本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及的是一种mrna分子在植物砧穗间传递的荧光鉴定方法。
背景技术：
在园艺作物生产实践过程中，应用嫁接技术可以提高植株抗性、增加产量、改善果实品质，对品种的改良，经济价值的提高都有着非常重要的意义，其中在果树生产上嫁接更是得到了广泛运用。在果树生产上发现，不同砧木对接穗的生理生化特性、开花结实、环境的适应能力以及树体生长发育等方面能产生不同的影响，而这些影响最终会对果品的形成以及后期的经济价值起到关键性的作用。
到目前为止，已经发现了许多可以由植物韧皮部进行远距离传递的内源mrna分子，比如拟南芥aux/iaa18和aux/iaa28(notaguchietal.,2012)、南瓜cmnacp(ruiz-medranoetal.,1999)、cmpp16(xoconostle-cazaresetal.,1999)、cmgaip(haywoodetal.,2005)、番茄thepfp-let6fusiongene(kimetal.,2001)、马铃薯stbel5(banerjeeetal.,2006；hannapel,2010)、poth1(aknotted1-liketranscriptionfactor)(mahajanetal.,2012)等草本植物。目前，在木本植物果树上鉴定到的可以进行远距离传递的内源mrna分子，有苹果内源的gai(xuetal.,2010)、梨内源的kn1(张文娜，2012)、gai(zhangetal.,2012)、nacp(zhangetal.,2013)、woxt1(duanetal.,2015)。这些mrna分子能够从砧木传递到接穗，影响接穗的生理和发育进程。因此，通过对砧穗间远距离传递mrna分子进行鉴定和机理研究，不仅可以为mrna在植物远距离传递机理以及砧穗间互作机理研究提供理论基础，而且也可利用发现的可传递mrna开发一种可以定向改良接穗性状的新型砧木育种方法，进而通过嫁接手段来调控接穗性状，既避免收获转基因产品，又可得到特定优良性状产品，达到提高经济效益的目的，还可为今后园艺作物育种及生产提供指导。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶(hmgr)是甲羟戊酸途径中合成萜类物质的第一个重要限速酶，是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控位点(bach,1986；choietal.,1992)，在植物的生长发育过程中起到非常重要的作用。在植物中hmgr多肽链部分都是由n-末端区、连接区、跨膜区和c-末端区这四部分组成，其中c-末端催化区域由基因中的近3’端编码形成，且在多数植物中高度保守(roberts,2007)。目前，梨属的杜梨pbhmgr1已经被克隆得到(黄晶等，2015)，其mrna在砧穗间的可传递性也已经被证明。
而对于鉴定植物基因的mrna能否进行远距离传递的方法，目前只有通过构建目的基因携带特异性标签的载体进行转基因嫁接后rt-pcr检测(haywoodetal.,2005)，巢式rt-pcr(kanehiraetal.,2010)，rt-pcr-caps(xuetal.,2010)等技术，虽然这些技术检测基因的传递性比较准确，但是其中存在的不足之处是进行pcr扩增反应有容易受到污染而产生假阳性的问题，不能直观检测到传递的信号，不能明确信号的传递位置和方向等，而目前较为直观检测的方法是将mrna标记上特异的分子探针，其探针上带有荧光，进行微注射后检测荧光扩散情况(xoconostle-cazaresetal.,1999)，但是这种方法仍然有其不足之处，观察mrna传递的信号只是存在于一两个细胞间，属于胞间短距离传递的鉴定方法，而且所需要的仪器非常昂贵，操作技术要求高，花费也比较高昂，一般实验室很难达到，因此对于如何研究mrna在砧穗间进行远距离传递的过程，其苛刻的要求大大限制了所能鉴定的mrna的数量，这样就为进行植物内源mrna嫁接传递的研究更增加了难度，使得植物在mrna远距离传递方面的研究难以推进，新的远距离传递的内源mrna难以发现。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术通过构建基因携带特异性标签的载体进行转基因嫁接后无法直观地观测到mrna发生了传递的问题，提供一种mrna分子在植物砧穗间传递的荧光鉴定方法。
本发明提供的一种mrna分子在植物砧穗间传递的荧光鉴定方法是通过构建基因携带荧光蛋白标签的载体，制备转基因植物；以转基因植物为砧木，将其和野生型接穗在无菌条件下进行微嫁接，观察砧木和接穗的荧光出现情况，若砧木和接穗不定根均观察到荧光，则说明所述基因的mrna分子在植物砧穗间传递。
另一方面，本发明提供一种mrna分子在植物砧穗间传递的荧光鉴定方法，通过构建基因携带荧光蛋白标签的载体，制备转基因植物；以转基因植物为砧木，将其和野生型接穗在无菌条件下进行微嫁接，采用巢氏pcr检测，若砧穗巢氏pcr产物均出现特异性条带，则说明所述基因的mrna分子在植物砧穗间传递。
所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或蓝绿荧光蛋白。
在本发明的实施例中，所述基因为杜梨hmgr1。
所述载体为过表达gfp-pbhmgr1载体，其通过以下方法制备得到：提取杜梨基因组rna，反转录为cdna，进行pcr扩增，回收目的片段并纯化，连接t载体，转化感受态细胞，选择测序正确的阳性克隆即得，所述pcr扩增所用的引物对的序列如seqidno.2-3所示。
本发明方法进行巢氏pcr检测砧穗是否出现特异性条带时，第一轮pcr反应采用的引物对序列如seqidno.4-5所示，第二轮pcr反应采用的引物对序列如seqidno.6-7所示。
进一步地，本发明提供一种hmgr1mrna分子在植物砧穗间传递的荧光鉴定方法，包括如下步骤：
(1)分别提取杜梨总rna，反转录成cdna，pcr扩增hmgr1基因的全长；
(2)构建杜梨hmgr1基因携带荧光蛋白标签的载体，制备转基因植物；
(3)转基因植物为砧木，将其和野生型接穗在无菌条件下进行微嫁接，观察砧木和接穗的荧光出现情况，若砧木和接穗不定根均观察到相应荧光，则说明杜梨hmgr1基因的mrna分子在植物砧穗间传递。
步骤(1)所述pcr扩增采用的引物对序列如seqidno.2-3所示。
本发明的实施例选用的荧光蛋白为gfp，微嫁接后，取接穗生长出来的不定根与砧木根，放置于激光共聚焦显微镜下观察gfp荧光，比较接穗与砧木的gfp荧光情况，如果在嫁接体系中存在mrna的传递，则砧木根会出现gfp-pbhmgr1表达出的gfp荧光，同样在接穗烟草不定根也会出现因发生砧穗间mrna的远距离传递而由gfp-pbhmgr1表达出的gfp荧光；如果不发生传递，则只会在砧木根会出现gfp-pbhmgr1表达出的gfp荧光，在接穗烟草不定根则不会出现gfp荧光。
其中，用于扩增杜梨hmgr1基因带酶切位点片段，提取总rna的样品选择杜梨组培苗的韧皮部；用于鉴定过表达gfp-pbhmgr1基因，提取总rna的样品选择由叶盘法愈伤再生出来抗性芽的叶子；用于鉴定微嫁接后gfp-pbhmgr1基因，提取总rna的样品选择微嫁接14d接穗烟草的茎段以及砧木烟草茎段。
另一方面，本发明提供一种hmgr1mrna分子在植物砧穗间传递的荧光鉴定方法，包括如下步骤：
(1)分别提取杜梨总rna，反转录成cdna，pcr扩增hmgr1基因的全长；
(2)构建杜梨hmgr1基因携带荧光蛋白标签的载体，制备转基因植物；
(3)转基因植物为砧木，将其和野生型接穗在无菌条件下进行微嫁接，采用巢氏pcr检测，若砧穗巢氏pcr产物均出现长度为1084bp的特异性条带，则说明hmgr1基因mrna分子在植物砧穗间传递。
步骤(3)中巢氏pcr第一轮pcr反应采用的引物对序列如seqidno.4-5所示，第二轮pcr反应采用的引物对序列如seqidno.6-7所示。
本发明提供了上述荧光鉴定方法在植物种质资源改良中的应用。
本发明提供了上述荧光鉴定方法在鉴定可在植物砧穗间远距离传递mrna分子的基因中的应用。
本发明提供的方法解决了通过构建基因携带特异性标签的载体进行转基因嫁接后无法直观地观测到mrna发生了传递的问题，同时也解决了在mrna上标记特异的分子探针微注射要求高且花费高，一般实验室难以完成，rt-pcr鉴定基因传递性易受到污染的问题。本发明利用构建基因携带绿色荧光蛋白(gfp)标签的载体进行转基因，将转基因砧木和野生型接穗在无菌玻璃瓶中进行微嫁接，由于接穗存在在潮湿的环境中易长出不定根的特性，于是通过激光共聚焦显微镜检测接穗不定根发出的gfp荧光的有无，来判断基因是否发生了砧穗间远距离传递，最终解决了基因在砧木和接穗间可直观观测到能否进行远距离传递的问题，具有直观、快速、灵敏、准确性高，能够应用于各种植物基因而不受物种限制的特点。
本发明提供的方法可实现快速、灵敏、准确性高、直观地去鉴定任何一个基因在砧木和接穗能否进行远距离传递，烟草作为模式植物，也有很广的普遍性，具有广阔的市场前景。该方法过程简单，要求不高，转基因效率高，花费较便宜，一方面为科研者提供了鉴定基因传递的方法，另一方面，可直接观测到基因发生了传递，为实验提供了直接证据，省去了做大量实验以补充说明问题所花费的精力，间接缩短了实验时间，也节约了时间成本，提高了工作的效率。可以大范围的在各种植物上应用，解决了基因在砧木和接穗间远距离传递无法直观地观测的问题，而mrna标记上特异的分子探针微注射存在要求高且花费高，一般实验室难以完成，rt-pcr鉴定基因传递性易受到污染的问题，若可以大力推广该方法，这样不仅可以节约金钱与时间，还能够应用于很多植物基因，大大拓宽了可以鉴定砧穗间远距离传递mrna的数量，也使得植物信号传递方面的研究得以快速推进。
附图说明
图1所示为扩增杜梨hmgr1基因带酶切位点pcr扩增电泳图。图中m：dna分子量标准；1：杜梨。
图2所示为过表达gfp-pbhmgr1载体构建示意图。
图3所示为a：烟草叶盘法转基因；b：转基因gfp-pbhmgr1烟草阳性株系rt-pcr鉴定，其中m：dna分子量标准，泳道1、2、3、4、5、6、7分别为不同烟草株系；c：转基因gfp-pbhmgr1烟草生根；d：转基因gfp-pbhmgr1烟草开花结实；e：转基因gfp-pbhmgr1烟草收获种子。
图4所示为a：转基因gfp-pbhmgr1烟草种子播种后一个月；b：以转基因gfp-pbhmgr1烟草为砧木，野生型烟草为接穗微嫁接；c：转基因gfp-pbhmgr1烟草微嫁接14d接穗长出不定根。
图5所示为烟草接穗不定根与砧木根观察gfp荧光，bar＝50μm。
图6所示为接穗茎段与砧木茎段巢式pcr结果，阳性对照为转基因烟草砧木茎段，阴性对照为野生型烟草茎段。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1基因rna提取
杜梨韧皮部总rna的提取采用ctab法(张玉刚等，2005)，用30μldepc水溶解，电泳检测后置-80℃冰箱保存备用。
(1)去除rna中dna：
(2)在37℃下处理30min；加入550μl无rnase水(0.1％depc处理)，再加入等体积600μlci混匀；
(3)在4℃下，10000rpm离心10min，吸取上清，再加入等体积ci轻轻混匀；在4℃下，10000rpm离心10min；
(4)吸取上清，向管中加入2倍体积的无水乙醇，在-20℃下，沉淀1h；
(5)在4℃下，12000rpm离心20min；弃上清，再加入1ml75％乙醇进行漂洗沉淀，12000rpm离心5min，漂洗2次后用枪头吸出多余的乙醇；
(6)放于超净工作台里进行吹干，溶于30-50μldepc水中，之后放入-80℃冰箱保存以备用；
(7)1％琼脂糖凝胶电泳检测提取核酸的完整性，用紫外分光光度计通过测260nm处的吸光度计算提取的rna浓度。
植物烟草材料总rna的提取采用trizol法，从接穗茎段、砧木茎段中提取总rna，用30μldepc水溶解，1％琼脂糖凝胶电泳检测提取核酸的完整性，用紫外分光光度计通过测260nm处的吸光度计算提取的rna浓度，电泳检测后置-80℃冰箱保存备用。
实施例2过表达gfp-pbhmgr1载体构建将rna反转录为cdna
按照常规方法将实施例1得到的rna进行反转录为cdna，所得到的cdna作为下述pcr扩增的模板。
根据杜梨(pyrusbetulaefoliabunge)植物hmgr1基因序列信息，参考pcambia1305载体上的酶切位点，pbhmgr1cds选择bglⅱ、speⅰ作为基因插入位点，下划线表示酶切位点，引物设计如下：
上游引物：5‘-agatctatggacgtccgaaggc-3’，(seqidno.2)
下游引物：5’-actagtttaagcggacgcaacag-3’(seqidno.3)。
上述引物均由中美泰和生物技术有限公司合成。
pcr反应体系：2×estaqmastermix(dye)购自(北京康为世纪生物科技有限公司，cw0682s)
pcr反应程序如下：94℃预变性5min；94℃30s，57℃30s，72℃2min，34个循环；72℃最后延伸10min。
pcr产物检测：根据目标片段大小制作1％琼脂糖凝胶，0.1％tae电泳缓冲液，70-110v电压电泳约15min，溴化乙啶染色，紫外灯下检测pcr产物片段大小(见图1)。
经回收目的片段并纯化，连接t-simple载体，转化大肠杆菌感受态dh5α，菌落pcr检测，选择阳性克隆菌液，由中美泰和生物技术有限公司进行测序，将获得测序正确载体和pcambia1305质粒分别用bglⅱ、speⅰ进行双酶切。
酶切体系如下：10×buffer2μl，bglⅱ1μl，speⅰ1μl，质粒dna16μl，总体积20μl。
对酶切产物琼脂糖凝胶电泳，回收、连接。
放置于金属浴16℃连接9-10h，转化大肠杆菌感受态dh5α，菌落pcr检测，选择阳性克隆菌液，由中美泰和生物技术有限公司进行测序，将获得测序正确菌液提取质粒，获得重组质粒(见图2)。杜梨gfp-bglⅱ-pbhmgr1-speⅰ序列如seqidno.1所示。
实施例3根癌农杆菌感受态的制备与转化
1、根癌农杆菌感受态细胞的制备
(1)挑取单个菌落，加入20ml含有20mg/lrif的yep液体培养基中，振荡培养(28℃，200rpm，黑暗条件下)24-48h，农杆菌振荡培养至适宜的od600值为0.5。
(2)冰浴30min；
(3)4℃，5000rpm离心10min；
(4)在超净台中操作，弃上清，加入0.15m的nacl，重悬；
(5)冰浴20min后4℃，6000rpm离心5min；
(6)弃上清，加入20mm的cacl2，重悬，分装，每管200μl，加入等体积50％的甘油，-80℃保存。
2、根癌农杆菌感受态细胞的转化
(1)取100μl感受态细胞，置于冰上，完全溶解后轻轻悬浮细胞。
(2)加入5μl构建好的植物表达载体质粒，混匀，冰上30min。
(3)液氮中冷激60s。
(4)37℃热激5min，冰上放置2min。
(5)加入500μlyep培养基，于28℃180rpm振荡培养4h。
(6)室温6000rpm集菌，弃掉400μl上清，用剩余的培养基将细胞悬浮。
(7)将细菌均匀涂布在加有抗生素50mg/lkan及20mg/lrif的固体yep培养基上。
(8)将平板于28℃倒置培养过夜(24-48h)。
实施例4烟草预培养与菌液的制备
1、烟草预培养
烟草w38(nicotianatabacumvar.winsconsin38)转化使用叶盘法(murashigeetal.,1962)。将烟草叶片主脉两侧切成0.5cm×0.5cm大小的切片，平铺于ms+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa培养基，25℃，光下培养72h。
2、菌液的制备
20ml含有20mg/lrif、50mg/lkan的yep液体培养基振荡培养菌体(28℃，200rpm，黑暗条件下)6-9h，农杆菌生长至对数平台期，振荡培养至适宜的od600值为0.8-1.0。
实施例5烟草转化芽成苗
侵染方法参照hotsch等(1985)方法，并进行改良。将叶片置于菌液中轻轻摇动3min取出，用无菌滤纸吸去多余的菌液，放回原预培养固体培养基，25℃暗培养48h。转入脱菌固体培养基(预培养培养基+头孢霉素250mg/l)中，光下继续培养。7-10d后待叶片有愈伤组织生成后转入筛选固体培养基(脱菌固体培养基+潮霉素20mg/l)，诱导抗性芽的形成(见图3的a图)。
将抗性苗切下，接在含有ms培养基+iba1mg/l+头孢霉素250mg/l诱导生根，约20d左右获得阳性再生的转基因植株，提取其dna和rna进行rt-pcr鉴定(见图3的b图)，对获得的阳性株进行扩大繁殖并生根培养(见图3的c图)，在生根培养基中诱导生根2-3周后，置室温下炼苗一周，移栽至培养土(草木炭：蛭石＝1：1)等待开花收获种子(见图3的d图和e图)。
实施例6烟草种子的无菌播种和无菌玻璃瓶烟草种苗微嫁接
(1)取收获的种子大约100粒放入2mlep管；
(2)加入12.5％次氯酸钠消毒10min，之后吸干溶液；
(3)用无菌蒸馏水洗种子5次；
(4)将种子均匀播撒在ms培养基上。
选取播种30d后砧木转基因烟草和接穗烟草w38(nicotianatabacumvar.winsconsin38)种子幼苗(见图4的a图)，培养环境为恒定光源，光强1500lx，光照14h/10h昼夜循环，室温23～25℃，相对湿度85％。
在无菌条件下，将转基因烟草幼苗平切去头，留约1cm长茎段作为砧木；取苗高3～5cm的烟草苗，顶端留2-3片叶，基部平切，砧木接穗切口对齐，用硅胶套管固定，置入培养基ms中生长(见图4的b图)。
实施例7微嫁接后pbhmgr1mrna在转基因烟草砧木和野生型烟草接穗间传递的gfp荧光鉴定
微嫁接后14d，分别从接穗野生型烟草取样生长出来的不定根(见图4的c图)及砧木转基因烟草根段，使用激光共聚焦显微镜olympusfluoviewfv1000confocallaserscanningmicroscope(olympus,tokyo,japan)用×20物镜和激发光波长488nm观察根部1-3mm处gfp荧光蛋白表达情况(见图5)。
结果表明：gfp荧光蛋白在转基因烟草植株根强烈表达，在嫁接后，接穗生长出的不定根也出现了gfp荧光蛋白，而对照组中嫁接在野生型烟草砧木上的野生型烟草接穗，其生长出的不定根并没有gfp荧光蛋白的表达。
实施例8微嫁接后pbhmgr1mrna在转基因烟草砧木和野生型烟草接穗间传递的巢式pcr鉴定
按实施例1的方法提取总rna，反转录后进行巢式pcr(见图6)。以嫁接在野生型烟草砧木上的野生型烟草接穗的cdna为阴性对照，以转基因烟草砧木茎段的cdna为阳性对照。
第一轮pcr反应体系：2×estaqmastermix(dye)10μl，10μmseqidno.4和5所示的引物各1μl，cdna1μl，双蒸水7μl，总计20μl。
pcr反应程序如下：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，26个循环；72℃最后延伸10min。
第二轮pcr反应体系：2×estaqmastermix(dye)10μl，10μmseqidno.6和7所示的引物各1μl，第一轮pcr反应产物0.5μl，双蒸水7.5μl，总计20μl。
pcr反应程序如下：94℃预变性5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，34个循环；72℃最后延伸10min。
结果表明：砧木出现了1084bp特异性条带，gfp-pbhmgr1融合基因在转基因砧木烟草植株大量转录，在嫁接后接穗也出现了砧木的特异性条带，而对照组中的接穗并没有出现特异性条带。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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<110>中国农业大学
<120>一种mrna分子在植物砧穗间传递的荧光鉴定方法
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