用于检测斯氏弓形菌的荧光PCR引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于食品安全领域，具体涉及斯氏弓形菌检测用引物和探针组、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：弓形菌(Arcobacter)是一种新型食源性致病菌，国际食品微生物标准委员会(InternationalCommissiononMicrobiologicalSpecificationsforFoods，ICMSF)2002年将其规为对人类健康有严重危害类微生物。弓形菌中的布氏弓形菌(A.butzleri)、嗜低温弓形菌(A.cryaerophilus)和斯氏弓形菌(A.skirrowii)被认为与人类疾病相关。弓形菌与弯曲菌亲缘关系近、形态相似，呈弯曲或螺旋形杆状、不产芽胞，但两者生长特性有一定差异，弓形菌较弯曲菌生长温度范围更广、氧气耐受性更强，因而较弯曲菌更易存活。生长温度、氧气耐受性的差异和其它生化特性常用于鉴别弓形菌属和弯曲菌这2个属。自从Ellis等1977年首次建立了弓形菌的分离方法以来，不同学者建立了多种不同的增菌和平板分离模式的传统方法，其中以1999年Johnson和Murano建立的方法被认为是最好的方法。但是，由于弓形菌的生理生化特性表型差异性较大，导致其难以依赖传统的生理生化特性进行弓形菌种间分型鉴定。有学者的人工添加实验表明，添加了斯氏弓形菌的某些样品采用传统检测方法无法分离出此菌。这与斯氏弓形菌比其它弓形菌对抗生素更敏感、其生长繁殖速度也较慢有关，因而比其它弓形菌更难在含抗生素的培养基上生长。弓形菌检测的传统增菌平板分离方法与其它微生物传统检测方法一样，用于弓形菌的检测同样存在步骤复杂、检测周期长等许多的不足，非常有必要建立一种快速、准确的检测斯氏弓形菌的方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于检测斯氏弓形菌的荧光PCR引物、试剂盒及检测方法。本发明所采取的技术方案是：用于检测斯氏弓形菌的荧光PCR引物及探针，其是根据斯氏弓形菌的23SrRNA基因特异性序列所设计的。所述引物及探针的核苷酸序列如下所示：上游引物：5’-ATGCTCGTCATCGTAGGGTT-3’(SEQIDNO.1)；下游引物：5’-AGCGGATTTGCCTACTTAACAAC-3’(SEQIDNO.2)；探针：HEX-ATCGAGGTCACGGATGGAAGTGT-BHQ1(SEQIDNO.3)。一种用于检测斯氏弓形菌的试剂盒，其包括以上所述的荧光PCR引物及探针。斯氏弓形菌的荧光PCR检测方法，包括如下步骤：(1)提取样品DNA；(2)以样品DNA为模板，利用上述的荧光PCR引物、探针进行荧光PCR扩增；(3)根据扩增曲线来判断样品中是否含有斯氏弓形菌。荧光PCR扩增体系中含有以下组分：荧光PCR扩增的程序为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火1min，收集荧光，40个循环。本发明的有益效果是：本发明提供的实时荧光PCR反应方法结合上述引物和探针组具有以下特点：特异性强、灵敏度高、检测快速可靠、操作简便的特点。附图说明图1为实施例1中进行实时荧光PCR的结果示意图；图2、图3为实施例1中进行2株斯氏弓形菌的实时荧光PCR扩增曲线的结果示意图；图4、图5为实施例3中进行灵敏度实验的结果示意图。具体实施方式实施例1检测斯氏弓形菌的荧光PCR检测方法的建立1、引物设计根据斯氏弓形菌的23SrRNA基因特异性序列设计了一对特异性引物，序列如下所示：上游引物：5’-ATGCTCGTCATCGTAGGGTT-3’(SEQIDNO.1)；下游引物：5’-AGCGGATTTGCCTACTTAACAAC-3’(SEQIDNO.2)；探针：HEX-ATCGAGGTCACGGATGGAAGTGT-BHQ1(SEQIDNO.3)。2、荧光PCR检测配置总体积为25μL的实时荧光PCR的反应体系，具体为：组分工作液浓度加样量(μL)上游引物10μmol/L1下游引物10μmol/L1探针10μmol/L1ROXReferenceDyeII50×0.5dNTPs10mmol/L1PCR缓冲液10×2.5Taq聚合酶5U/μL0.5待检模板DNA/2去离子水/16.5其中，上游引物、下游引物、探针对应为所述斯氏弓形菌的实时荧光PCR检测引物和探针组中的引物和探针。将实时荧光PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中，按下述反应条件进行荧光PCR反应：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火1min，收集荧光，40个循环。结果判断：根据Ct值判断结果，Ct值≤35.0，可判定该样品为阳性，Ct值≥40，可判定样品结果为阴性；Ct值＞35.0而＜40，重做样本，重做结果Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。选择上述引物进行实时荧光PCR检测，以斯氏弓形菌的标准DNA溶液代替待检模板DNA，以去离子水代替待检模板DNA作为阴性对照，另外进行上述步骤；两者的实时荧光PCR检测结果见图1和图2，在图1和图2分别对应斯氏弓形菌的标准DNA溶液、去离子水。实施例2特异性实验本实施例主要是对实施例1提供的引物和探针组进行特异性实验，具体是：用下表中的大肠杆菌菌株的DNA分别取代待检模板DNA另外实施例一中所述的步骤2；以去离子水作为阴性对照。表2实验结果为：上表中2株斯氏弓形菌菌株扩增结果为阳性，其它菌株扩增结果均为阴性，2株斯氏弓形菌的实时荧光PCR扩增曲线见图2和图3。由图可见，上述引物和探针组对斯氏弓形菌具有特异性，因此，上述引物和探针组的特异性强，因此，在此前提下，本发明提供的检测方法非常可靠。实施例3灵敏度实验本实施例主要是对实施例1提供的引物和探针组进行灵敏度实验，具体是：将斯氏弓形菌ATTCC51132的标准DNA溶液2μL，使用核酸蛋白分析仪测量获得DNA溶液浓度为18ng/μL。溶液用去离子水10倍递增分别稀释至浓度1.8ng/μL、180pg/μL、18pg/μL、1.8pg/μL、0.18pg/μL，均取代待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤2。实验结果见图4所示，在图中扩增曲线从左到右依次分别对应浓度为18ng/μL、1.8ng/μL、180pg/μL、18pg/μL、1.8pg/μL的斯氏弓形菌ATTCC51132的标准DNA溶液的扩增曲线，因此，可判断该实时荧光PCR检测对此标准DNA的检测灵敏度高，其检测灵敏度可达3.6pg/反应。将斯氏弓形菌ATTCC51400的标准DNA溶液2μL，使用核酸蛋白分析仪测量获得DNA溶液浓度为24ng/μL。溶液用去离子水10倍递增分别稀释至浓度2.4ng/μL、240pg/μL、24pg/μL、2.4pg/μL、0.24pg/μL，均取代待检模板DNA另外操作实施例一中所述的步骤2。实验结果见图4所示，在图中扩增曲线从左到右依次分别对应浓度为24ng/μL、2.4ng/μL、240pg/μL、24pg/μL、2.4pg/μL的斯氏弓形菌ATTCC51132的标准DNA溶液的扩增曲线，因此，可判断该实时荧光PCR检测对此标准DNA的检测灵敏度高，其检测灵敏度可达4.8pg/反应。根据斯氏弓形菌ATTCC51132和斯氏弓形菌ATTCC51400的标准DNA灵敏度试验可判断本发明的检测方法具有灵敏度高的特点，其检测灵敏度可达pg级/反应。实施例4本实施例主要是对实施例1提供的引物和探针组进行样品污染调查，具体是：所有样品均无菌称取25g至的有滤网的均质袋，加入225mL弓形菌增菌肉汤，拍击式均质器均质2min，将上述滤过液进行置36℃微需氧(5％O2，79.8％N2，7.6％CO2，7.6％H2)增菌24h，按实施例一提取待检样品模板DNA并采用实时荧光PCR法检测。从市场上采购和收集生鲜禽(鸡、鸭)产品共52份，检出了斯氏弓形菌阳性样品2个，阳性率3.8％，表明该检测方法可有效应用于食品样品的斯氏弓形菌的检测。以上实施例表明：本发明提供的实时荧光PCR反应方法结合上述引物和探针组具有以下特点：特异性强、灵敏度高、检测快速可靠、操作简便的特点。SEQUENCELISTING<110>珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心<120>用于检测斯氏弓形菌的荧光PCR引物、试剂盒及检测方法<130><160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1atgctcgtcatcgtagggtt20<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2agcggatttgcctacttaacaac23<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3atcgaggtcacggatggaagtgt23当前第1页1 2 3