一种应用于植物上的CRISPR/Cas9载体的构建方法与流程
本发明涉及植物分子生物学领域，尤其涉及应用于植物上的crispr/cas9载体的构建方法。
背景技术：
crispr/cas9技术是自2013年兴起的一种高效简便的基因组编辑技术，目前已在动物、模式植物中得到广泛应用。它主要是基于细菌的一种获得性免疫系统改造而成，由于其可用于对dna进行定点编辑，并且可以同时作用于多个靶位点，同时编辑多个基因，较常规转基因方法具有明显优势，且沉默效果更加彻底，因此越来越多的研究人员对其产生了浓厚兴趣。此外，在常用的基因组编辑技术中，crispr/cas9相对于zfn和talen技术，具有操作简便、制备成本低的巨大优势，使其在常规分子生物学实验室即可使用。
目前，应用于动物上的crispr/cas9载体已经有大量的报道，而应用于植物上的crispr/cas9载体则相对较少，特别是能够进行多位点编辑的载体。
技术实现要素：
为克服现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了能够应用于植物上的crispr/cas9载体的构建方法，由其获得的载体不仅能够作用于单个靶位点，而且能够同时作用于两个靶位点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种应用于植物上的crispr/cas9载体的构建方法，其包括：
s1：靶序列退火复性：根据选定的靶序列，合成互补的oligodna，将合成的oligodna序列进行退火复性获得dna双链序列，并稀释；
s2：psg载体的酶切：采用限制性内切酶bbsi酶切psg载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；
s3：连接和转化：配置连接体系，将s1获得的稀释后的dna双链序列与s2获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌jm109中；
s4：重组质粒的鉴定和提取：分别挑单菌落于lb/amp液体培养基中震荡培养，分别以m13fwd和oligo-r为引物进行菌液pcr鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的lb/amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒；
s5：重组资料和pcc质粒的双酶切：将得到的重组质粒和pcc质粒进行双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段；
s6：连接、转化和鉴定：配置连接体系，将s5获得的酶切回收目标片段进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌jm109中，挑单菌落于lb/kan液体培养基中震荡培养，并进行菌液pcr鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的lb/kan液体培养基中培养，提取质粒，即获得构建好的crispr/cas9载体。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述psg载体的构建包括：
以px330质粒为模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase扩增sgrna片段，回收该片段，标记为sgrna1，引物序列为seqidno.1所示的sg1-f和seqidno.2所示的sg1-r；
使用ecori-hf和xbai分别双酶切puc19和sgrna1，回收目的片段后按1：7的摩尔比进行连接，得到重组质粒psg1，测序，保留序列完全正确的阳性质粒；
以psg1质粒为模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase扩增sgrna片段，回收该片段，标记为sgrna，引物序列为seqidno.3所示的sg2-f和seqidno.4所示的sg2-r；
使用ecori-hf和xbai双酶切puc19，使用bsai酶切sgrna，回收目的片段后按1：7的摩尔比进行连接，得到重组质粒psg，测序，保留序列完全正确的阳性质粒。
进一步，所述pcc载体的构建包括：
以px330质粒为模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase扩增hspcas9片段，其中引物cas-f：cas-r1：cas-r2＝1.5：0.2：1.3，回收该片段，标记为hspcas9，cas-f的序列如seqidno.5所示，cas-r1的序列如seqidno.6所示，cas-r2的序列如seqidno.7所示；
使用ncoi-hf和bsteii-hf分别双酶切pcambia1302和hspcas9，回收目的片段后按1：5的摩尔比进行连接，得到重组质粒pcc1，测序，保留序列完全正确的阳性质粒；
以pcambia1302质粒为模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase扩增camv35enhancedpromoter片段，回收该片段，标记为camv-ep，引物序列为seqidno.8所示的camv-ep-f和seqidno.9所示的camv-ep-r；
使用hindiii和ncoi分别双酶切pcc1和camv-ep，回收目的片段后按1：5的摩尔比进行连接，得到重组质粒pcc，测序，保留序列完全正确的阳性质粒。
进一步，在步骤s1中，合成一对互补的oligodna，即序列为seqidno.10所示的oligo-f和序列为seqidno.11所示的oligo-r。
进一步，在步骤s1中，合成两对互补的oligodna，分别为序列为seqidno.12所示的oligo1-f，序列为seqidno.13所示的oligo1-r，序列为seqidno.14所示的oligo2-f及序列为seqidno.15所示的oligo2-r。
进一步，在步骤s1中，将所述合成的oligodna序列进行退火复性的反应程序为：95℃变性5min，每30s降温1℃，降温至25℃，并于4℃保存；在所述步骤s2中，psg载体的酶切的反应体系为100μl，37℃反应过夜，65℃反应20min。
进一步，在所述步骤s4中，所得到的重组质粒为psg-cz；在所述步骤s5中，将得到的psg-cz重组质粒、pcc质粒分别采用ecori-hf和xbai进行双酶切，37℃酶切3h后，65℃反应20min得到所述酶切产物。
进一步，在所述步骤s4中，所得到的重组质粒为psg-cz1和psg-cz2；所述步骤s5中，将得到的psg-cz1重组质粒采用ecori-hf和kpni进行双酶切，psg-cz2重组质粒采用xbai和kpni进行双酶切；或将得到的psg-cz1重组质粒采用ecori-hf和bamhi进行双酶切，psg-cz2重组质粒采用xbai和bamhi进行双酶切；并将pcc质粒采用ecori-hf和xbai进行双酶切，37℃酶切3h后，65℃反应20min，得到所述酶切产物。
进一步，在所述步骤s6中，所述菌液pcr鉴定以m13rev和oligo-r为引物。
进一步，在所述步骤s6中，所述菌液pcr鉴定以oligo1-f和oligo2-r为引物。
与现有技术相比，本发明提供的应用于植物上的crispr/cas9载体的构建方法可获得应用于植物上的crispr/cas9载体，可用于下一步的遗传转化试验，该载体不仅能够作用于单个靶位点，而且能够同时作用于两个靶位点。
附图说明
图1为psg载体的图谱；
图2为pcc载体的图谱；
图3为本发明提供的应用于植物上的crispr/cas9载体的构建方法的流程图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明的目的在于提供一种能够应用于植物上的crispr/cas9载体，该载体不仅能够作用于单个靶位点，而且能够同时作用于两个靶位点。为实现此目标，该crispr/cas9载体由两个基本载体psg和pcc组成，构建方法具体包含以下内容：
1.psg载体的构建：
1)以px330质粒为模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase扩增sgrna片段，回收该片段，标记为sgrna1，引物序列如下：
(seqidno.1)sg1-f:
ggaattcatagtttcccatgattccttcatatttgc(下划线标记的为ecori酶切位点)；
(seqidno.2)sg1-r:
tacctctagagccatttgtctgc(下划线标记的为xbai酶切位点)；
2)使用ecori-hf和xbai分别双酶切puc19和sgrna1，回收目的片段后按1：7的摩尔比进行连接，得到重组质粒psg1，测序，保留序列完全正确的阳性质粒；
3)以psg1质粒为模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase扩增sgrna片段，回收该片段，标记为sgrna，引物序列如下：
(seqidno.3)sg2-f:
atatatggtctcaaattggatccggtaccgaattcatagtttcccatgattcct(下划线标记的为bsai、bamhi、kpni、ecori酶切位点)；
(seqidno.4)sg2-r:
atatatggtctcactagggatccggtaccctctagagccatttgtctgcagaatt(下划线标记的为bsai、bamhi、kpni、xbai酶切位点)；
4)使用ecori-hf和xbai双酶切puc19，使用bsai酶切sgrna，回收目的片段后按1：7的摩尔比进行连接，得到重组质粒psg，测序，保留序列完全正确的阳性质粒，psg载体的图谱如图1所示，psg载体的部分序列如下所示(seqidno.16)：
其中
2.pcc载体的构建
5)以px330质粒为模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase扩增hspcas9片段，其中引物cas-f：cas-r1：cas-r2＝1.5：0.2：1.3，回收该片段，标记为hspcas9，引物序列如下：
(seqidno.5)cas-f:
catgccatggactataaggaccacgacggagact(下划线标记的为ncoi酶切位点)；
(seqidno.6)cas-r1:
gaccttccgcttcttctttggctttttcttttttgcctggccggcct；
(seqidno.7)cas-r2:
cagggtcaccttaaccgaccttccgcttcttctttggct(下划线标记的分别为bsteii酶切位点和sv40核定位信号序列)；
6)使用ncoi-hf和bsteii-hf分别双酶切pcambia1302和hspcas9，回收目的片段后按1：5的摩尔比进行连接，得到重组质粒pcc1，测序，保留序列完全正确的阳性质粒；
7)以pcambia1302质粒为模板，使用高保真酶primestarhsdnapolymerase扩增camv35enhancedpromoter片段，回收该片段，标记为camv-ep，引物序列如下：
(seqidno.8)camv-ep-f:
cccaagcttttgcgtattggctagagcagcttg(下划线标记的为hindiii酶切位点)；
(seqidno.9)camv-ep-r:
catgccatggctcattgccccccgggatct(下划线标记的为ncoi酶切位点)；
8)使用hindiii和ncoi分别双酶切pcc1和camv-ep，回收目的片段后按1：5的摩尔比进行连接，得到重组质粒pcc，测序，保留序列完全正确的阳性质粒，pcc载体的图谱如图2所示。
具体地，crispr/cas9载体的构建方法如图3所示，包括：
s1：靶序列退火复性：根据选定的靶序列，合成互补的oligodna，将合成的oligodna序列进行退火复性获得dna双链序列，并稀释；
s2：psg载体的酶切：采用限制性内切酶bbsi酶切psg载体，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收；
s3：连接和转化：配置连接体系，将s1获得的稀释后的dna双链序列与s2获得的酶切产物进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌jm109中；
s4：重组质粒的鉴定和提取：分别挑单菌落于lb/amp液体培养基中震荡培养，分别以m13fwd和oligo-r为引物进行菌液pcr鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的lb/amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒；
s5：重组资料和pcc质粒的双酶切：将得到的重组质粒和pcc质粒进行双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段；
s6：连接、转化和鉴定：配置连接体系，将s5获得的酶切回收目标片段进行连接反应，将获得的全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌jm109中，挑单菌落于lb/kan液体培养基中震荡培养，并进行菌液pcr鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的lb/kan液体培养基中培养，提取质粒，即获得构建好的crispr/cas9载体。
实施方式1
本实施方式提供了作用于单个位点的crispr/cas9载体制备过程：
(1)靶序列退火复性。根据选定的靶序列，合成一对互补的oligodna，序列为：oligo-f(seqidno.10):caccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn，oligo-r(seqidno.11)：aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn。将合成的oligo序列按照表1进行退火复性，反应程序为：95℃变性5min，1℃/30s降温至25℃，4℃保存。将得到的dna双链序列稀释至0.1μm。
表1靶序列退火复性的反应体系
(2)psg质粒的酶切。采用限制性内切酶bbsi酶切psg载体，反应体系100μl，如表2所示，37℃反应过夜，65℃反应20min，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收，并使用核酸蛋白仪测定浓度。
表2bbsi酶切psg载体的反应体系
(3)连接和转化。按照表3配置连接体系，16℃反应30min后4℃反应过夜；将全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌jm109中。
表3复性产物与psg酶切片段的连接反应体系
(4)重组质粒的鉴定和提取。挑单菌落于800μl的lb/amp液体培养基中，37℃振荡培养。以m13fwd和oligo-r为引物进行菌液pcr鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的lb/amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒psg-cz。
(5)psg-cz和pcc质粒的双酶切。将得到的psg-cz重组质粒、pcc质粒分别采用ecori-hf和xbai进行双酶切，37℃酶切3h后65℃反应20min；酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段，并用核酸蛋白仪测定浓度。
(6)连接、转化和鉴定。按照表4配置连接体系，16℃反应30min后4℃反应过夜；将全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌jm109中；挑单菌落于800μl的lb/kan液体培养基中，37℃振荡培养；以m13rev和oligo-r为引物进行菌液pcr鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的lb/kan液体培养基中培养，提取质粒，-20℃保存。该质粒即为构建好的作用于单个位点的crispr/cas9载体，可用于下一步的遗传转化试验。
表4酶切回收片段的连接反应体系
实施方式2
本实施方式提供了作用于两个位点的crispr/cas9载体制备过程：
(1)靶序列退火复性。根据选定的靶序列，合成两对互补的oligodna，序列为：
oligo1-f(seqidno.12):caccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn；
oligo1-r(seqidno.13)：aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn；
oligo2-f(seqidno.14):caccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn；
oligo2-r(seqidno.15)：aaacnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn；
将合成的oligo序列分别按照表5进行退火复性，反应程序为：95℃变性5min，1℃/30s降温至25℃，4℃保存；将得到的dna双链序列稀释至0.1μm。
表5靶序列退火复性的反应体系
(2)psg质粒的酶切。采用限制性内切酶bbsi酶切psg载体，反应体系100μl(表6)，37℃反应过夜，65℃反应20min，酶切产物经超薄产物纯化试剂盒进行回收，并使用核酸蛋白仪测定浓度。
表6bbsi酶切psg载体的反应体系
(3)连接和转化。按照表7分别配置连接体系，16℃反应30min后4℃反应过夜。将全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌jm109中。
表7复性产物与psg酶切片段的连接反应体系
(4)重组质粒的鉴定和提取。分别挑单菌落于800μl的lb/amp液体培养基中，37℃振荡培养；分别以m13fwd和oligo-r为引物进行菌液pcr鉴定，将验证正确的菌液转接到新鲜的lb/amp液体培养基中，培养后进行质粒的提取，得到重组质粒psg-cz1和psg-cz2。
(5)psg-cz1、psg-cz2和pcc质粒的双酶切。将得到的psg-cz1重组质粒采用ecori-hf和kpni进行双酶切，psg-cz2重组质粒采用xbai和kpni进行双酶切；或将得到的psg-cz1重组质粒采用ecori-hf和bamhi进行双酶切，psg-cz2重组质粒采用xbai和bamhi进行双酶切；将pcc质粒采用ecori-hf和xbai进行双酶切，37℃酶切3h后65℃反应20min。酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶回收试剂盒分别回收目标片段，并用核酸蛋白仪测定浓度。
(6)连接、转化和鉴定。按照表8配置连接体系，16℃反应30min后4℃反应过夜；将全部连接产物采用热激发转化至大肠杆菌jm109中；挑单菌落于800μl的lb/kan液体培养基中，37℃振荡培养；以oligo1-f和oligo2-r为引物进行菌液pcr鉴定，将阳性菌液转接到新鲜的lb/kan液体培养基中培养，提取质粒，-20℃保存。该质粒即为构建好的作用于两个位点的crispr/cas9载体，可用于下一步的遗传转化试验。
表8酶切回收片段的连接反应体系
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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<110>四川农业大学
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