一种环状RNA高通量测序文库的构建方法及其试剂盒与流程

技术特征：

1.一种环状RNA高通量测序文库的构建方法，其依次包括以下步骤：

(S1)提取样品中的总RNA；

(S2)去除样品中的DNA；

(S3)检测并评定样品中的总RNA质量，确定RNA质量符合要求；

(S4)去除rRNA；

(S5)去除线性RNA；

(S6)构建用于高通量测序的环状RNA文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S3)中检测样品中总的RNA质量依次包括以下步骤：

(S31)利用1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA降解程度以及是否有污染；

(S32)利用紫外分光光度计检测RNA的纯度，即OD260/280比值；

(S33)检测RNA的完整性。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S4)去除rRNA依次包括以下步骤：

(S41)将与rRNA序列互补的DNA探针等质量混合，形成DNA探针库；

(S42)将所获得DNA探针库与经过检测并评定样品中的总RNA质量确定RNA质量符合要求的RNA混合杂交，形成DNA-RNA杂交物；

(S43)用RNase H消化所获得的DNA-RNA杂交物；

(S44)用DNase I消化DNA探针，获得rRNA耗竭的RNA；

(S45)通过荧光计测定rRNA耗竭的RNA的浓度。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S42)中所用的DNA探针库与RNA的重量比为(1-2)：1，优选1:1。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S42)中混合杂交所采用的条件为在95℃的温度下杂交2分钟，然后以0.1℃/s的速度将温度缓慢地降低至45℃。

6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S43)中用RNase H消化所获得的DNA-RNA杂交物所采用的条件为在37℃的温度下消化30分钟。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S6)中构建用于高通量测序的环状RNA文库依次包括以下步骤：

(S61)RNA片段化；

(S62)第一链合成：采用逆转录酶加随机引物的方法进行；

(S63)第二链合成：利用RNase H消化RNA/cDNA杂交物中的RNA链，然后通过DNA聚合酶I合成第二条链；

(S64)末端修复：利用End Repair Mix形成平末端的dsDNA并在5'端加上磷酸基团；

(S65)加A尾：利用Klenow 3'-5'exo-在dsDNA末端加A尾；

(S66)Y型Adapter连接：利用T4DNA Ligase连接Adapter和加了A尾的dsDNA；

(S67)第二链消化和文库扩增：利用UNG酶消化第二链；

(S68)质检及准备标引文库。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(S61)中RNA片段化的条件为在90-96℃，优选94℃的温度下片段化3-6分钟，优选5分钟。

9.一种环状RNA高通量测序文库构建的试剂盒，其特征在于，其包括：

(1)环状RNA富集试剂、DNase I、RNase H、RNaseR；

(2)种属特异的DNA探针；

(3)文库构建所需的各种酶：DNA聚合酶I、Large Fragment、T4Polynucleotide Kinase、Klenow Fragment、Escherichia coli UDG、T4DNA Ligase、Phusion High-Fidelity DNA Polymerase；

(4)磁珠、dNTP、Nuclease Free Water、dUTP、接头、引物，

其中，所述种属特异的DNA探针能与相应物种的rRNA序列互补。