本发明属于生物医药领域，更具体而言，本发明涉及一种tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白及其制备方法，还涉及tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物及其制备方法和用途。所述天花粉蛋白(tcs)与穿膜肽、肿瘤蛋白酶底物肽与肿瘤靶向配基的连接物能够更好地在恶性肿瘤部位富集，并被肿瘤细胞高表达的肿瘤蛋白酶激活，由穿膜肽介导入胞，实现肿瘤靶向。
技术背景
恶性肿瘤是人类生命安全的最大威胁之一。据世界卫生组织报道，癌症的发病率逐年升高，并且呈现年轻化趋势。在所有恶性肿瘤中，脑部肿瘤是最难以治愈、死亡率最高的恶性肿瘤之一。目前，治疗脑部肿瘤的手段以手术和放疗为主。由于血脑屏障的存在，大部分药物无法通过血脑屏障到达肿瘤部位，因此，脑部肿瘤缺乏有效的药物治疗手段。
随着生物技术的发展，生物大分子药物，尤其是蛋白类药物，由于其生物活性强、生物相容性好而受到越来越多的关注。蛋白药物已经成为21世纪新药研发最前沿的方向之一。
天花粉蛋白(tcs)是从葫芦科植物栝蒌的根——天花粉中提取到的一种蛋白质，在传统中医中被用作终止中期妊娠的引产药已有几个世纪的历史。tcs是分子量为27kda的i型核糖体失活蛋白，它具有n-糖苷酶活性，能够识别哺乳动物细胞的核糖体大亚基并使其脱嘌呤，从而抑制细胞的蛋白质合成，导致细胞死亡(参见文献wu,s.；lu,x.；zhu,y.；yang,j.；dong,y.n-glycosidasemechanismoftrichosanthin.scichinaclifesci1998,41,174-180)。同时，也有研究表明，tcs能够通过多种途径诱导细胞凋亡(参见文献li,m.；li,x.；li,j.c.possiblemechanismsoftrichosanthin-inducedapoptosisoftumorcells.anatrec(hoboken)2010,293,986-992)。正是由于tcs的这些生物活性，它被证实具有广谱的抗肿瘤活性(参见文献sha,o.；niu,j.；ng,t.b.；cho,e.y.；fu,x.；jiang,w.anti-tumoractionoftrichosanthin,atype1ribosome-inactivatingprotein,employedintraditionalchinesemedicine:aminireview.cancerchemotherpharmacol2013,71,1387-1393)。然而，tcs在体内不具备肿瘤靶向性，同时缺乏一定的入胞能力，另外，据报道，tcs还有较强的免疫原性(参见文献he,x.h.；shaw,p.c.；tam,s.c.reducingtheimmunogenicityandimprovingtheinvivoactivityoftrichosanthinbysite-directedpegylation.lifesci1999,65,355-368)。这些都制约了tcs作为抗肿瘤药物的临床应用。随着蛋白质修饰技术的发展，已有报道将具有穿膜活性的穿膜肽通过生物重组或者化学修饰方式连接在蛋白表面，能够运送蛋白入胞。然而，尚未有将该蛋白毒素药物用于脑部肿瘤治疗的报道。
乳铁蛋白(lactoferrin，lf)是一种分子量为82kda、广泛存在于哺乳动物乳汁中的内源性蛋白质，主要参与体内铁元素的转运。有报道表明，乳铁蛋白与细胞膜表面的低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein-1，lrp-1)有较高的亲和力。而血脑屏障的主要组成——脑微血管内皮细胞表面的lrp-1有较高的表达水平。因此，乳铁蛋白具有通过血脑屏障实现脑靶向的能力。因而，将天花粉蛋白运用化学修饰的方法修饰上乳铁蛋白，能够在增加天花粉蛋白分子量以延长体内半衰期的同时，实现跨越血脑屏障，进入脑部肿瘤组织的能力。
现有技术中对蛋白药物的传统化学修饰位点主要局限于蛋白中赖氨酸残基的侧链氨基，以及通过基因工程的手段引入的半胱氨酸的侧链巯基。这两种修饰方法的缺点明显。前者由于蛋白中赖氨酸残基较多，会导致修饰产物不均一，增加了修饰产物分离纯化的难度和成本。而后者虽然能够实现蛋白质的定点修饰，但是由于游离巯基的不稳定性，蛋白药物在制备及纯化的过程中易导致巯基的氧化，形成分子间二聚体。所以，需要开发一种新型的蛋白质修饰方法来实现蛋白药物的高效、专一、定点修饰。
内含肽(intein)介导的蛋白质原核表达、纯化及修饰方法是一种新型的蛋白质定点修饰技术。intein是一种具有自我剪切功能的多肽。在目的蛋白的c端融合intein序列以及几丁质结合域(cbd)亲和标签。该技术用大肠杆菌原核表达系统进行外源蛋白的表达，再用几丁质柱对目的蛋白进行亲和纯化时，用含有巯基的试剂进行柱上切割，在intein的介导下，能将目的蛋白从intein上切下，同时在蛋白的c末端引入相应的活性基团，用于下游的蛋白修饰。例如，如果用l-半胱氨酸作为切割试剂，此时蛋白的末端会额外引入一个半胱氨酸，能够利用其巯基进行下游的修饰。我们用双官能团的聚乙二醇(peg)马来酰亚胺-peg-琥珀酰亚胺(mal-peg-nhs)对乳铁蛋白进行活化，使其马来酰亚胺化，就能与基于内含肽技术表达纯化后末端引入了半胱氨酸的重组蛋白进行修饰反应。
技术实现要素：
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明人进行了广泛深入的研究，最终得到本发明。
本发明的一个目的是提供一种tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物，所述连接物由所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白定点与肿瘤靶向配基(如乳铁蛋白)连接修饰而制备，所述肿瘤靶向配基修饰在所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的c末端；所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的巯基与所述肿瘤靶向配基的马来酰亚胺共价连接。
本发明的又一个目的是提供所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的制备方法。
本发明的还一个目的是提供所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的用途。该连接物能够通过乳铁蛋白的受体介导作用实现穿越血脑屏障以及脑部靶向。该连接物能够被肿瘤组织高表达的基质金属蛋白酶-2所切割并激活，从而增加天花粉蛋白的入胞能力以及抗肿瘤毒性作用。
根据一个方面，本发明提供了一种tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白，其特征在于：tcs的c端融合穿膜肽，然后与肿瘤蛋白酶底物肽融合，其中，所述tcs、穿膜肽、肿瘤蛋白酶底物肽序列之间各有3～10个甘氨酸作为连接序列。
天花粉蛋白(tcs)为天然植物来源的蛋白，可以通过大肠杆菌原核表达体系实现高效的表达。本发明提供了一种重组tcs的原核表达与纯化方法。
本发明采用全基因合成的方法合成tcs全长基因(基因序列为gatgttagcttccgtttatcaggtgcaacaagcagttcctatggagttttcatttcaaatctgagaaaagctcttccaaatgaaaggaaactgtacgatatccctctgttacgttcctctcttccaggttctcaacgctacgcattgatccatctcacaaattacgccgatgaaaccatttcagtggccatagacgtaacgaacgtctatattatgggatatcgcgctggcgatacatcctattttttcaacgaggcttctgcaacagaagctgcaaaatatgtattcaaagacgctatgcgaaaagttacgcttccatattctggcaattacgaaaggcttcaaactgctgcaggcaaaataagggaaaatattccgcttggactccctgctttggacagtgccattaccactttgttttactacaacgccaattctgctgcgtcggcacttatggtactcattcagtcgacgtctgaggctgcgaggtataaatttattgagcaacaaattgggaagcgtgttgacaaaaccttcctaccaagtttagcaattataagtttggaaaatagttggtctgctctctccaagcaaattcagatagcgagtactaataatggacagtttgaaagtcctgttgtgcttataaatgctcaaaaccaacgagtcacgataaccaatgttgatgctggagttgtaacctccaacatcgcgttgctgctgaatagaaacaatatggca)，并通过本领域常规的分子克隆技术，克隆至原核表达载体ptxb1多克隆位点区的ndei/xhoi位点，形成tcs重组表达质粒。
本发明中的天花粉蛋白(tcs)表达产物的氨基酸序列为mdvsfrlsgatsssygvfisnlrkalpnerklydipllrsslpgsqryalihltnyadetisvaidvtnvyimgyragdtsyffneasateaakyvfkdamrkvtlpysgnyerlqtaagkireniplglpaldsaittlfyynansaasalmvliqstseaarykfieqqigkrvdktflpslaiislenswsalskqiqiastnngqfespvvlinaqnqrvtitnvdagvvtsnialllnrnnma。
天花粉蛋白(tcs)属于i型核糖体失活蛋白，只含具有n-糖苷酶活性的a链，比ii型核糖体失活蛋白缺少介导入胞的凝集素样b链，因此，该类蛋白毒素入胞效率低下，抗肿瘤细胞毒性远不如ii型核糖体失活蛋白。而穿膜肽是从自然中发现或通过人工筛选得到的一类具有穿透细胞膜活性的多肽。研究表明，穿膜肽不仅能够自己入胞，还能携带大分子，例如蛋白、核酸、甚至纳米粒进入细胞。shin等通过研究发现，将穿膜肽通过生物重组或者化学修饰的方式修饰白树毒素，都能够显著提高其入胞能力与细胞毒性。
基于此，本发明通过生物重组融合蛋白的方法，在tcs的c端融合穿膜肽——低分子量鱼精蛋白(lmwp)，从而提高tcs的入胞能力以及细胞毒性。所述穿膜肽lmwp的氨基酸序列为vsrrrrrrggrrrr。
由于具有生物活性的穿膜肽都具有能够促进蛋白药物穿过细胞膜的作用，因此本申请中所述的穿膜肽包括但不限于，富含阳离子的低分子量鱼精蛋白，这是因为具有生物活性的穿膜肽可以包括富含碱性氨基酸的穿膜肽和具有两亲性的穿膜肽，二者都可以促进细胞对本身缺乏入胞能力的蛋白药物的摄取。所述穿膜肽还可以为tat肽(ygrkkrrqrrr)、r9肽(rrrrrrrrr)等。
由于穿膜肽本身不具备肿瘤靶向性，单独修饰穿膜肽易造成在体内对正常细胞的毒副作用增大。根据这一方面，本发明人提供了tcs的c端融合穿膜肽与肿瘤蛋白酶底物肽(例如，基质金属蛋白酶-2(mmp-2)底物肽)融合蛋白的原核表达和纯化方法，所述底物肽氨基酸序列为plalag。
本发明中，所述融合蛋白中tcs、穿膜肽、肿瘤蛋白酶底物肽(例如，mmp-2底物肽)序列之间各有三个以上十个以下甘氨酸作为连接序列，目的是使穿膜肽与底物肽的序列暴露更为充分。
本发明中，公开了一种tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白，其基因序列同样通过全基因合成(基因序列为
gatgttagcttccgtttatcaggtgcaacaagcagttcctatggagttttcatttcaaatctgagaaaagctcttccaaatgaaaggaaactgtacgatatccctctgttacgttcctctcttccaggttctcaacgctacgcattgatccatctcacaaattacgccgatgaaaccatttcagtggccatagacgtaacgaacgtctatattatgggatatcgcgctggcgatacatcctattttttcaacgaggcttctgcaacagaagctgcaaaatatgtattcaaagacgctatgcgaaaagttacgcttccatattctggcaattacgaaaggcttcaaactgctgcaggcaaaataagggaaaatattccgcttggactccctgctttggacagtgccattaccactttgttttactacaacgccaattctgctgcgtcggcacttatggtactcattcagtcgacgtctgaggctgcgaggtataaatttattgagcaacaaattgggaagcgtgttgacaaaaccttcctaccaagtttagcaattataagtttggaaaatagttggtctgctctctccaagcaaattcagatagcgagtactaataatggacagtttgaaagtcctgttgtgcttataaatgctcaaaaccaacgagtcacgataaccaatgttgatgctggagttgtaacctccaacatcgcgttgctgctgaatagaaacaatatggcaggtggcggtgtgtctcgtcgccgccgtcgtcgtggcggtcgccgtcgccgtggtggcggcccgctgggtctggcaggtctcgag)，再用本领域中常用的分子克隆手段克隆在原核表达载体ptxb1多克隆位点区的ndei/xhoi位点，形成所述tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白的重组表达质粒。
本发明中表达得到的所述tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白的氨基酸序列为
mdvsfrlsgatsssygvfisnlrkalpnerklydipllrsslpgsqryalihltnyadetisvaidvtnvyimgyragdtsyffneasateaakyvfkdamrkvtlpysgnyerlqtaagkireniplglpaldsaittlfyynansaasalmvliqstseaarykfieqqigkrvdktflpslaiislenswsalskqiqiastnngqfespvvlinaqnqrvtitnvdagvvtsnialllnrnnmagggvsrrrrrrggrrrrgggplalag。
根据另一个方面，提供了所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的制备方法，具体步骤如下：
(a)将包含编码tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的基因的重组表达质粒转化大肠杆菌(例如，大肠杆菌bl21(de3))感受态细胞，得到含有重组质粒的菌株；
(b)将含有重组质粒的菌株用lb培养基培养至对数生长期，加入异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)诱导目的蛋白表达；
(c)离心收集菌体并超声破碎；
(d)离心，收集含有目的蛋白的上清液；将所述上清液用几丁质柱亲和纯化，洗去杂蛋白后，用含有l-半胱氨酸的缓冲液进行柱上切割过夜，收集洗脱液；
(e)将洗脱液超滤浓缩并除去溶液中的游离半胱氨酸，即得到tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白。
上述制备方法中，优选地，肿瘤蛋白酶底物肽为mmp-2底物肽，按照上述方法，可以制得tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白。
根据再一个方面，本发明提供了一种tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物，所述连接物由所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白定点与肿瘤靶向配基(即乳铁蛋白)连接修饰而制备，所述肿瘤靶向配基修饰在所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白的c末端；所述tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白的巯基与所述肿瘤靶向配基的马来酰亚胺共价连接。
根据又一个方面，本发明提供了所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的制备方法，包括如下步骤：
上述(a)～(e)；
(f)将乳铁蛋白与马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺(mal-peg-nhs)按摩尔比1:3～1:20在pbs溶液中进行反应，于室温中反应0.5～4小时，并用脱盐柱除去多余的mal-peg-nhs，得到活化后的乳铁蛋白；
(g)将步骤(e)中得到的tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白与步骤(f)中活化后的乳铁蛋白按摩尔比1:5～1:20进行反应，于4摄氏度反应过夜；
(h)用阳离子交换柱来分离纯化从步骤(g)中得到的tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物。
上述制备方法中，优选地，所述肿瘤蛋白酶底物肽为mmp-2底物肽，按照上述方法，可以制得tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物。
本发明中，运用内含肽介导的蛋白质修饰技术进行定点乳铁蛋白修饰技术不限于所述的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白，也可用于其他重组蛋白的末端乳铁蛋白修饰。
本发明中运用内含肽介导的蛋白质修饰技术对重组天花粉蛋白及其融合蛋白进行定点修饰的不限于上述乳铁蛋白，也可用于修饰其他具有靶向性功能的配体。
本发明制备的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物具有以下优点：
(1)乳铁蛋白能够增加蛋白药物的分子量，从而减慢机体对蛋白药物的代谢，延长蛋白药物的半衰期。
(2)乳铁蛋白能够遮蔽穿膜肽的正电荷，降低了蛋白药物对正常组织和细胞的毒性。
(3)乳铁蛋白能够通过受体靶向作用使蛋白药物能够跨越血脑屏障，实现脑部靶向。
(4)能够通过肿瘤及肿瘤外基质中高表达的mmp-2酶将乳铁蛋白与蛋白酶切分离，从而暴露出穿膜肽，实现肿瘤酶敏感靶向性。
(5)乳铁蛋白分子量较大，能够遮蔽天花粉蛋白tcs中的抗原表位，降低蛋白药物的免疫原性。
本发明还提供了所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在治疗肿瘤的药物制备中的用途。
优选地，所述tcs-穿膜肽-肿瘤蛋白酶底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物为tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物，前述用途中所述肿瘤为mmp-2酶高表达的恶性脑胶质瘤。同时，本发明人研究发现，将tcs开发成为具有脑靶向功能的基于穿膜肽的肿瘤酶敏感型给药系统，不但能够实现脑部原位肿瘤靶向，提高tcs的抗脑部肿瘤活性，更重要的是，由于内源性的乳铁蛋白具有极好的生物相容性存在，药物的毒副反应和tcs本身所具有的免疫原性都大大降低，从而进一步改善了tcs的成药性。同时，本发明也为传统中药——天花粉蛋白tcs的“老药新用”开辟了新的思路。
附图说明
图1为根据本发明的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的抗肿瘤机理图。
图2为根据本发明制备实施例1和制备实施例2中由内含肽介导的在重组蛋白末端定点引入半胱氨酸的机理示意图。
图3为根据本发明制备实施例2中内含肽介导的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的合成路线图。
图4为根据本发明制备实施例1和制备实施例2中内含肽介导的重组天花粉蛋白(重组tcs)与tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白纯化后电泳图。
图5为根据本发明制备实施例2中tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白的纯化色谱图。
图6为根据本发明制备实施例2中内含肽介导的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的电泳图。
图7为根据本发明实验实施例1中的c6与gl261细胞及其培养基中mmp-2酶含量检测的westernblot图。
图8为根据本发明实验实施例2中的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物(图中简称为融合蛋白-乳铁蛋白连接物)被mmp-2酶切前后的电泳图。
图9为根据本发明实验实施例3中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物对mmp-2酶高表达的肿瘤细胞gl261细胞增殖的抑制效果。
图10为根据本发明实验实施例3中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物对mmp-2酶高表达的肿瘤细胞c6细胞增殖的抑制效果。
图11为根据本发明实验实施例4中的bcec与gl261细胞中lrp-1受体表达检测的westernblot图。
图12为根据本发明实验实施例5中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在bcec细胞中的细胞摄取情况荧光图。
图13为根据本发明实验实施例5中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物transwell培养板中下室gl261细胞的细胞摄取情况荧光图。
图14为根据本发明实验实施例5中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在bcec细胞以及transwell培养板的下室gl261细胞的细胞摄取情况的流式分析图。
图15为根据本发明实验实施例6中酶切前后的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在gl261和c6细胞中的细胞摄取情况荧光图。
图16为根据本发明实验实施例6中酶切前后的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在hela和mcf-7细胞中的细胞摄取情况荧光图。
图17为根据本发明实验实施例6中酶切前后的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在gl261、c6、hela和mcf-7细胞中的细胞摄取情况的流式分析图。
图18为根据本发明实验实施例7中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在gl261脑原位瘤小鼠模型中的肿瘤靶向性和组织分布荧光图。
图19为根据本发明实验实施例7中tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在脑原位瘤和脑组织中分布的荧光图。
图20为根据本发明实验实施例8中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在gl261皮下瘤裸鼠模型中体内抗肿瘤治疗中的肿瘤体积增长曲线图。
图21为根据本发明实验实施例8中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在gl261皮下瘤裸鼠模型中体内抗肿瘤治疗终点时各治疗组肿瘤照片。
图22为根据本发明实验实施例8中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在gl261皮下瘤裸鼠模型中体内抗肿瘤治疗终点时各治疗组的肿瘤重量。
图23为根据本发明实验实施例8中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在gl261皮下瘤裸鼠模型中体内抗肿瘤治疗过程中各治疗组的动物体重变化曲线图。
图24为根据本发明实验实施例9中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在gl261脑原位瘤小鼠模型中体内抗肿瘤治疗各治疗组的动物生存曲线图。
图25为根据本发明实验实施例9中tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在gl261脑原位瘤小鼠模型中体内抗肿瘤治疗过程中各治疗组的动物体重变化曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明加以进一步说明，以下实施方式只以举例的方式描述本发明。但这些实施例并不意味着对本发明加以任何限制。很明显，本领域普通技术人员可在本发明的范围和实质内，对本发明进行各种变通和修改。需要了解的是，本发明意欲涵盖在所附权利要求书中包括的变通和修改。
试剂和药品
原核表达载体ptxb1、几丁质亲和柱购自neb。tcs重组表达质粒与tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白的重组表达质粒由上海捷瑞生物科技有限公司代为构建。酵母粉、蛋白胨购于oxiod。氨苄青霉素(amp)、异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)购于amresco。hepes和噻唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，mtt)，于sigma-aldrich购得。l-半胱氨酸、氯化钠(nacl)、吐温20、edta购于国药集团(上海)化学试剂公司。马来酰亚胺-聚乙二醇3500-琥珀酰亚胺(mal-peg-nhs)购于北京键凯科技有限公司。异硫氰酸酯荧光素(fitc)、琥珀酰亚胺酯cy5(nhs-cy5)染料购于大连美仑生物科技有限公司。新西兰乳铁蛋白购自南京康满林化工实业有限公司。bca蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。鼠源脑胶质瘤细胞c6、gl261，鼠源脑微血管内皮细胞bcec，人源宫颈癌细胞hela，人源乳腺癌细胞mcf-7购自中国科学院细胞库。dmem细胞培养基干粉，胰蛋白酶(trypsin)，胎牛血清(fbs)，双抗(penicillin-streptomycin)分别从gibco和invitrogen购得。
制备实施例1
重组天花粉蛋白tcs的制备
重组天花粉蛋白tcs的原核表达和纯化
a：将tcs重组表达质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，得到含有重组质粒的菌株。
b：将含有重组质粒的菌株用含有100μg/mlamp的lb培养基，于37℃恒温摇床中250rpm培养至对数生长期(600nm吸光值为0.6-0.8)，加入终浓度为1mm的iptg，于25℃，150rpm表达过夜(14h)。
c：用离心机6,000rpm，4℃离心20min收集菌体。
d：用hepes缓冲液(含20mmhepes，150mmnacl，1mmedta，0.5‰吐温20，ph8.5)将菌体重悬。
e：用探头超声破碎仪以400w功率超声破碎细胞30min。
f：12,000rpm，4℃离心20min，收集上清液，即得到含有目的蛋白的上清液。
g：将含有目的蛋白的上清液过用hepes缓冲液预平衡的几丁质柱，流速为1ml/min。上样完成后，用25倍柱体积的hepes缓冲液洗去非特异性结合的杂蛋白。
h：用3倍柱体积的含有50mm半胱氨酸的hepes缓冲液流经柱子，并保留少量缓冲液，关闭柱子出口，在柱上切割过夜(16h)。
i：打开柱子出口，收集流出的含有目的蛋白的缓冲液，并继续加入3倍柱体积的hepes缓冲液，继续将目的蛋白洗脱下来。
j：将收集到的蛋白洗脱液用截留分子量为10,000的超滤管进行浓缩，并用脱盐柱除去溶液中多余的半胱氨酸，得到未修饰的重组tcs。
制备实施例2
tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的合成
(1)tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白的表达和纯化
a：将所述tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白的重组表达质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，得到含有重组质粒的菌株。
b：将含有重组质粒的菌株用含有100μg/mlamp的lb培养基，于37℃恒温摇床中250rpm培养至对数生长期(600nm吸光值为0.6-0.8)，加入终浓度为1mm的iptg，于25℃，150rpm表达过夜(14h)。
c：用离心机6,000rpm，4℃离心20min收集菌体。
d：用hepes缓冲液(含20mmhepes，150mmnacl，1mmedta，0.5‰吐温20，ph8.5)将菌体重悬。
e：用探头超声破碎仪以400w功率超声破碎细胞30min。
f：12,000rpm，4℃离心20min，收集上清液，即得到含有目的蛋白的上清液。
g：将含有目的蛋白的上清液过用hepes缓冲液预平衡的几丁质柱，流速为1ml/min。上样完成后，用25倍柱体积的hepes缓冲液洗去非特异性结合的杂蛋白。
h：用3倍柱体积的含有50mm半胱氨酸的hepes缓冲液流经柱子，并保留少量缓冲液，关闭柱子出口，在柱上切割过夜(16h)。
i：打开柱子出口，收集流出的含有目的蛋白的缓冲液，并继续加入3倍柱体积的hepes缓冲液，继续将目的蛋白洗脱下来。
j：将收集到的蛋白洗脱液用截留分子量为10,000的超滤管进行浓缩，用脱盐柱除去溶液中游离的l-半胱氨酸，得到tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白，用bca法测定蛋白浓度。
(2)乳铁蛋白的马来酰亚胺活化
将乳铁蛋白与mal-peg-nhs按摩尔比1:5溶于磷酸盐缓冲液中于室温反应一小时，用脱盐柱将多余的mal-peg-nhs除去，得到活化后的乳铁蛋白。
(3)tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的合成
将收集到的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白与活化后的乳铁蛋白按摩尔比1:5混合，在磷酸盐缓冲液中于4℃反应过夜。用阳离子交换柱spff以及快速蛋白纯化色谱仪fplc对反应产物进行分离纯化，将样品用进样器推入柱子中，用含有0.15-1m的nacl的ph7.2磷酸盐缓冲液以0.02m/min的梯度(即nacl的浓度每分钟增加0.02m)进行梯度洗脱，收集第一个洗脱峰(即含有0.15m的nacl的ph7.2磷酸盐缓冲液的洗脱峰)，得到tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物(图5)，其电泳图见图6。
实验实施例1
c6与gl261细胞及其培养基中mmp-2酶含量测定
用本领域常规的westernblot来检测c6与gl261细胞及其培养基中的mmp-2酶含量。具体方法如下：将对数生长期的ht1080和huvec细胞用胰酶消化后稀释成1.5×105个细胞/ml的细胞悬液，转移到6孔细胞培养板(nunc公司)中，每孔加入2ml细胞悬液，用含10％小牛血清的dmem完全培养基培养4h(37℃，5％co2)。待细胞贴壁后，将培养基弃去，细胞用pbs洗两次，更换为无血清的dmem培养基，每孔1ml，继续培养24h。收集培养基上清，并将细胞用细胞裂解液裂解30min，于4℃离心15min，收集上清，用bca法测定蛋白浓度，用缓冲液稀释至相同浓度。在培养基与细胞裂解液样品中加入上样缓冲液于沸水中煮5min。用10％聚丙烯酰胺凝胶跑胶，并电转至0.45μmpvdf膜上，用5％脱脂奶粉封闭2小时。用封闭液配置1,000倍稀释的抗mmp-2兔抗(购自abcam)以及20,000倍稀释的抗β-actin鼠抗(购自sigma)4℃孵育过夜。将一抗洗涤三次后孵育相应种属来源的1,000倍稀释的二抗(购自碧云天生物技术有限公司)，于室温孵育1小时。将二抗洗涤三次后，在膜上滴加ecl显色底物(购自thermopeirce)，在多功能凝胶成像仪中成像(biorad)。
结果如下：
从图7中可见，无论是gl261细胞的细胞内还是细胞培养基中都相较于c6细胞有着显著的mmp-2酶过表达。这说明gl261细胞可以用作后续mmp-2酶敏感性实验的细胞模型。
实验实施例2
tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的体外酶切实验
(1)酶切介质制备
将对数生长期的gl261细胞用胰酶消化后稀释成1.5×105个细胞/ml的细胞悬液，转移到nunc的6孔细胞培养板中，每孔加入2ml细胞悬液，用含10％小牛血清的dmem完全培养基培养4h(37℃，5％co2)。待细胞贴壁后，将培养基弃去，细胞用pbs洗两次，更换为无血清的dmem培养基，每孔1ml，继续培养24h。吸取培养基，以12,000rpm4℃离心10min除去细胞碎片，将上清用于体外酶切实验。
(2)体外酶切实验
将tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物(简称融合蛋白-乳铁蛋白连接物)用上述方法制备的酶切介质稀释至终浓度为0.1mg/ml，同时加入0.2‰的nan3，于37℃恒温摇床内250rpm酶切48h。酶切效率用sds-page电泳检测。结果如图所示。酶切产物为30kda左右的条带(图8)。
实验实施例3
mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴蓝，商品名：噻唑蓝)法分别测定重组tcs与tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的体外抗肿瘤效应
将对数生长期的gl261，c6细胞分别消化后稀释成密度为l.5×104个细胞/ml的细胞悬液，转移到96细胞培养孔板(nunc公司)中，每孔加入200μl细胞悬液，用含10％小牛血清的dmem完全培养基培养24h(37℃，5％co2)。
通过预实验确定最佳药物浓度范围，加入不同浓度的溶液(浓度分别为10-8、5×10-8、10-7、5×10-7、10-6、2×10-6、5×10-6、10-5mol/l的重组tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物，用含有10％胎牛血清的dmem培养基稀释)，每个浓度做6个复孔。培养48小时，加入mtt(5mg/ml，购自美国sigma-aldrich公司)20μl，培养4h，加dmso200μl，震荡使结晶物充分溶解混匀。用酶标仪(thermoscientific)测定各组od值，主波长为570nm，参考波长为490nm。计算各组的细胞增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝(对照组od值-实验组od值)/对照组od值×100％。
结果如下：
tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物对脑胶质瘤细胞c6和gl261增值率的影响：在mmp-2高表达的肿瘤细胞gl261中，该连接物相较于重组tcs细胞毒性明显增加(图9)；而在mmp-2低表达的肿瘤细胞c6中，相对于重组tcs明显较弱(图10)。这应当是由于gl261细胞分泌表达的mmp-2酶特异性切开了上述连接物中的乳铁蛋白和peg链，从而使穿膜肽暴露，进而介导tcs入胞，发挥其细胞毒性；而c6细胞缺乏mmp-2的表达，无法将乳铁蛋白和peg切下，导致其遮挡住了穿膜肽，使其丧失了入胞能力。这进一步证明了所述tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的mmp-2肿瘤酶响应性。
实验实施例4
bcec与gl261细胞lrp-1受体表达情况检测
用本领域常规的westernblot来检测脑微血管内皮细胞bcec与脑胶质瘤gl261细胞lrp-1受体表达情况。具体方法同实验实施例1。
结果如下：
从图11可见，bcec细胞中的lrp-1受体表达较高，而gl261细胞中lrp-1受体表达相对较低。因此，bcec细胞可用于体外血脑屏障透过能力评价的模型细胞。
实验实施例5
tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物对血脑屏障透过能力的体外评价
(1)蛋白药物的fitc荧光标记
将制备实施例1和制备实施例2中得到的重组tcs与tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物与是其摩尔量20倍过量的fitc荧光素混合，于4℃避光反应过夜。用脱盐柱除去多余的fitc荧光素。用bca法测定蛋白的浓度。
(2)bcec细胞中的细胞摄取实验
将对数生长期的bcec细胞用0.25％胰酶消化分散后，细胞计数调整浓度制备1×105个细胞/m1的细胞悬液，转移至12孔细胞培养板内，每孔加入1ml。培养24小时后，加入fitc标记的两种蛋白药物5μm，继续在培养箱中培养3小时。用荧光显微镜(zeiss)进行拍摄，之后用0.25％胰酶消化分散后用流式细胞仪(bdpharmingen)的fl1通道检测细胞摄取情况。
(3)transwell血脑屏障透过实验
将对数生长期的bcec细胞用0.25％胰酶消化分散后，细胞计数调整浓度制备1×105个细胞/m1的细胞悬液，转移至transwell培养板的上室，每孔加入200μl，培养48小时。将对数生长期的gl261细胞用0.25％胰酶消化分散后，细胞计数调整浓度制备1×105个细胞/m1的细胞悬液，转移至transwell培养板的下室，每孔加入500μl，培养24小时。在上室中分别加入fitc荧光标记的两种蛋白药物(重组tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物)各2μm，继续在培养箱中培养4小时。用荧光显微镜(zeiss)进行拍摄，之后用0.25％胰酶消化分散后用流式细胞仪(bdpharmingen)的fl1通道检测细胞摄取情况。
结果如下：
从图12、图13、图14中可见，tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物不仅在lrp-1受体高表达的bcec细胞中有较好的细胞摄取水平，并且在transwell培养板中能够较好地透过上室的bcec进入下室的gl261细胞中。这体现了tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在体外良好的血脑屏障透过能力。
实验实施例6
tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的mmp-2响应性细胞摄取评价
(1)荧光标记的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的体外酶切
将实验实施例6中用fitc荧光标记的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物以实验实施例2的方法用gl261细胞的条件培养基进行体外酶切。将酶切后的蛋白用超滤管(mwco10,000，merckmillipore)浓缩并除去培养基。用bca法测定蛋白浓度。
(2)tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物酶切前后的细胞摄取水平评价
将对数生长期的c6、gl261、hela、mcf-7细胞用0.25％胰酶消化分散后，细胞计数调整浓度制备1×105个细胞/m1的细胞悬液，转移至12孔细胞培养板内，每孔加入1ml。培养24小时后，加入酶切前后的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物各2μm，在培养箱中继续培养3小时。将细胞用4％多聚甲醛固定10min，用dapi对细胞核进行染色，用荧光显微镜(zeiss)进行拍摄。用相同方法处理的细胞用0.25％胰酶消化分散后用流式细胞仪(calibur，bdpharmingen)的fl1通道检测细胞摄取情况。
结果如下：
从图15、图16、图17中可见，在四种肿瘤细胞中，酶切后的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的细胞摄取水平均比酶切前有显著的提高，证明所述tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物具有肿瘤高表达mmp-2酶依赖型的细胞摄取能力。
实验实施例7
tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的体内肿瘤靶向性及组织分布实验
(1)蛋白药物的cy5荧光标记
将制备实施例1和制备实施例2中得到的重组tcs与tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物与nhs-cy5染料以摩尔1:3比例混合，于4℃避光反应过夜。用脱盐柱除去多余的nhs-cy5染料。
(2)gl261脑原位瘤荷瘤裸鼠模型的建立
将对数生长期的gl261细胞经0.25％胰酶消化分散后，细胞计数调整浓度制备1×107个细胞/m1的细胞悬液。取体质量为18-22g的balb/c裸鼠(购自上海斯莱科实验动物有限公司)3只，将裸鼠头皮剪开，在右侧大脑的颅骨钻孔，用脑立体定位仪在颅骨下方3mm左右处注射细胞悬液5μl/只。用医用胶将小鼠的伤口粘合。每天观察动物的活动和饮食状况。
(3)tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物的体内肿瘤靶向性及组织分布实验
肿瘤细胞接种7天后，将cy5标记的连接物以尾静脉的方式注射，100μl/只。注射后24小时将裸鼠置于小动物活体成像仪中进行观察与拍照。将动物脱臼处死后，取出主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)与大脑，在活体成像仪中观察与拍照。
(4)tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在脑组织中的分布
将脑组织用30％蔗糖溶液脱水后用4％多聚甲醛固定，用oct包埋剂中包埋，用冰冻切片机(leica)进行冰冻切片。将切片用3％牛血清白蛋白(bsa)室温封闭1h，加入50倍稀释的兔源lrp-1抗体(abcam)，4℃孵育过夜，用pbst洗涤液后，加入fitc标记的羊抗兔二抗(santacruz)，室温孵育1h，再次洗涤后封片。用激光共聚焦显微镜(olympus)进行观察拍摄。
结果如下：
从图18a中可见，tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物在尾静脉注射后24小时能够到达脑部，相较tcs有更好的体内脑靶向能力。从组织分布图(图18b)中可见，蛋白药物的主要代谢器官——肝脏和肾脏有着较多的药物分布。
从图19可见，在脑部原位瘤中，蛋白药物有着较高的蓄积和穿透水平，证明了在肿瘤高表达的mmp-2的酶切激活作用下穿膜肽介导的组织穿透能力。而在脑部组织中，蛋白药物与lrp-1受体有着良好的共定位，证明所述的连接物能够通过lrp-1受体介导的方式进入脑部。
实验实施例8
tcs与tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物(简称融合蛋白-乳铁蛋白连接物)在皮下瘤模型中的体内抗肿瘤实验
(1)gl261皮下瘤荷瘤裸鼠模型的建立
将对数生长期的gl261细胞经0.25％胰酶消化分散后，细胞计数调整浓度制备5×106个细胞/m1的细胞悬液。取体质量为18-22g的balb/c裸鼠(购自上海斯莱科实验动物有限公司)20只，在裸鼠背部皮下注射细胞悬液100μl/只。观察ht1080细胞在balb/c体内的生长和成瘤情况。
(2)荷瘤裸鼠的抗肿瘤效应
当肿瘤体积为100mm3左右时将其随机分成4组：重组tcs组、融合蛋白-乳铁蛋白低剂量组、融合蛋白-乳铁蛋白高剂量组，以生理盐水组为阴性对照。各组均采用尾静脉注射方式给药，tcs给药100nmol/kg，融合蛋白-乳铁蛋白低剂量组给药50nmol/kg，融合蛋白-乳铁蛋白高剂量组给药100nmol/kg。每两天给药一次。给药期间每天监视裸鼠体重变化，并测定瘤的长径(l，单位：mm)、短径(s，单位：mm)，计算肿瘤体积：v(单位：mm3)＝l×s2/2。给药18天后，将裸鼠脱臼处死，取下肿瘤，小心去除瘤表面的血迹及包膜，称重。
图20为给药过程中的肿瘤体积增长图。从图中可以看到，相对于生理盐水组，重组tcs组对肿瘤的生长有一定的抑制作用。而tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物组有更为显著的抑瘤效果。图21、图22则直观地显示了给药完成后各组的肿瘤照片与瘤重，从图中可见，注射生理盐水的小鼠肿瘤明显较大，而注射重组tcs和tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白药物的小鼠肿瘤有不同程度的明显减小。
图23为给药过程中各组别小鼠的体重变化图。从图中可见，tcs组与融合蛋白-乳铁蛋白组在给药过程中，实验动物的体重并未发生明显的变化，证明本发明所构建的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物具有良好的生物相容性，系统毒性较低。
实验实施例9
重组tcs与tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物(简称融合蛋白-乳铁蛋白连接物)在原位瘤模型中的体内抗肿瘤实验
(1)gl261原位瘤荷瘤裸鼠模型的建立
取体质量为18-22g的balb/c小白鼠(购自上海斯莱科实验动物有限公司)27只，按实验实施例7中的方法接种gl261脑部原位肿瘤。
(2)荷瘤小鼠的抗肿瘤效应
将实验小鼠分为三组：生理盐水阴性对照组(7只)、重组tcs组(10只)与融合蛋白-乳铁蛋白组(10只)。在gl261脑部原位肿瘤接种后的第6天开始给药。每两天给药一次，给药方式为尾静脉注射，给药剂量为100nmol/kg。治疗过程中监测实验小鼠的体重，并记录小鼠的存活率。
结果如下：
从图24、图25可见，由于脑部原位瘤的生长作用，生理盐水对照组小鼠的体重迅速下降，并且生存期最短。而tcs治疗组的小鼠虽然生存期有所延长，但仍于实验终点前全部死亡。融合蛋白-乳铁蛋白治疗组小鼠有最长的生存期和存活率，在实验终点时仍有动物存活。这证明了本发明所构建的融合蛋白-乳铁蛋白连接物具有延长脑原位瘤患者生存期、提高存活率的潜力。
综上所述，本发明所构建的tcs-穿膜肽-mmp-2底物肽融合蛋白-乳铁蛋白连接物具有脑靶向和穿透血脑屏障的能力。通过乳铁蛋白对lrp-1受体的高亲和力作用，将天花粉蛋白tcs运送至脑部。在到达脑组织后，所述连接物能够通过脑肿瘤细胞高表达的mmp-2酶将乳铁蛋白切下，从而暴露出穿膜肽序列，进而介导天花粉蛋白tcs药物入胞，产生对脑部肿瘤的杀伤作用。该连接物能够在体内、外抑制mmp-2高表达脑肿瘤细胞的增值，在脑原位瘤动物模型中显著延长动物的生存期和存活率，并具有良好的生物相容性。
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