本发明克隆表达了一种D-乳酸氧化酶，并公开了其核苷酸序列和氨基酸序列及酶学性质和应用，属于工业微生物领域。
背景技术：
D-乳酸氧化酶(D-lactate oxidase)是一种以FAD(FMN)为辅酶的α-羟酸氧化酶(习惯上均称之为D-乳酸氧化酶)。D-乳酸氧化酶可用于生物传感器中测定乳酸的含量，或氧化D-乳酸生产丙酮酸。也有被用于光学纯α-羟酸的制备(中国专利201210109290.4)
目前为止，已经在迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)和运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)等中发现了D-乳酸氧化酶。(Kalnenieks U,Galinina N,Bringer-Meyer S,et al.Membrane D-lactate oxidase in Zymomonas mobilis:evidence for a branched respiratory chain[J].FEMS microbiology letters,1998,168(1):91-97)
本发明首次从柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶不仅可以氧化(R)-α-羟酸，而且可以氧化(R)-α-羟酸酯，该反应与NAD(NADP)为辅酶的乳酸脱氢酶参与的反应相比逆反应极微弱，可应用于光学纯(S)-α-羟酸酯和(S)-α-羟酸的制备。
技术实现要素：
本发明从柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)中克隆得到了一种以FAD为辅酶的D-乳酸氧化酶的基因，利用大肠杆菌工程菌异源表达，公开了其相关的酶学特性，并进行了应用研究。
本发明的技术方案如下：
1、菌株
本发明D-乳酸氧化酶基因的来源菌株为：Citrobacter koseri ATCC BAA-895，购自美国ATCC菌种库。
2、D-乳酸氧化酶基因的克隆
提取Citrobacter koseri ATCC BAA-895菌体基因组总DNA。设计特异性引物，应用PCR方法，扩增出D-乳酸氧化酶基因全长编码框序列。并构建重组质粒。
3、D-乳酸氧化酶表达与纯化
将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)中，诱导表达。菌体破碎后得到粗酶液，纯化后冷冻干燥备用。
4、D-乳酸氧化酶的酶学性质分析
以D-乳酸为底物研究pH对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
以D-乳酸为底物研究温度对本发明所述D-乳酸氧化酶酶活的影响。
D-乳酸氧化酶的底物特异性分析：所用的底物有D-乳酸、乙醇酸、D-苯乳酸、D-对羟基苯乳酸、D-酒石酸、D-苹果酸、D-扁桃酸、D-丹参素。
酶活测定方法为：根据Characterization of a Lactate Oxidase from a Strain of Gram Negative Bacterium from Soil，Applied Biochemistry and Biotechnology,56,1996,278-288。所述方法进行。
5、D-乳酸氧化酶拆分混旋的α-羟酸酯
拆分α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)的方法为：取纯化好的酶0.1克于50mL三角瓶中，加入溶有α-羟酸酯5mM的pH 7的磷酸盐缓冲液中，于30℃，150rpm水浴摇床中转化16h，转化后液相色谱分析上清液。(R)-α-羟酸酯中的α-羟基被脱氢氧化成对应的α-酮酸酯，(S)-α-羟酸酯不被氧化。
产物(S)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价：
对映体过量值％e.e＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％
(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(SS/S0)×100％
式中SR为反应后(R)-对映体的峰面积，SS为反应后(S)-对映体的液相色谱峰面积，S0为反应前(R)-和(S)-对映体的液相色谱峰面积之和。
产物测定液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。
所述的α-羟酸酯为下列之一：丹参素冰片酯、丹参素异丙酯、苯乳酸冰片酯、苯乳酸异丙酯、对羟基苯乳酸冰片酯、对羟基苯乳酸异丙酯、扁桃酸冰片酯、扁桃酸异丙酯、丹参素细辛醇酯、乳酸冰片酯、苯乳酸细辛醇酯、对羟基苯乳酸细辛醇酯。
所述的α-羟酸酯，根据中国专利200610042787.3、201410180490.8、201410175950.8和20140699506.6公布的方法合成。
本发表明的有益之处：从Citrobacter koseri ATCC BAA-895中克隆表达出一种新型的D-乳酸氧化酶，该酶可以氧化(R)-α-羟酸和(R)-α-羟酸酯，可用于规模化制备手性纯(S)-α-羟酸酯，具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
实施例1
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶基因的克隆与大肠杆菌工程菌构建。
1、Citrobacter koseri ATCC BAA-895 DNA的提取
将Citrobacter koseri ATCC BAA-895菌株在LB培养基中培养12h，12,000rmp/min离心10min得到菌体，应用细菌基因组DNA抽提试剂盒(TaKaRa公司)按照其操作提取菌体基因组总DNA，放冰箱备用。
2、大肠杆菌感受态制备
(1)接种E.coli DH5α和BL21(DE3)分别于含有20mL LB培养基的250mL摇瓶中，37℃、200rpm/min培养过夜。
(2)按1％接种量接种于50mL LB培养基中，37℃培养至OD600约0.6(约2～3h)。
(3)将菌液转移到50mL预冷的离心管中，冰上放置30min，8000rpm/min、4℃离心5min。
(4)弃上清，加入5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，使菌体悬浮，冰上放置20min，8000rpm/min、4℃离心5min。重复2次。
(5)弃上清，加入1.5mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液(含15％甘油)，轻轻悬浮菌体，然后按每个离心管(1.5mL)加入100μL菌液分装，-70℃冰箱保藏备用。
3、D-乳酸氧化酶基因的克隆
(1)引物设计
设计引物序列为：
引物1：5'GCCGGGATCCATGAGAAAGCGTATTGTCATACAAA 3'
引物2：5'GCCGTCTAGATCGTCGGACGCCGCT 3'
(2)PCR扩增
用以上合成的两条引物，以Citrobacter koseri ATCC BAA-895的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
本步骤中扩增体系为：
扩增程序为：
98℃，10min
98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min反应30个循环
72℃，10min
PCR产物送华大基因测序后得到该酶的基因序列，如SEQ ID NO:1所示。根据该基因序列得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
(3)双酶切和连接
将pColdⅡ质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系为：10×cut buffer 3μl,DNA 4μl，酶BamHI和XbaI各0.5μl，无菌水2μl共30μl。37℃水浴下双酶切1h。将DNA片段克隆到pColdⅡ载体上，并转化到E.coli DH5α感受态细胞中。连接体系：10×DNA ligase buffer 2.5μl，DNA片段8μl，载体DNA 2μl，T4 DNA ligase 1μl，无菌水11.5μl共25μl。16℃水浴下连接12h-16h。
(4)转化
步骤：
1在连接体系中加入100μl DH5α感受态细菌，轻混匀，冰浴30min。
2放入预热的42℃水浴中，放置90s进行热休克处理。
3立即冰浴2min。
4加入1ml不含抗生素的LB培养液，37℃培养1h使菌体复苏。
5将菌体均匀涂布在含抗生素的LB平板上。
6培养24h长势良好。挑单菌落进行菌落PCR，核酸电泳验证，提取重组质粒。将重组质粒导入BL21大肠杆菌感受态中，保存备用。
实施例2
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的诱导表达及分离纯化。
1、加500μl重组菌液到50ml LB培养液中。37℃培养2.5h，15℃下静置0.5h。再加20μl 0.5M的IPTG，15℃下冷诱导培养24h。将发酵液进行离心(8000rmp/min，10min)得到菌体，用磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液(20mmol/L，pH 7.0)复溶菌体，超声破碎仪破碎，离心(8000rmp/min，10min)收集上清得到粗酶液。
2、将步骤1得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统操作进行镍柱纯化，洗脱方法为：将A1、A2、B1、B2四根管路都放进水里，设置system flow 20ml/min流速，进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.3、pre-pressure 0.5、Gradient 0、inset A1，待水滴均匀流出后装柱子，平衡十分钟之后把A1放进结合液中，B1放进洗脱液中，再进行排气一次，平衡二十分钟，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液(B1所处溶液)梯度洗脱目的蛋白，将吸附在离子柱上的蛋白洗脱下来得到纯化的酶。纯化后的酶经冷冻干燥备用。
实施例3
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适温度。以D-乳酸为底物，将底物与pH为9.0的磷酸缓冲液在30-60℃不同的温度条件下水浴15min，测定D-乳酸氧化酶的酶活，确定酶的最适反应温度为40℃。
实施例4
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶的最适pH值。以D-乳酸为底物，将底物在pH 3-9，40℃水浴15min测定酶的酶活，结果发现在pH 9.0条件下D-乳酸氧化酶酶活最高。
实施例5
本实施例为本发明所述D-乳酸氧化酶与不同底物的反应特性，列于表2中。
表2 D-乳酸氧化酶对不同底物的活性
实施例6
根据发明内容中的方法拆分各种外消旋α-羟酸酯，结果如下表所示：
表3拆分各种外消旋α-羟酸酯的效果
由上表可以看出，当在反应时间充分时，可以得到各类高光学纯的(S)-α-羟酸酯，该酶的光学专一性非常好。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种氧化酶及其应用
<130> No
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1803
<212> DNA
<213> Citrobacter koseri ATCC BAA-895
<400> 1
atgagaaagc gtattgtcat acaaagcgct atgcttagtt ccgatagttt gtcccaccac 60
aaggagtgga gaatgtcttc cattacaacg acagataata aagcctttct taatgagctc 120
acccgtctgg tgggtcattc gcacctgctc accgatcctg caaaaaccgc ccgctaccgc 180
aaggggttcc gttccggtca gggcgaagcg ctggccgtgg tcttccccgg ctcgctgctg 240
gaattgtggc gcgtactgaa cgcctgcgta aacgccgata aaatcattct gatgcaggcc 300
gccaataccg gcctgactga aggttccacg ccgaacggca acgattacga tcgcgaaatt 360
gtcatcatca gcacgctacg cctcgacaag ctgcacgtcc tcagtaaagg cgaacaggtg 420
ctggcatacc caggcaccac gctgtactca ctggaaaaag cgcttaaacc ttttggtcgc 480
gaaccgcact cggttatcgg ttcctcctgt atcggcgcgt cagttattgg cggcatttgc 540
aataactccg gcgggtcgct ggtacaacgc ggcccggcgt ataccgaaat gtcgctgttc 600
gcgcgcattg atgaacaggg caaattacag ctggtgaacc atctgggcat cgaactgggc 660
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atcgcggaga aatatggcaa agatacgttc ctgatgatcg acaagctcgg caccgacaaa 1080
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ttccgcccgc atttcactga ccgcgcgatg cagaagttcg gccatttatt ccctaaccat 1200
ctgccgccgc gcatgaaaag ctggcgcgac aaatatgagc atcatctgct gttaaaaatg 1260
gcgggagacg gggtggcgga agcacaaagc tggctgaccg agtttttcaa aaccgccgag 1320
ggcgatttct ttgcctgtac cccggaggaa ggcagcaaag cgttcctgca ccgttttgcc 1380
gcggcaggcg cggcgatccg ttatcaggcg gtgcatgccg atgaggtgga ggatattctc 1440
gcactggata tcgccttacg gcgtaacgac accgaatggt atgagcatct gccgccggaa 1500
attgacagcc agctggtgca taaactctat tacggtcatt tcatgtgcta tgtcttccat 1560
caggattaca tcgtgaagaa aggcgtcgat gcccatgcgc tgaaagagca aatgctggaa 1620
ctgctgcgcc agcgcggcgc gcaatatccg gcagagcata acgttggtca tttgtacaaa 1680
gcgccggaga cgctggcgcg tttttatcgt gaaaatgacc ccaccaacag catgaatccg 1740
ggtattggta aaacaagtaa gctgaaattc tggaaagaag cggcgtccga cgagacgcat 1800
tga 1803
<210> 2
<211> 600
<212> PRT
<213> Citrobacter koseri ATCC BAA-895
<400> 2
Met Arg Lys Arg Ile Val Ile Gln Ser Ala Met Leu Ser Ser Asp Ser
1 5 10 15
Leu Ser His His Lys Glu Trp Arg Met Ser Ser Ile Thr Thr Thr Asp
20 25 30
Asn Lys Ala Phe Leu Asn Glu Leu Thr Arg Leu Val Gly His Ser His
35 40 45
Leu Leu Thr Asp Pro Ala Lys Thr Ala Arg Tyr Arg Lys Gly Phe Arg
50 55 60
Ser Gly Gln Gly Glu Ala Leu Ala Val Val Phe Pro Gly Ser Leu Leu
65 70 75 80
Glu Leu Trp Arg Val Leu Asn Ala Cys Val Asn Ala Asp Lys Ile Ile
85 90 95
Leu Met Gln Ala Ala Asn Thr Gly Leu Thr Glu Gly Ser Thr Pro Asn
100 105 110
Gly Asn Asp Tyr Asp Arg Glu Ile Val Ile Ile Ser Thr Leu Arg Leu
115 120 125
Asp Lys Leu His Val Leu Ser Lys Gly Glu Gln Val Leu Ala Tyr Pro
130 135 140
Gly Thr Thr Leu Tyr Ser Leu Glu Lys Ala Leu Lys Pro Phe Gly Arg
145 150 155 160
Glu Pro His Ser Val Ile Gly Ser Ser Cys Ile Gly Ala Ser Val Ile
165 170 175
Gly Gly Ile Cys Asn Asn Ser Gly Gly Ser Leu Val Gln Arg Gly Pro
180 185 190
Ala Tyr Thr Glu Met Ser Leu Phe Ala Arg Ile Asp Glu Gln Gly Lys
195 200 205
Leu Gln Leu Val Asn His Leu Gly Ile Glu Leu Gly Gln Thr Pro Glu
210 215 220
Gln Ile Leu Ser Thr Leu Asp Asp Glu Arg Ile Lys Asp Glu Asp Val
225 230 235 240
Arg His Asp Gly Arg His Ala His Asp Tyr Asp Tyr Val Thr Arg Val
245 250 255
Arg Asp Ile Glu Ala Asp Thr Pro Ala Arg Tyr Asn Ala Asp Pro Asp
260 265 270
Arg Leu Phe Glu Ser Ser Gly Cys Ala Gly Lys Leu Ala Val Phe Ala
275 280 285
Val Arg Leu Asp Thr Phe Glu Ala Glu Lys Asn Gln Gln Val Phe Tyr
290 295 300
Ile Gly Thr Asn Gln Pro Asp Val Leu Thr Glu Ile Arg Arg His Ile
305 310 315 320
Leu Ala Lys Phe Asp Asn Leu Pro Val Ala Gly Glu Tyr Met His Arg
325 330 335
Asp Ile Tyr Asp Ile Ala Glu Lys Tyr Gly Lys Asp Thr Phe Leu Met
340 345 350
Ile Asp Lys Leu Gly Thr Asp Lys Met Pro Phe Phe Phe Thr Leu Lys
355 360 365
Gly Arg Thr Asp Ala Met Leu Glu Lys Val Lys Ile Phe Arg Pro His
370 375 380
Phe Thr Asp Arg Ala Met Gln Lys Phe Gly His Leu Phe Pro Asn His
385 390 395 400
Leu Pro Pro Arg Met Lys Ser Trp Arg Asp Lys Tyr Glu His His Leu
405 410 415
Leu Leu Lys Met Ala Gly Asp Gly Val Ala Glu Ala Gln Ser Trp Leu
420 425 430
Thr Glu Phe Phe Lys Thr Ala Glu Gly Asp Phe Phe Ala Cys Thr Pro
435 440 445
Glu Glu Gly Ser Lys Ala Phe Leu His Arg Phe Ala Ala Ala Gly Ala
450 455 460
Ala Ile Arg Tyr Gln Ala Val His Ala Asp Glu Val Glu Asp Ile Leu
465 470 475 480
Ala Leu Asp Ile Ala Leu Arg Arg Asn Asp Thr Glu Trp Tyr Glu His
485 490 495
Leu Pro Pro Glu Ile Asp Ser Gln Leu Val His Lys Leu Tyr Tyr Gly
500 505 510
His Phe Met Cys Tyr Val Phe His Gln Asp Tyr Ile Val Lys Lys Gly
515 520 525
Val Asp Ala His Ala Leu Lys Glu Gln Met Leu Glu Leu Leu Arg Gln
530 535 540
Arg Gly Ala Gln Tyr Pro Ala Glu His Asn Val Gly His Leu Tyr Lys
545 550 555 560
Ala Pro Glu Thr Leu Ala Arg Phe Tyr Arg Glu Asn Asp Pro Thr Asn
565 570 575
Ser Met Asn Pro Gly Ile Gly Lys Thr Ser Lys Leu Lys Phe Trp Lys
580 585 590
Glu Ala Ala Ser Asp Glu Thr His
595 600