一种支原体污染的处理方法与流程

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种支原体污染的处理方法。

背景技术：

在细胞培养技术是一种体外增殖细胞的常规实验技术，目前被广泛用于教学、科研和临床实验。污染控制是细胞培养能否成功的关键所在。引起培养细胞污染的微生物有细菌、霉菌、黑胶虫、支原体等，其中支原体是常见的污染物。

支原体在体型上比细菌和真菌小，一般的光学显微镜并不能观察到其存在，且受到支原体污染的细胞有相当一部分仍然可以生长增殖，因此支原体污染相较于细菌和真菌的污染并不容易发现。被支原体污染的细胞，不可避免的会在细胞代谢和功能发生改变，从而影响利用污染细胞进行实验的结果，同时也是生物制品的一个安全隐患。

目前，培养的细胞一旦发生支原体污染，大多的解决方式是灭活后丢弃，但是如果细胞是非常珍贵无法替代的，这种方法就不能使用了。

技术实现要素：

鉴于上述问题，本发明提出了一种支原体污染的处理方法实现在不灭活后丢弃的前提下清除支原体污染的目的，本发明采用如下技术方案：

提供一种支原体污染的处理方法，包括以下步骤：

(1)获取待处理的细胞；

(2)用含10ug/mL环丙沙星的培养基培养所述待处理的细胞；

(3)定时更新所述培养基，并且使所述待处理的细胞的生长密度保持在50％-80％；

(4)检测不到支原体污染的情况之后停止使用所述培养基。

优选地，所述定时更新所述培养基的方法采用如下任意一种：

每隔固定天数更新所述培养基；

每当所述细胞的生长密度达到所述第一预设密度时，更新所述培养基。

优选地，所述第一预设密度为75％-85％。

优选地，所述使所述细胞生长密度保持在50％-80％通过如下步骤：

检测所述待处理的细胞的生长密度；

使用胰酶消化并弃去多余的细胞；

用新的所述培养基继续培养。

优选地，所述检测不到支原体污染的情况之后停止使用所述培养基为通过PCR检测不到支原体的DNA的存在时停止使用所述培养基。

优选地，所述检测不到支原体污染的情况之后停止使用所述培养基为当所述待处理的细胞处理时长超过两周之后停止使用所述培养基。

优选地，所述培养基为含20％胎牛血清的DMEM培养基。

优选地，所述待处理的细胞的获取方法包括如下步骤：

在培养瓶中培养支原体污染的细胞至第二预设密度，舍弃上清液，使用磷酸缓冲溶液洗涤两次；

使用胰蛋白酶溶液进行消化；

用新鲜的基础培养基终止消化，并重悬细胞，得到所述待处理的细胞。

优选地，所述第二预设密度为75％-85％。

优选地，所述消化过程在预设条件下进行，所述预设条件为：温度37℃、CO₂浓度5％。

优选地，所述新鲜的基础培养基为含20％胎牛血清的DMEM培养基。

与现有技术相比，该发明一种支原体污染的处理方法具有如下有益效果：

本发明一种支原体污染的处理方法采用在培养基中添加环丙沙星的方法去除支原体，达到了在对细胞的影响小情况下，即并不是采用先灭活后丢弃方式，彻底清除支原体污染的目的，同时还具有停止使用环丙沙星后不复发的优势，在一定程度上提高了非常珍贵的无法替代的细胞生存能力，便于人们的研究。

本发明一种支原体污染的处理方法采用环丙沙星材料具有简单易取，成本低廉的优势，降低了本发明的应用门槛，同时便于本发明的推广应用。

本发明一种支原体污染的处理方法具有操作简单，步骤少、时间短的特点，在一定程度上提高了人们的生产效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了本发明一个实施例一种支原体污染的处理方法流程图；

图2示出了本发明一个实施例一种支原体污染的处理方法的PCR检测支原体的DNA电泳示意图；

图3示出了本发明一个实施例一种支原体污染的处理方法的环丙沙星处理一周的HepGL细胞光镜图；

图4示出了本发明一个实施例一种支原体污染的处理方法的停止使用含10ug/mL环丙沙星的培养基的两周后的HepGL细胞光镜图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

请参阅图1-图2，对本发明一种支原体污染的处理方法做详细叙述：

(1)获取待处理的细胞。

具体地，待处理的细胞的获取方法包括如下步骤：

在培养瓶中培养支原体污染的细胞至第二预设密度，舍弃上清液，使用磷酸缓冲溶液洗涤两次；

使用胰蛋白酶溶液进行消化；

用新鲜的基础培养基终止消化，并重悬细胞，得到待处理的细胞。

其中，第二预设密度为75％-85％；消化过程在预设条件下进行，预设条件为温度37℃、CO2浓度5％；新鲜的基础培养基为含20％胎牛血清的DMEM培养基。

示例地，假设待处理的细胞为HepGL细胞，HepGL细胞的获取方法包括如下步骤：

首先，将受支原体污染的HepGL细胞在25cm2培养瓶中长满至约80％，弃去培养上清，加入3mL磷酸缓冲溶液洗涤2次；

其次，弃去磷酸缓冲溶液，加入0.25％胰蛋白酶液1ml，轻轻摇匀培养瓶，使酶液完全浸润所有细胞表面约1-2分钟；

然后，去掉胰蛋白酶液，接着置37℃、5％CO2培养箱内继续消化1-2分钟，期间取出培养瓶置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，细胞变圆后立即终止消化；

最后，加入5ml含20％胎牛血清的DMEM高糖培养基终止消化，并重悬细胞，用吸管吹打尽可能使之成为单细胞悬液，以减少细胞团块中的腔隙影响药物作用。

在一些实施方式，为了提高待处理的细胞的质量，还可以通过台盼蓝确认待处理的细胞的活性，一般大于95％即可。

(2)用含10ug/mL环丙沙星的培养基培养待处理的细胞；其中培养基为含20％胎牛血清的DMEM培养基。

考虑到现有市场上已经具有医用环丙沙星注射液，因此，实施发明时可以直接采用，从而降低本发明的原材料获取成本，便于本发明的推广应用。

示例地，假设上述的单细胞悬液为待处理的细胞，步骤二在实施时可以参照如下：将单细胞悬液按照1:3加入25cm2培养瓶中，加入含20％胎牛血清的高糖DMEM至液体总量为10mL；然后按照每1mL液体加5uL环丙沙星注射液(浓度为2mg/mL)，用移液器加入50uL环丙沙星注射液，使得环丙沙星的浓度为10ug/mL。

(3)定时更新培养基，并且使待处理的细胞的生长密度保持在50％-80％。

优选地，定时更新培养基可采用如下任意一种：

每隔固定天数更新培养基；

每当细胞的生长密度达到第一预设密度时，更新培养基。

在具体实施中，考虑到一般情况下，待处理的细胞增殖至80％需要两天时间，因此固定天数优选为两天；同时，考虑到一些特殊情形，也为了便于保持待处理的细胞的生长密度保持在50％-80％，第一预设密度优选为75％-85％。

在一些实施方式中，使细胞生长密度保持在50％-80％通过如下步骤：

检测待处理的细胞的生长密度；

使用胰酶消化并弃去多余的细胞；

用新的培养基继续培养。

示例地，检测HepGL细胞的细胞生长密度，当细胞生长密度为75％-85％时，用胰酶消化并弃去多余的细胞，使细胞生长密度保持在50％-80％。

值得一提的是，在实际检测过程中可以采用观察法，通过观察估算细胞生长密度。

(4)检测不到支原体污染的情况之后停止使用培养基。

具体地，检测支原体污染可以通过PCR检测支原体的DNA，当通过PCR检测不到支原体的DNA的存在时停止使用培养基。当然为了获得更好的检测结果，还可以在停止使用含10ug/mL环丙沙星的培养基之后使用新鲜的基础培养基培养一段时间，期间留取处理后的细胞上清测PCR检测处理效果。

如图2所示，图2示出了PCR检测支原体的DNA电泳图，其中，1-7为环丙沙星处理时每两天取样结果；8-20为停止使用含10ug/mL环丙沙星的培养基后三周期间取样所测结果。从图中可以看出，用10ug/ml环丙沙星处理后以及停止使用含10ug/mL环丙沙星的培养基继续培养的过程中，测得的支原体DNA都是阴性，说明支原体通过环丙沙星处理后被清除，且在撤药后无复发，表明支原体已经在细胞中被完全清除。

当然，在一些实施方式中，为了提高清除的效果还可以，同时避免反复检测还可以根据处理时长确定停止使用含10ug/mL环丙沙星的培养基，具体时长，譬如上述的两周等，具体处理时长可以根据细胞的污染情况以及细胞本身的特性去确定，本发明实施例对此不作限制。

请参阅图3-图4，图3示出了环丙沙星处理一周的细胞光镜图，图4示出了停止使用含10ug/mL环丙沙星的培养基的两周后的HepGL细胞光镜图，由图3和图4的对比可见，环丙沙星对HepGL细胞生长活性状态与无污染支原体的正常HepGL细胞相仿，也即是环丙沙星处理对HepGL细胞生长活性状态无明显影响，因此，可以认定环丙沙星处理是一种比较简单有效的清除细胞污染支原体的方法，其对支原体杀灭彻底，撤药后不再复发，且对细胞的影响小。

与现有技术相比，本发明一种支原体污染的处理方法具有如下技术效果：

本发明一种支原体污染的处理方法采用在培养基中添加环丙沙星的方法去除支原体，达到了在对细胞的影响小情况下，即并不是采用先灭活后丢弃方式，彻底清除支原体污染的目的，同时还具有停止使用环丙沙星后不复发的优势，在一定程度上提高了非常珍贵的无法替代的细胞生存能力，便于人们的研究。

本发明一种支原体污染的处理方法采用环丙沙星材料具有简单易取，成本低廉的优势，降低了本发明的应用门槛，同时便于本发明的推广应用。

本发明一种支原体污染的处理方法具有操作简单，步骤少、时间短的特点，在一定程度上提高了人们的生产效率。

以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。