一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法与流程

本发明公开了一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法，属于酶工程领域。

背景技术：

染料木素(又名金雀异黄素、染料木黄酮等)被认为是一种重要的大豆异黄酮，主要存在于大豆种子的子叶和胚轴中。染料木素在人体及动物细胞中具有广泛的药理学功效。主要表现为：1)具有化学防癌(乳腺癌和前列腺癌等)作用。染料木素具有类雌性激素及抗激素作用，可以抑制肿瘤细胞合成过程中相关酶的活性，在肿瘤细胞形成过程中抑制肿瘤血管增生，延缓或阻止肿瘤变成癌细胞。2)可以预防心血管疾病。染料木素会激发低密度的脂蛋白受体产生正向调节作用，同时可以促进胆固醇的清除，抑制血小板的凝集，对于动脉粥样硬化等疾病具有预防和治疗作用。3)可以预防绝经后疾病。染料木素是典型的植物雌激素，所具有的雌激素活性能够缓解妇女更年期综合症及预防绝经后疾病。4)抗骨质疏松作用。染料木素的雌激素活性能够激活雌激素受体，提高成骨细胞活性；另外还可以增加骨密度，抑制骨量丢失，对骨质疏松具有较好的改善作用。

染料木素易溶于二甲基亚砜和乙醇等有机溶剂，几乎不溶于水。此特性严重限制了其作为食品添加剂和口服药物及静脉注射药剂等在食品和医药行业中的应用。近年来，为了提高染料木素在水溶液中的溶解度，大量染料木素衍生物受到了人们的关注。其中染料木素的糖基化衍生物因其与染料木素具有相似的生理生化功能、安全性较高、具有较高的水溶性等优点被认为是最佳的染料木素替代物之一，具有十分重要的应用价值。据报道双葡萄糖基染料木素和三葡萄糖基染料木素在水中的溶解度分别是染料木素的3700倍和44000倍，且共价连接糖链越长，水溶性越好。但是与染料木素连接的糖链越长，越不稳定，易被水解。我们利用环糊精葡萄糖基转移酶催化染料木素糖基化反应，通过对反应体系及反应条件进行优化，最终获得了提高染料木素糖基化衍生物产量的最佳条件。

技术实现要素：

本发明需要解决的技术问题是提供一种利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法。

所述的利用环糊精葡萄糖基转移酶高产染料木素糖基化衍生物的方法，主要步骤如下：

1)将染料木素溶解于二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为5～10g/L的溶液，作为糖基受体；

2)将可溶性淀粉溶解于50mM的PBS缓冲液(pH 6.0～7.5)中配制成浓度为30～50g/L的溶液，作为糖基供体；

3)将环糊精葡萄糖基转移酶溶解于50mM的PBS缓冲液(pH 6.0～7.5)中配制成浓度为10～40g/L的溶液。

4)1mL反应体系中含有可溶性淀粉溶液，染料木素溶液以及环糊精葡萄糖基转移酶溶液比例为4/4/2～6/2/2)，混合并放置于2mL带盖子的小管内。于30～50℃震荡器中缓慢震荡15～25h左右。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。

本发明的有益效果：本发明通过优化环糊精葡萄糖基转移酶催化染料木素糖基化反应条件，提高了糖基化染料木素产物的产量。特别是对于主产物(Glc)₂-genistein，在最适条件下其产量较优化前有大幅度的提高。

附图说明

图1不同用于溶解染料木素的溶剂对染料木素糖基化衍生物合成的影响。

图2不同糖基供体对染料木素糖基化衍生物合成的影响。

图3不同可溶性淀粉浓度对染料木素糖基化衍生物合成的影响。

图4不同染料木素浓度对染料木素糖基化衍生物合成的影响。

图5不同底物配比(可溶性淀粉/染料木素，v/v)对染料木素糖基化衍生物合成的影响。

图6不同酶浓度对染料木素糖基化衍生物合成的影响。

图7不同反应pH对染料木素糖基化衍生物合成的影响(pH 4.5～6.0，醋酸-醋酸钠缓冲液；pH 6.0～8.0,PBS缓冲液)。

图8不同反应温度对染料木素糖基化衍生物合成的影响。

图9不同反应时间对染料木素糖基化衍生物合成的影响。

具体实施方式：

实施例1：不同溶剂溶解染料木素对糖基化染料木素产物合成的影响。

取0.1g染料木素分别溶解于10mL的DMSO，甲醇，乙醇，水，乙酸乙酯等不同溶剂中配制成不同的染料木素溶液。然后取300μL染料木素溶液，500μL浓度为10g/Lα-环糊精溶液(溶剂为pH 6.5的50mM PBS缓冲液)，200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH 6.5的50mM PBS缓冲液)混合于2mL带盖子的小管内。于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。

如图1所示，当用DMSO作为染料木素溶剂时，糖基化染料木素衍生物产量最高。因此选用DMSO作为染料木素溶剂。

实施例2：不同糖基供体对糖基化染料木素产物合成的影响。

分别选用α-环糊精，β-环糊精，可溶性淀粉，麦芽糊精，麦芽糖，葡萄糖，蔗糖作为糖基供体，溶解于pH 6.5的50mM PBS缓冲液中配制成浓度为10g/L的溶液。然后分别取500μL糖基供体与300μL浓度为10g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)以及200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH 6.5的50mM PBS缓冲液)混合于2mL带盖子的小管内。于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。

如图2所示，当选α-环糊精作为糖基供体时，染料木素糖基化产物产量最高。但因为α-环糊精价格昂贵，增加了成本，因此不是最合适的糖基供体。而可溶性淀粉作为糖基供体时，染料木素糖基化产物产量均高于较其他糖基供体(除α-环糊精外)。因此选用可溶性淀粉作为糖基供体。

实施例3：不同可溶性淀粉浓度对糖基化染料木素产物合成的影响

将可溶性淀粉溶于pH 6.5的50mM PBS缓冲液中分别配制成不同浓度(10，20，30，40，50g/L)，然后分别取500μL不同浓度可溶性淀粉溶液与300μL浓度为10g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)以及200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH 6.5的50mM PBS缓冲液)混合于2mL带盖子的小管内。于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。如图3所示，当可溶性淀粉浓度为40g/L时，染料木素糖基化衍生物产量最高。所以选取可溶性淀粉最适浓度为40g/L。

实施例4：不同染料木素浓度对糖基化染料木素产物合成的影响

将染料木素溶于DMSO中分别配制不同浓度(1，2.5，5，7.5，10g/L)，然后分别取300μL不同浓度的染料木素溶液与500μL浓度为40g/L可溶性淀粉溶液(溶剂为pH 6.5的50mM PBS缓冲液)以及200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH 6.5的50mM PBS缓冲液)混合于2mL带盖子的小管内。于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。如图4所示，当染料木素浓度为7.5g/L时，染料木素糖基化衍生物产量最高。所以选取染料木素最适浓度为7.5g/L。

实施例5：不同底物配比(可溶性淀粉/染料木素，v/v)对糖基化染料木素产物合成的影响

分别取不同体积配比的初始浓度为40g/L可溶性淀粉溶液(溶剂为pH 6.5的50mM PBS缓冲液)和初始浓度为7.5g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)(如可溶性淀粉体积/染料木素体积分别为200μL/600μL，300μL/500μL，400μL/400μL，500μL/300μL，600μL/200μL，100μL/700μL)，然后与200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH 6.5的50mM PBS缓冲液)混合于2mL带盖子的小管内。于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。如图5所示，当可溶性淀粉与染料木素溶液体积比为6/2时，染料木素糖基化衍生物产量最高。所以选取可溶性淀粉和染料木素溶液最适体积比为6/2，即取可溶性淀粉溶液600μL，染料木素溶液200μL。

实施例6：不同酶浓度对糖基化染料木素产物合成的影响

将环糊精葡萄糖基转移酶溶解于pH 6.5的50mM PBS缓冲液中配制成不同浓度(2，5，10，15，20，30，40g/L)，分别取200μL不同浓度的环糊精葡萄糖基转移酶与600μL浓度为40g/L可溶性淀粉溶液(溶剂为pH 6.5的50mM PBS缓冲液)以及200μL浓度为7.5g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)，混合于2mL带盖子的小管内，于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。

如图6所示，当环糊精葡萄糖基转移酶浓度为15g/L时，染料木素糖基化衍生物产量最高。所以选取最适环糊精葡萄糖基转移酶浓度为15g/L。

实施例7：不同反应pH对糖基化染料木素产物合成的影响

将可溶性淀粉和环糊精葡萄糖基转移酶分别溶解在不同pH的缓冲液中(如50mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH分别为4.5，5.0，5.5，6.0；50mM PBS缓冲液，pH分别为6.0，6.5，7.0，7.5；8.0)。然后分别取200μL浓度为15g/L的环糊精葡萄糖基转移酶与600μL浓度为40g/L可溶性淀粉溶液以及200μL浓度为7.5g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)，混合于2mL带盖子的小管内，于30℃震荡器中缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。如图7所示，当pH 6.5时，单糖基染料木素衍生物产量最高，而在pH 7.0时，双糖基染料木素衍生物产量最高。因为双糖基染料木素衍生物的水溶性远高于单糖基染料木素衍生物，所以我们选pH 7.0作为该反应的最适pH。

实施例8：不同反应温度对糖基化染料木素产物合成的影响

分别取200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH 7.0的50mM PBS缓冲液)与600μL浓度为40g/L可溶性淀粉溶液(溶剂为pH 7.0的50mM PBS缓冲液)以及200μL浓度为7.5g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)，混合于2mL带盖子的小管内。分别放于不同温度震荡器中(20，30，40，50，60℃)缓慢震荡24h。反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。

如图8所示，当反应温度为40℃时，双糖基染料木素衍生物产量最高，因此我们选取40℃作为反应最适温度。

实施例9：不同反应时间对糖基化染料木素产物合成的影响

分别取200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH 7.0的50mM PBS缓冲液)与600μL浓度为40g/L可溶性淀粉溶液(溶剂为pH 7.0的50mM PBS缓冲液)以及200μL浓度为7.5g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)，混合于2mL带盖子的小管内。放于40℃震荡器中分别反应不同时间(0，5，10，15，20，25h)，反应完成后通过高效液相色谱(HPLC)检测产物产量。

如图9所示，当反应时间为20h时，双糖基染料木素衍生物产量最高，因此我们选取最佳反应时间为20h。

根据综上所述的反应条件优化结果，我们选取最适的反应条件为：

1mL反应体系中分别包含200μL浓度为15g/L环糊精葡萄糖基转移酶(溶剂为pH 7.0的50mM PBS缓冲液)，600μL浓度为40g/L可溶性淀粉溶液(溶剂为pH 7.0的50mM PBS缓冲液)，以及200μL浓度为7.5g/L染料木素溶液(溶剂为DMSO)。将该反应体系混合并放置于2mL带盖子的小管内，于40℃震荡器中缓慢振荡反应20h。

虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。