本发明涉及培养基，特别涉及一种含有豆粕提取物的发酵培养基，以及所述培养基在促进高山被孢霉产EPA中的应用。
背景技术：
EPA(全顺式-5、8、11、l4、17-二十碳五烯酸)是一种ω-3系列长链多不饱和脂肪酸，具有抗凝血、抗癌、抗炎、防心血管病、降血脂等特殊生理功能，在医药保健品、食品和饲料行业均有较多的应用。EPA的生物来源主要包括海洋鱼类和微生物发酵生产，微生物发酵法生产EPA原料丰富、周期短、价格便宜、占地面积小、不受气候影响等，越来越受关注。目前通过微生物发酵法生产EPA的商业化产品是杜邦公司报道的New HarvestTMEPAoil和salmon，所用菌株是解脂耶氏酵母基因工程菌。高山被孢霉油脂含量丰富，目前已是花生四烯酸(AA)的商业化生产菌。野生型高山被孢霉需在低温下合成EPA，且产量较低。中国发明专利申请CN2016101289357公开了一株高产EPA的重组高山被孢霉MA-oPaFADS17-3(它同样被命名为CCFM695)，该菌株是通过在野生型高山被孢酶中过表达来源于瓜果腐霉的ω-3脂肪酸脱饱和酶，最终得到成功表达候选ω-3脂肪酸脱饱和酶的高山被孢霉重组菌株。据记载，将该重组菌接种于Broth培养基中，在28℃200rpm摇床培养7d，测得其EPA(C20:5)的产量达到617.1mg/L，占总脂肪(TFA)的18.7％，而且表现出高效率地将AA催化转化为EPA，转化率达到49.9％。为进一步提高其EPA产量，本发明对其培养基组成进行了优化。
技术实现要素：
本发明的目的克服现有技术缺陷，在降低发酵成本的前提下通过优化发酵培养基的组成配方，进一步提高高山被孢霉CCFM695在常温条件下的EPA产量。
为了实现上述目的，本发明提供豆粕提取物在促进高山被孢霉产EPA中的应用。
进一步地，本发明提供豆粕提取物在高山被孢霉发酵培养基中作为氮源的应用。
在本发明中，豆粕提取物的制备方法是：以重量计，取豆粕1份，加入5份水，煮沸并保持沸腾10-30min；所得产物用双层纱布过滤，弃去滤渣，所得滤液冷却至室温，即为所述豆粕提取物。
优选地，所述豆粕提取物在高山被孢霉发酵培养基中的浓度是10-70g/L。
本发明还提供一种发酵培养基，所述发酵培养基组成如下：
所述发酵培养基的pH值为6.0-8.0；
所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种。
在本发明中，所述淀粉是玉米淀粉、可溶性淀粉或马铃薯淀粉。
本发明还提供上述发酵培养基作为高山被孢霉产EPA的培养基的应用。
以下详细解释本发明的技术方案。
本发明以中国发明专利申请CN 2016101289357公开的高山被孢霉MA-oPaFADS17-3(它同样被命名为CCFM695)作为对象。该菌株是通过过表达来源于瓜果腐霉的ω-3脱饱和酶oPaFADS17基因的重组高山被孢霉，该菌株于2015年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.11394。
根据记载，该菌株是以Broth培养基为发酵培养基，其组成为：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L磷酸二氢钾，0.25g/L七水硫酸镁，10g/L硝酸钾，余量为水，pH 6.0。
本发明是通过如逐步优化发酵培养基的组成，试图进一步提高高山被孢霉CCFM695的EPA产量。
优化过程如下：
A、菌种活化
将高山被孢霉CCFM695以1％接种量接种到活化培养基中，在28℃200rpm的转速下活化36h，活化两代；
活化培养基的组成为：20g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物(Yeast extract)、10g/L硝酸钾、1g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水合硫酸镁，采用1M HCl和1M NaOH水溶液将其pH调节至6.0，再在温度115℃下灭菌20min，得到所述的活化培养基。
B、葡萄糖浓度对EPA产量的影响
将活化两代的高山被孢霉CCFM695按1％的接种量接种到葡萄糖浓度分别为40g/L、50g/L和60g/L的发酵培养基中，然后在温度28℃的室温条件下，以200rpm的转速发酵7天，每个浓度做3个平行，分别测定所得发酵产物的脂肪酸组成，确认碳源(即葡萄糖)的合理浓度。
发酵培养基的组成为：葡萄糖(不同浓度)、5g/L酵母提取物(Yeast extract)、10g/L硝酸钾、1g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水合硫酸镁，采用1M HCl和1M NaOH水溶液将其pH调节至6.0，再在温度115℃下灭菌20min，得到所述的发酵培养基。
C、碳源的优化
确认碳源(即葡萄糖)的合理浓度后，分别以玉米淀粉、可溶性淀粉、马铃薯淀粉及它们的混合物，以及甘油作为碳源，替代发酵培养基中的葡萄糖，其他培养条件同步骤B，分别测定所得发酵产物的脂肪酸组成，确认碳源的合理选择。
D、有机氮源的优化
确认碳源的合理浓度和具体选择后，分别以10g/L、30g/L、50g/L、70g/L豆粕提取物作为有机氮源，替代发酵培养基中的酵母提取物(Yeast extract)，其他培养条件同步骤B，分别测定所得发酵产物的脂肪酸组成，确认有机氮源的合理选择。
其中，所述豆粕提取物的制备方法是：称取豆粕适量，按豆粕与水重量比1：5分别加水后煮沸并保持沸腾20min，所得产物用双层纱布过滤，弃去滤渣，所得滤液冷却至室温，即为所述豆粕提取物。
在本发明中，豆粕应当理解为大豆提取豆油后得到的副产品，其呈不规则碎片状，颜色为浅黄色至浅褐色，味道具有烤大豆香味。豆粕是市场上能够购买获得的产品，例如中储粮镇江粮油有限公司销售的豆粕产品。
E、无机氮源的优化
确认碳源和有机氮源后，以硝酸钾作为发酵培养基的无机氮源，分别设置添加浓度设为0g/L、5g/L、10g/L，其他培养条件同步骤B，分别测定所得发酵产物的脂肪酸组成，确认无机氮源的合理选择。
F、pH值的优化
通过盐酸和/或氢氧化钠溶液调节发酵培养基的pH值分别设为5、6、7、8、9，培养条件同步骤B，分别测定所得发酵产物的脂肪酸组成，确认pH值的合理选择。
经过上述试验和结果比较，本发明意外地发现通过合理选择碳源和有机氮源能够大幅提高高山被孢霉CCFM695在常温环境下的EPA产量，由现有技术记载的617.1mg/L提高至1.7g/L，为现有技术的275.5％。而且所选用的碳氮源为葡萄糖和豆粕，二者市场价格较低且容易获得，能够有效降低发酵培养基的生产成本。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
在本发明中，如无特殊说明，用于表示浓度的“％”均为重量百分比，或“份”均为重量份。
本发明使用的培养设备是上海知楚仪器有限公司销售的振荡培养箱(型号:ZQZY-70B)。
实施例1：发酵培养基中葡萄糖浓度的确定
将高山被孢霉CCFM695以1％接种量接种到活化培养基中，在28℃200rpm转速条件下活化36h，活化两代；
活化培养基的组成为：20g/L葡萄糖、5g/L酵母提取物(Yeast extract)、10g/L硝酸钾、1g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水合硫酸镁，采用1M HCl和1M NaOH将其水溶液的pH调节至6.0，再在温度115℃下灭菌20min，得到所述的活化培养基。
在现有技术记载的Broth培养基(20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，1g/L磷酸二氢钾，0.25g/L七水硫酸镁，10g/L硝酸钾，余量为水，pH 6.0。)的基础上，考察提高葡萄糖浓度是否有利于高山被孢霉生长和提高脂肪酸产量，所以将其中的葡萄糖浓度设置为40g/L、50g/L、60g/L(培养基中的其他组分不变)，将实验菌株高山被孢霉MA-oPaFADS17在28℃条件下常温发酵7天，测定样品中脂肪酸含量。
所述的脂肪酸测定方法参考文献：
Wang L,Chen W,Feng Y,et al.Genome characterization of the oleaginous fungusMortierella alpina.Plos One,2011,6(12):e28319.
表1不同初始葡萄糖浓度对高山被孢霉CCFM695发酵产EPA的影响
注：表中数据以平均值±标准差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法进行著性分析。
结果显示，CCFM695菌株在常温条件下可积累大量的EPA，其结果与现有技术记载的一致。与CN 2016101289357记载的数据相比，适当提高葡萄糖浓度有利于总脂肪酸(TFA)和EPA产量的提高，该提高幅度低于预期。其中，过高或过低的葡萄糖浓度都不利于EPA产量的提高，50g/L的葡萄糖浓度最适宜该菌株在摇瓶中发酵产EPA。
实施例2：碳源种类的确定
分别以50g/L的玉米淀粉、可溶性淀粉、马铃薯淀粉或甘油替代实施例1的发酵培养基中的葡萄糖，还设置葡萄糖和可溶淀粉各25g的组别，其他组成及条件不变，将实验菌株高山被孢霉CCFM695在28℃条件下常温发酵7天，测定样品中脂肪酸含量。
表2不同碳源种类对高山被孢霉CCFM695发酵产EPA的影响
注：表中数据以平均值±标准差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法进行著性分析。
结果显示，高山被孢霉CCFM695可以不同程度利用多种淀粉作底物进行发酵产脂，其中玉米淀粉的效果最佳，EPA产量最高达到1237mg/L且总脂肪酸(TFA)含量最高，显著优于其他组别，而可溶性淀粉的效果也显著高于现有技术达到935mg/L，这主要是因为玉米淀粉或可溶性淀粉均可以显著提高菌体的生物量的原因。但以可溶性淀粉作为碳源时，明显看到其总脂肪酸含量较低，这可能是由于可溶性淀粉有利于生物量的提高而不利于脂肪酸的积累，因此其综合效果不如玉米淀粉。而马铃薯淀粉、葡萄糖与可溶性淀粉的混合物以及甘油作为碳源时，EPA产量则没有显著变化。
实施例3：有机氮源的确定
在培养基中碳源为50g/L的葡萄糖的前提下，对比有机氮源酵母提取物(Yeastextract，价格昂贵)与豆粕提取物(廉价)对高山被孢霉产脂肪酸的影响，其中酵母萃取物在培养基中的浓度为5g/L，豆粕提取物在培养基中的浓度为50g/L，其他组成及条件不变，将实验菌株高山被孢霉CCFM695在28℃条件下常温发酵7天，测定样品中脂肪酸含量。
表3不同有机氮源对高山被孢霉CCFM695发酵产EPA的影响
注：表中数据以平均值±标准差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法进行著性分析。
进一步设定豆粕提取物的不同添加浓度，分别为10g/L、30g/L、50g/L与70g/L，其他组成及条件不变，将实验菌株高山被孢霉CCFM695在28℃条件下常温发酵7天，测定样品中脂肪酸含量。
表4不同豆粕提取物浓度对高山被孢霉CCFM695发酵产EPA的影响
注：表中数据以平均值±标准差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法进行著性分析。
结果表明，相比昂贵的酵母萃取物，豆粕提取物作为有机氮源使用时，不仅价格低廉，还意外地发现其对菌体生长有显著的促进作用，EPA产量大副提高，高达1551mg/L。
此外，当用酵母提取物作为有机氮源时，AA和EPA的产量比约为1:1，表明AA转化为EPA的转化率约50％(转化率＝EPA产量/AA+EPA总量*100％)，而以豆粕提取物作有机氮源时，EPA的产量明显高于AA产量，约为2倍，转化率达到61.4％，表明豆粕提取物有利于促进高山被孢霉从AA向EPA的催化转化，更适合EPA的工业化生产。
当中，豆粕提取物浓度为30-70g/L时均表现出明显的增产效应，其中以50g/L效果最佳，EPA产量最高。
实施例4：无机氮源浓度的确定
在50g/L葡萄糖作碳源、5g/L酵母萃取物作氮源的情况下，设置发酵培养基中无机氮源硝酸钾的不同添加浓度，分别设为0g/L、5g/L、10g/L，其他培养条件不变，将实验菌株高山被孢霉CCFM695在28℃条件下常温发酵7天，测定样品中脂肪酸含量。
表5不同硝酸钾浓度对高山被孢霉CCFM695发酵产EPA的影响
注：表中数据以平均值±标准差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法进行著性分析。
与现有技术教导的一致，氮源限制有利于高山被孢霉产脂一致，通过调节不同的无机氮源的浓度可以发现，当培养基中添加低浓度的无机氮源时，可适当提高EPA的产量。
实施例5：pH值的确定
考察培养基pH值对菌株EPA产量的影响。分别用1M盐酸和1M氢氧化钠溶液将Broth基础培养基的pH值调为5、6、7、8、9，其他条件不变，将实验菌株高山被孢霉CCFM695在28℃条件下常温发酵7天，测定样品中脂肪酸含量。
表8不同pH值对高山被孢霉CCFM695发酵产EPA的影响
注：表中数据以平均值±标准差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法进行著性分析。
从表格数据可以看出，pH6-8时均有异于菌株的发酵产脂肪，表现为产量高于现有技术的记载，其中，pH＝6时效果最优，EPA产量最高。
实施例6：正交优化实验
将碳源、有机氮源、无机氮源三个对EPA合成影响较大的三个因素进行三因素三水平的正交实验，设计表格如下：
表9影响EPA合成的因素和水平
表10SPSS设计的正交实验结果
表11正交实验结果的方差分析
注：K值表示A、B、C的某一水平对应的EPA含量
Rj值为kmax-kmin
根据极值R可以判断出，RA>RB>RC，所以碳源种类对EPA的影响最大，有机氮源豆粕提取物的浓度次之，无机氮源KNO3浓度的影响在三者中最小。通过比较k值的大小，可以得出，最优发酵方案为A1B2C2，即碳源为葡萄糖，豆粕浓度50g/L，KNO3浓度5g/L，在此条件下，EPA产量最高可达1733.5mg/L。比原始条件(600mg/L)下提高了2.9倍。
综上所述，本发明通过合理选择发酵培养基中的碳源和有机氮源，以葡萄糖或淀粉(特别是玉米淀粉)作为碳源、且以豆粕提取物作为有机氮源，实现大幅提高高山被孢霉CCFM695在常温环境下的EPA产量至1.7g/L，为现有技术的275.5％。而且所选用原料的市场价格较低且容易获得，能够有效降低发酵培养基的生产成本。