一个可原核表达小麦黄花叶病毒潢川分离物NIb蛋白的质粒载体的制作方法

本发明涉及植物病毒学和分子生物学，提供了一个可原核表达小麦黄花叶病毒潢川分离物NIb蛋白的质粒载体。
背景技术：
：小麦黄花叶病于1927年在日本首次报道，其病原主要包括小麦黄花叶病毒(Wheatyellowmosaicvirus，WYMV)和中国小麦花叶病毒(Chinesewheatyellowvirus，CWMV)，其中小麦黄花叶病毒的分布区域较为广泛。1980年以后，我国长江流域各省麦区也陆续报道了其危害，小麦黄花叶病毒在我国分布广泛，长江流域各省份以及山东、河南、陕西等省份都有分布，对小麦生长、发育构成严重危害。与其他大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)病毒一样，自然情况下WYMV是由根肿菌目多粘菌属的禾谷多粘菌(Polymyxagraminis)传播。这种真菌产生休眠孢子堆,休眠孢子堆抗逆性极强,至少可在土壤中存活20-25年。WYMV粒子呈弯曲线状，长度分为300和600nm两种。WYMV为二分体基因组，由两条线性的单链正义RNA组成。RNA1全长约7.6kb，RNA2全长约3.6kb，分别编码一个270kDa和100kDa的多聚蛋白。WYMVRNA的5’端有共价结合的VPg，3’端有一个poly(A)尾。其中RNA1编码的NIb蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的活性，参与WYMV的基因组复制，而基因组复制水平直接决定WYMV在植物体内的致病性。RNA病毒在细胞体内的累积与基因组复制、蛋白翻译甚至病毒粒子包装有关，而独立研究基因组复制的调控需要建立体外复制体系。然而目前还没有WYMV体外复制的研究体系，需要通过原核表达并纯化NIb蛋白来建立体外复制体系，但是NIb蛋白的编码序列在不同WYMV分离物中的同源性较高，而目前研究仅通过同源推导知道其应该具备RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)活性，但对于其如何调控WYMV基因组复制的机制却依然不清楚，特别是具备RdRp活性的蛋白在原核表达、纯化过程中容易造成活性丧失，因而根据现有技术是无法建立体外复制体系的。技术实现要素：本发明提供了提供了一个可原核表达小麦黄花叶病毒潢川分离物NIb蛋白的质粒载体，该质粒载体名称为pMAL-WYMV-NIb，含有WYMV潢川分离物的NIb蛋白编码序列，该质粒可用来进行NIb蛋白的原核表达，利用纯化的NIb蛋白建立NIb介导的体外复制体系，可用于WYMV基因组复制调控的研究。发明人首先公开了一个可原核表达小麦黄花叶病毒潢川分离物NIb蛋白的质粒载体，该质粒载体名称为pMAL-WYMV-NIb，含有WYMV潢川分离物NIb蛋白的编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，编码的氨基酸序列如SeqIDNo.2所示。为了获得该质粒，发明人首先利用PCR方法以含有NIb蛋白编码序列的质粒为模板获得WYMV潢川分离物NIb蛋白的编码序列，然后将NIb蛋白的编码序列利用酶切和连接插入到pMAL-C2X(NEB公司)载体中，获得了含有小麦黄花叶病毒NIb蛋白的原核表达质粒载体，该质粒载体名称为pMAL-WYMV-NIb，其中含有WYMV潢川分离物NIb蛋白的编码序列。发明人利用该质粒载体进行原核表达并通过亲和层析方法纯化NIb融合蛋白，利用纯化的NIb融合蛋白进行体外复制实验，可成功识别基因组3'UTR，并以其为模板产生互补链。由此证明WYMVNIb介导的体外复制体系的建立成功，将为WYMV的复制调控研究和WYMV的体内致病性机理解析提供体系和数据支持。更为具体的，发明人公开了该可原核表达小麦黄花叶病毒潢川分离物NIb蛋白的质粒载体pMAL-WYMV-NIb的构建方法如下：根据GenBank中公布的WYMV潢川分离物(WYMV-HC)RNA1的序列(登录号：AF067124)和RNA2的序列(登录号：AF041041)，设计引物(引物信息见表1)扩增NIb的编码序列和其他片段(对应于RNA1和RNA2的5'末端，中间序列和3'末端，用于制备对应的RNA作为体外复制模板)；以含有WYMV潢川分离物RNA1全序列的质粒pUWR1-1(董家红，2004，博士论文记载)为模板，在Taq酶的作用下进行PCR扩增得到WYMV潢川分离物的NIb编码序列；此PCR产物经DNA回收试剂盒回收后进行BamHI和SalI(Takara)双酶切，与同样双酶切的pMAL-C2X载体(NEB公司)连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR、质粒酶切鉴定和DNA测序，得到含有WYMV潢川分离物NIb蛋白编码序列的阳性克隆pMAL-WYMV-NIb。表1本发明中用到的引物PrimernameSequence(5'to3')PCRfragmentSeqIDNoWYM-R1-4921-BamHI-FATGGATCCATGGCCTCCGACACTCTCAGCNIbSeqIDNo.3WYM-R1-6504-SalI-RATGTCGACGATAGTTTGGAGCTCAATGCTGCTNIbSeqIDNo.4WYM-T7-R-1-FATtaatacgactcactataGGAAAATAAAACCACCACAAACRNA15'160ntSeqIDNo.5WYM-R1-162-RATCTCGAAGGGAGTGAAGAARNA15'160ntSeqIDNo.6WYM-R1-T7-390-FATtaatacgactcactataGCAGCCCCGCACATCTCATGCRNA1int160ntSeqIDNo.7WYM-R1-549-RATCTCGAGTGTGGTTGTTCCAAAGTGRNA1int160ntSeqIDNo.8WYM-T7-R1-7387-FATtaatacgactcactataGGACCATAACCCCCCTCCGCRNA13'260ntSeqIDNo.9WYM-R1-7644-RATATTACCTTCTGGTACTCGTAAACGCACRNA13'260ntSeqIDNo.10WYM-T7-R-2-FATtaatacgactcactataGGAAAATAAAACCACCACAAACRNA25'170ntSeqIDNo.11WYM-R2-170-RATAGAAGCGGAAAGAACTAGGRNA25'170ntSeqIDNo.12WYM-R2-T7-390-FATtaatacgactcactataGCTTGCTGCCAACCTTCGTRNA2int160ntSeqIDNo.13WYM-R2-549-RATGAAGGTTCGGACTGGTTGTRNA2int160ntSeqIDNo.14WYM-T7-R2-3460-FATtaatacgactcactataGGGCACCGCGCGTTGTGCCACGRNA23'190ntSeqIDNo.15WYM-R2-3652-RATGTCACATTTCCTGTGTACAAAAGCTGGRNA23'190ntSeqIDNo.16注：酶切位点用下划线表示，T7启动子序列用小写斜体表示；int：表示中间序列nt：核苷酸获得质粒pMAL-WYMV-NIb后，发明人利用该质粒进行原核表达，并通过亲和层析方法纯化可溶性的NIb融合蛋白，进而建立NIb介导的体外复制体系，实验结果表明NIb蛋白可特异识别WYMVRNA1和RNA2的3’末端片段，产生其互补链。主要步骤包括：1)融合MBP的NIb蛋白的预表达：将质粒pMAL-WYMV-NIb转化大肠杆菌Rossetta的感受态细胞，利用SDS-PAGE电泳测试不同IPTG浓度对目的蛋白(带MBP标签的NIb蛋白，命名为MBP-NIb)的诱导作用，确认最优化IPTG诱导浓度为0.4mM。2)MBP-NIb蛋白的可溶性分析：在确认IPTG可诱导目的蛋白表达的前提下，分析目的蛋白的可溶性。并测试不同诱导温度对于可溶性目的蛋白比例的影响，确认最佳的诱导温度为20℃，保证可溶性目的蛋白的比例可满足后续的亲和层析纯化。3)可溶性蛋白的AmyloseResin亲和柱层析纯化(MBP标签)：利用AmyloseResin(NEB公司，0111207)制备层析柱，经装柱、平衡、上样、洗脱等步骤纯化可溶性MBP-NIb蛋白，用于后续的体外复制活性测试。4)NIb介导的体外复制体系：首先通过体外转录制备WYMVRNA1和RNA2的不同片段(包括5'末端、中间序列和3'末端),然后测试纯化的MBP-NIb蛋白对于不同RNA片段的催化能力，最终体外复制实验表明MBP-NIb蛋白特异性识别WYMVRNA1和RNA2的3'末端片段，并催化合成其互补链。综上所述，本发明获得了一个可原核表达小麦黄花叶病毒潢川分离物NIb蛋白的质粒载体，该质粒载体名称为pMAL-WYMV-NIb，含有WYMV潢川分离物的NIb蛋白编码序列，该质粒可用来进行NIb蛋白的原核表达，利用纯化的NIb蛋白建立NIb介导的体外复制体系，可用于WYMV基因组复制调控的研究。附图说明图1为WYMV潢川分离物NIb蛋白编码序列的PCR产物电泳结果示意图，其中M为为SinoBio公司的DNALadder5000，PCR产物应为1600bp；图2为质粒pMAL-WYMV-NIb的酶切鉴定结果电泳示意图，其中M为SinoBio公司的DNALadder5000，酶切后分别得到载体和NIb编码片段；图3为质粒pMAL-WYMV-NIb原核表达的预表达结果示意图，其中M为Transgen公司的BluePlusIIProteinMarker。IPTG诱导后有约100kDa的特异蛋白表达，其分子量与NIb(58kD)和MBP标签(40kD)的分子量之和相符；图4为融合MBP的NIb蛋白的可溶性分析结果示意图，其中M为Transgen公司的BluePlusIIProteinMarker，IPTG诱导后有约100kDa的特异蛋白表达，超声波处理后分析可见上清和沉淀中目的蛋白(MBP-NIb)的比例，其中20℃诱导可达到20％左右，而37℃诱导下小于1％；图5为WYMV潢川分离物NIb融合蛋白介导的体外复制结果示意图，体外复制实验是分析纯化得到NIb融合蛋白是否具有催化活性及其识别的特异性模板，由图可知，MBP-NIb可特异性识别RNA1的3'片段和RNA2的3'片段，催化产生各自的互补链；同时可见其中反应条带的强弱也说明MBP-NIb对于不同识别片段(RNA1的3’片段和RNA2的3'片段)的催化效率不同。具体实施方式本发明实施例中除特殊说明外其他均采用现有技术；实施例1可原核表达小麦黄花叶病毒潢川分离物NIb蛋白的质粒载体pMAL-WYMV-NIb的构建方法，具体步骤如下：根据GenBank中公布的WYMV潢川分离物(WYMV-HC)RNA1的序列(登录号：AF067124)，设计引物WYM-R1-4921-BamHI-F和WYM-R1-6504-SalI-R，这对引物的PCR扩增产物即为WYMV潢川分离物NIb蛋白的编码序列。以含有WYMV潢川分离物RNA1全序列的质粒pUWR1-1(董家红，2004，博士论文记载)为模板，在Taq酶(全式金，AP221-01)的作用下进行PCR，引物对为WYM-R1-4921-BamH1-F和WYM-R1-6504-Sal1-R；PCR条件：94℃预变性5min；94℃40s变性，51℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存；扩增得到WYMV潢川分离物的NIb编码序列；此PCR产物经DNA回收试剂盒(全式金，EG101-02)回收后进行BamHI和SalI(Takara)双酶切，与同样双酶切的pMAL-C2X在T4DNA连接酶(Takara,2011A)的作用下在16℃下过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，涂带有100mg/mL氨苄青霉素的LB平板，经菌落PCR筛选、酶切鉴定和DNA测序确认得到阳性克隆pMAL-WYMV-NIb。结果分析：PCR反应产物的电泳结果显示，PCR产物约为1.6kb(图1所示)，与WYMVNIb的编码序列(1584个核苷酸)长度基本吻合。此PCR产物经BamHI和SalI酶切后插入同样经BamHI和SalI酶切的pMAL-C2X中，转化产物经菌落PCR初筛后，提质粒进行酶切鉴定，选用BamHI和SalI双酶切鉴定，酶切结果显示有约1.6kb的酶切条带，并且剩余的酶切片段大小为约6.7kb，基本确认该质粒中含有WYMV-NIb的基因序列(图2所示)；并通过质粒的DNA测序进行最终鉴定。实施例2WYMV潢川分离物NIb蛋白的原核表达：具体操作步骤如下：融合MBP的NIb蛋白的预表达：首先该质粒转化大肠杆菌Rossetta的感受态细胞，涂带有100mg/mL氨苄青霉素的LB平板；挑取含重组质粒的Rossetta菌株置于5ml的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养箱中培养过夜；取过夜培养的菌液按1:100的比例加入到30mL新鲜的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600至0.4-0.6之间；将新鲜培养的菌液放置在冰上10min，分装到指形管中，每管3ml，共6管。加入IPTG至终浓度分别为0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM。37℃，200rpm培养4h；取1.5ml诱导培养物于1.5mL离心管中，13000rpm，离心30s，收集菌体，去上清。样品处理：向收集的菌中加入100μLddH2O，振荡悬浮，加入等体积的2×SDS蛋白上样缓冲液。沸水浴5min，冰上静置5min。跑胶及检测：将上述样品各取10μL点样，120V电泳，至溴酚蓝指示带完全跑出。染色：将分离胶放在培养皿中，加入染色液，保鲜膜密封，在微波炉里中高火加热15s，取出，水平摇床摇动10min，倒掉染色液，染色液回收。脱色：加入脱色液，在微波炉里中高火加热15s，水平摇床摇动10min，去脱色液，加入ddH2O，水平摇床振荡至脱色干净。结果分析：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，与阴性对照(IPTG浓度为0mM)相比，IPTG终浓度分别为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM时，诱导菌液中均有分子量约100kDa的特异蛋白表达(图3所示)，此蛋白分子量与融合MBP的NIb蛋白的大小基本吻合。后续实验中使用中IPTG终浓度为0.4mM。实施例3融合MBP的NIb蛋白的可溶性分析：按照原核表达的基本步骤，在0.4mMIPTG浓度下，诱导10mL菌液，20℃，200rpm振荡培养过夜，并设置对照组；将诱导好的菌液集中在1.5mL离心管中，不同温度诱导条件分别收集1mL菌液(样品处理备用)；将菌体收集物用1.0mL蛋白缓冲液重新悬浮，并加入PMSF(终浓度为0.1mM)。注意：从此步开始，所有操作在冰上进行。超声波破碎(条件：400W，100次，工作4s，间隔4s)在冰上进行。13000rpm，15min，4℃，将上清液和沉淀分开。样品处理将1mL诱导的菌体收集物和1ml未诱导的菌体收集物分别加入100μL水，剧烈振荡悬浮后加入等体积的2×SDS蛋白上样缓冲液。对于超声波处理后的沉淀，处理方法同上；对于超声波处理后的上清液，加入等体积的2×SDS蛋白上样缓冲液。将上述样品沸水浴5min，冰上静置5min。跑胶及检测具体过程见实施例2中的操作；最终检测目的蛋白在上清和沉淀中的比例。结果分析：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示，在37℃下诱导表达的目的蛋白基本都以包涵体的形式存在于沉淀中，上清中目的蛋白含量比例极低，小于1％；而在20℃下诱导表达的目的蛋白在上清中的相对比例明显提高，可达到20％左右(图4所示)，可满足后续的亲和层析实验。实施例4可溶性蛋白的AmyloseResin亲和柱层析纯化(适用于MBP标签)：按照上述原核表达的方法，0.4mMIPTG于20℃诱导500mL菌液，离心后用柱平衡缓冲液重悬菌体，并进行超声波破碎；离心后将上清液用0.45μm的水系滤膜过滤至50ml离心管中，置冰上备用，等待过层析柱。亲和层析(4℃环境中进行)，装柱：取2mLAmyloseResin(NEB公司，0111207)填料加入层析柱中，使液体流出；平衡：用5-10倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；上样：将样品通过层析柱；洗涤：用5-10倍柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱，收集流出液；洗脱：用3mL洗脱液洗脱目的蛋白(用离心管收集洗脱液，每管500μl，并做标记，放置于冰上)。检测：上清液、洗涤液和不同浓度maltose的洗脱液各取10μl进行SDS-PAGE电泳，检测纯化蛋白的质量。最终，将含有目的蛋白的溶液储存在-80℃。其中所采用的平衡缓冲液(AmyloseResin)：20mMTris-Cl(pH8.0)，25mMNaCl，1mMEDTA(pH8.0)，10mMβ-mercaptoethanol，10％glycerol；洗脱缓冲液(AmyloseResin)：在平衡缓冲液中加入0.5Mmaltose母液，使maltose终浓度达到10mM。实施例5体外转录制备WYMVRNA1和RNA2的不同RNA片段：以含有WYMV潢川分离物RNA1和RNA2全序列的质粒pUWR1-1和pUWR2-1(董家红，2004，博士论文记载)为模板，通过PCR扩增获得对应于WYMV不同位置的PCR片段(所用引物和扩增片段见表1)，并利用DNA回收试剂盒(全式金，EG101-02)进行切胶回收。利用以上PCR产物为模板，在T7RNA聚合酶(普洛麦格，P2075)的作用下进行体外转录反应(反应体系：PCR产物4.0μg，100mMDTT12.0μl，5mMrNTPs12.0μl，5×T7Buffer24.0μl，Rnase酶抑制剂0.5μl，T7RNA聚合酶2.0μl，H2O补至120μl)，反应温度37℃，反应时间2.5h；反应产物经1.5％的琼脂糖凝胶电泳后切胶纯化对应的RNA片段。纯化后RNA片段作为体外复制的模板备用。实施例6WYMVNIb介导的体外复制体系：在MBP-NIb蛋白的作用下进行体外复制反应(反应体系：RNA模板1.0μg，1MTris-Cl(pH8.2)2.5μl，1MMgCl20.5μl，1MDTT0.5μl，1MKCl5μl，10mg/mlyeasttRNA1.75μl，20mMATP2.5μl，20mMGTP2.5μl，20mMCTP2.5μl，1mMUTP0.5μl，α-32P-UTP0.5μl，NIb融合蛋白12.5μl，H2O补至50μl)，反应温度20℃，孵育1h-1.5h；反应结束后加入70μLddH2O混匀，加入120μL酚/仿(0.5mL苯酚/0.5mL氯仿/0.04mL0.5MEDTA/0.01mL10％SDS混合物)抽提；离心上清液加入2.4倍体积的NH4Ac/isopropanol(5MNH4Ac:isopropanol＝1:5),混匀，-20℃过夜沉淀，沉淀经离心、洗涤、晾干；加入10μLRNAloadingbuffer，然后在5％PAGE胶(含8M尿素)中，1500mA电泳1-2h；干胶，压磷屏成像。结果分析：体外复制结果如图5显示，MBP-NIb蛋白可特异性识别WYMVRNA1和RNA2的3'末端序列，产生其互补链。其中反应条带的强弱也说明MBP-NIb对于不同特异性识别片段(RNA1的3’片段和RNA2的3'片段)的催化效率不同。说明此通过质粒pMAL-WYMV-NIb原核表达并纯化的MBP-NIb蛋白可介导针对WYMV的体外复制体系。<110>山东农业大学<120>一个可原核表达小麦黄花叶病毒潢川分离物NIb蛋白的质粒载体<160>16<210>1<211>1590<212>DNA<213>人工序列<400>1atggcctccgacactctcagcaagatcaacaactccatccttggcttt48MetAlaSerAspThrLeuSerLysIleAsnAsnSerIleLeuGlyPhe151015ggaagtgatttgaaaggccagcttgttcaacccgtaacaccagctcta96GlySerAspLeuLysGlyGlnLeuValGlnProValThrProAlaLeu202530cgcactcgctttgaggccctgttcggtggtggaagcttcgaactcgtc144ArgThrArgPheGluAlaLeuPheGlyGlyGlySerPheGluLeuVal354045ggaacaatgaacaaaggactcatagacaaacacataattgttggggag192GlyThrMetAsnLysGlyLeuIleAspLysHisIleIleValGlyGlu505560aacgacaacgttcatgatttcatgagagagcaccccacttttgcttgg240AsnAspAsnValHisAspPheMetArgGluHisProThrPheAlaTrp65707580cttcagggtttcatggacgaatacgcaccaagtgtcttgaactactcg288LeuGlnGlyPheMetAspGluTyrAlaProSerValLeuAsnTyrSer859095gcttactacaaggatctttgcaagtacaataggaagaagcaccaactc336AlaTyrTyrLysAspLeuCysLysTyrAsnArgLysLysHisGlnLeu100105110tccttcaaccctcacgagcttcggagtgccaccgctggaatgatcaga384SerPheAsnProHisGluLeuArgSerAlaThrAlaGlyMetIleArg115120125atgttggaagacgccggcctaactcaaggcgacgtgaggacaccccaa432MetLeuGluAspAlaGlyLeuThrGlnGlyAspValArgThrProGln130135140caggttgtttcagacatgcagtggaacacttccgccggaccaagctac480GlnValValSerAspMetGlnTrpAsnThrSerAlaGlyProSerTyr145150155160cagggcaagaaaagagacgtttgcgcacatctcagcgagcaggaagtt528GlnGlyLysLysArgAspValCysAlaHisLeuSerGluGlnGluVal165170175ctacaccttgcagaaacgtcgcgacacagatttctagcctgcaattcc576LeuHisLeuAlaGluThrSerArgHisArgPheLeuAlaCysAsnSer180185190atcggcatttggaacggatcgctcaaagcagagcttaggacgattgag624IleGlyIleTrpAsnGlySerLeuLysAlaGluLeuArgThrIleGlu195200205aaagtagaagctgagaaaaccagagttttcacggcttcgccaatcacg672LysValGluAlaGluLysThrArgValPheThrAlaSerProIleThr210215220agcctattcgccatgaagttctacgttgacgatttcaacaagaagttc720SerLeuPheAlaMetLysPheTyrValAspAspPheAsnLysLysPhe225230235240tatgcgacaaacctgaaagctccacacacggtaggaatcaacaaattc768TyrAlaThrAsnLeuLysAlaProHisThrValGlyIleAsnLysPhe245250255agcagaggctgggaaatgctccacgacaagctcaaccgcccaggttgg816SerArgGlyTrpGluMetLeuHisAspLysLeuAsnArgProGlyTrp260265270cttcacggcagtggcgatgggtcacgattcgatagttcaattgaccct864LeuHisGlySerGlyAspG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