本发明属于植物保护和生物技术领域，尤其涉及一种弱酸/碱处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株抑制其侵染水稻SA途径相关基因上调的方法。
背景技术：
随着对全球气候变化对农业生产影响的越来越多关注，许多研究集中在各种气候变化对植物病害流行的影响，以及气候改变植物病原菌与寄主互作的特定机制方面。植物病害的出现源于感病寄主植物、病原菌以及适于病害发展的环境条件三者间的互作，这就是已知的病害三角。环境条件的改变加重了植物病害发病症状，且与44％的新病害流行有关。环境条件的改变能对病原菌及寄主植物产生直接影响。
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)因其对水稻产量和品质造成严重危害而被认为是影响水稻生产最为严重的子囊菌亚门真菌之一。正常条件下，落在寄主植物表面的分生孢子开始发芽，很快分化出芽管形成特化的侵染细胞即附着胞，稻瘟病菌株利用高度特化的侵染结构——附着胞穿透寄主植物。成功穿透寄主后，侵染菌丝在寄主细胞内快速生长同时出现梭形病斑。5到7天时，病斑上产生大量分生孢子，开始新一轮的侵染循环。在侵染过程中，病原菌侵染的寄主植物周围的pH、温度、湿度、以及寄主植物细胞的微环境如植物响应病原菌侵染时产生的SA和JA等激素水平上升或下降都会影响到病原菌侵染寄主过程中的信号转导、裂解酶类或次生代谢产物的产生。与pH相关的真菌细胞内的信号转导途径也有不少报道，真菌能在范围较广的pH值范围内生长发育，真菌通过分泌酸性或碱性物质调控其周围的pH以利于其侵染和定殖。构巢曲霉菌中的7个蛋白与pH识别相关，其中的两个蛋白PalH和PalI是推测膜蛋白，PalH(7个预测跨膜螺旋)携带有pH识别活性。通过对PACC缺失菌株的研究表明，pH信号途径在各种致病真菌毒性中的作用。PACC的缺失会对真菌分泌代谢产物或裂解酶产生极大地负作用。因此，pH信号途径似乎控制许多细胞功能，而这些细胞功能与病菌的各种侵染过程相关。Landraud等人研究发现，当稻瘟病菌株处于碱性条件下，转录因子PACC在的表达量明显上调。PacC在稻瘟病菌生物学方面具有重要作用，而且pH是影响稻瘟病菌与寄主互作过程的一种重要因子。由此可以看出，环境因子(温度、湿度、pH、活性氧、感染寄主的微环境的pH等)在稻瘟病菌与寄主水稻互作过程具有重要作用。
目前，大部分研究主要集中在pH如何影响寄主与病原互作机制的研究，有关pH如何影响受病原菌效应蛋白基因过表达菌株侵染的水稻SA途径相关基因表达的研究很少涉及。
技术实现要素：
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种抑制侵染水稻SA途径相关基因上调的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明包括以下步骤：
(1)利用弱酸/碱pH5,pH5.5,pH8,pH8.4溶液处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子；
(2)用不同pH处理后的孢子悬浮液喷雾接种水稻叶片；
(3)于0h,24h,48h,72h和96h时间点取样，提取水稻样品总RNA；
(4)反转录成cDNA，real-timeRT-PCR检测cDNA；
(5)分析SA途径相关的两个主要基因PAL和EDS1在不同时间点的表达。
本发明的有益效果在于：
本发明是一种弱酸/碱处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株抑制其侵染水稻SA途径相关基因上调的方法，与现有技术相比，本发明提供一种更为简便、直接有效准确地定量弱酸/碱处理的病原菌基因过表达菌株侵染水稻后对水稻SA途径相关基因表达的影响，为更快速准确地分析水稻与稻瘟病菌互作时对弱酸/碱响应机制的研究提供重要的实验依据。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明：
本发明包括以下步骤：
(1)利用弱酸/碱pH5,pH5.5,pH8,pH8.4溶液处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子；
(2)用不同pH处理后的孢子悬浮液喷雾接种水稻叶片；
(3)于0h,24h,48h,72h和96h时间点取样，提取水稻样品总RNA；
(4)反转录成cDNA，real-timeRT-PCR检测cDNA；
(5)分析SA途径相关的两个主要基因PAL和EDS1在不同时间点的表达。
本发明中pH5/pH8处理稻瘟菌孢子、稻瘟病菌孢子喷雾接种、水稻育苗、水稻总RNA提取、real-time RT-PCR及数据分析等方法均与常规相同。
本发明的有益效果是全面而准确的检测经弱酸/碱(pH5,pH5.5,pH8,pH8.4)处理的稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子悬浮液喷雾接种于水稻叶片上，于不同时间点取样，提取水稻叶片总RNA，real-time RT-PCR分析受侵染水稻SA途径相关基因PAL和EDS1的表达。克服了已有研究病菌与寄主互作时对非生物因子响应机制时借助温室设计各种弱酸处理以观察寄主表型变化、以及筛选大量水稻防御相关基因表达等周期长和效率低的弊端，最终达到为今后测定弱酸/碱影响受病原菌效应蛋白过表达菌株侵染水稻SA途径相关基因的表达方法提供有效准确的目的。具体方法是分别采用弱酸/碱(pH5,pH5.5,pH8,pH8.4)处理稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子，将处理后的孢子悬浮液喷雾接种于水稻叶片上，于不同时间点(0h,24h,48h,72h和96h)取样，提取样品总RNA，real-time RT-PCR分析SA途径相关的两个基因(PAL和EDS1)的表达量。可快速、直接准确地了解弱酸/碱处理的病原菌基因过表达菌株侵染水稻后对水稻SA途径相关基因表达的影响，克服了已有研究病菌与寄主互作时对非生物因子响应机制时借助温室设计各种弱酸处理以观察寄主表型变化、以及筛选大量水稻防御相关基因表达等周期长和效率低的弊端。
实施例一：
采用pH5处理稻瘟病菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水稻叶片上，28℃黑暗保湿24h后，置于温室中进行保温保湿。于接种0h、24h、48h和96h取样，TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA，利用实时荧光定量试剂盒进行SA途径相关的两个基因(PAL和EDS1)表达量检测(表1)。
表1 PAL和EDS1在pH5.0处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量
实施例二：
采用pH5.5处理稻瘟病菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水稻叶片上，28℃黑暗保湿24h后，置于温室中进行保温保湿。于接种0h、24h、48h和96h取样，TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA，利用实时荧光定量试剂盒进行SA途径相关的两个基因(PAL和EDS1)表达量检测(表2)。
表2 PAL和EDS1在pH5.5处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量
实施例三：
采用pH8.0处理稻瘟病菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水稻叶片上，28℃黑暗保湿24h后，置于温室中进行保温保湿。于接种0h、24h、48h和96h取样，TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA，利用实时荧光定量试剂盒进行SA途径相关的两个基因(PAL和EDS1)表达量检测(表3)。
表3 PAL和EDS1在pH8.0处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量
实施例四：
采用pH8.4处理稻瘟病菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水稻叶片上，28℃黑暗保湿24h后，置于温室中进行保温保湿。于接种0h、24h、48h和96h取样，TrizolRNA提取试剂盒提取样品总RNA，利用实时荧光定量试剂盒进行SA途径相关的两个基因(PAL和EDS1)表达量检测(表4)。
表4 PAL和EDS1在pH8.4处理稻瘟菌过表达菌株侵染水稻不同时间点表达量
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。