利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法与流程

本发明涉及转伸展蛋白水稻的分子生物学技术领域，尤其涉及一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法。

背景技术：

伸展蛋白(extensin)是一种细胞壁结构蛋白，一般由一条多肽链组成，并富含羟脯氨酸残基[1](tierneyetal.,1987)。伸展蛋白广泛存在于植物细胞壁中，在整个植物界从单细胞的团藻、低等的苔藓植物，到高等的裸子植物、被子植物中均有表达[2](merkouropoulosetal.,1999)。其脯氨酸残基可被羟基化,羟脯氨酸及丝氨酸残基可被糖基化，有些种类伸展蛋白还进行分子内和分子间的交联反应。伸展蛋白几乎涉及植物生长发育的各方面，包括花粉的识别与受精[3](wuetal.,2001)，细胞分裂与分化，细胞伸长的停止[4](itoetal.,1998)，衰老与脱落[5](merkouropoulosetal.,2003)，参与生物与非生物胁迫反应[6](showalter,1993)等。wei[7]等(2006)证实在拟南芥中，伸展蛋白基因atext1的过量表达限制了病原菌丁香假单胞菌的入侵。拟南芥atext3，atext18的突变体植株正常生长受到影响[8,9,10,11](halletal.,2002；cannonetal.,2008；sahaetal.,2013；choudharyetal.,2015)。roberts[12]等(2006)在拟南芥中超表达atext1，转基因植株茎粗增大，而茎的高度降低。但迄今为止，尚无伸展蛋白对提高植物抗倒伏能力的报道。

参考文献：

1.tierneyml，varnerje.reviewtheextensins.plantphysiol1987；84:1-2.

2.merkouropoulosg，barnettdc，shirsatah.thearabidopsisextensingeneisdevelopmentallyregulated，isinducedbywounding，methyljasmonate，abscisicandsalicylicacid,andcodesforaproteinwithunusualmotifs.planta1999；208(2):212-219.

3.wuh，degb，marianic，etal.hydroxyproline-richglycoproteinsinplantreproductivetissues:structure，functionsandregulation.cellularandmolecularlifesciences2001；58(10):1418-1429.

4.itom，kodamah，komaminea，etal.expressionofextensingenesisdependentonthestageofthecellcycleandcellproliferationinsuspension-culturedcatharanthusroseuscells.plantmolecularbiology1998；36(3):343-351.

5.merkouropoulosg，shirsatah.theunusualarabidopsisextensiongeneatext1isexpressedthroughoutplantdevelopmentandisinducedbyavarietyofbioticandabioticstresses.planta2003；217(3):356-366.

6.showalteram.structureandfunctionofplantcellwallproteins.plantcell1993；5(1):9-23.

7.wei,g.,andshirsat,a.h.extensinover-expressioninarabidopsislimitspathogeninvasiveness.mol.plant.pathol.2006；7,579-592.

8.hallq,cannonmc.thecellwallhydroxyproline-richglycoproteinrshisessentialfornormalembryodevelopmentinarabidopsis.plantcell2002；14(5):1161-72.

9.cannonmc,terneusk,hallq,tanl,wangy,wegenhartbl,etal.self-assemblyoftheplantcellwallrequiresanextensinscaffold.pnas2008；105(6),2226-31.

10.sahap,rayt,tangy,duttai,evangelousnr,kieliszewskimj,etal.self-rescueofanextensinmutantrevealsalternativegeneexpressionprogramsandcandidateproteinsfornewcellwallassemblyinarabidopsis.plantj,2013；75(1):104-16.

11.choudharyp,sahap,rayt,tangyh,yangd,cannonmc.extensin18isrequiredforfullmalefertilityaswellasnormalvegetativegrowthinarabidopsis.frontplantsci2015；6.

12.robertsk,shirsatah.increasedextensinlevelsinarabidopsisaffectinflorescencestemthickeningandheight.jexpbot2006；57:537-45.

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法，即利用转基因技术对水稻进行遗传改良，提高茎秆抗倒伏能力，为提高植物机械支撑力做理论以及技术上的探索。

本发明的目的是这样实现的：

一、利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法(简称方法)

本方法包括下列步骤：

①从水稻中克隆osextl基因cdna

基因编码区序列如seqidno：1，cdna长度为844bp；

②构建含ubi启动子的基因载体，并转化水稻中花11，获得转基因植株，其转基因水稻种子extl(oryzasativaextl)于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为cctccno：p201701；

③将获得的转基因水稻种子extl开花后30天进行茎秆抗倒伏能力的测定。

本发明具有下列优点和积极效果：

增加osextl基因在水稻中的表达量，使转基因水稻茎秆抗倒伏能力(开花后30天测定)提高了48％。

附图说明

图1是转osextl基因水稻茎秆的抗倒伏能力的比较图片；

图2是植物表达载体的构建示意图。

转基因水稻种子extl(oryzasativaextl)于2017年1月3日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学邮编：430072)，保藏编号为cctccno：p201701。

具体实施方式：

下面结合附图和实施例详细说明：

一、实施例1：osextl基因cdna的克隆

从水稻中克隆osextl基因的cdna，如序列1，长度为844bp；pcr产物经过回收，酶切，连接载体。

——合成引物扩增osextl的cdna(844bp，包含cds519bp)

正向引物：cgcggatccacgaccattattcctcctcctc；

反向引物：cggggtaccgcctgatagaaagcgacaacatg。

二、实施例2：表达载体的构建

将osextl的cdna序列连接t载体后，酶切，转入表达载体pubi-zh2，见图2。

三、实施例3：植物表达载体转化农杆菌

1、农杆菌活化

将保存的农杆菌(eha105)在固体lb培养基上画线(加抗生素：kan，如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性)，抗生素浓度为：50μg/ml，28℃培养1-2天，然后转移到新的加有抗生素的固体lb培养基上再培养2天；

2、农杆菌感受态细胞的制备

将100μl接种于1mllb液体培养基中，150rpm28℃振荡培养过夜；

吸取1ml菌液接种到100ml液体培养基中培养至od600＝0.5；

将菌液置冰上30min，使培养物冷却到0℃；

4℃，5000rpm离心30s，弃去上清液；

沉淀用60ml0.1mcacl2悬浮，冰浴30min；

5000rpm离心30s，弃去上清液；

每管用100μl含15％甘油的20mmcacl2悬浮，用于转化；

制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200μl分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转-80℃保存，使用时从-80℃取出，置冰上融化后使用。

3、dna直接转化农杆菌

200μl农杆菌感受态细胞中加入质粒dna0.1～1μg(5-10μl)，之后冰浴30min；

放入液氮中7-8min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；

取出离心管，冰上放置2min，加入0.8mllb，28℃，150rpm振荡培养3～4hr；

取出菌液于kan抗生素的lb平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养，2天左右菌落可见。

4、重组农杆菌鉴定

挑取单菌落，接种于含相应抗生素的lb液体培养基中，28℃振荡培养过夜；

小量提取质粒dna，加gte同时加5μl溶菌酶(50μg/ml，贮藏浓度为50mg/ml或10mg/ml)；

质粒酶切或pcr鉴定。

四、实施例4：水稻成熟胚愈伤组织的诱导、分化、生根及移栽方法

1、愈伤诱导

将成熟的水稻种子去壳，先用无菌水冲洗3遍，然后用70％的乙醇处理1分钟，不时摇动；

无菌水冲洗3遍，每次30秒，不时摇动；

0.1％升汞溶液消毒12分钟(或2.5％naclo消毒30min)，不时摇动；

无菌水冲洗5遍以上，每次30秒，不时摇动；

将种子放在灭菌滤纸上吸干水分，然后放在诱导培养基上；

28℃，暗培养4周；

2、愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤(即散落到培养基上的愈伤，不要选从种子上发出来的愈伤)，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度28℃；

3、预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养4-14天，温度28℃；

4、愈伤与农杆菌共培养

1)农杆菌培养

在带有对应抗性选择的lb培养基上预培养农杆菌两天，温度28℃；

将农杆菌转移至装有悬浮培养基的带塞试管或离心管里，重悬农杆菌，调节农杆菌的悬浮液至od600为0.8-1.0；

2)农杆菌侵染

将预培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；

将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吹干(30min-1h)；

然后放置在已铺有一层滤纸的共培养基上培养3天，温度19-20℃。

5、选择培养

将共培养的愈伤转移至灭菌好的三角瓶内；

灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

浸泡在含400ppm羧苄青霉素的灭菌水中30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干(1h以上)；

转移愈伤至选择培养基上选择培养2次，每次2周。(第一次羧苄青霉素筛选浓度为400ppm，第二次为250ppm)；

6、分化培养

将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7天(可省略)；

转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃；

7、生根培养

剪掉分化时产生的根(留1-2mm)；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2周，温度26℃；

8、移栽

待苗高10-12cm，根系发生较好，打开瓶盖，洗掉根上的残留培养基(注意不要伤根)，移栽花盆中。在最初的几天，蒙上保鲜膜，保持水分湿润。

五、实施例5：转基因阳性苗的鉴定

1、基因插入鉴定

检测引物：潮霉素通用引物和基因特异性引物；

2、表达鉴定

基因特异引物。

六、实施例6：水稻秸杆抗倒伏的测定

抗倒伏指数测定：用开花后30天水稻材料进行倒四节倒伏指数测定。倒四节倒伏指数计算公式如下：倒伏指数＝(鲜重×株高)/折断力。鲜重：地上部分倒四节基部以上所有重量(包括茎秆、叶片、叶鞘、穗子)；株高：倒四节基部到穗顶端长度；折断力：将待测样品倒四节水平放置在宽带度为5cm的装置中，采用折断力仪(dik7401；daiki,osaka,japan)对倒四节进行折断力测定，结果见图1。

<110>华中农业大学

<120>利用伸展蛋白提高水稻茎秆抗倒伏能力的方法

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>844

<212>osextl基因的cdna

<400>

acgaccattattcctcctcctctctggagtctagtctcctctcctcactcctcactcgccccactccgccgcttcactcgcgagctcgtcgttggcgccggcggcaatggcgtccccccgcgcgctctccctcctcctcgtcctcctgggcatggccctcgcgtcgttcccctccgccgcctccgcctcccgcgacctccgcccccgccgcgcgggcttcgtcgtccgcggccgcgtctggtgcgacacctgcctcgccggcttcgagacccccgcctccacctacatcgccggagcgaaggtaaaggttgagtgcagatcgaaatccactggcgccaagacatgcagcttcgagggccagactgaccacactggcacctacaacatccctgtcaacgatgagcatgagcacgagctctgcgagtctgtccttgtgagcagcccggacgcaaagtgtggcaagattgttgctggacgggagagggctcctgtcttcctcaccaacaacaatggtgtgacatctaatgttcggttggcgaacgctctgggcttccagaaggatgctcctcttgctgcgtgcgcacaaatcctcaagatgtacgaggaagtggacgaccgcgtttgaaggatgtgagttatgtatcaatattcgtacgttgttgaaatactctaagaagacttctatataccttttactgagagcaaaactatcagcatcagatgttgcgtgcttgataagttgtgatatagcttagcacttgagtatgttatatgtatgttcgtctgcagctgaactgcaaaactcatcagttactaaatcgacatgttgtgctttctatcaggc；

<210>2

<211>31

<212>正向引物

<400>

cgcggatccacgaccattattcctcctcctc；

<210>3

<211>32

<212>反向引物

<400>

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