本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种用于l-苹果酸的分离方法。
背景技术：
苹果酸,又名羟基丁二酸、羟基琥珀酸或1-羟基乙烷二羧酸,分子式为c4h6o5，分子量134.09，结构式为hoocchohch2cooh。苹果酸具有右旋（d-型）和左旋（l-型）两种旋光异构体及dl-型外消旋体三种型式产品。l—苹果酸用途广泛。
l-苹果酸为天然果汁之重要成份，味道柔和，具特殊香味，不损害口腔与牙齿，代谢上有利于氨基酸吸收，不积累脂肪，是新一代的食品酸味剂，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂”。目前在老年及儿童食品中正取代柠檬酸。l—苹果酸是人体必需的一种有机酸，也是一种低热量的理想食品添加剂。
l-苹果酸是生物体三羧酸的循环中间体，口感接近天然果汁并具有天然香味，与柠檬酸相比，产生的热量更低，口味更好，因此广泛应用于酒类、饮料、果酱、口香糖等多种食品中，并有逐渐替代柠檬酸的势头。是目前世界食品工业中用量最大和发展前景较好的有机酸之一。
l－苹果酸中含有天然的润肤成分，能够很容易地溶解粘结在干燥鳞片状的死细胞之间的“胶粘物”，从而可以清除皮肤表面皱纹，使皮肤变得嫩白、光洁而有弹性，因此在化妆品配方中备受青睐。
l－苹果酸可用于药物制剂、片剂、糖浆中，还可以配入氨基酸溶液中，能明显提高氨基酸的吸收率；l－苹果酸可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用；还可用于制备和合成驱虫剂、抗牙垢剂等。另外l－苹果酸还可以作为工业清洗剂、树脂固化剂、合成材料增塑剂、饲料添加剂等。
l-苹果酸的生产最初是在培养黄曲霉时有少量苹果酸伴随琥珀酸和富马酸产生。后来，由糖类物质发酵来生产l-苹果酸，但是传统的发酵法生产l-苹果酸培养时间长、能耗大、产酸率低，糖的利用率不高，很难实现工业化生产。随着氨基酸行业逐步发展，发酵法生产技术l-苹果酸也有了长足的进步，但是l-苹果酸的工业平均转化率为70%-80%，尚有20%-30%富马酸残留，反应液中l-苹果酸的含量较低，大约为100g/l左右，目前国内尚无规模化的l-苹果酸生产方法。申请人之前的发明专利“一种直接发酵法生产l-苹果酸的方法”以及“一种l-苹果酸提取新工艺”通过优化工艺以及菌株合理配伍，大幅度提高了苹果酸的产量以及糖酸转化率，但是黄曲霉会产生一定量的黄曲霉素，产品中会残留黄曲霉毒素，后续分离步骤繁琐，增加了企业成本。发酵液中苹果酸纯度较低，而从发酵液中分离苹果酸的工艺路线复杂，包括多步酸解、过滤、精制、结晶等多个步骤，产品收率低、纯度低。
技术实现要素：
针对现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于l-苹果酸的分离方法，该分离方法苹果酸产率大，产品收率和纯度高。
本发明的技术方案是通过如下方式来实施的：
一种用于l-苹果酸的分离方法，其包括如下步骤：步骤1）制备米曲霉种子液，步骤2）制备寄生曲霉种子液，步骤3）发酵，步骤4）离心、过滤以及离子交换。
具体地，所述分离方法包括如下步骤：
步骤1）制备米曲霉种子液：将米曲霉菌液按照8％的接种量接入米曲霉种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养16小时得到米曲霉种子液；
步骤2）制备寄生曲霉种子液：将寄生曲霉菌液按照6％的接种量接入寄生曲霉种子罐中进行培养，在温度为32℃，摇床转速为200r/min，培养24小时得到寄生曲霉种子液；
步骤3）发酵：将米曲霉种子液和寄生曲霉种子液按照3:2的体积比混匀得到混合种子液，然后按照混合种子液∶发酵罐培养基为1∶8的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养3d，然后添加碳酸钙，维持碳酸钙的浓度在80g/l，继续发酵3d，停止发酵，得到l-苹果酸发酵液；
步骤4）离心、过滤以及离子交换：将l-苹果酸发酵液2000rpm离心10min，去除沉淀，收集上清液，微滤膜过滤，截留分子量为10000da，微滤温度为30℃；滤过液再进行超滤，截留分子量为1000da，超滤温度为30℃，收集透过液，将透过液通过装填有强碱弱酸型两性离子交换树脂的色谱柱，然后洗脱吸附于树脂上的苹果酸，将得到的洗脱液减压蒸馏，真空干燥，得到l-苹果酸。
优选地，所述米曲霉种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，ph值6.0。
优选地，所述种子罐的培养基组分为：木糖10g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，ph值6.5。
优选地，所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米浆12g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，ph值6.2。
优选地，所述米曲霉为米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584，所述寄生曲霉为寄生曲霉(aspergillusparasiticus)cicc40365。
本发明的有益效果主要包括但是并不限于几个方面：
针对现有技术的缺陷，本发明经过多次尝试，采用米曲霉和寄生曲霉按照一定比例混合，二者之间具备一定的协同作用，比常规的米曲霉发酵方法，能够提高苹果酸的产量，而且大大降低了黄曲霉毒素的产生，简化了后续分离步骤，降低了企业成本。本发明采用两种不同菌株独立增殖制备种子液的步骤，避免了相同培养工艺造成的菌株增殖效率慢，菌株活性低等缺陷；本发明发酵工艺中添加碳酸钙来维持碳酸钙浓度，提高了发酵效率；本发明发酵液中分离l-苹果酸产品收率和纯度高，操作工艺简单，生产成本低，可规模化生产。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于l-苹果酸的分离方法，其包括如下步骤：
1）将米曲霉(aspergillusoryzae)菌液（浓度为1×108cfu/ml)按照8％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养16小时得到米曲霉种子液，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，ph值6.0；
2）将寄生曲霉(aspergillusparasiticus)菌液（浓度为1×108cfu/ml)按照6％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为32℃，摇床转速为200r/min，培养24小时得到寄生曲霉种子液，其中，种子罐的培养基组分为：木糖10g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，ph值6.5；
3）将米曲霉种子液和寄生曲霉种子液按照3:2的体积比混匀得到混合种子液，然后按照混合种子液∶发酵罐培养基为1∶8的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养3d，然后添加碳酸钙，维持碳酸钙的浓度在80g/l，继续发酵3d，停止发酵，得到l-苹果酸发酵液；所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米浆12g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，ph值6.2；所述米曲霉为米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584，所述寄生曲霉为寄生曲霉(aspergillusparasiticus)cicc40365（可见微生物学通报2014年，41（6）吴悦等）；发酵液中l-苹果酸的测定：采用2,7—萘二酚显色法，取样品溶液1.0ml，加入6.0ml分析纯的浓硫酸，再加入0.1ml2,7—萘二酚溶液，接着在100℃水浴中加热20min，取出待冷却至室温后，于385nm下进行比色测定，以蒸馏水作对照校正仪器零点。用标准样品先作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，385nm处吸收值即od385为纵坐标，通过未知样品在385nm处的od值，则可在标准曲线上查得相应的苹果酸含量。检测l-苹果酸产量为156.1g/l，且残糖含量为1.2g/l；
4）取l-苹果酸发酵液100l，2000rpm离心10min，去除沉淀，收集上清液，微滤膜过滤，截留分子量为10000da，微滤温度为30℃；滤过液再进行超滤，截留分子量为1000da，超滤温度为30℃，收集透过液，将透过液通过装填有强碱弱酸型两性离子交换树脂的色谱柱，使其中的苹果酸被吸附，然后用70℃热水洗脱吸附于树脂上的苹果酸，反复洗脱3-5次，将得到的洗脱液合并，减压蒸馏，真空干燥，得到l-苹果酸产品13.2kg；产品纯度大于99%，熔点为90-100℃，比旋光度为－2.19、硫酸盐含量小于0.03%，氯化物含量小于0.005%，透光率、重金属含量等相关指标符合相关标准要求。
实施例2
一种制备l-苹果酸的方法，其包括如下步骤：
将米曲霉(aspergillusoryzae)菌液（浓度为1×108cfu/ml)按照8％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为33℃，摇床转速为200r/min，培养16小时得到种子液，其中，种子罐的培养基组分为：蔗糖3g，硝酸钠0.2g，硫酸铵0.5g，磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.1g，一水硫酸锰0.1g，七水硫酸亚铁0.01g，硫酸镁0.01g，氯化钠0.01g，ph值6.0；
按照种子液∶发酵罐培养基为1∶8的体积比例转入发酵罐中培养，温度33℃，培养3d，然后添加碳酸钙，维持碳酸钙的浓度在80g/l，继续发酵3d，停止发酵，得到苹果酸发酵液；
所述发酵罐培养基组分为：碳酸钙80g/l，葡萄糖80g/l，玉米浆12g/l，硫酸铵2g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾0.2g/l，磷酸氢二钾0.1g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，ph值6.2；
所述米曲霉为米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。
l-苹果酸的测定方法同实施例1。检测l-苹果酸产量为99.3g/l，且残糖含量为4.3g/l。
实施例3
本发明检测了碳酸钙对生产l-苹果酸产量的影响。发酵第三天不添加碳酸钙，其他同实施例1，经过检测，l-苹果酸产量为143.5g/l，残糖含量为1.9g/l。
本发明还检测了采用申请人之前的专利技术“一种直接发酵法生产l-苹果酸的方法”制得发酵液中黄曲霉毒素含量为12.69ug/l；而本申请实施例1制得发酵液中黄曲霉毒素含量小于0.5ug/l。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。