本发明涉及组织工程关节软骨损伤修复治疗领域，具体来说是一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法。
背景技术：
关节软骨缺损在临床较为常见，目前治疗关节软骨缺损的主要方法均有明显缺陷,软骨损伤目前的治疗方法包括软骨成形术、骨髓刺激技术（即微裂缝），自体骨软骨移植、自体软骨细胞移植疗法等。
骨髓刺激技术临床上一般用于年轻患者较小的病变，其也显示出巨大的成功,自体骨软骨移植通常是用于给患者较小的病变,骨软骨移植也被用于较大的软骨损伤的治疗，但这种技术的使用受移植物来源的限制，造成供体部位的额外损伤，修复后过度生长，骨膜增生，同时有疾病传播的风险。
第一代的细胞疗法即自体软骨细胞移植（autologouschondrocyteimplantation,aci），将自体软骨细胞悬液注入缺损中以修复损伤。大量的研究表明，aci技术可显著改善运动功能，减轻症状，产生透明样软骨。但是这种技术需取健康的骨膜缝合固定，对健康组织产生影响，且技术复杂，手术时间长，存在修复后过度生长，骨膜增生，骨膜脱落，细胞流失等风险，限制了这种技术的应用。第二代细胞疗法采用一种可吸收的胶原膜覆盖软骨缺损，替代自体健康骨膜组织，这种技术与第一代的细胞疗法具有类似的疗效，减少了对健康组织的损害。但其仍需两次手术，仍需缝合，技术相对复杂，细胞分布不均衡，存在细胞流失的风险。
第三代细胞疗法将培养的自体软骨细胞种植在可吸收的胶原膜上，通过纤维蛋白胶固定于损伤处,无需缝合，手术时间显著缩短，疗效显著，不受损伤面积的限制，临床效果持久，克服了第一、第二代aci技术的缺点。但是仍需二次手术，治疗费用高昂。
另一方面，随着组织工程技术的发展，干细胞技术日益成熟，其在医学上应用也越来越被关注,由于干细胞具有组织全能性，能分化成各种组织细胞，尤其是可分化成软骨细胞，这使其在临床上应用于修复软骨损伤成为可能。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术中的治疗效果差、成本高的缺陷，提供一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法来解决上述问题。
本发明公开了一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法，具体步骤为：
（1）、在无菌条件下，用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去针头后，加入含10mldmem高糖培养基的培养瓶中，混匀后得到骨髓悬液，备用；
（2）、在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封带入实验室中，然后将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再对上清离心30min，去沉淀，0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；
（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，进行梯度离心，即在2000rpm的条件下，离心20min；
（4）、吸取中间白膜层，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；
（5）、向dmem高糖培养基中加入fgf-2、自体血清、庆大霉素，直至dmem高糖培养基中的fgf-2的质量浓度为10ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，然后将目的细胞加入15ml含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的dmem高糖培养基中，吹打计数，以5×105/cm2接种于t25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的co2培养箱中培养，以后每三天更换一次dmem高糖培养基，该dmem高糖培养基同样含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml；
（6）、细胞贴壁达到90%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入3-5ml高糖dmem培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培养基中加入fgf-2、自体血清、庆大霉素，直至dmem高糖培养基中的fgf-2的质量浓度为10ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，用含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的高糖dmem培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（10）、细胞培养3-4周后，细胞传代3次；
（11）、吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入3-5ml高糖dmem培养基终止消化；
（12）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；
（13）、用0.3-1ml生理盐水重悬细胞，得到细胞悬液；
（14）、取无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根据膜的面积，细胞数约2×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；
（15）、待胶原膜吸附细胞10-15min后，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200u/ml。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的dmem高糖培养基中含有庆大霉素，所述的dmem高糖培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml。
所述的步骤（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
作为优选，本发明所述的接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的使用方法为：取本发明制得的接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜，使糙面朝向关节软骨缺损处，光面朝向关节腔，固定于软骨缺损处，以修复软骨损伤。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本发明采用了一种猪腹膜源的ⅰ/ⅲ型胶原双分子层膜结构，其一面具有相对较高密度的胶原纤维，表面摩擦较低，细胞不通透，可阻止细胞向关节腔扩散，另一面为粗糙的表面，上面空隙较大，有利于软骨细胞附着其中，这种膜具有持久性、耐撕裂，其可承受切割、打孔、缝合等操作，其具有弹性，可修成不同形状，不会随着时间的推移而收缩,其具有可吸收性，移植2周后可被降解吸收,可作为极佳的组织工程支架材料,治疗效果好，而且成本较低；
2、本技术通过对第二代aci技术的改进，使比第三代技术更高密度、更均匀分布的细胞吸附于胶原膜上，其方案为取无菌干燥猪胶源ⅰ/ⅲ型胶原膜修剪成与软骨损伤处相同的形状，然后接种高浓度软骨细胞，细胞数约2×106/cm2使其达到饱和湿度，使胶原膜吸附细胞10-15min，细胞即可均匀吸附。该方案先修剪胶原膜为需要形状，再接种细胞，可以避免因修剪和切割孵育了细胞的膜而引起的关键软骨细胞的损失，本技术有利于细胞在体内的扩增和分布，同时可以缩短术后的康复时间，操作上也更简单化，同时也保留了第三代技术的疗效和操作的简单性；
3、采用骨髓间充质干细胞（bonemarrow–derivedmesenchymalstemcells，bmsc)作为种子细胞，其来源充足，通过简单的骨髓穿刺就可取材，不存在组织配型及免疫排斥反应，体外培养性能稳定，易于传代扩增，可克服体内软骨细胞作为种子细胞来源有限、体外扩增易导致种子细胞老化及生物学功能衰退的缺点，同时也减少了患者手术次数，降低治疗费用；
4、使用自体血清，避免了使用胎牛血清可能引起的免疫原性反应；
5、本发明可用于治疗3-20cm2的软骨损伤面积，修复面大；
6、使用了10ng/ml的成纤维生长因子-2（fgf-2）,其可促进骨髓间充质干细胞分裂增殖，缩短细胞培养周期，又有利于维持细胞的分化潜能，有利于细胞后期分化为为软骨细胞。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明公开了一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法，具体步骤为：
（1）、在无菌条件下，用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去针头后，加入含10mldmem高糖培养基的培养瓶中，混匀后得到骨髓悬液，备用；
（2）、在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封带入实验室中，然后将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再对上清离心30min，去沉淀，0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；
（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，进行梯度离心，即在2000rpm的条件下，离心20min；
（4）、吸取中间白膜层，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；
（5）、向dmem高糖培养基中加入fgf-2、自体血清、庆大霉素，直至dmem高糖培养基中的fgf-2的质量浓度为10ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，然后将目的细胞加入15ml含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的dmem高糖培养基中，吹打计数，以5×105/cm2接种于t25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的co2培养箱中培养，以后每三天更换一次dmem高糖培养基，该dmem高糖培养基同样含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml；
（6）、细胞贴壁达到90%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入3-5ml高糖dmem培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培养基中加入fgf-2、自体血清、庆大霉素，直至dmem高糖培养基中的fgf-2的质量浓度为10ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，用含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的高糖dmem培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（10）、细胞培养3-4周后，细胞传代3次；
（11）、吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入3-5ml高糖dmem培养基终止消化；
（12）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；
（13）、用0.3-1ml生理盐水重悬细胞，得到细胞悬液；
（14）、取无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根据膜的面积，细胞数约2×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；
（15）、待胶原膜吸附细胞10-15min后，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200u/ml。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的dmem高糖培养基中含有庆大霉素，所述的dmem高糖培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml。
所述的步骤（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
作为优选，本发明所述的接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的使用方法为：取本发明制得的接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜，使糙面朝向关节软骨缺损处，光面朝向关节腔，固定于软骨缺损处，以修复软骨损伤。
实施例1
本发明公开了一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法，具体步骤为：
（1）、在无菌条件下，用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去针头后，加入含10mldmem高糖培养基的培养瓶中，混匀后得到骨髓悬液，备用；
（2）、在无菌条件下，取患者外周血150ml，置于血袋中，密封带入实验室中，然后将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再对上清离心30min，去沉淀，0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；
（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，进行梯度离心，即在2000rpm的条件下，离心20min；
（4）、吸取中间白膜层，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；
（5）、向dmem高糖培养基中加入fgf-2、自体血清、庆大霉素，直至dmem高糖培养基中的fgf-2的质量浓度为10ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，然后将目的细胞加入15ml含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的dmem高糖培养基中，吹打计数，以5×105/cm2接种于t25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的co2培养箱中培养，以后每三天更换一次dmem高糖培养基，该dmem高糖培养基同样含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml；
（6）、细胞贴壁达到90%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱2min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入4ml高糖dmem培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培养基中加入fgf-2、自体血清、庆大霉素，直至dmem高糖培养基中的fgf-2的质量浓度为10ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，用含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的高糖dmem培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（10）、细胞培养3周后，细胞传代3次；
（11）、吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于温箱2min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入4ml高糖dmem培养基终止消化；
（12）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；
（13）、用0.3-1ml生理盐水重悬细胞，得到细胞悬液；
（14）、取无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根据膜的面积，细胞数约2×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；
（15）、待胶原膜吸附细胞14min后，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200u/ml。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的dmem高糖培养基中含有庆大霉素，所述的dmem高糖培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml。
所述的步骤（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
实施例2
本发明公开了一种接种自体骨髓间充质干细胞的胶原膜的制备方法，具体步骤为：
（1）、在无菌条件下，用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出骨髓9ml,去针头后，加入含10mldmem高糖培养基的培养瓶中，混匀后得到骨髓悬液，备用；
（2）、在无菌条件下，取患者外周血180ml，置于血袋中，密封带入实验室中，然后将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再对上清离心30min，去沉淀，0.22μm孔径过滤除菌，得到自体血清，分装待用；
（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，进行梯度离心，即在2000rpm的条件下，离心20min；
（4）、吸取中间白膜层，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，再加入50mlpbs吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，得到的沉淀即为目的细胞；
（5）、向dmem高糖培养基中加入fgf-2、自体血清、庆大霉素，直至dmem高糖培养基中的fgf-2的质量浓度为10ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，然后将目的细胞加入15ml含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的dmem高糖培养基中，吹打计数，以5×105/cm2接种于t25细胞培养瓶中，置于37℃，5%的co2培养箱中培养，以后每三天更换一次dmem高糖培养基，该dmem高糖培养基同样含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml；
（6）、细胞贴壁达到90%以上后，吸干培养液，用pbs液轻洗细胞两次；
（7）、向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于37℃，5%的co2温箱3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入5ml高糖dmem培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，再将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，再将细胞悬液转移到50ml离心管内，再加入45ml高糖dmem培养基，在1200rpm的条件下，离心7min，去上清后，重复上述步骤两次，即得到清洗后的沉淀；
（9）、向dmem高糖培养基中加入fgf-2、自体血清、庆大霉素，直至dmem高糖培养基中的fgf-2的质量浓度为10ng/ml、自体血清的体积浓度为10%、庆大霉素的质量浓度为45ug/ml为止，用含10ng/mlfgf-2、10%自体血清、庆大霉素45ug/ml的高糖dmem培养基调节细胞浓度为1×108/l，将细胞接种于75cm2细胞培养瓶内继续培养；
（10）、细胞培养3周后，细胞传代3次；
（11）、吸干培养液，向培养瓶内加入胰蛋白酶-edta溶液，胰蛋白酶-edta溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶-edta溶液中的edta的质量浓度为0.01%，直至覆盖所有细胞为止，然后置于温箱2min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入3ml高糖dmem培养基终止消化；
（12）、将细胞悬液在1200rpm的条件下，离心7min，弃上清，再用生理盐水洗涤细胞3次；
（13）、用0.3ml生理盐水重悬细胞，得到细胞悬液；
（14）、取无菌干燥猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜并修剪成与软骨损伤处一样的形状，置于无菌塑料平皿中，糙面朝上，光面朝下放置，再根据膜的面积，细胞数约2×106/cm2，用塑料套管缓慢滴加细胞悬液于准备好的猪源ⅰ/ⅲ型胶原膜的糙面上，直至胶原膜达到湿饱和状态；
（15）、待胶原膜吸附细胞15min后，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200u/ml。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的dmem高糖培养基中含有庆大霉素，所述的dmem高糖培养基中的庆大霉素的浓度为45ug/ml。
所述的步骤（7）、（11）中，胰蛋白酶-edta溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。