人工染色体载体的制作方法

本申请是申请号为“200980147845.0”，申请日为2009年11月18日，优先权日为2008年11月28日，发明名称为“人工染色体载体”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及一种在哺乳动物宿主细胞系中生产蛋白质的方法。

哺乳动物细胞系统中的重组蛋白生产是生物技术中的一项重要话题。重组蛋白生产中的一个关键步骤是生成表达高水平的感兴趣蛋白质的细胞系及分离其中超越细胞分裂周期和时间具有稳定表达的单细胞克隆(wurm,f.m.naturebiotechnology22,1393-1398(2004))。需要生成在工业规模上在细胞培养中稳定、安全、可靠且可再现地表达高产量的分泌蛋白的细胞系的方法。特别地，这种需要随着制药工业为治疗而开发和生产的生物制品的量日益增多而日益增强。

通常，这是通过含有启动子、感兴趣基因和选择标志的表达载体随机基因组整合入已建立的生产细胞系的染色体dna中而实现的。

常用的生产细胞系是自哺乳动物或昆虫细胞衍生的。细胞系为永久建立的细胞培养物，给予适宜的新鲜培养基和空间，它就会无限增殖。细胞系与细胞株的区别在于它们规避了海弗利克(hayflick)极限(hayflickl.(1965)."thelimitedinvitrolifetimeofhumandiploidcellstrains."exp.cellres.37(3):614–636)且变得永生化。已建立的生产细胞系的例子有cho、ns0、cos、或sf9细胞，或人细胞系像perc-6和hek293。

对于哺乳动物细胞以及细胞系的遗传工程，通常使用质粒作为载体。质粒为与染色体dna分开的非染色体dna分子，其能够在细菌中独立于染色体dna而复制。在许多情况中，它是环状的及双链的。在正在增殖的哺乳动物细胞中，在随机整合入宿主细胞的基因组中之后，质粒能在宿主细胞中无限维持，而且能经其启动子导致感兴趣基因/产物的生成，通常是蛋白质。

虽然这种遗传工程方法是简单的及直截了当的，但是它缺乏可再现性。自此类载体表达蛋白质受到整合位点周围的染色质的实质性影响，其趋于随时间而使表达沉默(wurm,f.m.naturebiotechnology22,1393-1398(2004))。这使得合适克隆的选择成为一种冗长且费时的规程。

已经开发了数种策略来克服邻近染色质的位置效应。例如，使用载体侧翼的“抗阻抑物”元件，或者将载体特异性整合入具有开放染色质的染色体基因座中(kwaks,t.h.etal.naturebiotechnology21,553-558(2003),huang,y.etal.journalofimmunologicalmethods322,28-39(2007))。

本领域已经使用人工染色体来提供转基因宿主，诸如动物或植物。

wo2002/097059a2记载了经改造而含有位点特异性、重组指导的dna整合的位点的人工染色体，对于改造转基因动物特别有用。

us2008/0060093a1披露了生成经自主微型染色体转化的植物的方法。

morallietal(emboreports2006vol7(9)911-918)披露了人类人工染色体(hac)载体，其作为基因转移系统用于表达和互补研究。

适宜蛋白质表达载体的开发构成真核细胞系中的重组蛋白生产中的一个关键步骤。对于细胞培养中的重组蛋白生产，一般试图使载体展示下述特征：

1)表达应当独立于基因组中的转化位点，

2)表达应当与整合的转基因拷贝数有关，

3)表达应当随时间而维持，及

4)表达水平应当高。

本发明的目标是提供容许生成稳定细胞克隆的方法和载体，以改善真核生产细胞系中的重组蛋白生产。

本发明的主题解决了该目标。

依照本发明，提供了一种在真核细胞系中生产蛋白质的方法，包括下述步骤：

a)提供人工染色体的骨架，

b)将编码所述蛋白质的核酸重组入所述骨架中以生成表达载体，

c)将所述表达载体导入真核宿主细胞系中以获得真核表达细胞系，

d)培养所述表达细胞系以生成所述蛋白质，并

e)分离所述蛋白质。

如此，依照本发明使用的表达细胞系具有基于人工染色体的整合表达载体。

依照本发明使用的细胞系理解为永久建立的细胞培养物，给予适宜的新鲜培养基和空间，它就会无限增殖，如此已经永生化。以下，依照本发明使用的细胞系也称作“宿主细胞系”或“宿主细胞”。

特别地，依照本发明的方法涉及含有外来核酸序列的人工染色体构建物及使用这些构建物离体(exvivo)生产蛋白质像分泌蛋白的方法。

依照本发明人工染色体可以在生产细胞系中用于大规模生产重组蛋白。优选地，人工染色体是自细菌衍生的，像细菌人工染色体，也称作“bac”，例如具有来自f-质粒的元件，或具有来自p1-质粒的元件的人工染色体，其称作“pac”。人工染色体还可具有来自噬菌体的元件，像“粘粒”的情况。另外，优选地，依照本发明使用的人工染色体是自酵母衍生的，像酵母人工染色体，也称作“yac”，及自哺乳动物衍生的，像哺乳动物人工染色体，也称作“mac”，诸如自人类和人类人工染色体衍生的，称作“hac”。

这些人工染色体的共同之处在于它们含有在用于dna复制的各自细胞中超越细胞分裂而复制和保存所需要的复制起点序列。粘粒、bac、和pac具有来自细菌的复制起点，yac具有来自酵母的复制起点，mac具有哺乳动物细胞的复制起点，而hac具有人类细胞的复制起点。另外，依照本发明使用的人工染色体可具有选择标志，通常是抗生素抗性，其容许选择携带人工染色体的细胞。

这些人工染色体为包括自染色体衍生的负责各自生物体中的复制和维持的元件且能够稳定维持大基因组dna片段的载体。这些大基因组dna片段通常在30-50kb(对于粘粒而言)、50-350kb(对于pac和bac而言)、100-3000kb(对于yac而言)、和>1000kb(对于mac和hac而言)的范围中。

依照一个优选的实施方案，依照本发明使用的人工染色体选自下组：bac、yac、pac和粘粒，该组也称作“微生物人工染色体”。微生物人工染色体通常是最多5000kbp的小染色体。优选地，依照本发明的人工染色体的大小为100-350kbp，但是也可以大于350kbp。

依照本发明使用的优选人工染色体骨架为细菌、噬菌体或酵母起源的。这些一起可视为具有非常相似的载体特征但插入dna基因座的容量不同的微生物人工染色体。另外，可使用自bac、粘粒、pac、yac衍生的人工染色体，同样的，那些来自哺乳动物(mac)或人类(hac)的。作为bac骨架，优选依照本发明使用rosa26bac构建物。还有，可使用视为开放染色质的其它基因座，诸如b-肌动蛋白、gapdh、hprt、核糖体蛋白质。

依照本发明使用的人工染色体的别的元件为含有基因座位的大dna片段的元件。这些基因座位是优选的及在人工染色体导入各自真核生产细胞系中之后有功能的。为了表达感兴趣的基因产物，这些基因座位含有调节染色质结构和转录因子可及性的元件和决定转录水平的元件，像增强子和启动子序列。

在人工染色体中，这些上文所述元件中的一些仅仅是正确的dna复制所需要的。这些元件是复制起点和选择标志基因，例如细菌和酵母中的，像抗生素抗性。如此，人工染色体中携带这些元件的部分称作骨架。

人工染色体为大的、基于dna的载体，其已经广泛用于构建dna文库，用于复杂的基因组绘图和分析。bac已经在大规模测序计划中用于对生物体的基因组测序，例如人类基因组计划。作为bac中的插入物扩增生物体的小段dna，然后测序。最后，在计算机上重排测序部分，产生生物体的基因组序列。

bac也已经作为大载体用于生成转基因小鼠(giraldo,p.&montoliu,l.transgenicresearch10,83-103(2001)。在这个例子中，小鼠的原代细胞表达经bac中的各自基因座受到调节的感兴趣基因。

发现人工染色体可用于生成具有改良特性的真核表达细胞系。例如，令人惊讶地证明依照本发明的基于bac的载体可用于转染真核细胞系及以高效方式在细胞培养中在细胞系中表达重组蛋白。依照本发明的一个优选实施方案，依照本发明的基于bac的载体用于生成人igg1的恒定区的片段。直接比较用常规载体或用基于bac的载体生成的大量hek293细胞培养物显示，基于bac的载体令人惊讶地将蛋白质产量提高了10倍。进一步分析包含基于bac的载体的稳定细胞克隆显示，蛋白质生产与整合的bac拷贝数成正比，而且蛋白质生产甚至在30次传代之后仍是稳定的。

依照本发明，一般地，如此有可能提高分泌蛋白和多肽的表达，特别是为了重组蛋白的工业生产，这通常涉及大规模的生产，例如使用至少1升发酵体积，更优选至少5升，甚至更优选使用至少100升发酵培养基进行发酵。优选地，采用使用分批或连续发酵技术的发酵。

分泌蛋白为自真核宿主细胞生成并分泌至其胞外环境的蛋白质或多肽。通常，这得到信号肽的支持，其理解为指导蛋白质的翻译后转运的短(例如长2-100个氨基酸)肽序列。信号肽一般用于生成自生产细胞分泌的蛋白质。这些信号肽通常自成熟的分泌蛋白切除。引导分泌蛋白的信号肽的例子有在人卡帕轻链中找到的“melglswifllailkgvqc”(felgenhauer,m.,kohl,j.andruker,f；nucleotidesequencesofthecdnasencodingthev-regionsofh-andl-chainsofahumanmonoclonalantibodyspecifictohiv-1-gp41；nucleicacidsres.18(16),4927(1990))。信号肽也可称作靶向信号、信号序列、转运肽、或定位信号。

信号肽的氨基酸序列将蛋白质(其在胞质中合成)引导至某些细胞器，诸如核、线粒体基质、内质网、叶绿体、质外体和过氧化物酶体。在表达载体中使用的信号肽通常在蛋白质转运之后被信号肽酶自蛋白质切除。

依照本发明的载体如此基于包括可编码分泌蛋白的基因的人工染色体，优选采用信号肽，例如连同分泌蛋白一起。优选地，在表达和转运入细胞培养物上清液时，自分泌蛋白切除信号肽。

优选地，依照本发明的方法用于提供选自下组的重组蛋白：血清蛋白质，包括免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或衍生物、清蛋白、血液因子、多肽激素、细胞因子、趋化因子、酶和生长因子、及它们的衍生物。

衍生物包括多肽的任何片段、缀合物、融合、核酸或同源物，其源自分泌蛋白或与分泌蛋白相似。

为了生成依照本发明的蛋白质，培养表达细胞系以生成蛋白质，并分离蛋白质。因此，可采用本领域中使用的分离或分开的方法，诸如层析分开方法以定量分离产物。

作为真核宿主细胞，在必要时，使用可提供真核蛋白质糖基化的任何宿主细胞。优选地，使用人类、灵长类、小鼠、仓鼠细胞的哺乳动物或昆虫单细胞或细胞系。优选的例子有hek细胞诸如hek293、cho、cos、ns0细胞、小鼠成了血白细胞细胞、perc6、或sf9细胞。

优选地，通过重组技术，诸如同源重组或盒交换，诸如由整合酶介导的，像φc31整合酶介导的盒交换，将编码所述重组蛋白的核酸与人工染色体骨架基因重组。

优选地，依照本发明的载体稳定整合入宿主细胞的染色体中，优选哺乳动物或昆虫染色体，更优选人类、鼠类或仓鼠起源的染色体，以提供转基因宿主。

依照本发明的转基因细胞系作为单细胞、稳定的单细胞克隆、作为细胞系等等来提供。然而，本发明明确排除转基因人类。优选地，转基因宿主细胞在其染色体的遗传学图内包含载体，通常连同丰富表达的基因或蛋白质(也称作丰富蛋白质)的基因座一起或直接连接在其中。

丰富蛋白质在本文中理解为在mrna和多肽水平由宿主细胞高度表达的蛋白质，例如核糖体蛋白质、细胞骨架蛋白质和用于dna合成的蛋白质，像dna聚合酶。此类丰富蛋白质通常是由宿主细胞高度表达的天然蛋白。使用丰富蛋白质的基因座通常促进人工染色体编码的分泌蛋白在高速率稳定表达。再次，优选基因座是哺乳动物或昆虫起源的。

优选地，一般地，选择的基因座含有开放染色质形成或蛋白质表达的调节元件。特别地，优选采用抗缩合增强子，或是经由作为天然增强子包含在基因座中的元件，或是经由外源、异源或合成的提供表达染色质结构的调节元件。由此，转录因子可到达基因座。

“开放染色质(openchromatin)”或“活性染色质”或“常染色质”区可进行结构改变，导致缩合较少和高度转录的结构。认为常染色质的形成代表染色质介导的基因调节的根本机制，其使得基因处于活性状态，这对于获得为蛋白质表达而设计的基于人工染色体的载体是优选的。

在遗传学和进化比较领域，基因座理解为染色体上可被一种或多种基因占据的固定位置。蛋白质的基因座理解为致力于表达所述蛋白质的至少一部分的基因位置。给定基因座处的dna序列变体称作转基因染色体。对特定基因组已知的基因座的有序列表称作遗传学图。

优选地，依照本发明使用的基因座衍生自生产细胞系的序列。例如，对于哺乳动物宿主，使用哺乳动物蛋白质的基因座，也称作哺乳动物基因座。对于昆虫细胞，优选使用昆虫蛋白质的基因座，也称作昆虫基因座。优选地，依照本发明采用人类或鼠类基因座。例示性的基因座是rosa26或丰富表达和关键基因的基因座，像贝塔-肌动蛋白和其它细胞骨架蛋白质以及核糖体蛋白质。

甚至更优选采用与宿主细胞相同类型或物种的基因座，这提供同种异基因的基因座。例如，将哺乳动物基因座整合入用于哺乳动物宿主细胞生产的载体中，例如，将整合入依照本发明的载体中的人类基因座导入人类细胞系中。优选地，使用这种同种异基因的系统来生产人类蛋白质。进一步优选地，优选将具有小鼠基因座的载体整合入鼠类宿主细胞系中，而优选将具有仓鼠基因座的载体整合入仓鼠宿主细胞系中，而将具有昆虫基因座的载体整合入昆虫细胞系中。

优选地，依照本发明使用的调节元件包括启动子，或是包含在天然基因座中的天然启动子，或是作为异源元件，诸如真核和/或原核启动子，或者甚至可以使用双重启动子。例示性的启动子是通用启动子，优选cmv、caggs、tk(胸苷激酶)、遍在蛋白质c或ef2，它们通常用于转染。在人工启动子之外，可使用天然启动子，像贝塔-肌动蛋白或核糖体蛋白质。优选地，选择强启动子。

已经证明了优选将超过一个拷贝的人工染色体导入宿主细胞中以提高产量，优选至少2个拷贝，更优选至少3个拷贝，更优选至少5或10个拷贝，优选将多至50个拷贝整合入宿主细胞中。然而，采用甚至更高数目，多至500个拷贝的人工染色体可能是有益的，特别是在采用超过一个基因座来表达蛋白质时。基因组中增多的人工染色体整合拷贝数与感兴趣基因升高的表达，及如此各自编码的蛋白质升高的产量成正比。这是与使用敲入策略相比明显的优势，在敲入策略中，将感兴趣基因插入宿主细胞系的一个或两个拷贝的染色体基因座中，不使用人工染色体。

如此，使用依照本发明的人工染色体支持高产量的蛋白质表达。优选地，依照本发明的生产方法提供至少1pg/细胞/天，优选至少3,5,10,30,50高至100pg/细胞/天的产量。通过适当扩增提高所述宿主细胞的密度后，可提高产量。

发现依照本发明的克隆稳定生成蛋白质，甚至在多次传代之后。令人惊讶地显示产量没有显著降低，即降低不超过30％，甚至在第10,20或30代之后，如此证明是稳定的表达系统。

可提供依照本发明的载体作为表达工具，与常规表达单元组合来促进重组蛋白生产，或优选独自作为完整表达单元。如此，优选地，依照本发明的载体包含基因的调节元件以能够在稳定细胞系中随机整合人工染色体，对周围的染色质不产生影响。

在一个具体的实施方案中，依照本发明的载体是作为完整表达单元提供的，其含有所有调节元件来提供稳定蛋白质表达。如此，可将依照本发明的载体导入宿主细胞中，不依赖染色体整合。

发现例如依照本发明的基于bac的载体提供与常规载体相比明显的优势。它提供更高水平的表达，例如至少10倍，而且它受不想要的染色质效应的影响更小，如此简化表达高水平感兴趣蛋白质的单细胞克隆的分离。另外，基于人工染色体的载体可利用内源调节元件，如此避免长期培养中的表达沉默。

使用依照本发明的基于人工染色体的载体，特别是小人工染色体，像微生物人工染色体，例如bac，提供敲入策略的所有优势。另外，那些载体能以高拷贝数整合入宿主基因组中，而敲入载体至多以1或2个拷贝整合。载体的表达与整合拷贝数成比例，如此，基于人工染色体的载体提供比敲入策略要高的表达水平。另外，生成依照本发明的稳定细胞系，特别是使用基于bac的载体，是一种简单的过程，而且比敲入策略耗时要少。如上所述，使用常规载体表达感兴趣基因高度受制于不想要的染色质效应。为了克服这个问题，常规载体的侧翼为短dna序列，称作染色质隔离子。被认为是染色质隔离子的dna元件有一长串，例如基因座控制区、基质附着元件、抗阻抑物元件、遍在染色质元件、边界元件、等(wurm,f.m.naturebiotechnology22,1393-1398(2004))。所有这些元件已经用于常规载体，获得不同的成功率。这些染色质隔离子是在它们的真实基因组背景之外使用的短dna序列，如此不提供真实的染色质环境。

另一方面，依照本发明使用的含有特定基因座(vgrosa26)的基于人工染色体的载体定义为染色质单元。它们含有真实内源基因组背景中指定基因座的大多数(如果不是所有的话)染色质调节元件。如此，依照本发明使用的载体提供比侧翼只有染色质隔离子的常规载体好得多的染色质调节或环境。依照一个优选的实施方案，依照本发明的方法不利用染色质隔离子。

图1a显示了用于蛋白质生产的构建物的示意图。caggsfc是一种常规表达载体，其含有caggs启动子、信号肽、接着的igg1基因fc区、ires-eyfp-sv40polya报告元件和pgk新霉素盒。rosa26^baccaggsfc构建物是通过将caggsfc载体重组入含有rosa26基因座的bac而生成的。将caggsfc载体置入rosa26基因座反义转录物的外显子2中，其具有100kb上游和下游序列。

图1b显示了常规载体和基于bac的载体之间蛋白质生产效率的比较。分析了用caggsfc和rosa26^baccaggsfc载体生成的hek293大量培养物(细胞集合)中的fc产量。caggsfc载体给出0.5pg/细胞/天的产量，而基于bac的载体给出5.7pg/细胞/天的产量。测量是一式三份实施的。误差棒指示标准偏差。

图1c显示了蛋白质生成和整合bac转基因拷贝之间的之间的关联。对12个单克隆的分析显示了rosa26^baccaggsfc载体1至55的拷贝数范围及5.5至30pg/细胞/天的fc产量。蛋白质生成与bac转基因拷贝数成正比。

图1d显示了蛋白质生成在培养传代期间得到稳定维持。fc蛋白质的产量是在自rosa26^baccaggsfc培养物分离的6个亚克隆中在第1代和第30代时测量的。没有发现明显差异。误差棒指示标准偏差。

通过下述实施例来进一步描述本发明。

实施例1：人类fc的表达

为了测试bac生产重组蛋白的效率，我们生成了两种表达载体：caggsfc载体，其由caggs启动子(niwa,h.,yamamura,k.&miyazaki,j..gene108,193-199(1991))、信号肽、接着的作为感兴趣基因的人类igg1fc片段(即铰链、ch2和ch3)(fc)、ires/eyfp报告物和pgk-新霉素盒组成。第二种载体，rosa26^baccaggsfc，由caggsfc载体重组入含有rosa26基因座的bac骨架中组成(图1a)。

用caggsfc和rosa26^baccaggsfc载体转染hek293细胞。g418选择14天后，建立了caggsfc和rosa26^baccaggsfc的两份大量培养物(细胞集合)。对上清液中fc蛋白质生成的分析显示了caggsfc和rosa26^baccaggsfc大量(细胞集合)培养物的产量分别为0.5和5.7pg/细胞/天(图1b)，证明了使用基于bac的载体显著提高蛋白质生成。

接着，我们分析了转基因拷贝数和fc蛋白质产量之间的关联。自rosa26^baccaggsfc培养物建立了12个亚克隆，它们含有1至55个拷贝的转基因。这些培养物的上清液中的蛋白质产量与转基因拷贝数有关，而且范围为5.5至30pg/细胞/天(图1c)。bac载体拷贝数和蛋白质生成之间的相关系数r²为0.88。这提示在使用基于bac的表达载体时，蛋白质生成与整合转基因拷贝数成比例。

最后，我们调查了随时间和渐增的传代数的长期蛋白质生成。将来自rosa26^baccaggsfc培养物的6个亚克隆培养30代，并分析蛋白质生成。自第1代至第30代，fc蛋白质产量没有显著降低(图1d)，指示基于bac的载体提供随时间稳定的重组蛋白生成。

在这项工作中，我们使用含有rosa26基因座的bac来遮蔽(shield)表达单元(caggsfc)。凭借这种办法，我们显示了对于重组蛋白生成，基于bac的载体产生比常规载体要好的结果。为了重组蛋白生成，基于bac的载体的进一步改良可包括使用在生产细胞中高度有活性的内源/天然启动子。例如，对hek293细胞的转录概况分析鉴定了强表达水平的rpl23a基因，其编码一种核糖体蛋白质。因此，在hek293细胞中使用含有rpl23a基因座的bac可进一步提高重组蛋白生成。

材料和方法

质粒和细胞培养

caggsfc表达载体是通过常规克隆方法装配的，而且侧翼为两个attb位点(phic31整合酶识别位点)。rosa26^baccaggsfcbac载体是如先前所述生成的(blaas,l.,musteanu,m.,zenz,r.,eferl,r.&casanova,e.biotechniques43,659-660,662,664(2007))。简言之，使用phic311介导的盒交换，将caggsfc载体重组入含有rosa26基因座的bac中，进入rosa26反义转录物的外显子2。

为了建立大量培养物，将24μgcaggsfc和rosa26^baccaggsfcbac载体用noti线性化，并使用lipofectamine2000(invitrogen)转染入hek293中。转染后2天，将g418(800μg/ml)添加至培养基(dmem高葡萄糖，10％fcs，补充有谷氨酰胺、丙酮酸盐和非必需氨基酸)。在14天里进行选择。此后，在g418缺失下培养培养物，并在1周后测量大量培养物中的fc蛋白质生成。

可使用层析方法来分离fc蛋白质。

fc蛋白质测定

将5x10⁵个细胞在2ml培养基中接种入6孔板的每一个单孔。接种后72小时，使用elisa测定法测量上清液中的fc蛋白质浓度。为了elisa，将山羊抗人类igg(fc特异性的)f(ab′)2片段(sigmai-3391)以1μg/ml吸附到maxisorp板的微孔上，于4℃过夜，接着用含5％bsa的pbs于25℃封闭1小时。清洗后，分别以稀释系列将样品和标准品添加至经封闭的微孔并于25℃温育1小时。清洗板并用在pbs/bsa中1:70000稀释的蛋白a–hrp(sigmap-8651)检测结合的fc，接着用tmb底物溶液(sigmat0446)染色。于450nm测量elisa，参照波长630nm。

rosa26^baccaggsfc拷贝数分析

使用eyfpfacs分选自rosa26^baccaggsfc培养物建立稳定亚克隆。单细胞克隆中的转基因拷贝数通过实时pcr来定量，基因组dna作为模板。用寡聚物rosaf5′tcttgtccttttacctcccttgta(seqidno.1)和rosar5′gaacatattcaaaacaccaggattt(seqidno.2)来扩增rosa26bac。这些寡聚物识别bac和内源rosa26基因座。用寡聚物actinf5′tcatgtttgagaccttcaacacc(seqidno.3)和actinr5′gatcttcatgaggtagtcagtcaggt(seqidno.4)来扩增贝塔-肌动蛋白基因座作为内部对照。

序列表

<110>奥地利经济服务有限责任公司(austriawirtschaftsservicegesellschaftmbh)

bauer,anton

<120>人工染色体载体

<130>ab001p

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>扩增寡"rosaf"

<400>1

tcttgtccttttacctcccttgta24

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>扩增寡"rosar"

<400>2

gaacatattcaaaacaccaggattt25

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>扩增寡"actinf"

<400>3

tcatgtttgagaccttcaacacc23

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>扩增寡"actinr"

<400>4

gatcttcatgaggtagtcagtcaggt26