一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法与流程

本发明涉及间充质干细胞领域，更具体的，涉及一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法。

背景技术：

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能够自我更新，具有多向分化潜能的祖细胞。在成骨不全、造血功能不全、骨组织的再生等疾病的治疗中，均可分化为相应终端分化细胞。在再生医学治疗领域，以间充质干细胞为基础的细胞治疗方法由于其自我更新和多向分化的潜能，越来越受到人们的青睐。从脐带中也可以分离MSCs很早就已经被J.W.Kim等人证明，带标本中不仅能够分离得到了MSCs，而且也通过成脂诱导，成骨诱导验证了MSCs具有分化潜能，对MSCs的分离及培养是脐带间充质干细胞得以良好应用的重要保证，目前大多数MSCs的分离及培养方法难以实现规模化生产。

中国专利文献公开号CN103421739A公开了一种高效分离脐带间充质干细胞的方法，使用插管分离脐带间充质干细胞以及使用trypLETM消化和无血清培养基培养脐带间充质干细胞的步骤。本发明虽然能够更快的得到完全来自母体的脐带间充质干细胞，而且对细胞的损伤更小，但其培养方式简单，不适合大规模生产，加工效率有限，工业化生产前景局限。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题在于提出一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法，其采用组织块法对胶体进行分离，能够获得数量可观的原代细胞，适合大规模工业化生产。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法，按如下步骤实施：

SOO:胶体分离步骤：从采集瓶内取出脐带，测量所述脐带长度并记录，对所述采集瓶内部的保存液进行支原体检测；将所述脐带移送至无菌培养皿内，对所述脐带进行冲洗及去血渍并将所述脐带裁剪成数段；剔除所述脐带内部的血管及羊膜；从所述脐带中分离出华通氏胶，对所述华通氏胶进行洗涤；

S10：组织块制备步骤：将所述华通氏胶转移至离心管，对所述华通氏胶进行离心处理；对所述离心管内部的洗涤液进行无菌检测，并对所述华通氏胶进行称重；向所述华通氏胶内部加入用于培养脐带充质细胞的专用培养基；将所述华通氏胶剪切成组织块，其与所述专用培养基混合后，形成组织块匀浆；

S20：接种处理步骤：依据所述华通氏胶的重量继续加入适量所述专用培养基，直至所述组织块匀浆的浓度与预设浓度保持一致；采用电动移液器对所述组织块匀浆进行吹打，使其均匀混合；将所述组织块匀浆分成若干份，分别加入若干培养瓶内进行接种，并在若干所述培养瓶内加入所述专用培养基；

S30：原代细胞培养及收获步骤：平置所述培养瓶使得所述组织块匀浆均匀分布于所述培养瓶的底部；将所述培养瓶置于含有二氧化碳且恒温恒湿的培养箱内；对所述培养瓶内部的所述专用培养基进行换液处理；当所述培养瓶内部的细胞克隆团的面积百分比与预设面积百分比一致时，向所述培养瓶内加入消化酶进行消化处理；反复吹打瓶底直至所述细胞克隆团脱离，并将所述细胞克隆团转移至定容离心管内，加入适量的氯化钠注射液并吹打悬浮液，直至所述离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致；对所述定容离心管内部的混合物进行过滤，并将滤液收集至所述定容离心管内；

S40：原代细胞传代步骤：观察装有原代细胞单个所述离心管内部的余下细胞沉淀量，依据所述余下细胞沉淀量合并多个所述离心管的内容物至一个离心管内；加入适量的氯化钠注射液并吹打重悬浮细胞，直至所述离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致。去除所述离心管内部的上清液，在所述离心管内部加入所述专用培养基并吹打重悬浮细胞，在所述离心管内进行定容后依据S30步骤接种至所述培养瓶；

S50：细胞传代步骤：当传代细胞的融合度与预设融合度一致时，向所述培养瓶内加入消化酶进行消化处理；反复吹打瓶底直至所述细胞克隆团脱离，并将所述细胞克隆团转移至定容离心管内，加入适量的氯化钠注射液并吹打悬浮液，直至所述离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致；去除所述离心管内部的上清液，在所述离心管内部加入所述专用培养基并吹打重悬浮细胞，在所述离心管内进行定容后依据S30步骤接种至所述培养瓶。

本发明地进一步技术方案，在SOO步骤中，采用无菌镊子将所述脐带移送至10cm无菌培养皿内，加入5～10ml氯化钠注射液对所述脐带进行冲洗，重复2～3次，接着采用将无菌手术剪将所述脐带裁剪成约2～3cm数段，并加入5～10ml氯化钠注射液洗涤所述脐带上的血凝块，重复洗涤；从所述脐带中分离出华通氏胶，加入5～10ml氯化钠注射液对所述华通氏胶进行洗涤。

本发明地进一步技术方案，在S1O步骤中，将所述华通氏胶转移至50ml离心管，加氯化钠注射液20～30ml轻轻晃动，并离心处理，离心处理参数为840g，5min；向所述华通氏胶内部加入1～2ml专用培养基；采用无菌长柄手术剪将所述华通氏胶剪切成组织块，其与所述专用培养基混合后，形成1～4mm³组织块匀浆。

本发明地进一步技术方案，在S2O步骤中，所述预设浓度为0.4～0.6g/ml；所述培养瓶的型号配置为T75，在T75培养瓶内部加入0.5g华通氏胶体及10ml所述专用培养基。

本发明地进一步技术方案，在S3O步骤中，原代细胞培养5～6天，所述培养瓶内部的所述专用培养基呈浅黄色时，对所述培养瓶内部的所述专用培养基进行全量换液处理；原代细胞培养9～10天，对所述培养瓶内部的所述专用培养基进行半量换液处理。

本发明地进一步技术方案，所述培养箱内部的二氧化碳体积分数为5±0.2％，所述培养箱内部的培养温度为37±0.5℃。

本发明地进一步技术方案，在S4O步骤中，依据所述余下细胞沉淀量合并多个所述离心管的内容物至一个离心管内，离心管定容为30ml；对离心管内部的内容物进行二次离心，离心处理参数为210g，10min，所述培养瓶内部的传代细胞密度为5000～6000个/cm²。

本发明的有益效果为：

本发明提供的脐带间充质干细胞的分离及培养方法，其采用组织块法进行分离，能够获得原代间充质干细胞呈间充质干细胞的特征形态很均一，适合工业化大规模生产，分离华通胶原的平均质量产率分数值为40％左右，每克胶原产出间充质干细胞的平均产率为5.4×10⁶/g，原代细胞的传代密度为5.3×10³/cm²，传代至P2代时每克，胶原的细胞产量的平均值为8.75×10⁸/g，生产效率得到了大幅的提高，为脐带间充质干细胞的分离及培养的推广奠定了良好的基础。

附图说明

图1是本发明具体实施方式提供的脐带间充质干细胞的分离及培养方法的流程图；

图2是本发明具体实施方式提供的脐带间充质干细胞的分离及培养方法的脐带间充质干细胞形态图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

如图1和图2所示，实施例中提供了一种脐带间充质干细胞的分离及培养方法，按如下步骤实施：

SOO步骤:胶体分离步骤：(1)首先，从保存盒中取出采集瓶。然后，从采集瓶内取出脐带，测量脐带长度并将脐带长度进行记录。最后，对采集瓶内部的保存液进行支原体检测。(2)采用无菌镊子将所述脐带移送至10cm无菌培养皿内，加入5～10ml氯化钠注射液对脐带进行冲洗，重复2～3次，去除血渍。接着，采用将无菌手术剪将脐带裁剪成约2～3cm数段，并加入5～10ml氯化钠注射液洗涤所述脐带上的血凝块，重复洗涤，直至洗涤液清澈，血渍基本除净。(3)剔除脐带内部的两条动脉血管、一条静脉血管以及羊膜。(4)从脐带中分离出华通氏胶，具体的，利用长柄锯齿镊将华通氏胶撕下，加入5～10ml氯化钠注射液对华通氏胶进行洗涤。优选的，华通氏胶是位于羊膜与血管之间的白色结缔组织。

S10步骤：组织块制备步骤：(1)洗涤及离心华通氏胶，将华通氏胶转移至50ml离心管，加氯化钠注射液20～30ml轻轻晃动，并离心处理，处理参数为840g，5min。(2)对离心管内部的末次洗涤液进行无菌检测，末次洗涤液也即收集末次洗涤氯化钠注射液，收集末次洗涤氯化钠注射液至少5ml，余下液体去除上清液，对华通氏胶进行称重，并记录华通氏胶的重量。(3)向华通氏胶内部加入1～2ml用于培养脐带充质细胞的专用培养基，采用无菌长柄手术剪将华通氏胶剪切成组织块，其与专用培养基混合后，形成1～4mm³组织块匀浆。

S20步骤：接种处理步骤：依据所述华通氏胶的重量继续加入适量所述专用培养基，直至所述组织块匀浆的浓度与预设浓度保持一致；采用电动移液器对所述组织块匀浆进行吹打，使其均匀混合；将所述组织块匀浆分成若干份，分别加入若干培养瓶内进行接种，并在若干所述培养瓶内加入所述专用培养基；

在S2O步骤中，所述预设浓度为0.4～0.6g/ml；所述培养瓶的型号配置为T75，在T75培养瓶内部加入0.5g华通氏胶体及10ml所述专用培养基。

S30步骤：(1)原代细胞培养步骤：平置培养瓶使得组织块匀浆均匀分布于培养瓶的底部，将培养瓶置于含有二氧化碳且恒温恒湿的培养箱内。培养箱内部的二氧化碳体积分数为5±0.2％，培养箱内部的培养温度为37±0.5℃。对培养瓶内部的专用培养基进行换液处理。具体的，原代细胞培养5～6天，培养瓶内部的专用培养基呈浅黄色时，对培养瓶内部的专用培养基进行全量换液处理。将2～3个培养瓶中的未贴壁的组织块和旧的培养液合并转移到至50ml离心管进行离心处理，处理参数为840g，5min。离心处理产生的残余组织块合并加入至50ml离心管中，并加入10～15ml新鲜地专用培养基，用具有宽口吸头的移液管对离心管内部悬浮液吹打均匀，并将离心管的内容物等量均分到原来的培养瓶后定容至15ml/T75瓶，并放置于培养箱内进行培养。原代细胞培养9～10天，对培养瓶内部的专用培养基进行半量换液处理。稍稍倾斜培养瓶，用具有宽口吸头的移液管轻轻吸掉半量旧的培养液，补足等量新鲜专用培养基，并放置于培养箱内进行培养。(2)原代细胞收获步骤：当培养瓶内部的细胞克隆团的面积百分比与预设面积百分比一致时，优选的，原代培养的第12～14天，细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，即预设面积到达70％～80％时，准备消化处理并进行细胞收获。向培养瓶内加入消化酶进行消化处理，消化酶优选为0.125％Trypsin～0.01％EDTA溶液，EDTA溶液使用前置于20～25℃室温放置15～25min，每75cm²加入2ml消化酶溶液，消化酶溶液的消化时间为1.5～2.5min。加入专用培养基2～3ml反复吹打瓶底直至细胞克隆团大部分脱离，并将细胞克隆团转移至50ml定容离心管内，加入4～5ml氯化钠注射液并吹打悬浮液，直至离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致。采用150目无菌滤网对定容离心管内部的混合物进行过滤，并将滤液收集至定容离心管内，对滤液进行离心洗涤处理，处理参数为210g，10min。

S40步骤：原代细胞传代步骤：观察装有原代细胞单个离心管内部的余下细胞沉淀量，依据余下细胞沉淀量合并多个离心管的内容物至一个离心管内；加入适量的氯化钠注射液并吹打重悬浮细胞，直至离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致，离心管定容至30ml，对重悬浮细胞吹打混匀并取样计数，计数后进行二次离心处理，处理参数为210g，10min。去除离心管内部的上清液，在离心管内部加入专用培养基并吹打重悬浮细胞，在离心管内进行定容后依据S30步骤接种至培养瓶，传代细胞密度为5000～6000个/cm²。接种后放置于培养箱内进行培养。

S50步骤：细胞传代步骤：细胞培养72±2小时(P1～P3代)，当传代细胞的融合度与预设融合度一致时，优选的，当倒置显微镜镜下观察需传代的细胞融合达85％～90％后，将培养瓶从培养箱取出，培养瓶内得旧培养液转移至50ml离心管备用，备用培养液可用于阻止酶消化进程，用4～5ml氯化钠注射液轻轻冲洗细胞培养瓶1～2遍，洗涤后的氯化钠注射液弃去。向培养瓶内加入消化酶进行消化处理，消化酶优选为0.125％Trypsin～0.01％EDTA溶液，EDTA溶液使用前置于20～25℃室温放置15～25min，每75cm²加入2ml消化酶溶液，消化酶溶液的消化时间为1.5～2.5min。加入专用培养基2～3ml反复吹打瓶底直至细胞克隆团大部分脱离，并将细胞克隆团转移至50ml定容离心管内，加入4～5ml氯化钠注射液并吹打悬浮液，直至离心管内部的细胞浓度与预设浓度保持一致。采用150目无菌滤网对定容离心管内部的混合物进行过滤，并将滤液收集至定容离心管内，对滤液进行离心洗涤处理，处理参数为210g，10min。去除所述离心管内部的上清液，在离心管内部加入专用培养基并吹打重悬浮细胞，在离心管内进行定容后依据S30步骤接种至培养瓶。

本发明是通过优选实施例进行描述的，本领域技术人员知悉，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，其他落入本申请的权利要求内的实施例都属于本发明保护的范围。