本发明涉及基因重组和蛋白质原核表达领域，具体说是一种双促溶原核表达标签，由大肠杆菌硫氧还蛋白trxa和小泛素样修饰蛋白sumo串联组成，将其用于原核表达载体的外源蛋白编码基因上游，以促进所表达的外源蛋白的正确折叠，增强可溶性。
背景技术：
由于原核表达系统缺乏适当的翻译后加工机制，所以在大肠杆菌为宿主菌表达外源蛋白过程中，会因不正确的蛋白折叠而形成不溶性的包涵体，需要再次经过复杂的变性复性处理，很难表达大量的可溶性外源蛋白。
大肠杆菌硫氧还蛋白trxa具有催化蛋白质二硫键还原的功能，可帮助蛋白质正确折叠，共表达可以增加外源蛋白的可溶性，并且在trxa下游还有一个肠激酶位点，表达后使用肠激酶切下trx，保证表达外源蛋白的生物学功能，但其切割效率较低，且促溶效果不甚理想。
小分子泛素样修饰蛋白sumo(smallubiquitin-likemodifier),是一种分子伴侣,具有同泛素相似的结构(β-折叠片缠绕一个α-螺旋的球状折叠)，保守存在于真核生物中，参与蛋白质翻译后修饰等多种生理进程。因为其具有一个高度疏水的核心，能为融合蛋白的折叠提供成核位点，从而作为分子伴侣和融合标签用于提高外源蛋白稳定性和可溶性，且sumo蛋白三级结构能够被sumo蛋白酶完整识别，经过特异性的酶切后的目的蛋白具有天然的n末端，保证了目的蛋白的活性。在表达水平和产物的可溶性方面sumo表达系统明显优于传统表达系统。
本发明在大量生物信息学模拟分析，多种序列组合的设计和实际生物学活性筛选结果的基础上，设计了一种trxa和sumo融合形成双促溶表达标签序列，将该序列置于原核表达载体的外源蛋白编码基因上游，作为促溶标签与外源基因融合表达，可以显著促进所表达的外源蛋白的正确折叠，提高所表达的外源蛋白的可溶性。
技术实现要素：
：
本发明目的是设计一种trxa和sumo双促溶表达标签序列，并将该序列应用于原核表达载体的外源蛋白编码基因上游，作为促溶标签与外源基因同时融合表达，以提高所表达的外源蛋白的可溶性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种trxa和sumo双促溶表达标签序列，具有序列表seqidno：1中碱基序列。
所述trxa和sumo双促溶表达标签的构建,是通过pcr技术将sumo基因克隆，并在其两端增加kpni和ncoi限制性内切酶位点；
采用引物：
f:5’–cggggtaccatgtcggactcagaagtcaat-3’
r:5’–cagtccatggcaccaatctgttctctgtgagc-3’
通过pcr技术扩增出sumo的基因片段；
利用限制性核酸内切酶kpni和ncoi的酶切连接技术将pcr扩增获得的sumo基因连接入pet32a表达载体trx基因的下游和多克隆位点((multiplecloningsite,mcs)的上游区(替代原pet32a表达载体212位至238位的碱基序列)，构建成一种trxa和sumo双促溶表达标签序列，使在同一质粒载体中，利用trx与sumo以融合形式双表达，促进外源蛋白可溶性表达。
本发明具有如下优点：
1.本发明同时采用大肠杆菌硫氧还蛋白trxa和小泛素样修饰蛋白sumo两个分子伴侣组成双促可溶性表达的标签，相对于单一的标签，可以更好的促进外源融合蛋白正确折叠,提高表达量。克服了单一标签促可溶性表达效果不理想的情况。
2.本发明所设计的trxa和sumo双促溶表达标签序列，经原核表达载体在大肠杆菌等宿主菌中表达出来的蛋白质序列，含有的sumo蛋白，其三级结构能够被sumo蛋白酶完整识别，可被特异性的酶切割，使释放出来的下游目的外源蛋白具有天然的n末端，保证了目的蛋白的活性。相较于同类的肠激酶酶切位点，sumo酶切更准确，效率更高。并且由于本发明所设计的双促溶表达标签具有his-tag序列，可被ni亲和层析柱特异性吸附，从而使切割后的外源目的蛋白仅经过一次洗脱即可实现纯化，不仅得到的外源目的蛋白纯度较高，而且大大节约了研究的时间和成本。
附图说明
图1为构建pet32a-sumo质粒pcr验证以1.5％琼脂糖凝胶电泳分析结果图，其中：
1.sumo片段基因；2.psumo质粒pcr结果；3.pet32a-sumo质粒pcr结果；
图2为pet32a-sumo质粒测序结果图；
图3为单链抗体与超抗原融合蛋白(scfv-sag)在仅含trx标签的pet-32a载体菌体诱导前后的15％sds-page电泳分析图，其中：
1.诱导前菌体全蛋白；2.16℃诱导16h后菌体全蛋白；3.16℃诱导16h后菌体的可溶性蛋白；
图4为单链抗体与超抗原融合蛋白(scfv-sag)在pet32a-sumo双标签促促可溶性表达的15％sds-page电泳分析图，其中：
1.诱导前菌体全蛋白；2.16℃诱导16h后菌体全蛋白；3.16℃诱导16h后菌体的可溶性蛋白；
图5为经akta多步纯化后得到的可溶性融合蛋白。
具体实施方式
实施例1
trxa和sumo双促溶表达标签的碱基序列如下：seqidno：1
(1)seqidno：1的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：750bp
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cdna
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人工合成
(2)sumo基因的pcr扩增
(a)pcr引物设计及反应条件：
根据sumo基因序列及pet32a的dna序列设计一组引物：
正向引物:5’–cggggtaccatgtcggactcagaagtcaat-3’(由北京华大基因公司合成)
反向引物:5’–cagtccatggcaccaatctgttctctgtgagc-3’(由北京华大基因公司合成)
pcr反应体系为：10xpyrobestbuffer(购自大连宝生物公司)5μl、dntp(购自大连宝生物公司)250μmol、上下游引物各25pmol、模板psumo质粒dna(购自lifesensors公司)0.1μg、pyrobestdna聚合酶(购自大连宝生物公司)2u，无菌超纯水补齐体积至50μl。
pcr反应条件为：
第一阶段：95℃，5min；
第二阶段：94℃，55s；62℃，2min；72℃，1min；共30个循环；
第三阶段：72℃，10min；
(b)pcr产物回收：pcr扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收750bp的目的条带(图1所示)，操作方法按照江苏康为世纪有限公司胶回收纯化试剂盒使用说明进行。
(c)回收产物双酶切：回收后的pcr产物经限制性内切酶kpni(购自大连宝生物公司)和ncoi(购自大连宝生物公司)双酶切，消化产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析并再次切胶回收。
实施例2
sumo序列与trxa序列的融合连接
(1)pet32a载体双酶切：将pet32a载体质粒dna(购自novagen公司)经限制性核酸内切酶kpni和ncoi双酶切，消化产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，胶回收大片段dna。
(2)酶切产物的连接与转化：将经双酶切的sumo的pcr产物片段和pet32a载体以3：1的摩尔比例混合，使用t4dna连接酶(购自大连宝生物公司)16℃连接过夜，构建出新型表达载体pet-32a-sumo。连接产物转化进入大肠杆菌感受态细胞dh5α(购自大连宝生物公司)(转化操作按照f.奥斯伯等编著的《精编分子生物学实验指南》第三版page39-40)，以氨苄霉素(购自sigma公司)抗性筛选转化子。
(3)表达载体pet-32a-sumo的验证：将挑选的阳性转化子扩培，抽提质粒dna(抽提方法安装江苏康为世纪小量dna提取试剂盒使用说明进行)，经过kpni和ncoi双酶切鉴定。并将双酶切验证正确的重组克隆质粒送往上海生工进行测序，测序结果如图2所示。将测序正确的质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞ad494(购自novagen公司)中。
实施例3
trxa和sumo双促溶表达标签序列的应用及效果评价
(1)将外源基因scfv-sag连接入含有trxa和sumo
双促溶表达标签序列的表达载体pet-32a-sumo：将pet-32a-sumo质粒dna和含有scfv-sag的质粒pet-32a-scfv-sag(构建过程参见参考文献：徐明恺等.2006.fusionimmunotoxinanti-her-2-scfv-sec2expressedine.coliwithanimprovedexpressionvectorpask75-ex:itsconstructionandfunction.生物化学与生物物理进展(英文版).33(8):781-788.)的dna分别使用ncoi和xhoi(购自大连宝生物公司)双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收1881bp的scfv-sag片段和6100bp的pet-32a-sumo质粒片段，以t4dna连接酶16℃连接过夜，构建外源基因scfv-sag融合trxa和sumo双促溶表达标签序列的融合蛋白表达载体pet-32a-sumo-scfv-sag。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞dh5α。以氨苄青霉素抗性筛选转化子，挑选重组单克隆扩培，提取质粒dna，经ncoi和xhoi双酶切鉴定正确重组克隆。并将双酶切验证正确的重组克隆质粒送往上海生工进行测序。将测序正确的质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞ad494。
(2)外源融合蛋白的表达：接种转化重组质粒pet-32a-sumo-scfv-sag的ad494单菌落于100μg/ml氨苄青霉素的液体lb中37℃过夜，次日按1：100转接到下一代，37℃培养至od6000.8，加入终浓度为10mmiptg(购自sigma公司)16℃诱导12h。同时，以含有原始重组质粒pet-32a-scfv-sag的ad494单菌落做同样的操作，作为单促溶标签对照。离心收集诱导表达后的菌体，每100ml原培养物的菌体重悬于10ml平衡缓冲液(50mm咪唑，500mmnacl，ph7.9)，于0℃超声破碎至菌液变得清亮，100000rpm10min超高速离心，收集上清。分别取离心前和离心后的上清液，作为诱导后全细胞蛋白和诱导后全细胞可溶性蛋白的样品，以12％的sds-page分别分析含有pet-32a-scfv-sag和pet-32a-sumo-scfv-sag的ad494基因工程菌中可溶性表达量的差异。结果如图3和图4所示，含有pet-32a-sumo-scfv-sag的ad494基因工程菌可产生相对量更多的可溶性蛋白，说明sumo的加入进一步促进了所表达的外源蛋白的正确折叠，增强了可溶性蛋白的表达比例。
(3)利用akta工作站(美国ge公司产品)纯化外源融合蛋白：离心收集诱导表达后的菌体，每100ml原培养物的菌体重悬于10ml平衡缓冲液(50mm咪唑，500mmnacl，ph7.9)，于0℃超声破碎至菌液变得清亮，100000rpm10min超高速离心，收集上清，上样于ni亲和层析柱(美国ge公司产品)，使用平衡缓冲液(50mm咪唑，500mmnacl，ph7.9)漂洗十个柱体积，至uv检测数值稳定。最后使用洗脱缓冲液(280mm咪唑，500mmnacl，ph7.5)洗脱目的蛋白，在uv检测数值开始拉升后进行收集，直至uv平稳。将收集的蛋白洗脱液使用millipore超滤管(美国merckmillipore公司产品，截留分子量30000)，以4000g离心20min进行超滤并使用pbs稀释后再次超滤，最后收集蛋白液通过12％的sds-page分析纯度，实验结果如图5所示。
以上实验结果证明trxa和sumo双促溶表达标签能够帮助外源融合蛋白正确折叠,提高了外源蛋白的可溶性表达量，是表达重组蛋白的理想工具。
sequencelisting
<110>中国科学院沈阳应用生态研究所
<120>一种trxa和sumo双促溶表达标签序列及应用
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