一种无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法以及无血清轮状病毒疫苗制品与流程

本发明涉及轮状病毒疫苗原液的制备方法，尤其涉及用生物反应器微载体培养无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法以及无血清轮状病毒疫苗制品。

背景技术：

目前，大量生产人用轮状病毒疫苗所利用的细胞基质包括原代细胞，如小牛肾细胞；连续传代细胞，如非洲绿猴肾细胞(Vero)。Vero细胞是世界卫生组织认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比较，Vero细胞具有可连续传代、生长速度快、遗传性状稳定，恶性转化程度低、生物安全性较高、培养条件要求不苛刻、易于在生物反应器实施大规模培养等优势。

作为贴壁成纤维细胞，Vero细胞对血清有依赖性，因为血清能为细胞的体外培养提供必要的生长因子，激素，细胞贴附因子和营养成分。

利用牛血清作为Vero细胞培养和疫苗制备的培养基补充成分,具有诸多不利因素：血清组分的复杂性和不确定性，导致血清生产批次间的质量差异，增加了病毒疫苗生产的不稳定性和产品质量控制的难度，影响着病毒疫苗的生产工艺和疫苗质量；血清中存在病毒(如朊病毒)等病原微生物污染的潜在风险，给疫苗的使用带来了不容忽视的安全隐患。

血清对病毒有一定的抑制作用，轮状病毒、甲肝病毒、水痘病毒等，需要胰酶激活才能很好感染细胞的病毒，由于血清培养基中的血清中和了胰酶，使病毒不能充分激活，从而降低了所收获病毒的滴度。

由于以上情况，美国、欧盟和日本等发达国家已经全面停止在生物制药中应用血清，FDA将停止含血清细胞培养工艺生产的生物技术新药的申报受理。无血清培养已成为包括疫苗在内的生物技术药物生产的总趋势。

现有的无血清培养技术多停留在方瓶、转瓶和细胞工厂(多层静止瓶)水平。而方瓶、转瓶及细胞工厂作为培养容器，存在工艺参数不容易控制，无法实现细胞的高密度培养和获得较高滴度的病毒液，产品的均一性也得不到保证。因此，开发能够大规模生产的生物反应器微载体无血清培养Vero细胞人用轮状病毒疫苗病毒原液的制备方法是十分必要的。

现有技术的缺陷可归纳成如下几点。

1.血清疫苗生产不稳定、质量难以控制；

2.血清中潜在的病毒微生物会造成不安全的隐患；

3.血清对病毒有一定的抑制作用，使用有血清培养基培养Vero细胞和制备病毒液，使病毒收获液滴度较低。特别是一些需要胰酶激活才能很好感染细胞的病毒(如轮状病毒等)，由于血清培养基中的血清中和了胰酶，使病毒不能较好地激活，从而大幅度地降低了所收获病毒液的病毒滴度。

4.方瓶、转瓶及细胞工厂作为培养容器，不能很好地控制工艺参数，不利于细胞生长过程中的气体交换及营养充分供应，不能很好地控制工艺过程，无法实现细胞的高密度培养和获得较高滴度的病毒液，也难以实现产品的均一性。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决上述现有技术的缺陷，提供一种生物反应器微载体无血清培养Vero细胞轮状病毒疫苗病毒原液的制备方法以及无血清轮状病毒疫苗制品，用于制备出均一性好、滴度高、无血清成分和安全性高的无血清病毒性疫苗原液，为大规模生产无血清培养生产Vero细胞基质的人用轮状病毒疫苗奠定基础。

本发明的第一技术方案为一种生物反应器微载体培养无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的方法，其特征在于，包含以下步骤，

步骤1.用无血清培养基培养Vero细胞，获得无血清培养基适应细胞株；

步骤2.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞种子库；

步骤3.利用获得的所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清轮状病毒毒株工作种子库；

步骤4.使用无血清培养基复苏、培养、传代、扩增Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，细胞扩增后，应用生物反应器和微载体，使用无血清培养基，连续灌流培养高密度Vero细胞；

步骤5.接种轮状病毒毒株工作种子库毒种后，进行生物反应器微载体无血清培养，在病毒扩增至高峰时，收获病毒液，收获液病毒滴度，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化处理，得到无血清人用轮状病毒原液。

第二技术方案基于第一技术方案，其特征在于，所述步骤2中，直接以无血清培养基复苏、培养和传代扩增所述无血清培养基适应细胞株，建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库。

第三技术方案基于第二技术方案，其特征在于，所述步骤3中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，接种病毒性疫苗毒株，培养扩增后收获冻存，建立无血清病毒性疫苗毒株主种子库，再以无血清病毒性疫苗毒株主种子库毒种接种无血清Vero细胞工作种子库细胞，培养扩增后收获冻存，建立无血清病毒性疫苗毒株工作种子库。

第四技术方案基于第三技术方案，其特征在于，所述步骤4中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增所述无血清Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞，称取适量微载体，加入无血清培养基平衡过夜，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到罐内，补充无血清培养液至工作体积，调整生物反应器培养参数，细胞接种一定时间后，调整搅拌桨转速，开始灌流细胞扩增培养基，在细胞数量达到规定量时，做好接种病毒的准备。

第五技术方案基于第四技术方案，其特征在于，所述步骤5中，在微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养基，进行载体上细胞与病毒的吸附，完成细胞对病毒的吸附之后，在病毒高峰到来时，收获病毒液。

第六技术方案基于第三技术方案，其特征在于，所述步骤3中，在病毒液中加入含10-40μg/mL胰蛋白酶的激活剂，37℃水浴作用60min，取长满单层的状态良好的Vero细胞，将激活后的病毒液株以MOI 0.005接种Vero细胞，置于37℃恒温室吸附60min，补加无血清病毒维持液液至30mL，轻轻混匀，将细胞瓶继续置于37℃恒温室培养，于接种病毒规定时间后，病毒高峰期收获病毒并取样，细胞瓶及取样管密封置于-20℃，连续冻融三次，置于-80℃冻存。

第七技术方案基于第四技术方案，其特征在于，所述步骤4中，使用无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，根据生物反应器工作体积，按载体投入量8-18g/L计算，称取适量微载体，用0.05mol/L PBS(pH 7.2)浸泡，换液3～4次，用PBS于4℃浸泡过夜，经高压灭菌后，载体以加液泵导入罐体内，加入无血清培养基，转速50转/分钟，温度37℃，PH7.2-7.6，DO20-60，平衡过夜，将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，控制细胞悬液的体积，取样进行细胞计数，保证接种后的细胞密度不低于1.0-1.5×10⁶个/ml，无菌连接细胞接种瓶和生物反应罐，使用正压将细胞接种到罐内，补充无血清培养液至工作体积，整生物反应培养参数：温度为37℃，DO20-60，通气量为0.5LPM，搅拌桨转速25-35转/分钟，温度37℃，PH7.2-7.6，细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速至50-60转/分钟，开始灌流细胞扩增培养基，第一至三天为0.5-1个罐体积/灌流量，第二天为2.5个罐第三天至第七天为1-3个罐体积/灌流量，每天取样镜下观察细胞生长状态，同时结合氧气消耗量和PH变化情况调整灌流量，当第6-7天细胞数量达到0.9-1.1×10⁷个/ml时，做好接种病毒的准备。

第八技术方案基于第五技术方案，其特征在于，所述步骤5中，在病毒液中加入含10-40μg/mL胰蛋白酶的激活剂，37℃水浴作用60min，生物反应器微载体培养Vero细胞7天左右，待微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入病毒，并补充胰蛋白酶至2-4μg/mL，然后以25-30转/分钟进行载体上细胞与病毒的吸附，大约30-60分钟,温度33-35℃，吸附完成后，将搅拌桨转速调至50转/分钟，完成细胞对病毒的吸附之后，搅拌桨转速提至50-60转/分钟，温度35℃，观察细胞病变情况，三天左右之后，病毒高峰到来，3-7天，收获病毒液，连续冻融3次后备用。

第九技术方案基于第一至第八的任一技术方案，其特征在于，所述步骤5中，根据生物反应器的容量，对于低于14L的生物反应器的容量，进行灌流培养。

第十技术方案为无血清轮状病毒疫苗制品，其特征在于，所述无血清轮状病毒制品由权利要求1至9中任一方法制得。

附图说明

图1为用生物反应器微载体无血清培养Vero细胞制备轮状病毒疫苗病毒原液以及成品的工艺流程图；

图2为无血清Vero细胞工作库细胞状态的图；

图3无血清Vero细胞工作库支原体检定结果及阳性对照图(DNA染色法)；

图4为接种轮状病毒工作库病毒后Vero细胞发生病变照片(T225方瓶)；

图5为生物反主应器微载体无血清培养Vero细胞贴壁及生长情况的图；

图6为生物反应器微载体培养无血培养Vero细胞轮状病毒人-牛重配株G1型病毒接种病毒前后情况的图。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明。在下述实施方式中描述的具体实施例仅作为示例性说明，不构成对本发明范围的限制。

首先，对本发明的技术方案进行说明。

获得无血清培养基适应细胞株。再此基础上建立无血清培养Vero细胞种子库和无血清病毒性疫苗毒株种子库。

使用无血清培养基VP-SFM对Vero细胞工作种子库细胞复苏、培养、传代、扩增。

细胞扩增后，应用NBS(New Brunswich Scientific)公司7.5L-50L生物反应器(Celligen 310或Celligen 310 Bioreactor System With Cell Lift Impeller)和由GE公司(General Electric Company)生产的微载体cytodex-1，以8-20g/L高密度微载体培养技术，使用无血清培养基，大规模连续灌流培养高密度Vero细胞。通过培养，可达到1.5x10⁷/毫升的细胞密度，约6-8天后，满球率大于85％。

接种病毒性疫苗毒株工作种子库毒种，如轮状病毒人-牛基因重配株G1(D×UK)、G2(DS-1×UK)、G3(P×UK)、G4(ST-3×UK)和CDC-9(G1P8)、水痘病毒Oka减毒疫苗株、甲肝病毒疫苗株等，进行生物反应器微载体无血清培养，约3-5天后，病毒扩增至高峰时，多次冻融细胞释放病毒粒子的病毒培养，收获液病毒滴度达到8.0LD50/毫升以上，经澄清、超滤浓缩、灭活和纯化等步骤，制备无血清人用轮状病毒疫苗等需要冻融才能释放病毒的病毒性疫苗原液。

图1为用生物反应器微载体培养无血清Vero细胞制备轮状病毒疫苗原液的工艺流程图。

以下，根据图1的工艺流程图，对本发明的制备方法进行说明。

1.获得无血清培养基适应细胞株

利用从ATCC引进的CCL-81Vero细胞，直接用GIBCO公司生产的无血清培养基VP-SFM的培养，获得无血清培养基适应细胞株。

2.无血清Vero细胞种子库的建立

对ATCC引进的CCL-81Vero细胞，直接以VP-SFM无血清培养基复苏、培养和传代扩增。建立无血清Vero细胞主种子库和工作种子库。

3.无血清病毒性疫苗毒株种子库建立

使用VP-SFM无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，接种病毒性疫苗毒株，培养扩增后收获冻存，建立无血清病毒性疫苗毒株主种子库，再以无血清病毒性疫苗毒株主种子库毒种接种无血清Vero细胞工作种子库细胞，培养扩增后收获冻存，建立无血清病毒性疫苗毒株工作种子库。

4.生物反应器微载体无血清培养基对Vero细胞的培养、扩增

4.1无血清Vero细胞工作种子库细胞的复苏、培养、和传代扩增

使用VP-SFM无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞，作为生物反应器培养的基础细胞。

4.2微载体准备

称取适量微载体，用0.05mol/L PBS(pH 7.2)浸泡，换液3～4次。用PBS于4℃浸泡过夜。经高压灭菌后，载体以加液泵导入罐体内，加入无血清培养基平衡过夜。

4.3生物反应器微载体细胞培养

4.3.1细胞导入生物反应器及细胞贴壁

将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，无菌连接细胞接种瓶和生物反应器，使用正压将细胞接种到罐内；补充无血清培养液至工作体积；调整生物反应培养参数。

4.3.2生物反应器微载体无血清细胞培养

细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速。开始灌流细胞扩增培养基。每天取样镜下观察细胞生长状态，同时结合氧气消耗量和PH变化情况调整灌流量。当第6-7天细胞数量达到0.9-1.1×10⁷个/ml时，做好接种病毒的准备。

5.无血清病毒性疫苗毒株的生物反应器微载体无血清培养、扩增及病毒液收获

5.1生物反应器微载体培养细胞病毒接种、培养及病毒收获

5.1.1病毒接种

生物反应器微载体培养Vero细胞7天左右，待微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入无血清培养基，然后以25-30转/分钟进行载体上细胞与病毒的吸附，大约30-60分钟，温度33-35℃。吸附完成后，将搅拌桨转速调至50转/分钟。

5.2病毒培养及收获

完成细胞对病毒的吸附之后，搅拌桨转速提至50-60转/分钟，温度35℃。每天取样镜下观察细胞病变情况。3-5左右后，病毒高峰到来，收获病毒液。

轮状病毒人-牛基因重配株G1(D×UK)、G2(DS-1×UK)、G3(P×UK)、G4(ST-3×UK)、CDC-9(G1P8)、水痘病毒Oka减毒疫苗株、甲肝病毒疫苗株等毒株的培养需要多次冻融细胞才能释放病毒粒子的病毒培养，在此类病毒中，如果病变较慢，细胞维持时间较长，使用小体积生物反应器的病毒培养可以选择灌流；如果接种病毒后三天左右能够达到病毒高峰期，使用体积较大生物反应器的可以不进行灌流培养，病毒高峰到来时即可收获病毒液进行下一步处理。

6.病毒液的澄清和超滤浓缩

以0.45-0.8μm进行深层过滤，以除去细胞碎片，然后用300KD-1000KD膜包,(5mmol/L磷酸盐，pH7.2，0.9％NaCl)，浓缩30-80倍。

7.灭活

每1000ml超滤浓缩液按终浓度1/4000，加10％稀释的β-丙内酯2.5ml，充分摇匀，置4℃24小时。8.2置37℃2小时水解。

口服轮状病毒疫苗和其它减毒活疫苗不需要灭活步骤。

8.凝胶层析

浓缩并检定合格后的病毒液经index-20Sepharose 4FF琼脂糖凝胶柱层析进行纯化。每次上样量800ml～1500ml。根据紫外检测仪监测，通过记录仪直观反映相应峰形，及时收取，为纯化后原液。

9.原液配制

根据测定的蛋白质含量和抗原含量进行配制、除菌，将疫苗原液与稀释液混合，加入终浓度为1％人血白蛋白、5％乳糖、5％蔗糖、1.8％右旋糖酐、0.1％谷氨酸钠作稳定剂，即为原液。原液应置于2-8℃条件下保存备用。

本发明的关键点和效果

1.由于使用无血清培养基培养Vero细胞和以Vero细胞为宿主的病毒来制备病毒性疫苗：1)由于免除了动物源性血清(主要是牛血清)带来的安全性风险；2)剔除了血清对病毒生长的抑制，利于提高病毒滴度。

2.以生物反应器微载体培养Vero细胞和以Vero细胞为宿主的病毒来制备病毒性疫苗：1)工艺过程更加可控，产品均一性更好；2)由于使用生物反应器微载体培养细胞和病毒可以保证细胞的气体交换及营养成分供应，可以增加所培养细胞密度，提高所培养病毒的滴度。3)无血清培养与生物反应器微载体培养相结合，进行以Vero细胞为基质的病毒性疫苗的制备，能够制备出均一性好、高滴度、高质量和高安全性的无血清病毒性疫苗原液，为大规模生产无血清培养基生产Vero细胞基质的病毒性疫苗奠定基础。

3.生物反器和无血清培养，增加了细胞培养密度，提高了病毒抗原滴度，细胞密度达到1.5-2×10⁷cells/ml,使人-牛重配G1血清型疫苗株达到8.0LogLD50/mL。

4.疫苗终产品无需进行牛血清蛋白残留的检定。临床疫苗接种中不存在接种对象对牛血清过敏的不良反应，提高了最终产品的安全性。《药典》规定使用牛血清作为培养基辅助成分，则牛血清残留量不得超过50ng/ml，本发明产品不含牛血清，产品规程将不设定牛血清残留检定项目。

5.生物反应器微载体培养技术与无血清培养技术的结合，利于产品的质量控制，疫苗产品均一性更好。为生物反应器微载体无血清培养病毒性疫苗的制备奠定了基础。

以下通过实施例对本发明进行说明

实施例一(生物反应器微载体无血清培养Vero细胞人-牛重配轮状病毒G1血清型(D×UK)疫苗原液的制备)

利用从ATCC引进的CCL-81Vero细胞，直接用GIBCO公司生产的无血清培养基VP-SFM的培养，获得无血清培养基适应株。在此基础上建立无血清培养Vero细胞种子库和无血清人-牛重配轮状病毒G1血清型(D×UK)毒株种子库(NIH提供的人-牛重配轮状病毒G1血清型(D×UK)毒株)。使用无血清培养基VP-SFM对Vero细胞工作种子库细胞复苏、培养、传代、扩增。细胞扩增后，应用NBS(New Brunswich Scientific)公司14L生物反应器(Celligen 310 Bioreactor System With Cell Lift Impeller)和由GE公司(General Electric Company)生产的微载体cytodex-1，以8-20g/L高密度微载体培养技术，使用无血清培养基，大规模连续灌流培养高密度Vero细胞，可达到1.5x10⁷/毫升的细胞密度，约6-8天后，满球率大于85％，接种无血清人-牛重配轮状病毒G1血清型(D×UK)毒株工作种子库毒种进行无血清培养，约3天后，病毒扩增至高峰时，经过病毒培养，收获病毒液，收获液病毒滴度达到8.5LD50/毫升以上，经澄清、超滤浓缩等步骤，制备无血清人用轮状病毒原液。

具体实施方案如下

实验材料

细胞和毒种：Vero细胞为来自ATCC的CCL-81；毒种为美国国立卫生研究院提供的人-牛重配轮状病毒G1血清型(D×UK)疫苗毒株。

主要试剂和耗材：VP-SFM无血清培养基和胰酶购自GIBCO公司；T75、T175、T225细胞培养瓶为CORNING公司产品；微载体cytodex-1、cytodex-3，由GE公司(General Electric Company)生产。

病毒激活剂：含一定浓度(10～40μg/mL)胰蛋白酶的无血清培养液。

病毒维持液：含一定浓度(1～4μg/mL)胰蛋白酶的无血清的培养液。

主要仪器设备：荧光倒置显微镜购自重庆光电有限公司，型号为IBE2003；倒置生物显微镜，型号XDS-1B，由上海蔡康光学仪器厂生产；电热恒温水浴锅购自上海精宏有限公司，型号为DK-8D；二氧化碳培养箱，型号MCO-20AIC，三洋公司生产；14L生物反应器，型号Celligen 310 Bioreactor System With Cell Lift Impeller为NBS(New Brunswich Scientific)公司生产。

2.无血清Vero细胞种子库的建立

2.1细胞的复苏、传代扩增和无血清Vero细胞主种子库的建立

2.1.1细胞复苏

从液氮罐中取出从ATCC引进的CCL-81Vero细胞，核对标签后立即放入38-40℃的温水中速溶(细胞必须在1～2分钟内完全溶解)；低速(1000rpm)离心约3-5分钟后取出。无菌条件下，弃去冻存管中的上清液，用吸管加入适量无血清培养基VP-SFM培养基，轻轻吹打细胞沉淀后，吸出置已灭菌的玻璃方瓶中，补足无血清培养基VP-SFM培养基，摇匀盖塞，并做好标记。将玻璃方瓶置于37℃恒温室静置培养48-96h。

2.1.2细胞传代扩增及无血清Vero细胞主种子库的建立

镜检适应无血清培养基的Vero细胞，无菌条件下操作，将方瓶内的旧培养液弃去，加入适量的0.125％胰酶溶液(含0.04％EDTA-2Na)，使其浸润细胞面及瓶壁。待细胞面呈毛玻璃状态时，弃去消化液；使残余消化液继续作用，待细胞面疏松时，加入适量VP-SFM无血清培养基使细胞分散均匀，根据细胞量进行分种(1:2～4)，补足VP-SFM无血清培养基，置37℃恒温室静置培养48-96h。

每天观察细胞形态和细胞活性，三天左右再次传代，经过4-5次无血清培养和传代扩增后，最终获得VP-SFM无血清培养的Vero细胞株。混悬细胞，用1mL细胞管分装，液氮中保存，同时，取样进行无菌、支原体等《药典》规定的相关项目检定。所有检定项目合格后，完成无血清Vero细胞主种子库的建立。

2.2无血清Vero细胞工作种子库的建立

2.2.1细胞复苏

从无血清Vero细胞主种子库中取出1支或几支细胞，核对标签后立即放入38-40℃的温水中速溶(细胞必须在1～2分钟内完全溶解)；低速(1000rpm)离心约3-5分钟后取出。无菌条件下，弃去冻存管中的上清液，用吸管加入适量无血清培养基轻轻吹打细胞沉淀后，吸出置已灭菌的玻璃方瓶中，补足无血清培养基，摇匀盖塞，并做好标记。将玻璃方瓶置于37℃恒温室静置培养48-96h。严格按照无菌操作，取适量的VP-SFM培养基，调节pH值为7.0～7.4，备用。

2.2.2细胞培养、传代扩增及无血清Vero细胞工作种子库的建立

镜检细胞，无菌条件下操作，将玻璃方瓶内的旧培养液弃去，加入适量的0.125％胰酶溶液(含0.04％EDTA-2Na)，使其浸润细胞面及瓶壁。待细胞面呈毛玻璃状态时，弃去消化液；使残余消化液继续作用，待细胞面疏松时，加入适量无血清培养基使细胞分散均匀，根据细胞量进行分种(1:2～4)，补足无血清培养基，置37℃恒温室静置培养48-96h。将长至致密单层的细胞依上述方法消化，加入适量无血清培养基，混悬细胞，经过传代、扩增，当细胞数量至一定规模后收集细胞，同时取样进行支原体等相关项目检定，用1mL细胞管分装，液氮中保存，建立无血清Vero细胞工作种子库。细胞生长状态见图2，支原体检定结果见图3。

3.人-牛重配轮状病毒G1血清型(D×UK)毒株种子库的建立

3.1毒种主种子库的建立

3.1.1病毒的激活

在病毒液中加入含10-40μg/mL胰蛋白酶的激活剂，37℃水浴作用60min。

3.1.2病毒的接种与吸附

取长满单层的状态良好的Vero细胞，将激活后的病毒液株以MOI 0.005接种Vero细胞。置于37℃恒温室吸附60min。补加无血清病毒维持液液至30mL，轻轻混匀。

3.1.3病毒的培养与收获

将细胞瓶继续置于37℃恒温室培养，于接种病毒后3天左右，病毒高峰期收获病毒并取样，细胞瓶及取样管密封置于-20℃，连续冻融三次，所取样按《药典》规定的相关项目检定，用毒种瓶分装其余病毒液，贴好标签，置于-80℃冻存，完成轮状病毒人-牛基因重配疫苗株(D×UK，G1)主种子库的制备。

3.2毒种工作种子库的建立

3.2.1病毒的激活

在病毒液中加入含10-40μg/mL胰蛋白酶的激活剂，37℃水浴作用60min。

3.2.2病毒的接种与吸附

取长满单层的状态良好的Vero细胞，将激活后的病毒液株以MOI 0.005接种Vero细胞。置于37℃恒温室吸附60min。补加含有胰蛋白酶(2-4μg/mL)无血清病毒维持液液至30mL，轻轻混匀。

3.2.3病毒的培养与收获

将细胞瓶继续置于37℃恒温室培养，于接种病毒后3天左右，病毒高峰期收获病毒并取样，细胞瓶及取样管密封置于-20℃，连续冻融三次，所取样按《药典》规定的相关项目检定，用毒种瓶分装其余病毒液，贴好标签，置于-80℃冻存，完成轮状病毒人-牛基因重配疫苗株(D×UK，G1)工作种子库的制备。无血清轮状病毒工作种子库病毒感染无血清Vero细胞工作种子库细胞情况见图4。

4.生物反应器微载体无血清培养基对Vero细胞的培养、扩增

4.1无血清Vero细胞工作种子库细胞的复苏、培养、和传代扩增

使用VP-SFM无血清培养基，复苏、传代和扩增无血清Vero细胞工作种子库细胞

4.2微载体准备

根据生物反应器工作体积，按载体投入量8-18g/L计算，称取适量微载体，用0.05mol/L PBS(pH 7.2)浸泡，换液3～4次。用PBS于4℃浸泡过夜。经高压灭菌后，载体以加液泵导入罐体内，加入无血清培养基，转速50转/分钟，温度37℃，PH7.2-7.6，DO20-60，平衡过夜。

4.3生物反应器微载体细胞培养

4.3.1细胞导入生物反应器及细胞贴壁：

将收获的细胞转入到细胞接种瓶中，控制细胞悬液的体积，取样进行细胞计数，保证接种后的细胞密度不低于1.0-1.5×10⁶个/ml。无菌连接细胞接种瓶和生物反应罐，使用正压将细胞接种到罐内。补充无血清培养液至工作体积。调整生物反应培养参数：温度为37℃，DO20-60，通气量为0.5LPM，搅拌桨转速25-35转/分钟，温度37℃，PH7.2-7.6。

4.3.2生物反应器微载体无血清细胞培养

细胞接种24小时后，调整搅拌桨转速至50-60转/分钟。开始灌流细胞扩增培养基。第一至三天为0.5-1个罐体积/灌流量，第二天为2.5个罐第三天至第七天为1-3个罐体积/灌流量。每天取样镜下观察细胞生长状态，同时结合氧气消耗量和PH变化情况调整灌流量。当第6-7天细胞数量达到0.9-1.1×10⁷个/ml时，做好接种病毒的准备。生物反主应器微载体无血清培养Vero细胞贴壁及生长情况见图5。

5.无血清病毒性疫苗毒株的生物反应器载体无血清培养、扩增及病毒液收获

5.1病毒激活

在病毒液中加入含10-40μg/mL胰蛋白酶的激活剂，37℃水浴作用60min。

5.2生物反应器微载体培养细胞病毒接种

5.1.1病毒接种

生物反应器微载体培养Vero细胞7天左右，待微载体上满球率达80％以上，换液，取样进行细胞计数，按MOI0.001-0.01加入病毒，并补充胰蛋白酶至2-4μg/mL，然后以25-30转/分钟进行载体上细胞与病毒的吸附，大约30-60分钟,温度33-35℃。吸附完成后，将搅拌桨转速调至50转/分钟。

5.1.2病毒培养及收获

完成细胞对病毒的吸附之后，搅拌桨转速提至50-60转/分钟，温度35℃。每天取样镜下观察细胞病变情况。三天左右之后，病毒高峰到来，3-7天，根据载体细胞病毒变情况，收获病毒液，连续冻融3次后备用。

本实施例中，采用多次冻融进行病毒培养，(如轮状病毒人-牛基因重配株G1(D×UK)、G2(DS-1×UK)、G3(P×UK)、G4(ST-3×UK)和CDC-9(G1P8)等及轮状病毒人源减毒活疫苗株等、水痘病毒Oka减毒疫苗株、甲肝病毒疫苗株、等不能灌流培养)。在生物反应器中培养3-7天后，根据细胞病毒变情况，载体上形态正常的细胞近10％左右，收获病毒液。生物反应器微载体培养无血培养Vero细胞轮状病毒接种病毒前及接种病毒96小时后情况见图6。

6.病毒液的澄清和超滤浓缩

以0.45-0.8μm滤膜进行深层过滤，以除去细胞碎片，然后用300KD-1000KD膜包,(5mmol/L磷酸盐，pH7.2，0.9％NaCl)，浓缩30-80倍。

疫苗配制

每一毫升轮状病毒疫苗原液的抗原含量应为7.5-8.0lgCCID50/mL另入7.2％(W/V)和12％(V/V)的10的蔗糖。

病毒原液滴度检定结果

采用CCID50联合酶联免疫法，将待检样品稀释一定浓度后接种至长满单层、状态良好的MA104细胞，继续培养一段时间后，用轮状病毒检测试剂盒检测病毒感染性滴度。

四种培养形式3次连续批次的病毒滴度检测结果

小结

由于轮状病毒感染细胞不向细胞外释放病毒及细胞碎片对病毒颗粒有较强的吸附性，可以使用较小的生物反应器进行连续灌流培养，也可以使用较大的生物反应器进行非灌流培养。病毒液收获后，需要对收获液进行三次的冻融，以使病毒释放到上清液中，然后再收取病毒上清液。轮状病毒属于肠道黏膜病毒，自然免疫途径为肠道黏膜免疫，人-牛重配疫苗株中有一个基因片段是人源的，其余为牛源的，牛源轮状病毒对人无致病性。疫苗为口服活疫苗，因此超滤浓缩后无需其它纯化步骤及灭活步骤，直接加入保护剂(庶糖等)，分装后即为疫苗。

从滴度检定结果可以看出，连续三批生物反应器微载体无血清培养Vero细胞人-牛重配轮状病毒G1血清型(D×UK)疫苗原液平均滴度为8.33lgCCID50/mL，三批有血清反应器培养原液的平均滴度为7.83lgCCID50/mL，三批有血清T225方瓶培养原液的平均滴度为6.25lgCCID50/mL，三批有血清3L转瓶培养原液的平均滴度为6.58，表明无血清培养有利于病毒对细胞的感染，是滴度得以提高的因素之一，同时，反应器微载体培养形式，为细胞作病毒培养提供了气体良好交换的条件和充足的营养供应，是滴度提高的第二个因素。对于有血清疫苗产品，中华人民共和国药典(三部，2015年版)规定牛残不得超过50ng/ml,而无血清疫苗产品检定项目中不设定牛血清残留蛋白检定，不仅减少了检定成本，也免除了临床使用产品时，个体对牛血清的过敏反应，提高了疫苗产品的安全性。

实施例二

在实施例一的基础上，使用较小容量的生物反应器，如低于14L的生物反应器，可以进行灌流培养。细胞维持时间较长，使用小体积生物反应器的病毒培养可以选择灌流，病毒高峰到来时即可收获病毒液进行下一步处理。

以上对本发明的实施方式以及实施例进行了说明，制备时的各种条件、试剂以及参数并不是唯一的，疫苗毒株和无血清培养基等也可根据需要进行改变，本领域的技术人员可以根据其知识对实施方式以及实施例中的参数、疫苗毒株和无血清培养基进行调整和改变，这种调整和改变均属于本发明的范围之内。