本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于目的基因干扰的rna片段及其应用。
背景技术：
基因沉默是真核生物调控内源基因表达和防御外源核酸入侵的一种重要机制。自20世纪90年代初期被发现以来，基因沉默迅速成为生物学领域的研究热点。2001年，基因沉默被《science》杂志评为十大科学进展之一。人工mirna(artificialmicrorna，amirna)是一种高效的基因沉默技术，利用天然mirna的生成和作用原理，人工设计以一个或多个特定基因为靶标的小rna分子，构建表达载体后遗传转化导入植物体内，高效特异的抑制靶标基因的表达。amirna与靶基因mrna一般完全互补或接近完全互补。主要作用方式是剪切靶基因mrna，促使mrna被降解。在剪切过程中，amirna5’端的2-8位碱基是与靶mrna互补的核心元件，第10-11位核苷酸碱基配对的靶mrna的orf区是剪切位点。剪切后，amirna会继续识别并剪切其它靶基因。
amirna技术以植物天然mirna的前体为基本骨架，将其茎环结构中的mirna/mirna*序列替换为amirna/amirna*序列，对目标基因进行沉默。因此，amirna技术在调控基因表达方面具有特异性和高效性。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种用于干扰目的基因的rna。
本发明提供的rna，为将mir160前体序列中的mir160序列替换为干扰目的基因rna片段甲，且将所述mir160前体序列中的mir160序列的反向互补序列替换为干扰目的基因rna片段甲的反向互补序列，得到rna。
上述rna中，所述mir160前体序列源自拟南芥或棉花。
上述rna(amirna-gus)中，所述目的基因为gus。
上述rna中，所述干扰目的基因rna片段甲的核苷酸序列为序列1第280-300位或序列3的296-316位；
或所述干扰目的基因rna片段甲的反向互补序列的核苷酸序列为序列1第338-358位或序列3第354-374位；
或所述mir160前体的核苷酸序列为序列5或序列6；
或所述mir160序列的核苷酸序列为序列5第280-300位或序列6第296-316位；
或所述mir160序列的反向互补序列的核苷酸序列为序列5第338-358位或序列6第354-374位。
上述rna中，所述用于干扰目的基因的rna的核苷酸序列为序列表中序列1或序列3。
编码上述的rna的dna分子也是本发明保护的范围；
或含有所述dna的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞或重组病毒也是本发明保护的范围。
本发明另一个目的是提供干扰gus基因表达的rna片段甲。
本发明提供的干扰gus基因表达的rna片段甲，其核苷酸序列为序列1第280-300位或序列3的296-316位。
编码上述的rna片段甲的dna分子甲也是本发明保护的范围；
或含有所述dna分子甲的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞或重组病毒也是本发明保护的范围。
上述的rna或上述的dna分子或表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞或重组病毒在干扰目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的rna或上述的dna分子或含有所述dna分子表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞或重组病毒在干扰植物中目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的rna片段甲或上述的dna分子甲或含有所述dna分子甲的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞或重组病毒在干扰gus基因表达中的应用也是本发明保护的范围；
或上述的rna片段甲或上述的dna分子甲或含有所述dna分子甲的表达盒、重组载体、重组菌、转基因细胞或重组病毒在干扰植物中gus基因表达中的应用也是本发明保护的范围。
上述中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；或所述双子叶植物为拟南芥和棉花。
本发明的实验证明，本发明将沉默gus基因表达的干扰片段替换mir160前体序列中的mir160序列得到amirna-gus；将其导入植物中，利用gus染色，通过肉眼观察，验证了amirna-gus载体的有效性，该方法简单有效。
附图说明
图1为mirna碱基序列分布的特点。
图2为用于干扰gus基因表达的amirna序列amirna-gus。
图3为atmir160-gus的pcr产物；
m：λ-hindiiidnamarker；1：atmir160-guspcr产物；
m2：dl2,000dnamarker；2：ghmir160-guspcr产物。
图4为vectordna的制备；
m1：λ-hindiiidigest；1：pbi121-clai
m2：λ-hindiiidigest；2：ghmir160-gusvectordna
图5为转基因植株表型。
图6为转基因植株gus染色。
图7为atmir160-gus测序酶切图。
图8为ghmir160-gus测序酶切图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、干扰目的基因的rna的制备
一、统计mirna序列的特点
mirna的长度一般为21-23nt，成熟的mirna5’端有一个磷酸基团，3’端为羟基且通常被甲基化。对已经发现且报道的拟南芥mirna序列(mirbase数据库，http://www.mirbase.org/index.shtml)统计后分析发现(图1)：(1)第1个碱基位较为保守，第1个碱基是u的序列占总数的56.44％，而是c的序列占总数的8.66％，(2)第9个碱基是g的序列占总数的33.49％，(3)第10个碱基是a的序列占总数的35.60％，(4)第15个碱基是t的序列占总数的30.91％(5)其他位置碱基几乎是随机出现。因此，根据以上序列特点设计人工mirna(amirna)序列可提高成功率。
二、设计沉默gus基因表达的干扰片段
mirna作为基因表达中的一类负调控子，主要在转录后水平上通过介导目标mrna的剪切来调节植物基因的表达。在mirna剪切靶mrna过程中，mirna5’端的2-8位碱基是与靶mrna互补的核心元件，第10-11位核苷酸残基配对的靶mrna的orf区是mirna的剪切位点。剪切后，mirna会继续识别并剪切其他靶基因。
根据mirna以上序列特点以及作用机制，设计了用于干扰gus基因表达dna甲(图2)：taaacggtgatacgtacgctt(序列2第280-300位)，其表达用于干扰gus基因表达的rna片段甲，uaaacggugauacguacgcuu(序列1第280-300位)
三、设计并合成用于干扰gus基因表达的amirna序列
大部分mirna序列保守性较高，广泛存在于多种植物中。在小rna数据库mirbasedatabase(release21)中共有145个mir160序列，存在于39个植物物种中。在拟南芥中有3个mir160，在棉花中有6个mir160。利用mir160前体序列作为人工mirna的前体骨架，在ncbi中提取拟南芥和棉花mir160前体序列。
源于拟南芥的用于干扰gus基因表达的amirna：
将拟南芥mir160a前体序列(序列5)中的mir160序列替换为上述二制备的用于干扰gus基因表达的rna片段甲，且将拟南芥mir160a前体序列中的mir160反向互补序列替换为rna片段甲的反向互补序列，得到的rna命名为atmir160-gus，即为用于干扰gus基因表达的amirna，命名为atmir160-gus；atmir160-gus的核苷酸序列为序列1，其中序列1第1-279位为拟南芥mir160a前体序列中的mir160序列上游部分，序列1第280-300位为用于干扰gus基因表达的rna片段甲；序列1第301-337位为拟南芥mir160a前体序列中的中间部分；序列1第338-358为rna片段甲的反向互补序列，序列1第359-497位为拟南芥mir160a前体序列中的mir160序列下游部分。
atmir160-gus的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2，其中，序列2第1-279位为拟南芥mir160a前体序列中的mir160序列上游部分编码序列，序列2第280-300位为用于干扰gus基因表达的dna甲；序列2第301-337位为拟南芥mir160a前体序列中的中间部分；序列2第338-358为dna甲的反向互补序列，序列2第359-497位为拟南芥mir160a前体序列中的mir160序列下游部分编码序列。
源于棉花的用于干扰gus基因表达的amirna：
将棉花mir160a前体序列(序列6)中的mir160序列替换为上述二制备的用于干扰gus基因表达的rna片段甲，且将棉花mir160a前体序列中的mir160反向互补序列替换为rna片段甲的反向互补序列，得到的rna命名为ghmir160-gus，即为用于干扰gus基因表达的amirna，命名为ghmir160-gus；ghmir160-gus的核苷酸序列为序列3，其中序列3第1-295位为棉花mir160a前体序列中的mir160序列上游部分，序列3第296-316位为用于干扰gus基因表达的rna片段甲；序列3第317-353位为棉花mir160a前体序列中的中间部分；序列3第354-374为rna片段甲的反向互补序列，序列3第375-557位为棉花mir160a前体序列中的mir160序列下游部分。
ghmir160-gus的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4，其中，序列4第1-295位为棉花mir160a前体序列中的mir160序列上游部分编码序列，序列4第296-316位为用于干扰gus基因表达的dna甲；序列4第317-353位为棉花mir160a前体序列中的中间部分；序列4第354-374为rna片段甲的反向互补序列，序列4第375-557位为棉花mir160a前体序列中的mir160序列下游部分编码序列。
四、用于干扰gus基因表达的amirna序列的应用
1、中间载体的制备
(1)dna片段的制作：根据dna片段atmir160-gus(序列2第1-497位)和dna片段ghmir160-gus序列(序列4第1-557位)，分别合成单链小片段dna，再通过pcr方法，把单链小片段dna拼接成一条完整的双链dna片段。
(2)连接反应：
在microtube管中配制下列表1的反应液。
表1为反应液
*dnaligationkit的组份(takaracodeno.6022)。
(3)16℃保温30分钟。
连接液全量转化至e.colicompetentcelljm109(takaracodeno.9052)。
(4)阳性克隆检测及质粒dna的提取
分别对平板上的菌落用pcr检测所含质粒中插入片段的长度大小。然后分别对菌落进行质粒dna提取，并进行dna序列测定。
ph-atmir160-gus质粒为将序列2第1-497位核苷酸所示的atmir160-gus的编码基因插入phannibal载体(takara)中得到的载体。
t-ghmir160-gus质粒为将序列4第1-557位核苷酸所示的ghmir160-gus的编码基因插入t-vectorpmdtm19(simple)载体(takaracodeno.3271)中得到的载体。
图7为atmir160-gus测序酶切图。图8为ghmir160-gus测序酶切图。
2、干扰载体的制备
以ph-atmir160-gus质粒为模板，pcr扩增(引物如下表2)noti酶切位点之间的序列2644bp(atmir160-gusinsertdna)，in-fusion克隆至经clai酶切处理的pbi121(穆敏等，酵母耐盐相关基因hal1在棉花中的功能表达,中国农业科学2016年14期，实验室保存)表达载体中，挑选阳性克隆质粒测序，生成pbi121-atmir160-gus。
以t-ghmir160-gus质粒为模板，pcr扩增(引物如下表2)noti酶切位点之间的序列569bp(ghmir160-gusinsertdna)，in-fusion克隆至经xhoi/clai酶切处理的pbi121(同上)表达载体中，挑选阳性克隆质粒测序，生成pbi121-ghmir160-gus。
具体如下：
a.insertdna的制备
(1)引物设计和合成
表2
(2)pcr扩增
使用
反应体系：
使用tks
反应体系：
取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示:
使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0(codeno.9762)切胶回收目的片段atmir160-gusinsertdna和目的片段ghmir160-gusinsertdna。
b、vectordna的制备
(1)酶切反应
反应体系:
反应条件:37℃4hours
取5ul进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0切胶回收载体片段，即为vectordna(图4)。
c.测序分析
使用
上述连接体系及条件如下:
将连接产物取1ul热转化至e.colicompetentcelljm109(codeno.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，提取质粒。
使用引物atvp1、atvp2、atp1、atp2、atp4对质粒pbi121-atmir160-gus测序，该质粒为将序列2第1-497位核苷酸所示的atmir160-gus的编码基因插入pbi121的clai酶切位点得到的载体。
使用引物ghp1、atp2对质粒pbi121-ghmir160-gus测序，该质粒为将序列4第1-557位核苷酸所示的ghmir160-gus的编码基因插入pbi121的xhoi/cla酶切位点得到的载体。
测序引物序列如下表3：
表3
3、重组农杆菌的制备
将质粒pbi121-atmir160-gus转入根癌农杆菌eha105(刘娜等，棉花hsp70基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究，中国农学通报2015,31(31):194-198)，得到重组菌pbi121-atmir160-gus；
将质粒pbi121-ghmir160-gus转入根癌农杆菌eha105(刘娜等，棉花hsp70基因植物表达载体的构建及转化烟草的研究，中国农学通报2015,31(31):194-198)，得到重组菌pbi121-ghmir160-gus。
4、转化拟南芥
1)、转化植株培养
(1)种子萌发和种植：无菌消毒后的拟南芥哥伦比亚野生型(陈锦华等，atcs82基因t–dna插入突变体筛选和过表达转基因植株的获得，湖南农业大学学报，第39卷第3期)种子播种于培养基上培养，然后将幼苗移栽到营养钵中。播种后的种子在短日照条件下培养后，转入长日照条件下诱导开花。浸染前，剪去已经形成的角果，得到待转化拟南芥。
(2)转化流程
选择生长状态良好的植株待转化拟南芥，将植株倒转使花薹部分完全浸没在重组菌pbi121-atmir160-gus或pbi121-ghmir160-gus菌液中，期间轻轻晃动植株。移出植株，植株倒置或侧翻除去表面流动的菌液。将植株移入培养室，正常生长。收集成熟的种子，得到转atmir160-gus和ghmir160-gus拟南芥种子。
(3)转化种子筛选
准备种子筛选所用的平板，含有羧苄青霉素和适当的抗生素。取一半的种子用于筛选。先用酒精处理，再用次氯酸钠处理，用无菌水清洗。将经过表面消毒的种子平铺在筛选培养基上培养。能够正常生长出子叶、真叶和根的绿色植株即为阳性植株。抗生素条件下，只有阳性植株才能长出真叶。将生长出真叶的植株转移到新鲜的筛选培养基上，继续培养1-2周，以确定它们是真的阳性植株。将筛选得到的阳性植株转移到营养钵中，继续培养至收获，得到转atmir160-gus拟南芥和转ghmir160-gus拟南芥(图5)。
(4)pcr检测验证
提取转atmir160-gus拟南芥和转ghmir160-gus拟南芥的基因组dna，用pcr检测npuii验证转基因阳性植株。扩增片段长度500bp。
npuⅱf1：cguugucacugaagcgggaagg
npuⅱr1：gagcggcgauaccguaaagcac
得到500bp扩增大小的为阳性转atmir160-gus拟南芥和阳性转ghmir160-gus拟南芥。
将空载体pbi121采用同样的方法转入拟南芥中，得到转空载体拟南芥。
5、转基因植株的gus染色验证gus基因是否被干扰表达
取2ml离心管，倒入1.5ml强染色性gus染色液(北京奥博莱，#s102)，用镊子挑取形态长势一致的阳性转atmir160-gus拟南芥植株、阳性转ghmir160-gus拟南芥植株、转空载体拟南芥植株，无菌水冲洗杂质，而后浸没在染色液中，37℃保温8h，转入70％乙醇中脱色2-3次。吸水纸吸干多余液体后观察染色情况。
结果如图6所示，经强染色性gus染色液染色，转空载体拟南芥能被染成蓝色；阳性转atmir160-gus拟南芥植株和阳性转ghmir160-gus拟南芥均未能被染色，说明gus基因由于atmir160-gus或ghmir166-gus干扰不能正常表达。
对比例：
1、构建ghmir166-gus序列
ghmir166-gus序列如序列8所示，ghmir166-gus序列为将棉花的mir166a前体序列中的mir166序列替换为用于干扰gus基因表达的rna乙(uuaaucaggaacuguucgccg)，且将棉花mir166a前体序列中的mir166反向互补序列替换为rna乙的反向互补序列，得到的rna命名为ghmir166-gus，即为用于干扰gus基因表达的amirna，命名为ghmir166-gus；ghmir166-gus的核苷酸序列为序列8，其中序列8第1-227位为棉花mir166a前体序列中的mir166序列上游部分，序列8第228-247为rna片段甲的反向互补序列，序列8第248-337位为棉花mir166a前体序列中的中间部分；序列8第338-358位为用于干扰gus基因表达的rna片段甲；序列8第359-509位为棉花mir166a前体序列中的mir166序列下游部分。
ghmir166-gus的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列7，其中，序列7第1-227位为棉花mir166a前体序列中的mir166序列上游部分编码序列，序列7第228-247为rna片段甲的反向互补序列，序列7第248-337位为棉花mir166a前体序列中的中间部分；序列7第338-358位为用于干扰gus基因表达的dna乙；序列7第359-509位为棉花mir166a前体序列中的mir166序列下游部分编码序列。
2、重组载体pbi121-ghmir166-gus质粒为将序列7所示的ghmir166-gus的编码基因插入pbi121的xhoi/cla酶切位点得到的载体。
3、转化
按照实施例1的四中的3-4的方法，得到阳性转ghmir166-gus拟南芥；
4、gus染色
按照实施例1的四中的5的方法，将阳性转ghmir166-gus拟南芥染色，结果如图6所示，阳性转ghmir166-gus拟南芥能被染成蓝色，表明，gus基因的表达不受ghmir166-gus影响。因此，并非所有的mirna和所有的干扰gus的片段均能实现本发明所需的amirna。
序列表
<110>中国农业科学院棉花研究所
<120>一种用于目的基因干扰的rna片段及其应用
<160>8
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>497
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
ggcuucaagaacaguaaccccaauuccuccacaagagggagagaaaacaaaagaucuucc60
aauuccauucucguacaugcaaaucacaauccaugccauagauuguuucuauuccuccuu120
auuuauugcuuguaucuguucaugcauggaccagguggagagagcauuacuuaaaaauag180
aauuagcuaucuguuuuaggcgaacuaguuuccuuacauaaccauguauaugucaugacg240
cauauacauauguagauguguauauguauuauauauguauaaacggugauacguacgcuu300
uaugcugagcccaucgaguaucgaugaccuccguggaaagcguacguaucaccguuuaua360
uccucauacauauauaauuauguuuugguaccaauugaauuguguugaugagcuuguuuu420
guagaagucucuguucauugccucaucauguguagaagagauuagagguaccucacgaau480
ccaucauaugcuuuuuu497
<210>2
<211>497
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
ggcttcaagaacagtaaccccaattcctccacaagagggagagaaaacaaaagatcttcc60
aattccattctcgtacatgcaaatcacaatccatgccatagattgtttctattcctcctt120
atttattgcttgtatctgttcatgcatggaccaggtggagagagcattacttaaaaatag180
aattagctatctgttttaggcgaactagtttccttacataaccatgtatatgtcatgacg240
catatacatatgtagatgtgtatatgtattatatatgtataaacggtgatacgtacgctt300
tatgctgagcccatcgagtatcgatgacctccgtggaaagcgtacgtatcaccgtttata360
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gtagaagtctctgttcattgcctcatcatgtgtagaagagattagaggtacctcacgaat480
ccatcatatgctttttt497
<210>3
<211>557
<212>rna
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
guuuuguuugagcugaacauccucucgucuuugcccaaacuuucuucuuugcuuguuuug60
ugccaaaucaaaggaacccagcuuuuucuuuugccacucagaucuucacaaguauacgcg120
cuuugccugugccuguaaauaugagcuuggccugugcaaagggauugaagaagaugauga180
gaugaugaucaucgucuaaaagcauugcacuucccaugcauuuccucauucgcggcauga240
uaccauaacaauaugcgcacgcacacaucaucaucauggcacacauauauguauauaaac300
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cccccccccaacccacc557
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<211>557
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<213>人工序列
<220>
<223>
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tatatgagaatctcaaggtatttcatcttcttatttaatcttaatatctctttctatgcc540
cccccccccaacccacc557
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<220>
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uccucauacauauauaauuauguuuugguaccaauugaauuguguugaugagcuuguuuu420
guagaagucucuguucauugccucaucauguguagaagagauuagagguaccucacgaau480
ccaucauaugcuuuuuu497
<210>6
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<220>
<223>
<400>6
guuuuguuugagcugaacauccucucgucuuugcccaaacuuucuucuuugcuuguuuug60
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cuuugccugugccuguaaauaugagcuuggccugugcaaagggauugaagaagaugauga180
gaugaugaucaucgucuaaaagcauugcacuucccaugcauuuccucauucgcggcauga240
uaccauaacaauaugcgcacgcacacaucaucaucauggcacacauauauguauaugccu300
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uuuuuuaccucuacuauauaugagaaucucaagguauuucaucuucuuauuuaaucuuaa540
uaucucuuucuaugcccccccccccaacccacc573
<210>7
<211>509
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<220>
<223>
<400>7
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cgcucgaguuuuaguuccgcacuucaauucuaucacucaccuaugccauuguuaaucuuc180
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