利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法与流程

文档序号:12411330阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种体外利用人多能干细胞构建类肾器官的培养方法,该方法包括步骤:

1)用基质胶作为细胞外基质,铺于细胞培养皿表面;

2)去除基质胶,向细胞培养皿中加入无饲养层培养基,接种人多能干细胞,进行人多能干细胞的培养传代;

3)细胞达到40~50%汇合度时,去除无饲养层培养基,加入含细胞因子的基础培养基,进行人多能干细胞的培养分化;

4)收集细胞置于Transwell培养装置中,制作类肾器官。

2.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤1)中是用移液枪吸取所述的基质胶,移入细胞培养皿中,晃动摇匀,使基质胶均匀分布覆盖于培养皿底部,然后将基质胶覆盖的细胞培养皿在37℃下放置3~6小时或在2~8℃放置过夜,放置期间基质胶需始终保持完全覆盖皿底。

3.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤1)中所述基质胶为Basement Membrane Matrix或hESC qualified Matrigel。

4.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤2)中所述的无饲养层培养基为完全培养基。

5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述的人多能干细胞包括人诱导多能干细胞。

6.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤2)中人多能干细胞接种前经过以下处理步骤:

解冻;或者,已经在连续的培养之中的人多能干细胞不需要解冻;

使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面。

7.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤2)中人多能干细胞培养温度为36℃~37.5℃,每天更换所述的无饲养层培养基1次,4天传代一次。

8.根据权利要求1所述的方法,其中,步骤3)中,细胞达到40~50%汇合度时定为第0天,所述的含细胞因子的基础培养基,第0天使用的是含8μM CHIR99021的基础培养基,第2天更换一次含8μM CHIR99021的基础培养基,第4天开始使用含有200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基每2天更换培养基。

9.根据权利要求1或8所述的方法,其中,步骤4)中所述的步骤是于步骤3)中人多能干细胞培养至第7天进行;

收集细胞置于Transwell过滤器表面的操作包括以下步骤:

(4-1)使用EDTA使人多能干细胞脱离原培养表面,收集细胞;

(4-2)使用不含细胞因子的基础培养基重悬细胞,进行细胞计数并离心,在Transwell培养装置的下室中加入含5μM CHIR99021的基础培养基,将离心后的细胞球体置于Transwell上室进行培养;

在将所述人多能干细胞置于Transwell上室进行培养1小时后将下室中的培养基换为含200ng/ml FGF9+1μg/ml肝素的基础培养基,每2天更换培养基,第12天开始每2天更换为不含细胞因子的基础培养基,共培养18天以上。

10.一种类肾器官,其是按照权利要求1~9任一项所述方法培养得到的。

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