利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法与流程

本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法。

背景技术：

植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)是指对胚胎或卵子行卵裂球或囊胚滋养层细胞活检，作染色体和(或)基因学检测，再将无遗传性疾病的胚胎植入母体子宫，是一种建立在辅助生育、分子生物学和遗传学基础上衍生出来的一种新的诊断技术。1990年世界上首例经PGD诊断的女婴在英国诞生。此后PGD技术迅速发展，进入20世纪90年代后期，PGD开始普及，目前全世界已报道7693个单基因病的PGD周期。其基本步骤是通过体外受精(in vitro fertilization,IVF)或胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)得到受精卵，经胚胎活检术获取1-2个胚胎卵裂细胞，遗传学分析卵裂细胞后，确定胚胎的遗传组成，选择正常胚胎移植宫内。

PGD技术难点在于检测材料有限而引起的等位基因脱扣率(allele dropout,ADO)的增加，即以单细胞底物诊断单基因缺陷病吋，如在杂合子的单细胞中，两个等位基因之一未被扩增。这是导致PGD误诊的主要原因。1994年Grifo报道了PGD因ADO导致误诊的病例。从而在临床上引起对ADO现象的重视。ADO可以随机作用于两个等位基因中的任何一个。在常染色体显性遗传病中，突变等位基因的ADO可能导致病态胚胎误诊为正常胚胎。ESHRE的指导意见认为ADO率最好小于10％。

目前单基因病PGD(single gene defect PGD，SGD-PGD)多数使用巢式PCR或多重巢式PCR扩增针对突变位点的特异靶向序列扩增，再进行测序或后续的分子生物学分析；或先采用单细胞全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)技术对单细胞DNA进行预扩增，再进行后续的分析，由于WGA产物可进行多次、多位点分析，其逐渐成为SGD-PGD的重要途径。WGA是一种旨在以最小的扩增偏倚(amplification bias)完整均一地扩增整个基因组序列的技术，全基因扩增技术包括以热循环为基础的简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)和不以PCR为基础的使用随机引物恒温扩增的多重置换扩增(multiple displacementamplification,MDA)技术。近年来，Zong等报道了多次退火环状循环扩增(multiple annealing and loopingbased amplification cycles，MALBAC)技术进行全基因组扩增和后续的高通量测序，MALBAC采用了线性扩增而非传统的指数扩增方式，因而能大幅度提高扩增的均一性，是一种可应用于PGD分析较为看好的全基因扩增技术。到目前为止，单细胞基因扩增诊断仍不能完全避免ADO问题，为了减少单细胞PCR中的ADO而造成的误诊，现有实验室开始引入了胚胎植入前遗传学单体型分析(preimplantationgenetic haplotyping，PGH)策略，通过对胚胎的多个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点检测结合家系单体型连锁分析，理论上可以解决单细胞扩增模板中等位基因丢失的问题。高通量测序技术的出现大大加速了PGH的技术革新，利用目标序列捕获芯片结合高通量测序技术快速筛选致病基因突变位点的SNP单体型信息，结合受检胚胎的SNP信息和突变点分析信息，可有效消除单细胞全基因组扩增过程中ADO的影响，提高SGD-PGD的准确率，可以预见基于高通量测序平台的PGH和基因突变点检测相结合的PGD是未来SGD-PGD的发展趋势。

本发明是基于SGD-PGD的方法学和临床应用研究。目前多家生殖中心已采用冻胚和囊胚移植，尽管有研究表明鲜胚和冻胚的移植成功率无明显差异，且囊胚的妊娠率高于分裂期胚胎，但长时间的体外暴露确是ART安全性评估中不可忽略的因素。根据ESHRE对全球SGD-PGD周期的统计，在所有活检胚胎中，90％为分裂期活检，98％以上都为鲜胚移植。鲜胚移植需要在24-48h之内对胚胎的基因型进行准确的判断，这需要检测中心内部具备测序平台或与公司建立快速服务协议，然而实际操作起来有一定难度。

高分辨熔解曲线分析技术(high-resolution melting analysis,HRM)和焦磷酸测序(pyrosequeneing)技术是近年发展起来的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。HRM基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、SNP、甲基化、HLA配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，受到普遍关注。而焦磷酸测序通过核苷酸和模板结合后释放的焦磷酸引发酶级联反应，促使荧光素发光并进行检测。焦磷酸测序是一个理想的遗传分析技术平台，既可进行DNA序列分析，又可进行基于序列分析SNP检测及等位基因频率测定等，该项技术已被广泛应用于医学生物等各个领域。目前，这两项技术在PGD检测中的应用还未见报道，本发明致力于开发这两项技术在SGD-PGD的应用，以求在可控范围内加速PGD结果检出时间。

国内外现状和发展趋势

随着遗传诊断技术的进步和致病基因报告数的上升，确定基因致病位点的家系数量也出现较大的增涨，SGD-PGD的需求呈现持续上升势头，要求进行PGD的单基因病患者已成为临床辅助生育治疗的一个重要人群。

Treff等在Ion Torrent测序平台上进行芯片目标捕获序列和高通量测序，对携带囊性纤维化(cystic fibrosis,CF)，沃克华宝综合征(Walker-Warburg syndrome,WWS)，家族性自律神经失调(familial dysautonomia,FD)，X-连锁低磷性佝偻病(X-linked hypophosphatemicrickets,XHR)或神经纤维瘤病(neurofibromatosis1,NF1)共6对夫妇的胚胎全基因组扩增产物进行了高通量测序，其PGD结果和实验室另两个常规方法的检测结果全部相符。由于二代测序检测在某些存在假基因的单基因病如多囊肾及肾上腺皮质增生的突变检出率较低，SNP单体型连锁分析的错误率较高，因此在应用二代测序简化和加速SGD-PGD过程的同时仍需依赖一代测序的加以验证，本发明的应用正是为了加快PGD检测进程，以实现胚胎卵裂期活检，新鲜周期移植的目的。

近年来随着二代测序技术的蓬勃发展，使得高通量的基因测序技术日臻成熟，逐渐从常规基础科研实验室转入临床医学的应用，尤其在试管婴儿大量出生的时代背景下，如何发挥二代测序的优势做好植入前的基因鉴别的任务成为研究的重点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供利用高分辨熔解曲线分析技术(high-resolution melting analysis,HRM)和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法，旨在解决PGD诊断过程中一代测序分析突变位点和SNP时间长的问题。

本发明是这样实现的，一种利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法，所述利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法包括：

利用高通量测序对单基因遗传病家系进行单体型分析；

建立基于HRM和焦磷酸测序技术以单细胞全基因组扩增产物为模板进行突变检测和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分型的分析方法。

进一步，所述利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法具体包括：

(1)DNA提取：

取5ml外周血，保存于EDTA抗凝管中，充分混匀；

使用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒，完成外周血DNA提取；

样本浓度检测：使用Nano drop2000检测定量，DNA总量不低于3ug，浓度不低于30ng/ul，OD260/280为1.7-2.0；

(2)采用目标序列捕获结合高通量测序，对明确致病的单基因病家系中有生育要求的夫妇及家系中另一位患者(或携带者)外周血DNA样本进行捕获测序和生物信息学SNP分析，获得该对夫妇致病基因连锁单体型信息；

(3)一代测序验证：对高通量测序所检出的可提供信息的SNP位点，在突变位点上下游1M以内分别选择3个～4个位点，设计引物，以获得单体型信息的三位受检者的外周血DNA为模板PCR扩增，测序；

(4)单个淋巴细胞分离：

取5ml外周血(三位进行单体型分析的受检者)，保存于肝素抗凝管中，充分混匀；

取2ml外周血分离单个淋巴细胞；

(5)全基因组扩增

使用REPLI-g Single Cell kit试剂盒，完成单细胞或卵裂球全基因组扩增提取DNA；

样本浓度检测：使用Qubit Fluorometer检测定量，DNA总量不低于2ugM<；

电泳检测：扩增范围在300bp～2000bp，阴性对照无条带；

(6)PGD预实验：以单个淋巴细胞全基因组扩增产物为模板，进行突变检测和SNP分型，测序，计算ADO率；

以单个淋巴细胞全基因组扩增产物为模板，运用HRM进行突变检测和SNP分型；

以单个淋巴细胞全基因组扩增产物为模板，运用焦磷酸测序进行突变检测和SNP分型。

进一步，所述采用目标序列捕获结合高通量测序，对明确致病的单基因病家系中有生育要求的夫妇及家系中另一位患者(或携带者)外周血DNA样本进行生物信息学分析，获得该对夫妇致病基因连锁单体型信息，具体包括：

gDNA片段化，片段末端修复加接头，构建文库；

捕获前对文库进行重排的连接介导PCR方法扩增；

将扩增后的样品与芯片进行杂交；

芯片清洗，去除未结合序列，然后将捕获序列洗脱下来；

对捕获后样品再次进行LM-PCR扩增；

通过qPCR估计目标区域的相对富集倍数，达到质控要求后进行测序前准备；

高通量测序分析。

进一步，HRM基因分型包括：

对样本进行PCR反应，需40min～2h；

通过溶解设备对PCR产物进行热变性并采集数据，热变性时间5min～10min；

通过数据分析软件分析，得出突变或SNP的信息。

进一步，焦磷酸测序基因分型包括：

设计和合成PCR引物，其中之一标记生物素；

PCR反应；

DNA双链的分离，含生物素的单链DNA与测序引物的退火；

对含生物素的单链DNA进行测序；

基于焦磷酸测序的突变检测和SNP分析。

本发明结合二代测序技术对单基因病家系进行准确的PGD检测，为SGD-PGD临床工作的开展提供的新的思路，对杜绝疾病的发生，提高人口质量具有重要的意义。

本发明可以直接应用于临床，为SGD-PGD诊断提供新的更为快速的检测手段。

附图说明

图1是本发明实施例提供的利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的高通量测序单倍型分析方法完成的DMD患者PGD诊断图；

图3是本发明实施例提供的RET基因存在C634Y杂合突变图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法，包括：

利用高通量测序对单基因遗传病家系进行单体型分析；

建立基于HRM和焦磷酸测序技术以单细胞全基因组扩增产物为模板进行突变检测和SNP分型的分析方法；

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的利用HRM和焦磷酸测序在单细胞中进行遗传检测的方法，具体包括：

1、从遗传咨询门诊中收集患有遗传疾病的患者及其家系资料；在进行基因检测之后，签署知情同意，获取夫妻双方及家系中另一患病或携带者外周血。

(1)DNA提取

取成人受检者不低于5ml外周血，保存于EDTA抗凝管中，充分混匀；

使用Qiagen公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒，严格按照试剂盒说明书完成外周血DNA提取；

样本浓度检测：使用Nano drop2000检测定量，DNA总量不低于3ug，浓度不低于30ng/ul，OD260/280为1.7-2.0。

(2)单个淋巴细胞分离

取成人受检者不低于5ml外周血，保存于肝素抗凝管中，充分混匀；

取2ml外周血分离单个淋巴细胞；

(3)全基因组扩增

使用Qiagen公司的REPLI-g Single Cell kit试剂盒，严格按照试剂盒说明书完成单细胞或卵裂球全基因组扩增提取DNA；

样本浓度检测：使用Qubit Fluorometer检测定量，DNA总量不低于2ug；；

电泳检测：主条带清晰，大小10K左右或主带弥散，主要分布于1K以上区域，且清晰可见，阴性对照无条带。

2、采用目标序列捕获结合HiSeq 2500系统高通量测序技术，对家系样本(两种单倍型精子全基因组扩增产物和妻子外周血DNA)进行捕获测序和生物信息学SNP分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息。

基本步骤：

gDNA片段化，片段末端修复加接头，构建文库；

捕获前对文库进行重排的连接介导PCR方法(Ligation-Mediated PCR,LM-PCR)扩增；

将扩增后的样品与芯片进行杂交；

芯片清洗，去除未结合序列，然后将捕获序列洗脱下来；

对捕获后样品再次进行LM-PCR扩增；

通过qPCR估计目标区域的相对富集倍数，达到质控要求后即可进行测序前准备；

高通量测序分析。

3、一代测序验证

对高通量测序所检出的可提供信息的SNP位点，在突变位点上下游1M以内分别选择3-4个位点，设计引物，以获得单体型信息的三位受检者的外周血DNA为模板PCR扩增，测序。

4、HRM基因分型

对样本进行PCR反应，需40min～2h；

通过溶解设备对PCR产物进行热变性并采集数据，需5-10min；

通过专业数据分析软件分析，得出突变或SNP的信息。

5、焦磷酸测序基因分型

设计和合成PCR引物，引物之一标记生物素；

PCR反应；

DNA双链的分离，含生物素的单链DNA与测序引物的退火；

对含生物素的单链DNA进行测序；

基于测序的突变检测和SNP分析。

6、PGD预实验

以单个淋巴细胞全基因组扩增产物为模板，进行突变检测和SNP分型，测序，计算ADO率；

以单个淋巴细胞全基因组扩增产物为模板，运用HRM进行突变检测和SNP分型；

以单个淋巴细胞全基因组扩增产物为模板，运用焦磷酸测序进行突变检测和SNP分型；

摸索HRM和焦磷酸测序实验条件以求达到三种方法的检测结果一致。

8、PGD诊断

使用预实验建立的条件为患者单个卵裂球进行PGD诊断。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明目前已成功实现高通量测序单倍型分析方法在在进行性肌营养不良(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)(图2)、脊髓性肌肉萎缩症(spinal muscular atophy,SMA)、多发性内分泌腺瘤病(图3)、鱼鳞病、血友病以及部分多囊肾患者PGD中的检测。

本发明实验工作将依托本单位生殖中心、中心实验室及教育部生殖遗传实验室。拥有LightCycler480Ⅱ(罗氏LightCycler480荧光定量PCR系统)、Qiagen PyroMark Q24焦磷酸测序仪、system(Qiagen)毛细管电泳系统、罗氏MagNA Pure LC 2.0全自动核酸分离纯化加样系统、BioRad-s1000PCR仪、Bio-Rad凝胶成像分析系统、eppendorf冷冻离心机、MilliQ超纯水机、NanoDrop2000超微量分光光度计以及3.0荧光定量仪等。可以满足从单细胞分离、PCR、HRM及焦磷酸测序所需使用的仪器设备和技术。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。