一种乙型脑炎病毒的保护性单克隆抗体及其抗原位点的应用的制作方法

本发明属于动物传染病防治技术领域，具体涉及一种针对乙型脑炎病毒ns1蛋白的保护性单克隆抗体及其对应抗原位点的应用

背景技术：

乙型脑炎病毒不仅引起人的中枢神经系统疾病，还可引起猪的繁殖障碍性疾病，是一种重要的人畜共患传染病病原。乙型脑炎病毒主要侵入神经系统，包括丘脑，基底神经节，脑干，小脑，大脑皮层和脊髓，导致严重的中枢神经系统疾病，例如脊髓灰质炎样严重瘫痪，无菌性脑膜炎和脑炎，71％的患者都是基底神经节和丘脑损伤，严重出现运动障碍，43％患者脑干损伤，经常出现急性呼吸衰竭症状，甚至死亡。患者的病死率与临床症状高达10％～50％，而且大约一半乙型脑炎病毒感染幸存者都有严重的神经后遗症。在亚洲每年大约50,000乙脑病例中就有15,000例死亡。2006年7月山西发生日本乙型脑炎流行，共60多人发病，其中19人死亡，造成了较大的社会影响。

目前已应用的乙型脑炎病毒疫苗为弱毒疫苗和灭活疫苗。其中灭活疫苗是世界卫生组织推荐的在全球应用的疫苗，虽然该疫苗具有较高的安全性，但是在免疫保护力上却不够理想，经常出现免疫失败的报道。乙型脑炎病毒弱毒疫苗由我国自行研制，该疫苗具有较高的免疫保护效率，但是由于安全性不够高，目前仅在我国使用，同时儿童是我国乙型脑炎病毒的主要免疫人群，考虑到安全性问题，儿童使用的疫苗仍以灭活疫苗为主。因此开发兼具高保护力和高安全性的乙型脑炎疫苗具有重要的意义。更为重要的是，目前尚没有针对乙型脑炎病毒的治疗技术，导致了该病的死亡率高，即使康复造成的后遗症也高。

乙型脑炎病毒编码两个重要的免疫保护蛋白，分别为囊膜蛋白(e)和非结构蛋白1(ns1)。e蛋白为结构蛋白，免疫后可以诱生中和抗体，为机体提供保护作用。ns1蛋白为非结构蛋白，在体内也具有很高的抗原性，诱导产生的抗体在细胞中没有中和活性，但是在动物体内却具有比结构蛋白e更高的免疫保护效率。研究发现，针对e蛋白的中和抗体可在体内起到治疗作用，然而针对乙型脑炎病毒ns1蛋白开发的治疗技术尚未有报道。通过筛选针对ns1蛋白的保护性单克隆抗体，应用于乙型脑炎的治疗，则具有较高的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，其目的之一是提供一种能够对乙型脑炎病毒有特异性的单克隆抗体。

本发明的目的之二是提供一种能够对乙型脑炎病毒起到保护作用的氨基酸序列。

本发明通过筛选得到了一株在动物体内对乙型脑炎病毒具有免疫保护功能的单克隆抗体，并对抗原位点进行了鉴定，得到一个具有较好免疫保护活性的抗原位点，具有较高的应用前景。

本发明通过如下技术方案实现：

申请人通过制备得到一株分泌乙型脑炎病毒ns1蛋白具有保护性作用单克隆抗体的jevns1单克隆抗体杂交瘤细胞株2b8，于2016年5月16日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为cctccno：201699。

将所述的单克隆抗体的通过静脉注射小白鼠后，可起到很好的治疗效果。

所述的单克隆抗体能识别ns1蛋白中的²²⁵wpethtlwgd²³⁴氨基酸片段，该片段的氨基酸序列如序列表seqidno：1所示。

本发明中所述具有保护作用的多肽序列为wpethtlwgd(其氨基酸序列见序列表seqidno:1所示)，经过鉴定其中的t、h、l、w氨基酸为关键氨基酸。

本发明得到具有保护作用的多肽序列，可用于多肽疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗以及基因工程多价疫苗的开发。

本发明的多肽序列可通过合成产生，也可以通过基因工程表达获得。

本发明的有益效果如下：

1.本发明将ns1的单克隆抗体用于乙型脑炎病毒的治疗，目前仍未有基于乙型脑炎病毒ns1治疗的方法，本发明为乙型脑炎的治疗提供了一种新方法。

2.本发明制备的单克隆抗体可通过杂交瘤细胞分泌，也可以通过基因工程改造成人源或者猪源基因工程抗体，具有很强的适用性。

3.本发明的保护性抗原表位可用于多种疫苗的开发，针对性强，可构建具有更高免疫保护效果的疫苗。

4.ns1蛋白在乙型脑炎病毒中提供的保护力达到100％，且针对ns1的抗体不会产生抗体依赖性增强作用，针对ns1的治疗效果比针对结构蛋白效果更理想。

附图说明：

序列表seqidno：1是本发明制备的多肽序列；序列长度为10个氨基酸。

图1：是本发明的总体技术路线图。

图2：本发明中ns1基因的pcr扩增得到的跑胶图。附图标记说明：图2中的lane1是ns1基因的pcr产物，图2中的lane2为dnamarker。

图3：本发明中使用的原核表达载体pet28a质粒图谱。

图4.本发明中表达并纯化的乙型脑炎病毒ns1蛋白。附图标记说明：lane1为表达纯化的ns1蛋白，lane2为蛋白质marker。

图5.本发明制备的单克隆抗体2b8与乙型脑炎病毒反应的间接免疫荧光鉴定。附图标记说明：图5a是用乙型脑炎病毒感染的细胞，可发现呈现明亮的阳性反应；图5b是未用乙型脑炎病毒感染的对照，呈阴性结果。

图6：本发明制备的单克隆抗体2b8与乙型脑炎病毒ns1蛋白的westernblot鉴定。附图标记说明：lane1显示单克隆抗体2b8可与ns1蛋白形成明显的杂交斑点，lane2为对照组与2b8单抗无反应，说明抗体特异性良好。

图7：ns1的分段表达策略。附图标记说明：图7中左边一列a-i的字母代表对不同ns1片段的命名，右边一列的数字代表该片段在ns1蛋白中的位置。

图8：不同片段的ns1与2b8单抗的反应性。附图标记说明：图8中的上方anti-his或2b8代表分别用不同的抗体与蛋白反应；a-i字母标识代表图7中所述的不同ns1蛋白片段。

图9：单个氨基酸位点的突变蛋白与2b8单抗的反应原性。附图标记说明：图9a中为不同氨基酸突变的ns1蛋白与his抗体的反应性；图9b为不同氨基酸突变的ns1蛋白与2b8单抗的反应性。泳道1为未突变蛋白对照，2-7分别对应于表2中的ka、kb、la、lb、ma、mb的突变。

图10：本发明制备的单克隆抗体对乙型脑炎病毒攻击的保护力试验结果。附图标记说明：用不同的单克隆抗体注射被乙型脑炎病毒感染的小白鼠，本发明的单克隆抗体2b8可达到80％的保护力，而本实验室制备的其它针对ns1的单抗则为0-20％之间。说明本发明制备的单克隆抗体2b8具有很好的治疗效果。

图11：多肽免疫保护的试验结果。

具体实施方式：

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，但不限制本发明的使用范围。

实施例1乙型脑炎病毒ns1蛋白抗原的制备

1)抗原的克隆表达

以乙脑病毒ns1基因(genbank登录号u47032.1)为模板，用引物forward：gcagaattcgacactggatgtgccattg，reverse：cagaagcttgagcatcaacctgtgatctaa进行目的片段的扩增。扩增体系如下：taqdna聚合酶1ul、10×taqbuffer5ul、模板1ul、forward引物1ul、reverse引物1ul、dntp2ul、h2o39ul。扩增条件如下：95度变性5分钟，然后进入循环：94度30秒、55度30秒、72度1分钟，反应35个循环后，72度延伸10分钟。pcr产物用1％琼脂糖凝胶回收，酶切回收后连入到载体pet-28a(图3)构建重组表达载体质粒，再将重组表达载体质粒转入大肠杆菌bl21(de3)菌株，37℃增殖，当od630值达到0.6-0.8时，向其中加入终浓度为0.8mm的iptg于28℃诱导12h。

2)重组蛋白包涵体提取

将重组菌用iptg诱导后，于8000rpm离心10min，收集菌体，用1×pbs洗涤菌体2次，用压力破碎仪充分破碎。破碎的溶液经8000rpm，离心15min，收集沉淀，弃上清。往沉淀中加19.7mlbuffera、0.3ml20％的skl(十二烷基肌氨酸钠)贮存液、20ul的dtt混合液，剧烈搅匀，使其缓慢溶解，室温静置30min-2h。然后8000rpm离心15min，收集上清，加入终浓度为0.2％聚乙二醇4000(peg4000)，1mmol/l氧化型谷胱甘肽和2mmol/l还原型谷胱甘肽。最后用teph8.0透析2-3天，其间应换液6-8次。透析后的蛋白用sds-page电泳检测(图4)，并测定蛋白浓度，分装成小管后置-20℃保存备用，作为小鼠免疫原及elisa的包被抗原。

实施例2乙型脑炎病毒ns1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备

(1)小鼠免疫

将上述制备的乙脑病毒ns1蛋白用pbs缓冲液稀释到800ug/ml，与等体积完全弗氏佐剂充分乳化，选择雌性5周龄balb/c小鼠4只，颈背部皮下两点注射0.2ml。第15天时加强免疫1次(佐剂改用不完全弗氏佐剂，免疫剂量和部位与首次免疫相同)；第30天时再加强免疫1次(同上)。在第45天时断尾采血，用间接elisa的方法检测抗体水平，在第46天时对免疫效果最好的balb/c小鼠使用不加佐剂的ns1蛋白100ug腹腔注射冲击免疫一次，三天后即可融合。

(2)sp2/0瘤细胞的制备

将冻存的sp2/0细胞复苏，培养至六孔板，然后收集细胞，用0.3ml基础1640培养基重悬，注入balb/c小鼠背部皮下。待10～14天后小鼠背部形成肿瘤时用颈椎脱臼法处死，75％酒精浸泡5min，消毒皮毛。将小鼠固定于解剖盘中，无菌状态下将肿瘤块剪下，置匀浆器中，加5ml1640基本培养基充分研磨后，补加1640基本培养基至10ml，静置5min，吸取上层的细胞悬液于另一离心管备用，再补加1640基本培养基至10ml，重复两次。1000rpm离心10min去上清，以20ml1640基本培养基重悬细胞。在另一50ml离心管中加入15ml淋巴细胞分离液，将sp2/0细胞悬液轻轻地加在分离液之上，1000rpm离心10min，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，用1640基本培养基洗2遍，计数后备用。

(3)免疫脾细胞的制备

取免疫的balb/c鼠的脾脏，加3ml1640基本培养基于匀浆器中研磨，制备脾细胞，再补加10ml1640基本培养基于匀浆器中，同上重复2次。1000rpm离心10min去上清，细胞重悬后计数。

(4)饲养细胞的制备

取未免疫的balb/c鼠，用吸管吸3ml1640液注入小鼠腹腔，吸打几次，再将液体吸出放置于50ml离心管中，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000rpm离心10min去上清，细胞重悬后计数，用hat培养基悬浮后，置于37℃，5％co2培养箱中待用。

(5)细胞融合

将sp2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以体积比为1:10比例在50ml离心管中混匀，1500rpm离心10min。倒空上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的融合用peg0.8ml，边加边轻轻用吸管尖搅拌。继续搅拌30秒后静置1min。然后慢慢加入37℃预温的1640基本培养基10ml，并不断轻轻地搅拌。最后缓慢加入30ml1640基本培养基。1000rpm离心5min，去上清后37℃放置5-8min。用hat培养基悬浮，同时也用hat培养基悬浮饲养脾细胞与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的hat培养基，均匀滴加入96孔细胞培养板中，约250μl/孔。置于37℃，5％co2培养箱中培养。融合后于第5天补加1滴hat培养基，第8-10天时换ht培养基100ul。待融合细胞集落长至培养孔1/4时，进行抗体检测。

(6)分泌单抗的杂交瘤细胞的筛选

采用间接elisa方法检测。用ns1蛋白包被96孔酶联板，并用0.5％的bsa37℃封闭1h，用洗涤液洗三次，然后加入杂交瘤细胞的培养上清100ul，同时设阴、阳性血清对照，于37℃温育30min，取出后洗涤三次，加入1:5000倍稀释的hrp标记的羊抗鼠igg，37℃反应30min，取出后洗涤三次，加入底物显色，用0.25％hf终止反应之后，在630nm的波长下检测od值。同时设sp2/0细胞的培养上清作为阴性对照，od630大于阴性对照3倍的样品为阳性。

(7)杂交瘤细胞的克隆化

经间接elisa试验检测为阳性的细胞孔，按有限稀释法进行亚克隆，克隆前一天制备小鼠饲养细胞层。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，用血细胞计数板计数活细胞数。将细胞用培养基(ht)稀释到每毫升5、10、50个细胞。将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板中100μl/孔。使相应的每孔分别含0.5、1和5个细胞。培养第4天换液一次，第5～6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。在克隆后第10～14天，细胞长满1/4～1/2孔底时，即可检测，如检出细胞生长孔有特异性抗体，可选择抗体效价高，呈单个克隆生长，形态良好的杂交瘤细胞孔，继续同法再克隆，一般克隆3次。3次后阳性孔的杂交瘤细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的杂交瘤细胞生长良好时，再转至6孔培养板中继续扩大培养，最后冻存杂交瘤细胞。

(8)针对不同抗原表位单克隆抗体的筛选

采用间接elisa法相加试验，计算相加指数(ai)来分析单抗决定簇，具体做法如下：

用ns1纯化蛋白包被酶标板，然后每孔加入各种单抗(均稀释5倍)各100μl，以及各单抗两两组合各50μl，37℃孵育1h，后续步骤与常规elisa相同。根据下列公式计算ai。a1、a2分别为各株单抗的a值，a1+2为两两组合的混合单抗的a值。ai大于10％表示两株单抗针对不同抗原表位，具有相加效应；ai小于10％则表示两株单抗针对抗原表位相同或相近。ai＝(a1+2-a1)/a2×100％。结果筛选出五株针对不同抗原表位的单克隆抗体，分泌这些抗体的杂交瘤细胞分别为1h9、2b8、3h1、4f12、4g11(结果见表1)。

表1单抗相加实验

注:“/”表示未检测

9)单克隆抗体的生产

对已经建株的杂交瘤细胞扩大培养同时在balb/c小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体，取8周龄的balb/c小鼠，腹腔注射灭菌的不完全弗氏佐剂0.5ml/只，3天后腹腔注射杂交瘤细胞5×10⁵～5×10⁶/只，7～10天后抽取小鼠腹水，1200rpm离心10min取上清，冻存备用。

10)单克隆抗体纯化

按照igg抗体纯化试剂盒的操作说明，纯化该腹水以获得乙脑ns1蛋白单克隆抗体。

实施例2本发明制备的单克隆抗体与ns1蛋白反应原性的间接免疫荧光鉴定

将hela细胞接种至24孔板中，待细胞长至70％-80％后，用不含血清的dmem洗两遍；然后加入适量无血清dmem，同时接jev病毒，培养1-2h后换成2％的培养基(2％的四季青+1％双抗+97％dmem)；36h后，弃去培养基，用pbs轻轻洗两次，5min/次；加入100％甲醇室温固定30min，pbs洗涤三次，5min/次；封闭液封闭1h，pbs洗涤三次，5min/次；加入待检单抗，37℃温箱孵育1h，pbs洗三次，5min/次；避光加入体积为1:500稀释的fitc标记的羊抗鼠igg，37℃温箱孵育1h，pbs洗三次，5min/次，荧光显微镜进行观察并拍照。单抗实验组细胞中均能观察到特异性的绿色荧光，荧光信号均位于细胞质中，与ns1蛋白在细胞中的定位一致(图5a)，而空白对照组则没有可见绿色荧光(图5b)。

实施例3单克隆抗体的westernblot鉴定

用原核表达的pet-28a-ns1蛋白进行sds-page电泳。电泳后通过半干法将蛋白从page胶转移到硝酸纤维素膜上。用2b8单克隆抗体与膜上的蛋白反应1个小时后，用pbst(缓冲液)对膜进行3次洗涤，然后加入体积比为1：5000稀释的hrp标记的羊抗鼠二抗并反应1个小时，再次洗涤三次后加入化学发光显色液进行显色。结果显示本发明的单抗可与乙脑ns1蛋白产生良好的反应，而对照组则无反应(图6)。

实施例4单克隆抗体所针对的保护性抗原表位的定位

为定位2b8单抗与ns1蛋白反应的表位，将ns1基因分成9个不同的片段进行表达(图7)，通过westernblot方法对不同片段的蛋白与2b8单克隆抗体或者标签蛋白的抗体检测，如果蛋白与抗his标签或抗gst标签的抗体反应，说明蛋白成功表达；如果蛋白同时与2b8分泌的单抗反应，则表明该单抗针对的保护性抗原表位位于该蛋白中。通过一系列的westernblot实验，发现2b8单克隆抗体与g片段不反应，但与h片段可发生反应(图8)，g片段为205-224位氨基酸，h片段为215-234位氨基酸，说明了2b8针对的抗原表位为224-234之间的氨基酸片段，其具体序列为wpethtlwgd。

实施例5保护性抗原表位中的关键氨基酸位点鉴定

针对上述鉴定的表位，进一步构建了一系列单个氨基酸突变的ns1基因(表2)，通过原核表达的方法构建并表达了这些突变基因，通过westernblot方法对突变蛋白的与杂交瘤细胞株2b8分泌的抗体的反应原性进行鉴定。结果显示，所有突变蛋白均与his的抗体反应，说明蛋白表达正确(见图9a)，而t²²⁸、h²²⁹、l²³¹、w²³²等4个位点中，任何一个氨基酸突变后，2b8都会失去与蛋白的反应原性，说明上述4个氨基酸为该抗原肽中的关键位点。

实施例6单克隆抗体在小白鼠内对乙型脑炎病毒攻击的保护用

用乙型脑炎病毒强毒攻击小白鼠，将攻毒当天记为第0天，在攻毒后第2天小鼠尾静脉注射五种纯化的单抗500μg/只，同时设pbs对照组。从攻毒第4天开始，pbs对照组小鼠逐渐有感染症状出现，表现为被毛直立，站立不稳，四肢震颤，精神萎靡等症状，从第5天开始出现死亡，而且随后几天，死亡数目急剧增加，至第15天全部死亡。同时设置了几种非保护性的单抗组，也在第5天开始出现死亡，而且死亡数目逐渐增加,死亡率80-100％。2b8单抗注射的小鼠可明显抵抗病毒的攻击，保护效率为80％(图10)。

表2不同突变位点的设置

实施例7多肽对小白鼠的免疫保护性验证

人工合成本专利中鉴定的保护性多肽wpethtlwgd，并将其偶联到klh，将该偶联抗原用弗氏佐剂乳化后，免疫小白鼠，于首免后2周，加强免疫一次。二免后两周，用jev进行攻击，观察小白鼠的保护率。结果显示：对照组在攻毒后第5天开始出现死亡，在短暂的几天内死亡数目急剧增加，在第7天时，小鼠全部死亡。在多肽疫苗免疫组实验过程中发现死亡小鼠在攻毒第4天就开始出现临床症状(四肢震颤，站立不稳，精神萎靡，身体蜷缩，眼睛微睁，背部被毛直立等)直至死亡；而存活的小鼠在攻毒后5天内出现轻微精神萎靡后观察不到明显的临床症状，多肽疫苗的保护效率可以达到33％，比相应的表达蛋白高(图11)。考虑到该多肽小(10个氨基酸)和免疫原性低的特性，能够获得33％的免疫保护效率，也足以说明该表位是ns1中的一个保护性抗原表位，可作为疫苗设计的靶标。

实施例82b8单克隆抗体在病毒治疗中的应用

鉴于单克隆抗体已经在人类及兽医疾病的治疗中取得了较大的成功，已经发展称为成熟的技术(bc,raposot,jains,huppt,argyledj.challengesandopportunitiesformonoclonalantibodytherapyinveterinaryoncology.vetj.2016dec；218:40-50)，可以预见本专利中获得的2b8单克隆抗体可应用于人及动物乙型脑炎的治疗。

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<110>华中农业大学

<120>一种保护性乙型脑炎病毒ns1蛋白的单克隆抗体及其应用

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