本发明属于农业生物
技术领域：
，具体涉及一种提高酪酸菌发酵生长效率的补料方法。
背景技术：
：酪酸菌(丁酸梭菌，Clostridiumbutyrium)作为人用或动物新型益生菌具有调整肠道菌群平衡、增强免疫、预防肿瘤发生等重要功能。酪酸菌的营养需求对其生长影响显著，常用的补料方法是补入氮源如蛋白胨、酵母膏、豆粕、豆粉水解液、鱼粉等和碳源如葡萄糖等，如：对比文献1(采用分批补料发酵法制备酪酸菌活菌制剂的方法，发明专利CN201110287802.1，2011)公开了酪酸菌发酵12-14h流加10-20％的葡糖糖溶液至发酵结束前8h以及发酵13-15h流加5-10％的豆粉水解液至发酵结束前10h的补料方法；对比文献2(一种连续发酵法生产酪酸菌制剂的方法，发明专利CN201210135950.6，2012)公开了一种连续发酵生产酪酸菌的方法，其中补入的氮源是6-8％的豆粉水解液，碳源是4-5％的葡萄糖。出于酪酸菌对氮源营养需求的考虑以及有机氮源成分对酪酸菌生长代谢影响的复杂性、不确定性和未知性，对比文献1和2采用了有机氮源(豆粉水解液)和葡萄糖(碳源)来笼统地满足酪酸菌的氮源需求。但是，这些有机氮源成分复杂、用量较大，使得生产成本较高。另外，对比文献1和2的补料方式也不涉及补料速率参数的控制。第三，酪酸菌发酵生长过程中合成大量的丁酸和乙酸是其代谢自适应进化的结果。但是，乙酸、丁酸的积累也会引起酸胁迫效应，并引起细胞自溶。显然，对比文献1和2均没有涉及酪酸菌在发酵过程中的酸代谢的内容。因此，若基于酪酸菌酸代谢的特点进行成分确定的补料则可能使酪酸菌发酵效率进一步提高。选择合适的补料方式与补料成分可能会实现上述目的。基于微生物细胞对数生长的特点，对比文献3(WangY,WangZH,DuGC等,2009,BioresourceTechnology,EnhancementofalkalinepolygalacturonatelyaseproductioninrecombinantPichiapastorisaccordingtotheratioofmethanoltocellconcentration,100:1343-1349)根据指数补料方程指导补料速率的设定。科学技术工作者利用该方程进行指数补料的应用时，通常认为：设定的比生长速率越接近细胞的最大比生长速率，细胞会越接近以最大比生长速率进行生长繁殖，一般会把比生长速率设定为最大比生长速率的80-90％，代入方程计算出每小时的补料速度，从而维持细胞的对数生长。对比文献3把该技术应用至毕赤酵母的指数补料发酵过程，比生长速率设定为最大比生长速率的80％，也获得了良好效果。现有技术没有把指数补料模式应用于厌氧微生物-酪酸菌发酵补料过程的报道。技术实现要素：本发明目的在于提供一种提高酪酸菌发酵生长效率的补料新方法，其是一种通过优化酪酸菌比生长速率以及控制酸代谢来提高酪酸菌发酵生长效率的补料方法。本发明目的通过下述技术方案实现：一种提高酪酸菌发酵生长效率的补料方法为：在酪酸菌发酵培养6h时开始进行指数流加葡萄糖溶液至13h，比生长速率设定在0.1-0.4h-1。优选为：在酪酸菌发酵培养6h时开始指数流加葡萄糖溶液至13h，比生长速率设定为0.225h-1(最大比生长速率的40％)。所述的葡萄糖溶液的浓度优选为500g/L；葡萄糖溶液的流加速率优选如下：发酵6-7h流加速率为210mL/h，发酵7-8h流加速率为260mL/h，发酵8-9h流加速率为330mL/h，发酵9-10h流加速率为410mL/h，发酵10-11h流加速率为510mL/h，发酵11-12h流加速率为640mL/h，发酵12-13h流加速率为800mL/h。优选的，所述的提高酪酸菌发酵生长效率的补料方法，包括如下步骤：(1)种子扩大培养与合瓶种子细胞的收集按无菌、无氧操作要求，从酪酸菌菌种冻干管接出细胞至新制备的厌氧管斜面培养基。36-38℃培养12-16h后，按无菌、无氧操作要求，加入10mL无菌、无氧水制备厌氧管种子液。120mL厌氧瓶装培养基60mL，按1-2％的比例(v/v)将酪酸菌厌氧管种子液接入厌氧瓶培养基中，36-38℃、100r/min在摇床上培养12-14h得到厌氧瓶种子液。按无菌、无氧操作要求，将厌氧瓶种子液进行合瓶操作，得到合瓶种子液。(2)发酵培养装有培养基的发酵罐(100L)灭菌、氮气置换除氧后，将合瓶种子液以1-2％的接种量(v/v)火焰保护接入发酵罐，按如下条件进行发酵培养：发酵温度36-38℃，转速100r/min，氮气流量控制为0.1vvm，罐压控制为0.03-0.04MPa，厌氧保护1h后，停止通氮气。发酵培养12-14h后，放罐。发酵6h开始，将比生长速率设定为0.1-0.4h-1进行指数流加葡萄糖溶液至13h。优选的，比生长速率的设定值为0.225h-1，葡萄糖溶液的浓度为500g/L，葡萄糖溶液的流加速率如下：发酵6-7h流加速率为210mL/h，发酵7-8h流加速率为260mL/h，发酵8-9h流加速率为330mL/h，发酵9-10h流加速率为410mL/h，发酵10-11h流加速率为510mL/h，发酵11-12h流加速率为640mL/h，发酵12-13h流加速率为800mL/h。上述培养基的配方优选为：葡萄糖20g/L，蛋白胨30g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，轻质碳酸钙1g/L，一水硫酸锰0.02g/L，pH7.3；厌氧管斜面培养基需另外加入琼脂，琼脂浓度20g/L，pH7.3。除氧后经0.1MPa蒸气灭菌20min备用。上述酪酸菌优选为丁酸梭状芽孢杆菌HBUT-01(ClostridiumbutyricumHBUT-01)，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCCNO：M2016628，保藏日期为2016年11月9日。一种酪酸菌，其保藏编号为CCTCCNO：M2016628。与现有技术相比本发明具有如下优点和显著的进步：就对比文献1和对比文献2所使用的成分复杂的高浓度豆粉水解液和葡萄糖而言，本发明技术具有补料成分更简单、明确(只补加了葡萄糖)、原料易购、成本低、流加速率明确、发酵时间短、操作可控性高、适用于发酵生产的特点。相比于对比文献3，本发明在酪酸菌发酵过程中克服了指数补料关于比生长速率设定值的技术偏见。对酪酸菌细胞对数生长的促进效果而言，指数补料方程的比生长速率设定值并不是越接近最大比生长速率越好，以较低的设定值(0.225h-1，最大比生长速率的40％)进行指数补料，其结果比0.35h-1(最大比生长速率的62％)的设定值更好地促进了酪酸菌细胞的对数生长。前者(比生长速率设定值0.225h-1)发酵14h放罐时，细胞数达到了12.8×108CFU/mL，与后者(比生长速率设定值0.35h-1)放罐细胞数持平。而且，还产生了出人意料的效果：发酵生成的乙酸、丁酸浓度显著降低，放罐时前者比后者分别降低了38.7％和33.3％，有效缓解了酸胁迫、促进了酪酸菌的生长，同时还节约了补料成本，产生了极好的技术效果。具体实施方式下面对发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。需要说明的是，下述酪酸菌(Clostridiumbutyrium)为丁酸梭状芽孢杆菌HBUT-01(ClostridiumbutyricumHBUT-01)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCCNO：M2016628)，保藏日期为2016年11月9日。实施例1(1)培养基的制备葡萄糖20g/L，蛋白胨30g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，轻质碳酸钙1g/L，一水硫酸锰0.02g/L，pH7.3；厌氧管斜面培养基需另外加入琼脂，琼脂浓度20g/L。除氧后经0.1MPa蒸气灭菌20min备用。(2)种子扩大培养与合瓶种子细胞的收集按无菌、无氧操作要求，从酪酸菌菌种冻干管接出细胞至新制备的厌氧管斜面培养基。37℃培养12h后，按无菌、无氧操作要求，加入10mL无菌、无氧水制备厌氧管种子液。120mL厌氧瓶装培养基60mL，按1％的比例(v/v)将酪酸菌厌氧管种子液接入厌氧瓶培养基中，37℃、100r/min在摇床上培养12h得到厌氧瓶种子液。按无菌、无氧操作要求，将厌氧瓶种子液进行合瓶操作，得到合瓶种子液。(3)发酵培养装有60L发酵培养基的发酵罐(100L)灭菌、氮气置换除氧后，将合瓶种子液以1％的接种量(v/v)火焰保护接入发酵罐，按如下条件进行发酵培养：发酵温度37℃，转速100r/min，氮气流量控制为0.1vvm，罐压控制为0.03-0.04MPa，厌氧保护1h后，停止通氮气。发酵培养14h后，放罐。按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以Hungate滚管计数法进行菌落CFU计数)为9.32×108CFU/mL，发酵液乙酸和丁酸浓度分别为0.78g/L和3.54g/L，每亿细胞产生的乙酸和丁酸分别为0.084mg和0.38mg。从发酵培养2h开始，每2h取样，10000rpm离心后，用生理盐水洗涤细胞沉淀物，后10000rpm离心操作。置于90℃烘箱中烘干24h，取出置于干燥器中冷却，称重，得到细胞干重。以培养时间(h)为横坐标，以细胞干重的自然对数为纵坐标，进行线性拟合。拟合方程的斜率为最大比生长速率，最大比生长速率为0.56h-1。实施例2(1)培养基的制备：同实施例1。(2)种子液扩大培养与合瓶种子细胞的收集：同实施例1。(3)发酵培养：除指数补料外，发酵培养其余条件同实施例1。指数补料：发酵6h开始，比生长速率设定值为0.112h-1(最大比生长速率的20％)，流加葡萄糖溶液(浓度为500g/L)至发酵培养13h。指数流加方程为F＝μ(VX)0exp(μt)/Yx/s(SF-S)，式中F、X和S分别为流加速率、细胞和底物浓度(g/L)，μ为比生长速率(h-1)，V为发酵液体积(L)，SF为补加葡萄糖的浓度(g/L)，Yx/s为细胞对底物(葡萄糖)的得率系数(g/g)，(VX)0为培养体系的初始细胞量(g)，t为流加时间(h)。葡萄糖溶液流加速率设定如表1所示：表1按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以Hungate滚管计数法进行菌落CFU计数)为9.46×108CFU/mL，比实施例1提高了1.5％；发酵液乙酸浓度为0.63g/L，比实施例1降低了19.2％；每亿细胞产生的乙酸为0.066mg，比实施例1降低了21.4％；丁酸浓度为2.5g/L，比实施例1降低了29.4％，每亿细胞产生的丁酸为0.264mg，比实施例1降低了30.5％。实施例3(1)培养基的制备：同实施例1。(2)种子液扩大培养与合瓶种子细胞的收集：同实施例1。(3)发酵培养：除指数补料外，发酵培养其余条件同实施例1。指数补料：发酵6h开始，比生长速率设定值为0.35h-1(最大比生长速率的62％)，流加葡萄糖溶液(浓度为500g/L)至发酵培养13h。按照实施例2中的指数流加方程计算得到葡萄糖溶液流加速率设定值，如表2所示：表2发酵时间(h)流加速率(mL/h)流加葡萄糖的质量速率(g/h)6-73701857-85202608-97403709-10105052510-11149074511-122120106012-1330001500按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以Hungate滚管计数法进行菌落CFU计数)为12.3×108CFU/mL，比实施例1提高了32％，比实施例2提高了30％。但是，发酵液乙酸浓度为1.63g/L，是实施例2的1.58倍；每亿细胞产生的乙酸浓度为0.133mg，是实施例2的2倍。发酵液丁酸浓度为6g/L，是实施例2的2.4倍；每亿细胞产生的丁酸为0.49mg，是实施例2的1.85倍。实施例4(1)培养基的制备：同实施例1。(2)种子液扩大培养与合瓶种子细胞的收集：同实施例1。(3)发酵培养：除指数补料外，发酵培养其余条件同实施例1。指数补料：发酵6h开始，比生长速率设定值为0.225h-1(最大比生长速率的40％)，流加葡萄糖溶液(浓度为500g/L)至发酵培养13h。按照实施例2中的指数流加方程计算得到葡萄糖溶液流加速率设定值，如表3所示：表3发酵时间(h)流加速率(mL/h)流加葡萄糖的质量速率(g/h)6-72101057-82601308-93301659-1041020510-1151025511-1264032012-13800400按上述方式厌氧发酵14h，细胞数(以Hungate滚管计数法进行菌落CFU计数)为12.8×108CFU/mL，比实施例1提高了37.3％，比实施例2提高了35.3％，与实施例3持平。但是，发酵液乙酸浓度为1g/L，比实施例3降低了38.7％；每亿细胞产生的乙酸浓度为0.078mg，比实施例1降低了7.14％，比实施例3降低了41.4％。发酵液丁酸浓度为4g/L，比实施例3降低了33.3％；每亿细胞产生的丁酸为0.31mg，比实施例1降低了18.4％，比实施例3降低了36.7％。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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