一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于动物医学领域中牛支原体病的检测，特别涉及一种用于检测牛支原体病原的实时荧光定量检测试剂盒及其专用引物、探针与其在检测牛支原体中的应用。

背景技术：

牛支原体一种能引起犊牛肺炎，成年牛乳腺炎的重要的病原微生物。1961年，美国科学家hale首次从患有乳腺炎的牛乳中分离到了牛支原体。对牛支原体的研究越来越深入。牛支原体属于柔膜体纲，支原体目，支原体属，无乳支原体，牛支原体亚种。除了能引起上述的肺炎和乳腺炎以外。在患有耳炎，关节炎，结膜角膜炎，生殖道炎症及不孕不育症等的病牛样本中均曾分离到牛支原体。每年在欧美地区由牛支原体引起的奶牛乳腺炎，犊牛肺炎等症状对养牛业造成的损失巨大。随着优质的外国种牛引进国内，在我国的湖北，重庆，内蒙等地区相继爆发了由牛支原体引起的相关疾病。发病率高达50％，某些地区病死率更是达到了100％。然而，国内缺乏相关研究延误对本病的诊断及治疗。从而引发了本病的进一步扩大及传播。目前，对牛支原体的检测有三种方法，血清学诊断，病原学诊断。

牛支原体的病原学诊断是实验室中的最为常用的诊断方法。通过对病牛样品中的总DNA提取，目的基因的PCR扩增及凝胶电泳从而诊断病原微生物。该方法较传统的培养法而言，周期短，特异性强。然而牛支原体属于无乳支原体牛亚种，它的DNA序列与牛乳支原体的相似性达到了98％。这不仅影响牛支原体PCR诊断方法的建立，更是对牛支原体血清学诊断产生了巨大的障碍。由于牛支原体与无乳支原体大量的膜蛋白相似，导致血清学的诊断方法的特异性低。

探针法(Taqman)指的是水解寡核苷酸探针。这种方法使用了具有5’外切核酸酶活性的聚合酶。该探针在5’端标记报告荧光基团，在3’端标记淬灭基团，在探针完整时报告荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，因此没有荧光产生。在延伸阶段，由于DNA聚合具有5’-3’外切酶活性，5’端标记报告荧光基团被水解掉，远离淬灭基团，于是产生荧光信号。如果在过程中，底物序列不能同探针互补，则探针仍然是游离的，未杂交的探针仍然保持完整，荧光信号也就不能被检测到。相反，如果正确的底物被扩增出来后，探针就会在复性阶段与其杂交，当聚合延伸到探针时，它就会将探针的5’端给替换下来，并将报告基团切割下来，这就使得报告基团和淬灭子分开，从而使荧光信号释放出来，可通过检测系统观察到信号的变化。Taqman探针的优点是可以利用多种荧光同时进行多重分析，这是等结合荧光基团所不具备的优点。

TU基因的功能是编码主要负责肽链延伸的延伸因子tuf。而肽链延伸是蛋白质合成的重要步骤。TU基因具有功能保守，其遗传稳定性及广泛分布性，使其成为遗传进化分子标靶重要基因。实验表明，Tuf基因比16sRNA基因更适合作为分子标靶。荧光定量PCR具有快速、稳定、灵敏等特点。在实验室及临床诊断，荧光定量PCR被广泛运用。该实验通过建立荧光定量Taqman探针法，为实验室及临床诊断提供依据。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒及其使用方法，已解决现有技术的不足。

本发明的技术方案是：一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒，包含TaqMan探针，PCR检测引物或该引物的衍生序列，PCR扩增试剂，阳性对照和阴性对照,

所述引物的衍生序列，是指在上述序列的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。其TaqMan探针是根据衍生序列、牛支原体目的基因序列自行设计合成，具有特异性、唯一性。

所述PCR扩增试剂为pfu DNA扩增酶、dNTPs和缓冲液，均为经经试验比较后的最佳配比浓度。

所述阳性对照为牛支原体标准株基因组或携带牛支原体基因的克隆质粒，优选为pMD19-T-TU；所述阴性对照为不含牛支原体基因的pMD19-T空载体质粒。

所述试剂盒包括实时荧光定量反应条件为94℃预变性3min，94℃变性10S，60℃退火30S，共40个循环。

所述的一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒使用方法，包含以下步骤：

[1]待检样本PCR模板的制备方法：

(1)取支原体培养物、组织匀浆液或鼻腔拭子浸液100μL，按照DNA提取试剂盒提取总DNA备用；

[2]牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒反应体系组装：

(1)取酶混合物12.5μL，上下游引物引物各1μL,探针1μL；

(2)加入已制备好DNA模板2μL，用灭菌双蒸水补至25μL；

[3]PCR扩增参数为：

(1)94℃预变性5min；

(2)94℃10s,60℃31s；循环数40，每个循环结束检测荧光值；

[4]检测结果判定:

阳性对照Ct值小于20，阴性对照无Ct值，说明试剂盒、操作过程均正常，实验成立；待检样本Ct值小于30，判为牛支原体核酸阳性；待检样本Ct值大于30，牛支原体核酸阴性。

本发明的有益效果：本发明首次建立了牛支原体的实时荧光定量检测方法，首先设计针对牛支原体基因的引物与探针，再以待测样品的为模板，结合实时荧光定量检测技术，实现对牛支原体进行定性、定量检测的目的。

本发明牛支原体的实时荧光定量检测方法明显优于现有的牛支原体检测方法，具有特异性高、灵敏度高、准确度高、检测速度快、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，可用于临床、科研以及生产中对牛支原体进行定性和定量分析，应用前景广阔。

附图说明

图1为本发明牛支原体的实时荧光定量检测方法的技术路线；

图2为扩增的牛支原体TU基因特异性保守区的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图3为以标准品质粒为模板进行实时荧光定量的扩增曲线；

图4为以标准品质粒为模板进行实时荧光定量的标准曲线；

图5为牛支原体实时荧光定量检测方法特异性的检测结果；

图6为牛支原体实时荧光定量检测方法灵敏度的检测结果；

图7为牛支原体普通检测方法灵敏度的检测结果。

具体实施方式

(一)提取牛支原体的基因组DNA

用细菌基因组提取试剂盒(购自天根公司)提取牛支原体(来源于纯培养物)的基因组，具体方法包括以下步骤:

1.取支原体培养液1-5mL，10000rpm离心1min，尽量吸净上清。

2.向菌体沉淀中加入即缓冲液，振荡至菌体彻底悬浮。

3.向管中加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

4.加入220μL缓冲液GB，振荡15sec，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

5.加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

8.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。

9.重复操作步骤。

10.将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

11.将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL此洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

(二)构建携带牛支原体基因的克隆质粒实时(荧光定量标准品)

根据牛支原体TU基因的核苷酸序列设计扩增牛支原体TU基因的引物，以步骤1提取的牛支原体的基因组DNA为模板，在基因引物和的引导下进行PCR扩增。25μLPCR反应体系为:牛支原体的基因组DNA 2μL，2×Taq PCR Master Mix(购于Tiangen公司)12.5μL，上游引物，下游引物各1μL，ddH₂O 8.5μL。反应条件为先95℃预变性然后95℃变性，61℃退火，72℃延伸，共35个循环；最后72℃终延伸10min。反应结束后，取10μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(110V 30min)，结果如图2(泳道M为Marker DL2000，泳道1～6为6个平行样，泳道-为阴性对照)所示，经扩增获得了长度为的DNA片段，用琼脂糖胶回收试剂盒(天根公司)回收、纯化扩增产物，将其连接到载体pMD19-T(购自TakaRa)中，将连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞(购自TakaRa)，筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序，测序结果表明经PCR扩增获得了序列正确的牛支原体TU基因，而且牛支原体TU基因成功连接入载体pMD19-T中的BamHI位点和HindⅢ位点之间，与预期结果相符，将携带牛支原体TU基因的重组载体命名为pMD19-T-TU。

将携带pMD19-T-TU的阳性克隆接入添加氨苄青霉素(Amp⁺)的液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养12-16h，培养结束后用质粒小提试剂盒(天根公司)提取质粒，得到携带牛支原体TU基因的克隆质粒。

将上述质粒经微量分光光度仪，得到质粒的DNA浓度为44.2ng/μL(OD₂₆₀＝0.883；OD₂₆₀/OD₂₈₀＝2.00；OD₂₈₀＝2.00)；19T质粒载体长度为2692bp，插入片段为104bp，阳性质粒含2796bp。平均分子量dsDNA＝(碱基数)×(660道尔顿/碱基)，则标准品pmd19T/TU的分子量为1.85×10⁶，阿伏伽德罗常数(每mol的微粒数)为6.02×10²³copy/mol；质粒拷贝数为1.91×10⁹copy/mol。

将牛支原体质粒通过dilution进行十倍稀释，得到1.91×10⁹，1.91×10⁸，1.91×10⁷，1.91×10⁶，1.91×10⁵标准品的模板。采用筛选好的条件进行荧光定量PCR，得到各自的Ct值，以Ct值为纵坐标，起始模板浓度的对数为横坐标做标准曲线。

(三)建立实时荧光定量的标准曲线

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

以步骤2获得的拷贝数分别为10²-10⁹拷贝的标准品质粒为模板，在实施例中引物及探针的引导下用荧光PCR仪进行实时荧光定量扩增。实时荧光定量反应体系为:25μl，Premix EX Taq^TM(2×)12.5μl，上下游引物各1μl，探针1μl，模板1μl，补水至25μl。实时荧光定量反应条件为94℃预变性，94℃变性10S，60℃退火30S，共40个循环。在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

结果各稀释度的质粒均能产生荧光信号，扩增曲线如图所示从右至左依次为以10²-10⁹拷贝标准品质粒为模板的扩增曲线横坐标为起始模板拷贝数，纵坐标为标准品质粒Ct值，从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，S型曲线基线平整，指数区明显，斜率较大，平台区基本汇于一起，这些均说明在该条件下模板的扩增是较为理想的。以起始模板拷贝数的对数为X轴，以10⁹-10²拷贝/μL牛支原体标准品质粒值Ct为Y轴绘制标准曲线:Ct＝-3.24logDNA拷贝数+46.2

(四)牛鼻拭子样品检测

无菌采集30份的牛鼻拭子样本，对样本进行处理:将牛鼻拭子浸入2mL的PBS液中，充分搅混。

提取待测样品的基因组模板DNA(模板)，每个样品设个3复孔，同时设阴性对照，用步骤3中的反应体系及反应条件进行牛支原体的实时荧光定量PCR检测。检测结果，将样品的值代入标准曲线的直线回归方程式，计算出样品拷贝数，再乘以稀释倍数再除以10，即为样品中牛支原体的拷贝数。

实施例检测牛支原体实时荧光定量检测方法的特异性

绵羊肺炎支原体，丝状支原体山羊亚种，沙门氏菌，巴氏杆菌，李斯特杆菌均来自贵州大学动物疫病研究所为模板，以10⁴拷贝/μL牛支原体克隆质粒标准品为阳性对照，以无菌去离子水为阴性对照，检测本发明牛支原体实时荧光定量检测方法的特异性。实时荧光定量检测的反应体系及反应条件与实施例相同。

特异性检测结果如图(曲线为阳性对照扩增曲线，曲线一为鉴别菌株扩增曲线，曲线为阴性对照)所示，可以看出，只有以牛支原体和阳性对照为模板会出现明显的S型扩增曲线(阳性)，以其它菌和病原体的基因组为模板均为直线(无扩增曲线，阴性)，空白对照也为直线(无扩增曲线，阴性)，与预期结果相符，表明本发明的检测方法具有较高的特异性。

检测牛支原体实时荧光定量检测方法的灵敏度

在实时荧光定量PCR检测中，检测灵敏度即所谓的检测低限通常有3种表示方法:

绝对检测低限(能被检测和定量到的模板起始拷贝最低数)、相对检测低限(能被检测和定量到的外源基因的最低百分含量)、实际检测低限(实际被检测的DNA数量)。本实施例中采用绝对检测低限测定本发明牛支原体实时荧光定量检测方法的灵敏度。检测牛支原体的实时荧光定量检测方法与普通检测方法的灵敏度，方法为:提取牛支原体的基因组。，然后以倍梯度进行稀释，再以经梯度稀释的牛支原体基因组为模板，模板浓度分别为10⁰-10⁹以去离子水作为阴性对照，每个浓度的模板取1μL，分别对本发明牛支原体的实时荧光定量检测方法和普通PCR检测方法的灵敏度进行检测。实时荧光定量PCR检测的反应体系及反应条件与实施例2中的步骤3相同。普通检测的反应体系及反应条件与实施例2中的步骤2相同。

本发明实时荧光定量检测方法的灵敏度检测结果如图(曲线0-9分别以贬此为模板的实时荧光定量扩增曲线所示，从图中可以看出，牛支原体浓度为10⁹-10⁰时均有明显的扩增曲线，最低检测浓度为10⁰。)

普通的灵敏度的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图7(泳道为DNAMarker DL2000，泳道0-9为不同浓度模板的PCR扩增产物，模板浓度分别为10⁹-10⁰，泳道10为阴性对照去离子水，泳道为所示，从图中可以看出，当牛支原体基因组浓度低于10⁴时无明显条带，普通检测方法的最低检测浓度为10⁴)。

上述实验结果表明，本发明牛支原体的实时荧光定量检测方法具有较高的灵敏度，其灵敏度是普通检测方法的1000倍。

实施例、检测牛支原体实时荧光定量检测方法的重复性

以携带牛支原体TU基因的阳性克隆质粒为模板，以稀释度为的为模板，作三次倍递增稀释以10⁵为模板分别作次重复检测，用所得Ct值算出值平均值、标准差和变异系数，建立组内重复性试验；以三个不同的10⁹，10⁷，10⁶为模板分别进行三次倍递增稀释得到三组稀释度为10⁹，10⁷，10⁶的模板，用所得值算出值平均值、标准差和变异系数值，分析其组间重复性。

表2牛支原体实时荧光定量检测方法的重复性检测结果

检测结果如表2所示，结果同一模板的不同稀释度的组内重复测定其CV值在0.351～1.184％之间，不同模板的组间重复测定其CV值在0.796～1.139％之间，值均低于2％，表明本发明牛支原体的实时荧光定量检测方法的重复性好。

牛支原体进行实时荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括以下用反应体系为25μL，Premix EX Taq^TM(2×)12.5μL，上下游引物引物各1μl，探针1μL，模板1μL，补水至25μL。包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为牛支原体标准株基因组或携带牛支原体基因的克隆质粒(优选为pMD19-T-TU)，所述阴性对照为不含牛支原体基因的反应物，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。

所述的一种牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒使用方法，包含以下步骤：

[1]待检样本PCR模板的制备方法：

(1)取支原体培养物、组织匀浆液或鼻腔拭子浸液100μL，按照DNA提取试剂盒提取总DNA备用；

[2]牛支原体Taqman荧光PCR试剂盒反应体系组装：

(1)取酶混合物12.5μL，上下游引物引物各1μL,探针1μL；

(3)加入已制备好DNA模板2μL，用灭菌双蒸水补至25μL；

[3]PCR扩增参数为：

(1)94℃预变性5min；

(3)94℃10s,60℃31s；循环数40，每个循环结束检测荧光值；

[4]检测结果判定:

阳性对照Ct值小于20，阴性对照无Ct值，说明试剂盒、操作过程均正常，实验成立；待检样本Ct值小于30，判为牛支原体核酸阳性；待检样本Ct值大于30，牛支原体核酸阴性。