较高的温度，例如，75℃和95℃，需要更多数量的液滴以将反应混合物保持在2μL的恒定体积(分别为约 30和55个液滴)。在较小体积(nL到pL)时，这可以通过减小DMF板之间的间隙间距和/或致动电极的尺寸来实现；较小的液滴更容易蒸发，然而，可以以更高的频率发生这样的补充以保持目标体积。在这个实例中，液滴均为0.5μL并且实验进行30分钟。在其它实施例中，补充液滴的体积在0.2至10μL之间(例如，0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10μL等)。

如所提及的，空气基质DMF设备可以通过视觉监测来检测蒸发并且反应体积可以由控制器(或手动地)“及时”补充。可选择地或另外地，该装置可以被配置为通过以取决于反应液滴被维持的温度的频率自动补充液滴而以开环方式(open-loop fashion)补充反应液滴。在这个变型中，控制器可以仅监测反应液滴保持在特定温度的时间并且可以基于该一个或更多个培养温度以一时间间隔提供补充液滴。因此，可以就何时可能需要补充反应液滴进行估计，并且补充液滴可以在附近保持等待并且在与反应液滴结合之前被加热一短时间段。通常，可以基于在反应步骤的过程中对反应液滴的检测或监测来引入补充液滴。

如上文所提及的，还可以在闭环(或半闭环，允许用户干预或预定异常)的基础上控制补充时间。例如，空气基质DMF设备通常可以包括感测和反馈控制系统(控制器)，其中监测反应液滴的体积(例如，尺寸) 和/或浓度，并且在达到预定阈值时，通过添加补充液滴自动重建体积。

如上文所提及的，作为上文所描述的视觉/光学方法的可选择的或另外的方案，例如蒸发的检测可以通过检测由反应液滴(例如，相邻和上方或下方)所占据的电极处的电特性来实现。例如，与每个单位单元或一组单位单元相关联的致动电极或单独的感测电极可被配置为使用反应液滴相对于一个或更多个单位单元的位置来监测反应液滴尺寸上的任何变化。例如，大约4μL的反应液滴可以与两个单位单元重叠；与这些单位单元相对应的电极可以通过致使致动电极和/或感测电极与接地之间(或者在相邻的致动电极和/或感测电极之间)的电特性(例如，电容，电阻等)变化的液滴底面积的变化来感测液滴的存在；液滴的体积在单位单元内(或整个液滴)可能影响电特性。当整个单位单元不再包含反应液滴的流体时，情况尤其如此。当单位单元中的一个(例如，通过询问与单位单元相关联的致动电极)不再包含足够的反应液滴(并且其中没有发生液滴移出单元的情况)时，控制器可以在给定的时间段内准备补充液滴。空气基质DMF装置可以被配置或校准以针对进行检测的不同的液滴体积和/或针对触发补充的不同的体积减小/蒸发的阈值，例如，当液滴已经降低一定的百分比(例如，20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％等)时。在一些其他变型中，控制器能够感测反应液滴的电容、阻抗、电阻等的变化，并且基于所检测到的阻抗或电容的变化来启动补充方案。

因此，在本文中所描述的任何空气基质DMF装置中，控制器可以被配置为使用致动电极来感测液滴(反应液滴)的尺寸。在DMF装置的标准操作中，可以通过向邻近液滴的电极施加电压来移动液滴。可以使用基于电特性的反馈来检测液滴致动/移动的成功。例如，DMF装置可报告由当随着液滴移动液滴在致动电极与大地之间(或离开致动电极)时的变化所导致的电参数值的变化。如(改编自由Shih等人的Lab Chip,2011,11, 535-540的)图9所示，液滴可以被模型化作为电路(RC电路)的一部分并且它的电特性(例如，RC特性)可以是作为(在节点处，如可以在图9 中所示出的1M的电阻两端测量出的)所测量的电势Vfeed的函数来感测或检测。当电极(例如，致动电极906)上不存在液滴时，由于空气的阻抗非常高，Vfeed的值等于零；随着液滴在电极上移动时，液体的有限阻抗逐渐将Vfeed增加到正阈值，反映了全电极覆盖和成功的液滴致动。在这种情况下Vfeed的改变或者取决于液滴面积的尺寸的任何其它反馈参数的改变可以被用来推出两种类型的信息：第一，液滴驱动是否成功并且液滴是否完全占据电极(并且这样可以重新施加/调节驱动电势以校正液滴运动)，并且第二，液滴占据了多大的面积。

图10示出了电特性(反馈)参数与液滴尺寸之间的相关性。如所示出的，液滴越大，并且因此被液滴覆盖的电极面积越大，则电压读数(例如，来自诸如图9中所示的电路的检测电压Vfeed)越高。关于由液滴覆盖的面积的信息因此可以用于确定静止液滴的蒸发速率。例如，蒸发速率可以用于触发像如本文中所描述的液滴补充的蒸发管理方法。在一个实例中，假设反应液滴的基准体积(baseline volume)占单位单元中的电极“覆盖区域”的100％；如果反馈电压读数指示70％的电极面积被液滴覆盖，则控制器可以确定30％的液滴已经蒸发，并触发补充液滴的释放、预处理和与反应液滴合并以校正对于提及的损失。

在其他变型中，可以通过视觉/光学手段来监测液滴尺寸的变化。如所提及的，空气基质DMF装置可以耦接到光学检测器以监测反应过程中的液滴尺寸。光学检测器可以与控制器通信，使得当出现反应液滴的体积下降到小于特定阈值量时，控制器将启动适当尺寸(例如，固定的尺寸或与蒸发量相匹配的尺寸)的经预处理的(例如，温度匹配的)补充液滴以进行传送。例如，在一个变型中，反应液滴可以用染料或其他有色标签着色，使得当检测器测量到反应液滴中的比色变化(反应液滴的亮度增加)时，它将启动补充滴方案以加热或冷却试剂液滴并且将其送至反应液滴。在一些情况下，它可以使用当反应液滴已经减少了预定体积时提供荧光强度变化的荧光标签。

在一些实例中，空气基质DMF装置可以包括与外部的智能设备或计算机源(例如，台式机、膝上型计算机、移动设备等)通信的电路，其中智能设备或计算机可以控制、监测和/或记录被发送以补充反应混合物的液滴。专用于监督补充过程的程序在反应在它的不同步骤中要求不同的温度或不同的试剂的实例中会是有利的。

已经对本文中所描述的补充技术进行了分析，示出了与对应的传统技术相比的可比较的或优异的结果。例如，图3A-3C示出了来自RNA断裂实验的一系列轨迹。令人惊讶的是，如通过比较图3B和3C所示，使用本文中所描述的补充装置和方法获得了较高的产量。实验条件的详细描述包含在下面的实施例3中。在图3A中，频谱示出了未断裂的起始RNA。图 3B的频谱示出了如此处所描述的使用如本文中所描述的采用了补充液滴的空气基质DMF装置的断裂反应的结果，并且图3C中所示出的频谱示出了使用常规方法的断裂结果。可以看出，从空气基质DMF装置获得的频谱与从常规方法获得的频谱相比具有几乎相同或更高的产量。甚至频谱的细小的特征(例如，左侧的细肩部和右侧的更宽的肩部)存在于两个频谱中。

类似地，图4A和4B示出了使用如本文中所描述的使用补充液滴的 DMF设备和方法与常规qPCR技术相比的DNA合成的比较。图4A示出了与常规技术相比较的空气基质DMF装置的阈值循环时间并且图4B示出了结果。如所示出的，空气基质DMF装置的阈值循环(Ct)几乎与使用常规方法的阈值循环相同。图4B示出了来自空气基质DMF装置(顶部) 和来自常规方法(底部)的频谱。从这两个频谱可以看出，来自如本文中所描述的使用补充液滴的空气基质DMF装置的结果产生了在200与400 bp之间发荧光的产物，与从传统方法获得的所得产物相似或相同。而且，两个信号的幅度也是相似的强度。令人惊讶的是，由空气基质DMF装置得到的产物比常规技术得到的频谱更干净，常规技术在300bp与400bp 之间看起来有较多噪声。

图5示出了使用凝胶电泳的、由使用如本文中所描述的利用补充的空气基质DMF装置与常规手段得到的传统PCR实验结果的比较。如凝胶所示，当与阶梯标准(ladder standard)比较时(实验细节可以在实施例4中找到)，空气基质DMF装置导出的结果与常规方法都产生目标200bp的片段。

实施例1：RNA提取

为了从人的PBMC提取总RNA，使5-10×10⁶个细胞在4℃下以1000 rpm受离心作用5分钟，并再悬浮于1ml的RNAzol(Molecular Research Center；Cincinnati,,OH)中，接着用400μL的水进行稀释。在室温(RT) 下培养15分钟后，使样本在4℃下以16000rpm受离心作用15分钟，并且将来自各管的约800μL的水相转移到新的2ml的管中并且与乙醇1:1 混合。使用Direct-zol试剂盒(Zymo Research；Irvine,CA)按照制造商的说明并且在10μL的水中洗脱来使纯化的总RNA恢复。使用Qubit 2.0荧光计(Life Technologies；Carlsbad,CA)量化RNA产量，并且使用配备有 RNA Nano 6000芯片的2100生物分析仪(Agilent；Santa Clara,CA)评估断裂尺寸分布。在-80℃下存储RNA样本。

实施例2：RNA断裂

在三个步骤中实现DMF介导的RNA断裂。首先，将含有180ng/μL 的人的PBMC总RNA(最终为270ng的RNA)和稀释的10X NEBNext 断裂缓冲剂(New England Biolabs；Ipswitch,MA)的液滴(0.5μL)(最终为4X)的三滴液滴(各0.5μL)从它们各自的贮存器被分配，在DMF表面上混合10秒并运送到热区。其次，将反应液滴(最终为2μL、270ng 的RNA和1X的断裂缓冲剂)在94℃下培养3分钟。最后，将反应物冷却至4℃，并且通过利用NEBNext停止溶液(New England Biolabs；Ipswitch, MA)的液滴(0.5μL)补充反应物来终止RNA断裂。通过在实验的过程中加入无核酸酶蒸馏水的六个补充液滴(各0.5μL)来维持反应体积。对于使用常规小试规模法进行的RNA断裂，除了体积[18μL的15ng/μL的 RNA(最终为270ng RNA)，2μL的10X的断裂缓冲剂(最终为1X)和 2μL的停止溶液]之外，处理是完全相同的，并且在由常规热循环仪加热的微量离心管中进行培养。在这两种情况下，使用Zymo RNA Clean和 Concentrator-5系统(Zymo Research；Irvine，CA)，按照制造商的一般步骤并且在5μL的无核酸酶蒸馏水中洗脱来使RNA断裂反应产物纯化。使用 2100生物分析仪(Agilent；Santa Clara,CA)上的RNANano 6000芯片分析RNA断裂尺寸分布。

实施例3：cDNA合成

通过DMF或Peregrine方法的小试规模的实施方案来完成第一链 cDNA合成。对于DMF介导的cDNA合成，开发了五个步骤的方案。第一、断裂的人的PBMC总RNA(100ng)的0.5μL的液滴和引物PP_RT (25mM)的0.5μL液滴从它们各自的贮存器被分配、在DMF表面上合并并且混合并且将1μL的液滴运送到热区。第二、将液滴在65℃下培养2 分钟，并且然后立即冷却至4℃。第三、三滴主混合物的液滴[均为0.5μL，包含45％的SMARTScribe 5X第一链缓冲剂(First-Strand Buffer)(Clontech； Mountain View,CA)，5.5％的20mM的DTT，22％的10mM的dNTP混合物，5.5％的RiboGuard RNase抑制剂(Epicentre；Madison,WI)和22％的SMARTScribe逆转录酶(Clontech；Mountain View,CA)以及0.1％W/v 的聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(Pluronic)F127]被分配到DMF表面，与 1μL的液滴合并并且将反应物在RT下培养3分钟，紧接着在42℃下培养 1分钟。第四、0.5μL的引物PP_TS(12mM)液滴与反应液滴合并并且在42℃下继续培养1个小时。最后、通过在70℃下培养5分钟来终止反应。在所有的情况下，如上所述，通过使反应液滴在设定在期望温度的热区115之间穿梭来执行温度变化。通过在实验过程中添加无核酸酶的蒸馏水的13个补充液滴(各0.5μL)来保持反应体积。对于使用常规的小试规模法的第一链cDNA合成，除了体积(3.5μL的断裂RNA、1μL的引物 PP_RT、4.5μL的主混合物和1μL的引物PP_TS)之外，处理是相同的，并且在通过常规热循环仪加热的微离心管中执行培养。在这两种情况下，使用AMPure XP珠(Beckman Coulter Genomics；Danvers,MA),按照生产商的方案，使用1.8X的体积并使用10-20μL的无核酸酶的蒸馏水洗脱来使第一链cDNA合成反应产物纯化。使用基于qPCR的测定来确定从第一链cDNA合成反应产物最理想地产生高质量双链cDNA库所需的PCR 循环的数目。在无核酸酶水中1:10地稀释第一链cDNA后，将1μL稀释液与5μL的SsoFast EvaGreen SuperMix(Bio-Rad；Hercules,CA)、3μL的无核酸酶水、0.5μL的10mM引物PP_P1 (5'-CAGGACGCTGTTCCGTTCTATGGG-3')和0.5μL的10mM引物 PP_P2(5'-CAGACGTGTGCTCTTCCGATC T-3')相结合。在CFX96qPCR 机器(Bio-Rad；Hercules,CA)上使用以下循环参数反复四次进行测定：95℃下持续45秒，接着95℃下持续5秒和60℃下持续30秒的25次循环。荧光强度超过检测阈值(即，循环阈值(Ct)]的周期数被识别为最理想的用于从未稀释的第一链cDNA合成反应产物产生双链cDNA库。使用2100 生物分析仪(Agilent；Santa Clara,CA)上的高灵敏度DNA测定芯片分析 cDNA库的产量和尺寸分布曲线。

实施例4：PCR

将来自噬菌体M13mp18的单链基因组DNA在无核酸酶的水中稀释至 250pg/μL的浓度。设计用于扩增M13mp18基因组的200-bp区域(位置 4905-5104)的正向引物和反向引物(在10mM Tris-HCl中各500μM)以等摩尔比混合并在无核酸酶的水中稀释至产生4X储备溶液(每个引物4 μM)。使用补充有0.025单位/μL的Hot Start Taq聚合酶(New England Biolabs；Ipswitch，MA)的Hot Start Taq 2X Master Mix(New England Biolabs； Ipswitch，MA)组合PCR反应物，在2X Master中有效地使Tap浓度翻倍。为了在DMF设备上进行PCR，(各自0.5μL的)主混合物、引物和模板的液滴从它们各自的贮存器分配、在DMF表面上合并并且混合，并运送到热区115进行温度循环(表S1)：在95℃下持续45秒；然后在95℃下持续20秒、在50℃下持续30秒并且在68℃下持续45秒的33个循环；最后在68℃下持续5分钟。在每个95℃的步骤结束时，将补充液滴(各 0.5μL)加入到反应液滴中。对于常规的PCR，反应混合物组成是相同的，但是放大到总共20μL，并且温度循环是相同的，但是使用常规的台式热循环仪(CFX96；Bio-Rad；Hercules，CA)完成。PCR产物通过凝胶电泳进行分析，使用E-Gel电泳系统(Life Technologies；Carlsbad，CA)中的2％琼脂糖凝胶。

当在本文中提到特征或元件“在”另一特征或元件“上”时，它可直接在其他特征或元件上或也可能存在介于中间的特征或元件。相反，当提到特征或元件“直接在”另一特征或元件“上”时，则不存在介于中间的特征或元件。还将理解的是，当提到特征或元件“连接”、“附接”或“耦接”到另一特征或元件时，它可直接连接、附接或耦接到其他特征或元件或者可以存在介于中间的特征或元件。相反，当提到特征或元件“直接连接”、“直接附接”或“直接耦接”到另一特征或元件时，则不存在介于中间的特征或元件。尽管参照一个实施方式进行了描述或示出，但是这样描述或示出的特征和元件可以应用于其他实施方式。本领域技术人员还将认识到，提到“邻近”另一特征布置的结构或特征可具有与相邻特征重叠或在相邻特征下方的部分。

本文中所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且不旨在限制本公开。例如，除非上下文另有清楚说明，否则如本文中所用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”旨在同样包括复数形式。将进一步理解，术语“包括(comprises)”和/或“包含(comprising)”当在本说明书中使用时，指定所陈述的特征、步骤、操作、元素和/或部件的存在，但不排除存在或添加一个或更多个其它特征、步骤、操作、元素、部件和 /或它们的组。如本文中所使用的，术语“和/或”包括相关联的所列项目中的一个或更多个的任意组合和所有组合并且可被缩写为“/”。

在本文中可以使用诸如“在...之下(under)”、“在...下面(below)”、“在…下(lower)”、“在...之上(over)”、“在...上面(upper)”等的空间相关术语，用于便于描述如附图中所示的一个元件或特征与另外的一个或更多个元件或特征的关系。将理解的是，空间相关术语旨在涵盖除了附图中描绘的定向之外的、设备在使用或操作时的不同定向。例如，如果附图中的设备被反转，因此，被描述为“在”其它元件或特征“之下(under)”、“在”其它元件或特征“下方(beneath)”的元件将将被定向成“在”其它元件或特征“之上(over)”。因此，示例性术语“在...之下(under)”可涵盖在...之上和在...之下的两种定向。该设备可以以其他方式定向(旋转90度或处于其他定向)并且据此解释本文中所使用的空间相关描述。类似地，除非另有明确说明，否则术语“向上(upwardly)”、“向下(downwardly)”、“垂直(vertical)”、“水平(horizontal)”等在本文中仅用于说明的目的。

尽管术语“第一”和“第二”在本文中可以用于描述各种特征/元件(包括步骤)，但这些特征/元件不应受这些术语的限制，除非上下文另有说明。这些术语可以用于将一个部件/元件与另一个部件/元件区分开。因此，在不脱离本公开的教导的情况下，下面论述的第一特征/元件可以被称为第二特征/元件，并且类似地，下面论述的第二特征/元件可以被称为第一特征/ 元件。

贯穿本说明书和所附的权利要求书，除非上下文另有要求，否则单词“包括”，并且诸如“包含”和“含有”的变型意味着可以在方法和制品中结合地使用各种组成部分(例如，组合物以及包括设备和方法的装置)。例如，术语“含有”将被理解为暗示包含任何所陈述的元件或步骤，但不排除任何其它元件或步骤。

除非另有明确说明，否则如在本文在说明书和权利要求书中所用的，包括在实例中所用的所有数字可以被读作好像以单词“约(about)”或“近似(approximately)”开头，即使该术语没有明确出现。当描述幅度和/或位置以指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内时，可以使用短语“约”或“近似”。例如，数值可以具有为设定值(或值的范围)的+/-0.1％、设定值(或值的范围)的+/-1％、设定值(或值的范围) 的+/-2％、设定值(或值的范围)的+/-5％、设定值(或值的范围)的+/- 10％等的值。本文中所陈述的任何数值范围旨在包括包含在其中的所有子范围。

尽管上面描述了各种示例性实施方式，但是在不脱离如通过权利要求所描述的本公开的范围的情况下，可以对各个实施方式进行若干改变中的任一个。例如，在可选择的实施方式中，通常可以改变执行各种所描述的方法步骤的顺序，并且在其他可选择的实施方式中，可以一起跳过一个或更多个方法步骤。各种设备和系统实施方式的可选特征可以被包含在一些实施方式中而不被包含在其他实施方式中。因此，前面的描述主要被提供用于示例性的目的，并且不应被解释为限制如在权利要求中阐述的本实用新型的范围。

本文中所包含的实例和图示通过示例性而非限制的方式示出其中可以实践主题的具体实施方式。如所提及的，可以利用和从其得到本主题的其他实施方式，使得可以在不脱离本公开的范围的情况下对结构和逻辑进行替换和改变。仅为了方便，实用新型主题的这样的实施方式在本文中可单独地或共同地由术语“公开”来提及，并且如果实际上公开了一个以上的话，并不旨在将本申请的范围主动地限制为任何单个实用新型或实用新型构思。因此，尽管本文中已示出和描述了特定实施方式，但是被设计为实现相同目的的任何布置可以替代所示的特定实施方式。本公开旨在覆盖各种实施方式的任何和所有修改或变型。在阅读以上描述后，上述实施方式的组合以及本文未具体描述的其他实施方式对于本领域技术人员来说将是明显的。