一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组及其应用的制作方法

文档序号:12697668阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的SSR标记引物组,SSR标记引物组共四组,每组包括4对引物;第一组的四对SSR标记引物分别为,标记Rops04的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示;标记RP106的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示;标记Rops09的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;标记RP150的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;

第二组的四对SSR标记引物分别为,标记RP035的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示;标记RP109的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示;标记RP200的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示;标记RP032的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示;

第三组的四对SSR标记引物分别为,标记Rops02的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示;标记Rops06的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示;标记Rops08的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示;标记RP206的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示;

第四组的四对SSR标记引物分别为,标记Rops05的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示;标记Rops10的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示;标记RP165的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示;标记RP01B的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示,下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

2.如权利要求1所述的SSR标记引物组,其特征在于,所述标记Rops04的上游引物、标记RP150的上游引物、标记RP200的上游引物、标记RP032的上游引物、标记Rops06的上游引物、标记RP206的上游引物、标记Rops05的上游引物、标记Rops10的上游引物的5’端连接有荧光标签FAM;

所述标记RP106的上游引物、标记RP109的上游引物、标记Rops08的上游引物、标记RP01B的上游引物的上游引物的5’端连接有荧光标签HEX;

所述标记Rops09的上游引物、标记RP035的上游引物、标记Rops02的上游引物、标记RP165的上游引物的5’端连接有荧光标签TAM。

3.一种利用上述SSR标记引物组鉴别刺槐种质资源亲缘关系的方法,包括如下步骤:

(1)取待鉴别样品,提取总DNA;

(2)以步骤(1)制得的总DNA为模板,分别用上述鉴别刺槐种质资源亲缘关系的四组SSR标记引物进行PCR扩增,制得PCR扩增产物;

(3)对步骤(2)制得的PCR扩增产物进行分析,当扩增出SSR标记时,用1表示,当未扩增出SSR标记时,用0表示,将每对SSR标记扩增后的结果转换为矩阵,用非加权算术平均聚类方法(UPGMA)分析计算遗传距离,得出刺槐种质资源亲缘关系。

4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,样品为叶片或枝条。

5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,总DNA的提取方法采用改良的CTAB法。

6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,PCR扩增体系如下,总体积为10μL:

4μLTakara Multi-plex PCR Master Mix,浓度为10μM的4条上游引物每条各0.2μL,浓度为10μM的4条下游引物每条各0.2μL,10~30ng/μL模板1μL,加3.4μL ddH2O补足至反应总体积。

7.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中,PCR扩增程序如下:

94℃预变性15min;94℃变性30s,55℃退火90s,72℃延伸60s,共28个循环;60℃终延伸30min,4℃终止反应。

8.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中的分析为:将步骤(2)的PCR扩增产物经电泳后进行测序;然后用软件GeneMarker ver.2.4.0统计每个个体16对SSR标记所有等位基因的长度,并与标准进行对照,当长度在标准范围内时,为有效扩增出SSR标记,当长度在标准范围外时,为未扩增出SSR标记;所述的标准范围如下:

标记Rops04的标准范围为105~110bp;

标记RP106的标准范围为143~154bp;

标记Rops09的标准范围为89~150bp;

标记RP150的标准范围为199~217bp;

标记RP035的标准范围为89~112bp;

标记RP109的标准范围为136~160bp;

标记RP200的标准范围为160~198bp;

标记RP032的标准范围为109~135bp;

标记Rops02的标准范围为107~138bp;

标记Rops06的标准范围为117~144bp;

标记Rops08的标准范围为191~205bp;

标记RP206的标准范围为222~246bp;

标记Rops05的标准范围为120~138bp;

标记Rops10的标准范围为182~187bp;

标记RP165的标准范围为146~159bp;

标记RP01B的标准范围为172~192bp。

9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述电泳为采用ABI 3730xl测序仪进行。

10.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中用非加权算术平均聚类方法计算遗传距离采用NTSYSpc-2.11F软件。

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