本发明属于生物医药和试剂检测领域,涉及x染色体定量检测法及试剂盒。具体涉及一种对细胞中x染色体定量检测的方法以及一种基于该方法的试剂盒。尤其涉及基于x染色体失活特异的dna差异甲基化区域的对细胞中x染色体定量检测的方法以及试剂盒。
背景技术：
：现有技术公开了人类体细胞中包含23对染色体，其中有22对常染色体，1对性染色体。性染色体包括x染色体和y染色体，可以决定性别：正常男性的性染色体为xy，包含1条x染色体，而正常女性的性染色体为xx，包含2条x染色体。x染色体的数量和结构异常与多种性染色体疾病相关，包括克兰费尔特综合征（klinefeltersyndrome），特纳综合征（turnersyndrome），x三体综合征（trisomyxsyndrome）等。对细胞中x染色体进行定量检测获取细胞中x染色体的数量与结构信息，可为多种性染色体疾病的诊断提供重要的中间结果。现有技术方法中，核型分析可以准确获知细胞中x染色体的数量和结构信息，在临床和科研中广泛应用，但该方法需进行细胞培养，周期较长；并需要有经验的检测人员观测识别，难以大规模开展；高通量遗传检测技术，如比较基因组杂交芯片、单核苷酸多态性分型芯片和和全基因组测序技术成本较过高；常规分子遗传学检测方法，如荧光定量pcr、毛细管电泳等难以检测疾病中高发的嵌合体和结构异常情况。研究公开了男性和女性体细胞中x染色体数量不同，需要通过剂量补偿（dosagecompensation）机制维持多数x连锁基因在不同性别间的转录水平相同或接近。在人类和哺乳动物中，这种剂量补偿是通过x染色体失活（xchromosomeinactivation）完成，即女性体细胞中随机有1条x染色体处于失活状态（xi），失活的x染色体上约有80%的基因失去转录活性；研究显示，x染色体失活发生在胚胎发育时期，非常稳定，可维持终身，其分子机制是通过表观遗传修饰，包括dna甲基化、非编码rna和组蛋白修饰的改变完成。x染色体失活符合n-1原则，即无论细胞中有几条x染色体，除了1条x染色体保持转录活性（xa），其它x染色体均失活。研究还公开了dna甲基化参与x染色体失活过程。在人类和哺乳动物中，dna甲基化主要是cpg二核苷酸序列上的胞嘧啶（c）碱基中5号碳原子上的氢原子（h）被一个甲基（-ch3）取代；cpg二核苷酸在基因启动子区往往成簇存在，形成cpg岛，启动子区的cpg岛的dna甲基化与基因的转录活性相关，通常低甲基化表明基因处于转录激活状态，高甲基化则处于转录抑制状态；在失活x染色体上，失活目标基因的启动子区处于高甲基化状态，而活化的x染色体上相应基因的启动子区则处于低甲基化状态。有关研究通过比较男性和女性样品中x染色体上cpg位点的甲基化水平，可以鉴定x染色体失活特异的dna差异甲基化位点（xidms），这些cpg位点在活化x染色体上未甲基化，而仅在失活染色体中高度甲基化，且主要定位于失活目标基因的启动子区，并成簇存在，形成x染色体失活特异的dna差异甲基化区域（xidmr），基于此，可通过对相关区域dna甲基化状态的定量分析，获取细胞中x染色体的定量信息。基于现有技术的研究现状，本申请的发明人拟提供一种对人类细胞中x染色体定量的方法，以及对人类细胞中x染色体定量检测的试剂盒。技术实现要素：本发明的目的是基于现有技术的研究现状，提供一种对人类细胞中x染色体定量检测的方法以及基于该方法的试剂盒，尤其涉及基于x染色体失活特异的dna差异甲基化区域的对细胞中x染色体定量检测的方法以及试剂盒。本发明基于在x染色体失活特异的dna差异甲基化区域（xidmr）中多个差异甲基化位点（xidms）的甲基化水平与细胞中x染色体数量正相关，对多个xidmr中的多个xidms的甲基化水平定量，可以获取细胞中x染色体的数量与结构信息的原理，提供了一种对人类细胞中x染色体定量检测的方法。本发明中对x染色体定量的原理如图1所示；按下述技术方案实现：筛选并验证x染色体失活特异的dna差异甲基化位点和区域（即xidms与xidmr），选择具有包含多个xidms的xidmr作为标志物；在已知核型的细胞中检测各xidmss的甲基化水平，计算各xidmr和全x染色体的拷贝数的正常参考值范围；根据xidmr中各xidms中甲基化与非甲基化片段比率获取未知核型细胞中x染色体数量与结构信息。具体的，本发明的对人类细胞中x染色体定量检测的方法，其包括步骤:1)以x染色体上多个中具有多个x染色体失活特异的dna差异甲基化位点（xidms）的区域（xidmr）作为标志物，设计对应甲基化检测引物选择核型正常的男性与女性细胞，抽取dna，使用iluumina公司infiniumhumanmethylation450beadchips（450k芯片）进行全基因组甲基化检测，获取x染色体上cpg位点的甲基化水平信息；所选xidms应符合在活化x染色体（xa）上处于未甲基化而在失活x染色体（xi）上高度甲基化；在男性细胞中，因仅含有1条xa，甲基化水平接近于0，而在女性细胞中，因含xa与xi各1条，甲基化水平接近0.5；本发明方法中具体筛选条件为：男性细胞中，cpg位点甲基化程度<0.05，标准差<0.02；女性细胞中，cpg位点甲基化程度介于0.4和0.6之间，标准差小于0.05，本发明中共有108个cpg位点符合筛选标准，这些位点大多位于基因的5’端启动子区附近：有101个cpg位点定位于转录起始位点（tss）上下游2kb内；对符合筛选条件的候选位点通过盐硫酸盐pcr后sanger测序（bsp）和焦磷酸测序验证，筛选候选位点及附近多个cpg位点均符合xidms标准的基因区域作为xidmr，作为检测标志物，设计扩增引物；2)建立正常核型细胞样品中各xidmr和全x染色体的拷贝数参考值范围使用亚硫酸盐氧化法，将待测dna样品中未甲基化的胞嘧啶（c）氧化为尿嘧啶（u），以所述亚硫酸盐转化待测dna样品为模板，扩增各xidmr，分析核型正常的男性与女性细胞中，各xidmr中各xidms的甲基化检测结果，分别计算各位点甲基化在男性样品中的均值和女性样品中的均值及标准差；本发明中，选择应用于x染色体定量分析的xidms，选择标准为：<0.05，标准差<0.02；0.37<<0.55，标准差<0.05；根据样品中各xidms的甲基化水平mx，分别计算位点的拷贝数，并根据各拷贝数的均值获取xidmr拷贝数nr，从而降低随机偏差的影响；nr计算公式为：(1)由于接近于0，因此也可使用简化公式：(2)公式(1)中n为各xidmr中所选xidms数量，i为各xidms顺序编号，为各样品在对应xidms中的甲基化水平；分别计算正常核型男性样品中的均值，标准差；正常核型女性样品中的均值，标准差；以为xidmr对应x染色体1拷贝参考值范围，以为对应x染色体2拷贝参考值范围；核型正常样品的全x染色体拷贝数参考值nx，为所选多个xidmr计算所得，计算公式为：(3)公式（3）中p为所选xidmr数量，为根据各xidmr计算所得的拷贝数；分别计算正常核型男性样品中的均值，标准差；正常核型女性样品中的均值与，标准差；以为xidmr对应x染色体1拷贝参考值范围，以为对应x染色体2拷贝参考值范围；3)检测未知核型细胞中x染色体数量与结构信息对未知核型样品，检测多个xidmr中每个xidms的甲基化水平，根据公式（1）计算各xidmr的拷贝数，根据公式（3）计算全x染色体拷贝数；如果与均在x染色体1拷贝或2拷贝参考值范围内，则判定细胞中x染色体为1条或2条；如果偏离1拷贝或2拷贝参考值，则根据获取细胞内x染色体数量；如果部分偏离1拷贝或2拷贝参考值，则判断细胞内x染色体存在结构异常，并根据拷贝数给出x染色体异常核型。同时，本发明还提供了一种基于xidmr标志物的x染色体定量检测试剂盒。所述的xidmr分别定位于sat1，uxt和utp14a基因启动子区，分别包含6个、6个和9个xidms；所述sat1基因处于x染色体短臂（xp），定位于xp22.1，xidmr序列如seqidno：1所示，uxt基因处于x染色体短臂（xp），定位于xp11.23-p11.22，xidmr序列如seqidno：2所示，utp14a基因处于x染色体长臂（xq），定位于xq26.1，xidmr序列如seqidno：3所示；所述试剂盒中包含对dna甲基化检测的前处理试剂，dna前处理采用亚硫酸盐氧化法，将未甲基化的胞嘧啶（c）氧化为尿嘧啶（u），并在后续pcr反应中转化为胸腺嘧啶（t）；所述试剂盒中含有对亚硫酸盐氧化处理后的sat1，uxt1和utp14a基因启动子区dna序列进行扩增的试剂和引物；扩增使用聚合酶链式反应（pcr），其中，扩增sat1基因xidmr的引物对序列为seqidno：4和seqidno：5；扩增uxt基因xidmr的引物对序列为seqidno：6和seqidno：7；扩增utp14a基因xidmr的引物对序列为seqidno：8和seqidno：9，其中seqidno：5、seqidno：7和seqidno：9所述序列引物5’端使用生物素标记；所述试剂盒通过对sat1，uxt和utp14a基因启动子区xidmr内xidms的甲基化定量对细胞内x染色体进行定量分析；定量方法采用焦磷酸测序，其中，sat1基因xidmr的焦磷酸测序引物为seqidno：10；uxt基因xidmr的焦磷酸测序引物为seqidno：11；utp14a基因xidmr的焦磷酸测序引物为seqidno：12；获得甲基化数据后使用公式（1）分析细胞内x染色体数量；本发明中，上述的分析包括步骤：1.抽提样本中的dna；2.使用亚硫酸盐将dna样品中未甲基化的胞嘧啶碱基氧化为尿嘧啶；3.使用相应引物对sat1，uxt1和utp14a基因启动子区进行pcr扩增，将尿嘧啶替换为胸腺嘧啶；4.对pcr产物进行焦磷酸测序，根据对应xidms中胞嘧啶和胸腺嘧啶相对信号强度获得甲基化数值；5.结合已知核型样品所获得参考值计算细胞中x染色体数量与结构信息。本发明中，最常见的情况下,所述的样本是离体的外周血。本发明的实验数据证明,at1，uxt1和utp14a基因启动子区xidms的甲基化水平可用于对细胞中x染色体进行定量分析。本发明的有益效果及具有实用性的例证为:1)本发明使用xidms作为检测x染色体数量与结构信息的探针，对x染色体数量进行相对定量，可以准确获取各探针区域的拷贝数信息，发现x染色体数量和结构异常。2)本发明基于分子遗传实验室常规操作方法，与目前临床常用的核型分析相比，无需细胞培养、操作简便，便于自动化与并行检测。因而具有检测时间较核型分析的3天以上缩短至6小时以内，并能检测更大量的样本。3)本发明提供的检测试剂盒基于对少量区域的甲基化检测，与近年来在科研中广泛应用的比较基因组芯片、二代测序等高通量方法相比，成本不足1/10，且数据分析简便，无需专门生物信息分析人员。4)本发明提供的检测试剂盒中所检测每个xidmr片段中包含多个xidms，对多个位点同时检测并取平均值，与荧光定量pcr等常见分子遗传检测方法相比，定量更为准确，不仅可以发现x染色体存在数量和结构的异常，也能够为常见性染色体疾病的诊断提供重要的中间结果。附图说明图1.x染色体失活特异的dna差异甲基化位点（xidms）对x染色体的定量检测，其中，n为细胞中x染色体数量，a.细胞中有1条x染色体为活化x染色体，其它为失活x染色体，在x染色体失活目标基因启动子区域，活化x染色体上cpg位点处于低甲基化状态（白色圆点），失活x染色体上cpg位点处于高度甲基化状态（黑色圆点）；b.细胞中不同x染色体数量情况下，xidms的甲基化水平存在显著差异，mcpginxa：活化x染色体上的甲基化cpg片段，mcpginxi：失活x染色体上的甲基化cpg片段，umcpginxa：活化x染色体上的未甲基化cpg片段，umcpginxi：失活x染色体上的未甲基化cpg片段；c.细胞中不同x染色体数量情况下,xidms中，未甲基化片段与甲基化片段的比值存在显著差异。图2.对sat1、uxt1和utp14a基因启动子区xidmr的验证，其中：a-c:bsp验证结果，d-f:焦磷酸验证结果；a、d：sat1基因xidmr；b、e：uxt1基因xidmr；c、f：utp14a基因xidmr；上方为男性dna样品结果，下方为女性dna样品结果。图3.基于xidms甲基化水平计算所得x染色体拷贝数，其中，46,xx健康女性样品；46,xy：健康男性样品；ts：turner综合征样品，*对于具有46,x,i(xq)核型细胞样品，仅显示xp拷贝数，----：正常女性参考值范围1.82-2.22。具体实施方式以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例1验证x染色体失活特异的dna差异甲基化位点和区域（即xidms和xidmr）本研究经复旦大学伦理委员会同意，根据赫尔辛基原则宣言（declarationofhelsinkiprinciples）施行。所有参与者均来自于中国上海复旦大学附属儿科医院，在知情同意的前提下参加本研究，并签署了知情同意书。生物样本来源于外周血白细胞核型分析的剩余样品，按试剂盒说明书提取dna，用紫外分光光度仪检测dna浓度和纯度，使用亚硫酸盐试剂转化。本实施例中，使用引物对sat1、uxt1和utp14a基因启动子区片段进行pcr扩增，对产物纯化后进行pcr测序，结果表明，所述的三个基因启动子区片段包含多个cpg位点，在男性dna样品中未甲基化，而在女性dna样品中部分甲基化，符合xidms特征，形成了xidmr（如图2.a、b、c所示）；本实施例中，还使用焦磷酸测序对所述的三个片段进行了甲基化定量分析，候选xidms在男性dna样品中甲基化程度为0或接近为0，在女性dna样品中甲基化程度接近50%（如图2.d、e、f所示），结果表明，xidmr的存在可以并行检测多个xidms的甲基化水平，有效的降低随机误差对结果的影响。实施例2建立各xidmr在正常人群中的参考值范围使用18例已知核型为46,xx和6例核型为46,xy的dna样品，使用引物对sat1、uxt1和utp14a基因启动子区xidmr片段进行pcr扩增后用焦磷酸测序进行甲基化定量分析，其中sat1和uxt1基因xidmr片段分别包含6个xidms，utp14a基因xidmr片段包含8个xidms；对于每个xidms，分别计算其在46,xy和46,xx核型样品中的甲基化均值和，并使用公式1计算各样品在每个xidmr处的拷贝数nr，分别计算46,xy和46,xx核型样品中的均值与，标准差与，以为xidmr对应x染色体1拷贝参考值范围，以为对应x染色体2拷贝参考值范围；使用公式（3）计算各样品全x染色体拷贝数nx，分别计算46,xy和46,xx核型样品中的均值与，标准差与，以为xidmr对应x染色体1拷贝参考值范围，以为对应x染色体2拷贝参考值范围；sat1、uxt1和utp14a基因启动子区xidmr和全x染色体拷贝数参考值范围如表1所示。表1.xidmr拷贝数在正常人群中的参考值范围核型sat1uxt1utp14ax染色体46,xy1.000.021.001.011.0046,xx2.050.262.010.382.010.312.020.20结果表明，本发明的方法，对于x染色体单拷贝的检测非常准确，在2.58倍标准差，即99%置信区间内偏差不超过2%，能非常灵敏地在男性样本中区分克兰费尔特综合征、46xx性反转等x染色体异常；本方法对于x染色体2拷贝样品具有较准确的定量，99%置信区间内偏差少于20%，结合3个xidmr拷贝数，99%置信区间内偏差可达到10%水平，显著优于荧光定量pcr等常规分子遗传学手段。实施例3：检测临床样品中x染色体数量与结构信息通过对sat1、uxt1和utp14a基因启动子区xidmr进行甲基化检测，对总计42例具有异常核型的临床血样进行了检测，其中包括36例特纳综合征患者、3例克兰费尔特综合征和3例x三体综合征患者，其中特纳综合征患者具有多种核型，包括45,x、46,x,i(xq)以及45,x与46,x,i(xq)，46,xx，47,xxx，46,x,del(xp)或46,xy核型的嵌合体；对样品提取dna；亚硫酸盐转化；pcr后进行焦磷酸测序，检测结果表明，样品的x染色体定量结果表明，至少2个xidmr的拷贝数偏离正常核型参考值范围，其中turner综合征患者样品的定量结果如图3所示；本实施例的结果同时显示，本发明的定量方法对于嵌合体、结构异常，以及x染色体高拷贝数均具有较高准确性，部分核型样品的分型结果显示如表2所示；如核型为46,x,i(xq)样品，其细胞包含1个正常x染色体和1个x染色体长臂等臂染色体，因此具有1条短臂和3条长臂，而检测结果表明，位于x染色体短臂的xidmr为单拷贝，而位于长臂的xidmr接近于3拷贝。表2.对部分核型样品的详细定量结果：核型sat1uxtutp14ax染色体45,x[12]/46,xx[9]1.471.481.431.4645,x[3]/46,xx[32]1.731.562.021.7745,x[7]/46,xx[13]1.771.701.651.7145,x[27]/47,xxx[3]1.511.501.661.5645,x[16]/46,x,r(x)(p11q22)[4]1.001.000.991.0045,x[6]/46,x,r(x)(p21q21)[14]1.001.451.071.1745,x[10]/46,x,r(x)(p22q25)[10]1.231.301.021.1845,x[7]/46,x,del(x)(p11)[13]1.081.621.46-45,x[13]/46,x,i(x)(q10)[7]1.001.001.47-45,x[8]/46,x,i(x)(q10)[12]1.001.001.75-45,x[9]/46,x,i(x)(q10)[11]1.001.002.14-45,x[4]/46,x,i(x)(q10)[16]1.001.002.14-45,x[3]/46,x,i(x)(q10)[32]1.021.003.40-45,x[4]/46,x,i(x)(q10)[56]1.001.003.14-46,x,i(x)(q10)1.001.003.03-46,x,i(x)(q10)1.001.003.35-46,x,i(x)(q10)1.001.003.45-47,xxx2.942.903.293.0447,xxx3.192.663.353.0747,xxy2.001.842.232.0247,xxy2.172.071.932.0649,xxxxy4.404.024.454.29sequencelisting<110>复旦大学附属儿科医院<120>一种对细胞中x染色体定量检测的方法和试剂盒<130>2016<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>70<212>dna<213>人<400>1cgtcactcgccgaggttccttgggtcatggtgccagcctgactgagaagaggacgctccc60gggagacgaa70<210>2<211>70<212>dna<213>人<400>2cacccaagcgcggcctttacctcaggccgccagcaataagaacggttggtaggaaccgcg60gcttccgggt70<210>3<211>70<212>dna<213>人<400>3acggaagtgacgtgtacgtcgcgagcgattgacggaaacagaaattgctttgcggcccgc60acggaaattg70<210>4<211>26<212>dna<213>人工序列<400>4taatgtttaaatgygtagtttttagt26<210>5<211>25<212>dna<213>人工序列<400>5cttaatcaaccrcaatatatcacta25<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6tttaagttggaggtttagttttt23<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<400>7caacttctctcacataaaccaaaa24<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8tttaagttggaggtttagttttt23<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<400>9taatcttctttaatctcctcraattc26<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<400>10gggtygattggtgtttatt19<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11gggattygattatttaggga20<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列<400>12gttttttttaygtttygtaygga23当前第1页12