本发明属于分子标记鉴定领域，具体涉及一种快速区分小黄鱼和大黄鱼及判定小黄鱼和大黄鱼杂交种的引物及方法。
背景技术：
小黄鱼和大黄鱼都属于四大海产，两者肉质细嫩，味道鲜美，深受广大消费者的青睐。但是由于过度捕捞、环境变化等原因，小黄鱼性早熟、日趋小型化现象日益明显；大黄鱼的野生资源极其稀少，其养殖群体品质严重下降，经济效益明显降低。杂交可以使生物的遗传物质从一个群体转移到另一群体，是增加生物变异性的一个重要方法。不同类型的亲本进行杂交可以获得变异性状的重新组合，杂交后代中可能出现双亲优良性状的组合，甚至出现超亲代的优良性状。因此，开展了小黄鱼与大黄鱼的杂交育种，培育出杂交子代，但是杂交子代是否确实为杂交种需要进行鉴定。
常规使用鉴定杂交鱼类的方法，主要从形态学方面进行鉴定。然而，形态学鉴定有时并不一定准确，存在很强的主观因素，并且形态学鉴定在苗种期只能区分大黄鱼与小黄鱼、杂交鱼，不能鉴定区分杂交种和小黄鱼，因为后两者在形态上较为相近，很容易混淆。分子遗传标记在鱼类杂交种鉴定工作中正发挥着越来越重要作用，可以快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的多态性，是当前用于水产生物种质鉴定与群体遗传特性分析的主要标记。利用电泳图谱分析技术，以条带的扩增情况来反映物种的特异遗传信息，操作方法简单、结果分析方便。本发明在不处死鱼种的基础上，只需剪取少量鳍条，利用微卫星标记技术便很容易区分小黄鱼和大黄鱼，并且能鉴定两者的杂交子代[小黄鱼（♀）与大黄鱼（♂）]确实为杂交种。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速区分小黄鱼和大黄鱼及判定小黄鱼和大黄鱼杂交种的引物及方法的技术方案。
所述的一种快速区分小黄鱼和大黄鱼及判定小黄鱼和大黄鱼杂交种的引物，其特征在于该引物的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述的一种快速区分小黄鱼和大黄鱼及判定小黄鱼和大黄鱼杂交种的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）提取大黄鱼、小黄鱼和小黄鱼与大黄鱼的杂交鱼DNA；
2）对样品DNA进行PCR扩增；
3）PCR 反应结束后，取扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并于紫外成像仪器中观察、拍照及记录，根据电泳图谱结果与DNA片段条带位置对比，在近250bp处有一个特异条带，确定为小黄鱼；在400bp左右处有一特异条带，确定为大黄鱼；杂交鱼与大黄鱼在相同位置具有一个特异条带，从而判定该杂交鱼确实为小黄鱼与大黄鱼的杂交种。
所述的一种快速区分小黄鱼和大黄鱼及判定小黄鱼和大黄鱼杂交种的方法，其特征在于所述步骤2）中PCR扩增条件为：10×Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl，Taq酶0.2μl，上游引物和下游引物各1μl，DNA模板1μl，ddH2O 18.3μl；PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min后进入35个循环：94℃ 35sec，59℃ 35sec，72℃ 1.0min；最后72℃延伸10min；所述上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明无需经测序等复杂步骤，经适宜的PCR扩增后，能够准确鉴定杂交子代确实为杂交种，并且能够区分小黄鱼与杂交鱼，从而为3种外形相近的鱼类的种质鉴定提供一种新的简单、快捷的鉴定方法。
附图说明
图1为小黄鱼、大黄鱼和杂交鱼的电泳图。
图中：1、2为小黄鱼；3、4、5为杂交鱼；6、7为大黄鱼。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例
（1）选取小黄鱼、大黄鱼以及杂交鱼[小黄鱼（♀）与大黄鱼（♂）] ，进行专业形态学鉴定；
（2）采用酚氯仿提取法提取小黄鱼、大黄鱼及杂交鱼样品的DNA；
（3）PCR扩增反应体系为：10×Buffer 2.5μl，dNTP 2.0μl，Taq酶0.2μl，上游引物和下游引物各1μl，DNA模板1μl，ddH2O 18.3μl；PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min后进入35个循环：94℃ 35sec，59℃ 35sec，72℃ 1.0min；最后72℃延伸10min；
上游引物：5’- GGTGGTGGCAAAATTTGATT -3’（如SEQ ID No.1所示）；
下游引物：5’- CCACACACCTAATGCCTCCT -3’（如SEQ ID No.2所示）；
（3）电泳染色对比图谱：PCR 反应结束后，取8μL 产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并于紫外成像仪器中观察、拍照及记录，根据电泳图谱结果与DNA片段条带位置对比（如图1所示），形态学鉴定为小黄鱼的在近250bp处有一个特异条带，确定为小黄鱼；形态学鉴定为大黄鱼的400bp左右处有一特异条带，确定为大黄鱼；形态学鉴定为杂交鱼的与大黄鱼在相同位置具有一个特异条带，以此可以很好区分小黄鱼与杂交鱼和大黄鱼，并且可以确定小黄鱼（♀）与大黄鱼（♂）的杂交子代遗传了大黄鱼的遗传物质，也就说明杂交子代不是由小黄鱼卵子经过雌核发育得来，即杂交子代确实为小黄鱼与大黄鱼的杂交种。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江省海洋水产研究所
<120> 一种快速区分小黄鱼和大黄鱼及判定小黄鱼和大黄鱼杂交种的引物及方法
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<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
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