特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP‑RNAi表达盒及应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体是涉及一种提高玉米籽粒大小的方法。

背景技术：

玉米是全世界最主要的禾谷类粮食和饲料作物之一，广泛应用于农业、工业及食品行业。由于胚乳占玉米籽粒重量80％-85％左右，胚乳细胞的分裂和发育状况决定着籽粒的重量和品质。而植物的胚乳发育是一个高度程序化的过程，在多个层面上受到精确调控，其发育及调控机制是生殖与发育生物学领域的前沿科学问题。

由于胚乳发育对玉米籽粒形成的重要性，近些年来，玉米胚乳发育的分子机理研究逐渐得到国内外研究者的关注。中国农业大学赖锦盛教授以及中国农业科学院张春义教授课题组分别研究发现，玉米胚乳的转录调控过程中存在大量的新转录区域，且多为胚乳组织特异性表达，除贮藏蛋白基因外，仍有大量差异基因的表达(Lai et al.2004；Lu et al.2013)。除从全基因组水平的研究外，细胞周期调控网络逐渐成为人们探讨玉米胚乳发育分子机理的研究热点。Leiva-Neto等研究发现，在玉米胚乳中特异性表达CDKA1-DN显性负相关等位基因，可使玉米胚乳胞内复制水平降至50％左右(Leiva-Neto et al.2004)。Sabelli等发现CYCA1；3在玉米胚乳发育游离核期大量表达，而CYCB1；3，D5；1和D2；1在胚乳发育中期高表达，说明不同亚族CYCs在玉米胚乳发育的不同阶段可能发挥不同的调控作用(Sabelli 2012)。同一课题组最近在PNAS杂志发表文章表明，在玉米胚乳发育的过程中，视网膜母细胞瘤相关蛋白(RBR)可负向调节CDKA；1活性，通过RNAi手段下调RBR1基因的表达，可以促进胚乳的细胞分裂和胞内复制(Sabelli et al.2013)。通过以上研究分析可知，玉米胚乳存在大量组织特异性表达基因，玉米胚乳发育各个时期，细胞周期相关调控蛋白的表达量及功能不尽相同。

细胞周期调控系统控制细胞的分裂，从而维持有机体的正常代谢和增殖，其核心成分是CDKs，这些激酶活性的周期性变化，控制着细胞周期进程。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDK inhibitors,CKIs)通过结合并抑制CDKs的活性来调控细胞周期进程，在阻止细胞分裂、响应环境信号等方面起着非常重要的作用(Morgan 1997)。植物CKIs与哺乳动物Kip/Cip家族具有较高的同源性，因此植物CKIs命名为Kip-related protein，简称为KRPs。KRPs对植物胚乳发育过程的调控作用已得到初步研究。如等人研究发现，过量表达Orysa；KRP1基因促使胚乳细胞核内复制水平下降，水稻种子内含物减少，胚乳细胞数量减少( et al.2006)。原位杂交分析表明Orysa；KRP3基因在水稻开花后第2天胚乳游离核期表达，但在开花后第5天胚乳细胞化期表达急剧下降，酵母双杂交实验证实Orysa；KRP3与Orysa；CKA1；1、Orysa；CKA2、以及Orysa；CYCD2；2互作，表明Orysa；KRP3可能参与调控水稻胚乳游离核期的细胞周期进程(Mizutani et al.2010)。

综合本领域的研究现状，KRPs在植物的不同组织及植物发育的不同阶段发挥着极其重要的作用，在调控植物胚乳发育过程中所发挥的重要功能也越来越凸显，但玉米胚乳游离核发育细胞周期进程的分子调控机制尚不明朗，通过抑制玉米KRP家族基因提高玉米籽粒大小的方法未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒。

本发明的第二个目的是提供一种含有特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的质粒。

本发明的第三个目的是提供一种含有特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的质粒的细胞株系。

本发明的第四个目的是提供含有特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的质粒的细胞株系在提高玉米籽粒大小的应用。

本发明的技术方案概述如下：

特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒，是由胚乳特异性启动子、SEQ ID No:1所示的核苷酸序列、SEQ ID No:3所示的核苷酸序列和SEQ ID No:1的反向序列组成，所述SEQ ID No:1所示的核苷酸序列、SEQ ID No:3所示的核苷酸序列和SEQ ID No:1的反向序列形成发夹结构。

胚乳特异性启动子的核苷酸序列优选SEQ ID No:2所示。

含有上述特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的质粒。

含有特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的质粒的宿主菌。

含有特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的质粒的宿主菌在提高玉米籽粒大小的应用，包括如下步骤：利用权利要求4所述宿主菌对玉米进行遗传转化操作，遗传筛选得到基因组含有所述KRP-RNAi表达盒的、提高玉米籽粒大小的转基因玉米株系。

本发明的优点：

本发明利用RNAi技术，构建了含有特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的植物双元表达质粒,将此质粒通过宿主菌转化玉米，成功抑制了KRP基因的表达，转基因株系显著提高了玉米籽粒大小，提高了玉米植株的丰产性，且对植株形态特征和生育期无影响，在玉米育种中具有重要意义和有良好的应用价值。

附图说明

图1为从玉米叶片中克隆SEQ ID No:1所示的KRP基因片段。1：空白对照，2：PCR产物，M：DNA marker III。

图2为重组质粒用PstI酶切结果。1-5为质粒，M：DNA marker III。

图3为农杆菌菌落PCR检测结果。M：DNA marker III，1:C58阴性对照，2：质粒阳性对照，3-10：农杆菌转化菌落。

图4为转基因玉米基因组DNA的PCR检测，M：DNA marker III，1:野生型阴性对照，2：质粒阳性对照，3-8：转基因阳性植株L1-L6。

图5为转基因玉米基因组DNA的KRP基因表达水平检测，M：DNA marker III，1:野生型对照，2-7：转基因阳性植株L1-L6。

图6为转基因玉米籽粒大小与非转基因玉米籽粒对比图，A为玉米转基因株系L2籽粒，B为非转基因玉米籽粒。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

B73玉米为商品化玉米自交系。

实施例1

玉米总RNA提取与逆转录。

所用仪器，玻璃器皿用180℃烘烤4h，塑料器皿，如枪头，离心管等可用0.1％DEPC浸泡过夜，再高压灭菌(121℃，20min)，烘干备用。

以试剂盒RNAeasy kit(Qiagen)从100mg新鲜B73玉米叶片中提取总RNA。以1μg RNA为模板，用iScript^TM cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)试剂盒进行反转录，得到cDNA第一链，反应体系如下：

5X iScript Reaction Mix：4μl

Transcriptase：1μl

RNA：15μl

实施例2

KRP基因CDS部分片段的克隆。

根据玉米KRP基因序列进行引物设计(GenBank accession number NM_001112308)，扩增其CDS中340bp片段为KRP-RNAi表达盒中的正向序列即SEQ ID No:1核苷酸序列。

引物序列：

SEQ ID NO.4所示上游引物为：5'-GGGCCCCTCGAGTGCAAGGCGTCGTCTCCCTG-3'

SEQ ID NO.5所示下游引物为：5'-GGGCCCAGATCTTCTCGAGCCTCCGGTTCCTT-3'。

PCR反应体系：

10X Buffer：5μl

2.5mM dNTP(超纯)：4μl

引物(Forward)：1μmol/L

引物(Reverse)：1μmol/L

模板(cDNA第一链)：1μl

Pfu DNA聚合酶：1U

加水补至50μl

PCR程序：

94℃预变性 5min

94℃变性 30s

58℃退火 30s

72℃延伸 1min

30个循环

72℃延伸 8min

取4μL产物进行凝胶电泳检测，序列测定由Invitrogen公司完成，PCR产物检测结果如图1所示。

实施例3

KRP基因CDS部分片段(SEQ ID No:1所示的核苷酸序列)与载体连接

将实施例2获得的PCR产物按以下步骤进行纯化：

1.加与产物等体积的氯仿，剧烈混匀，13000r/min，离心10min。

2.取上清，加1/10体积的NaAc(3M)，混匀。

3.加总体积10/3体积的无水乙醇，-20℃沉淀3h，然后12000r/min离心10min。

4.加30μl去离子H₂O溶解沉淀。

用XhoI和BglII两个限制性内切酶将纯化的PCR产物和载体pUCCRNAi分别进行酶切过夜(37℃)，反应体系如下：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

XhoI：0.5μl

BglII：0.5μl

将以上酶切好的产物进行连接反应：

两个酶切产物65℃加热30min终止反应。琼脂糖凝胶电泳检测，定量分析，使PCR产物量与质粒载体量比例为10:1，进行连接反应(16℃，6h)。

反应体系如下：

PCR产物：13μl

质粒：3.5μl

T4DNA ligase Buffer：2.5μl

T4DNA ligase：1μl

ATP：2.5μl

H₂O：2.5μl

连接产物转化E.coli：

1.取出制备好的感受态细胞于冰上化冻后，加入连接产物，轻轻摇匀后在

冰上放置30min。

2.移至42℃水浴中热激90s，再迅速放回冰上冷却1min。

3.加入200μl不含抗生素的液体培养基于37℃振荡培养45min。

4.取100μl菌液涂布于含氨苄青霉素(Amp)的筛选平板上，置37℃下培养12h。

5.从平板上挑取抗性菌落进行鉴定和保存。

连接产物鉴定：

挑取抗性菌落，放在含Amp 100mg/L LB液体培养基中培养，提取质粒DNA，在进行酶切验证。得到连接KRP基因CDS部分片段(340bp)的pUCCRNAi命名为pUCCRNAi-sense。

实施例4

反向KRP 340bp片段(SEQ ID No:1的反向序列)与pUCCRNAi-sense连接

将pUCCRNAi-sense，再进行KRP 340bp片段的反向连接。

用BamHI和SalI两个限制性内切酶将纯化的反向KRP 340bp片段的PCR产物和载体pUCCRNAi-sense分别进行酶切过夜(37℃)，反应体系如下：

质粒载体：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

BamHI：0.5μl

SalI：0.5μ

PCR产物：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

BamHI：0.5μl

SalI：0.5μl

连接、转化和鉴定过程与实施例3一致。

将连有正、反KRP片段的质粒命名为pUCCRNAi-sense-antisense。

实施例5

将中间序列SEQ ID No:3与pUCCRNAi-sense-antisense连接

根据SEQ ID No:3所示的核苷酸序列进行引物设计，扩增出两端含有BglII和BamHI酶切位点核苷酸序列。

引物序列：

SEQ ID NO.6所示上游引物为：5'-GGGCCCAGATCTGCGCCTTGTGAGCACGTTT-3'

SEQ ID NO.7所示下游引物为：5'-GGGCCCGGATCCTCTCGAGCCTCCGGTTCCTT-3'。

用BglII和BamHI两个限制性内切酶将纯化的PCR产物和载体pUCCRNAi-sense-antisense分别进行酶切过夜(37℃)，反应体系如下：

质粒载体：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

BamHI：0.5μl

BglII：0.5μ

PCR产物：

DNA：15μl

H-Buffer：2μl

H₂O：2μl

BamHI：0.5μl

BglII：0.5μl

连接、转化和鉴定过程与实施例3一致。

将连有正、反KRP片段以及中间序列的质粒命名为pUCCRNAi-sense-intron-antisense。实施例6

将pCAMBIA2300载体与胚乳特异性启动子的核苷酸序列SEQ ID No:2连接

根据SEQ ID No:2所示的核苷酸序列进行引物设计，扩增出两端含有BglII和BamHI酶切位点核苷酸序列。

引物序列：

SEQ ID NO.8所示上游引物为：5'-GGGCCCAGATCTGTTAACAGACCCGCCTCATT-3'

SEQ ID NO.9所示下游引物为：5'-GGGCCCGGATCCCATTGTTGGTACACTATTGT-3'。

用BglII和BamHI两个限制性内切酶将纯化的PCR产物和载体pCAMBIA2300分别进行酶切过夜(37℃)，反应体系与实施例5一致，连接、转化和鉴定过程与实施例3一致。

将连有胚乳特异性启动子核苷酸序列SEQ ID No:2的pCAMBIA2300质粒命名为pCAMBIA2300-Pzein。

实施例7

将sense-intron-antisense连接到表达载体pCAMBIA2300-Pzein中。

将质粒pUCCRNAi-sense-intron-antisense和pCAMBIA2300-Pzein分别用PstI酶切(37℃，过夜)。

DNA：50μl(两个质粒，各取25μl)

H-Buffer：20μl

H2O：128μl

PstI：2μl

两个酶切产物65℃加热30min终止反应。

将质粒pUCCRNAi-sense-intron-antisense切下的约900bp片段切胶回收，根据试剂盒说明书操作(Takara胶回收试剂盒)。

1.在紫外光源凝胶成像系统保护罩下，切取含DNA片段的琼脂糖，按切取重量：溶胶液体积为1:3(100mg：300μL)的比例加入Extraction Buffer。

2. 65℃水浴8min，至胶完全溶化。

3.将溶液置于离心柱中，静置1min，6000r/min离心30s。

4.弃去液体，在离心柱中加入500μL Washing Buffer，12000r/min离心30s，弃去液体。

5.在离心柱中加入650μL Washing Buffer，12000r/min离心30s，弃去液体。

6.重复步骤5。

7.12000r/min离心1min，甩干剩余液体。

8.加入20μL TE，静置2min，12000r/min离心1min即为回收的DNA。

将酶切后的质粒pCAMBIA2300-Pzein去磷酸化，37℃，1h，反应体系如下：

10X CIAP Buffer：10μl

CIAP：2μl

质粒：50μl

H₂O：38μl

去磷酸化产物75℃加热10min终止反应，和切胶回收的900bp片段进行连接，16℃，6h，体系如下：

900bp片段：10μl

去磷酸化质粒：9μl

T4DNA ligase Buffer：2.5μl

T4DNA ligase：1μl

ATP：2.5μl

连接产物转化细菌，提取质粒进行PstI酶切鉴定，结果如图2所示，1-5号为含有目基因的阳性质粒，将得到的新质粒命名为pCAMBIA2300-Pzein-sense-intron-antisense，其中Pzein-sense-intron-antisense的即为KRP-RNAi表达盒。

sense-intron-antisense为发夹结构。

实施例8

工程菌的制备，将含有KRP-RNAi表达盒的pCAMBIA2300-Pzein-sense-intron-antisense转化到农杆菌C58中。

1.从–80℃取出C58感受态，置于冰上，缓慢融化。

2.将2μl植物表达载体质粒DNA加入到200μl农杆菌C58感受态细胞中，用移液器混匀。

3.转移至电击杯中，置冰上放置。

4.设置好电击转化仪参数，25μF，400olm，1500V，时间为5ms，电击转化。

5.室温静置2min后加入1mL YEB培养液，28℃，200r/min培养3h。

6.离心收集菌液，沉淀用200μL dd H₂O悬浮，将菌体涂布于含100mg/L Ka YEB平板上，28℃培养48h，直至长出清晰可见的单菌落。

7.挑取单克隆菌落，并做好标记，将菌落分别溶于30μL无菌水中，煮沸10min，取上述菌液1μL作为模板，用克隆KRP片段的引物，进行PCR鉴定，结果如图3所示，3-10号农杆菌转化菌落为阳性菌株，得到含有pCAMBIA2300-Pzein-sense-intron-antisense质粒的C58农杆菌，即得到含有KRP-RNAi表达盒的宿主菌。

实施例9

玉米遗传转化。

将B73玉米未成熟胚愈伤组织浸入制备好的农杆菌液(OD600约为0.8)中，浸6-8min，使愈伤组织充分接触菌液，取出，用无菌的滤纸吸净多余的菌液后，正面朝下放入MS培养基中，25℃暗培养3d，将愈伤组织转移到新配制MS培养基中，两周换一次培养基，等小芽从愈伤上长出来到1cm左右，切出小芽移到1/2MS培养基中。

实施例10

转基因玉米移栽。

将在生根培养基中生长良好的转化植株去除封口膜，人工气候箱内炼苗3～5天，洗净培养基，种植在经过灭菌处理的蛭石中，人工气候箱内培养，控制适当的湿度(70％)、温度25℃和光照条件(16h光照/8h黑暗)，至健壮苗种植到温室中。

实施例11

转基因植物检测。

1.取植物新鲜叶片约1g放入研钵中，加300μL CTAB提取液，充分研磨。

2.混匀，于65℃温育1h。

3.加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻地颠倒混匀，室温下12000r/min离心10min。

4.取上清，加等体积异丙醇，会出现絮状沉淀，室温下12000r/min离心10Min。

5.弃上清，75％乙醇清洗2次。

6.烘干沉淀，溶于50μL dd H₂O中备用。

7.将基因组DNA进行PCR检测，通过选用npt II为目的片段设计引物。

SEQ ID NO.10所示上游引物为：5'-TATTCGGCTATGACTGGGCAC-3'

SEQ ID NO.11所示下游引物为：5'-GTCGATGAATCCAGAAAAGCG-3'。

结果如图4所示，转基因L1-L6株系玉米基因组DNA的PCR检测为阳性，基因组含有KRP-RNAi表达盒。

实施例12

半定量PCR检测KRP基因表达水平。

1.转基因玉米总RNA提取

提取方法同上述，严格按照说明书，所需枪头和离心管均从公司购买进口RNase-free产品，确保提取RNA无降解。提取RNA进行电泳检测，测定OD260、280，初步定量。

2.cDNA第一链合成

取相同浓度的RNA进行反转录，cDNA进行电泳检测，定量。

3.半定量PCR

取相同浓度的cDNA第一链进行PCR，引物：同实施例2引物，即SEQ ID NO.4所示上游引物和SEQ ID NO.5所示下游引物。

PCR反应体系为：

10X Buffer 2.5μl

2.5mM dNTP 2μl

引物(Forward) 1μmol/L

引物(Reverse) 1μmol/L

cDNA第一链 1μl

普通Taq酶 0.5U

总体积 25μl

PCR程序：

94℃预变性 5min

94℃变性 30s

58℃退火 30s

72℃延伸 45s

72℃延伸 8min

循环数为25、27和30个梯度。结果如图5所示，转基因玉米基因组DNA的KRP基因表达水平明显降低。说明本发明KRP-RNAi表达盒可以发挥抑制KRP基因表达的作用。

实施例13

转基因玉米T1代植株的栽培及籽粒收获

将经过验证的转基因玉米L2株系的种子在天津大学转基因实验基地于5月份进行播种，7-8月份进行套袋授粉，11月份进行籽粒的收获，如图6所示，转基因玉米株系的籽粒大小要大于对照非转基因玉米株系的籽粒大小。提高了玉米植株的丰产性，且对植株形态特征和生育期无影响，在玉米育种中具有重要意义和有良好的应用价值。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大学

<120> 特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒及应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 340

<212> DNA

<213> zea mays

<400> 1

atgggcaagt acatgcgcaa ggccaaggct tccagcgagg ttgtcatcat ggatgtcgcc 60

gccgctccgc tcggagtccg cacccgagcg cgcgccctcg cgctgcagcg tctgcaggag 120

cagcagacgc agtgggagga aggtgctggc ggcgagtacc tggagctaag gaaccggagg 180

ctcgagaagc tgccgccgcc gccggcgacc acgaggaggt cgggcgggag gaaagcggca 240

gccgaggccg ccgcaactaa ggaggctgag gcgtcgtacg gggagaacat gctcgagttg 300

gaggccatgg agaggattac cagggagacg acgccttgca 340

<210> 2

<211> 1452

<212> DNA

<213> zea mays

<400> 2

gttaacagac ccgcctcatt tttgtcaagc aaacaagaac cccttatata tcaaagagta 60

gtggtttgaa tttgtctaat atgaagttta acgggcttgg ctcatttaaa gtatttaata 120

attctgaaag acaagattaa actaactatg tatgatcctt tagcacgtta cagatggtcg 180

atgggcaagt tacatggttt atatagatgg acctatctat attccttcag tggttgagaa 240

aaaggtaaag gtgtgtccac actcacgtgc tcggctgcct ccgccgagac gaggcatggc 300

gttgcaaggt gaggcatggc atggtgtagc acgatagcag tcatggtcgt ggcacagtgt 360

agcattgctg tggatagata gataaactat tgttgtagtt agagtgcatg agtttttgaa 420

tgcaacacta gaattttcac aatttaactt aattaagaag ttatatcttg atgacataga 480

gttacctgac cattgatctc gcatgccctt ttagctctct cgttctctag actcaccctg 540

actatttaag tctcttgact cgccaatata aacaccatcc tatcatttgc tctcgaatac 600

ttctgtgtca caactcaact gtcagatgag tactccatta cagcacttac gtacacgagt 660

tctatgagag caggcctcca aaatgaatat ctacttagat gaaggacgac aatcgtgttc 720

tagggaaata tcagcgacac aactccttac ttccttcgct tcttcctagt gttttttgtt 780

gtgattgagt cgacacagca acaacactgc actattacaa ccagtacgac tatatcaact 840

agcaatgtct tccttatatg ttactattta ttttgcacat attcattatg tttaaatcac 900

ataggcacct ttctattggc atcaaaaaat tagtatcaac tttctagatt aaaatgaaac 960

taaaagtaca taaatttcta tcggtgggga tcgagtgatt ctttaaaccg attattacac 1020

aagttaacca cactaaaatt aacattggtg aatcgtgcca tgattttttt tctagtggaa 1080

aatagccaaa ccaagcaaca catatgtggc tatcgttaca catgtgtaaa ggtattgcat 1140

cacactattg tcacccatgt atttggacaa taccgagagg aaaaaccact tatttattgt 1200

attttatcaa gtttgtcttg cttacgtata aattataacc caacaaagta atcactaaat 1260

gtcaaaacca actagatacc atgtcatctc taccttatct tactaatatt ctttttgcaa 1320

aatccaaaat taatcttgca caagcacaag gactgagatg tgtataaata tctcttaaat 1380

tagtagctaa tatatcgcac atattattta gaccaactag caacatagaa gcacaatagt 1440

gtaccaacaa tg 1452

<210> 3

<211> 199

<212> DNA

<213> zea mays

<400> 3

tgcgccttgt gagcacgttt ggatccgcga aggcaatcgc tcggatcttc ccctaaccca 60

acccgggaac ggaccggagg gaaccgcagc atgaggaatg tccgcgtctc gtcgcaaggc 120

tcgttttgag ttttgggtca tagggcgggc agtccggggc acaagggtcc tggtactacc 180

caggtgcgaa gaaccccgg 199

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gggcccctcg agtgcaaggc gtcgtctccc tg 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gggcccagat cttctcgagc ctccggttcc tt 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gggcccagat ctgcgccttg tgagcacgtt t 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

gggcccagat cttctcgagc ctccggttcc tt 32

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gggcccagat ctgttaacag acccgcctca tt 32

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gggcccggat cccattgttg gtacactatt gt 32

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tattcggcta tgactgggca c 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gtcgatgaat ccagaaaagc g 21