本发明涉及一种富含RG-I的超低分子量果胶的制备方法，特别涉及一种利用超声辅助氧化处理绿色、快速制备超低分子量果胶的方法，属于多糖降解领域。
背景技术：
果胶主要是由D-半乳糖醛酸经α-1,4糖苷键连接的一类酸性杂多糖，其侧链含有大量的鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等中性糖。果胶主要包括均聚半乳糖醛酸聚糖(HG)、鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RG-I)和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RG-II)三个结构域，其广泛存在于植物中，如苹果、柑橘、番石榴、向日葵花盘及甘薯渣中，且被认为是一种可溶性的膳食纤维，具有降低胆固醇、预防糖尿病、防止肥胖以及维持肠道健康等多种生理功能。但果胶分子量太大，不易被消化吸收，因此限制其在小肠中的吸收，影响其生理活性的发挥。而改性后的超低分子量果胶溶解性好，易被吸收，且RG-I含量增加，并能表现出更强的生物活性，因此开发新型降解果胶的方法，制备改性低分子量果胶具有重要意义。
目前果胶降解的方法主要包括生物降解、物理降解和化学降解。生物酶解反应温和，专一性高，但反应条件苛刻，成本较高。物理降解法主要有超声降解、辐射降解、微波降解等，辐射法降解效率最高，但对分子结构破坏大，且安全性存在争议，使其应用受到限制；微波降解易产生高温影响降解产物生物活性；超声降解对产物活性结构破坏小，但其降解能力有限，只能将果胶降解至30kDa左右，仍不能被人体吸收。化学降解目前主要包括酸降解和碱降解，但由于加入强酸、强碱等，易造成环境污染，反应速率较慢，且一般在高温下进行反应，因此对结构影响破坏较大，降低生物活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于改进目前制备RG-I型超低分子量果胶技术，提供了一种绿色、安全、快速的富含RG-I的超低分子量果胶的制备方法。
实现本发明生产工艺的主要特征包括以下步骤：
(1)取蒸馏水，加入适量HCl溶液调整pH在3-5之间，加入FeCl2·4H2O、FeSO4·7H2O、Cu(CH3COO)2·H2O或CuSO4·5H2O，配置成金属离子浓度为0.5-5mmol/L的溶液A；
(2)取果胶溶于溶液A中，使得果胶的浓度为2-10mg/mL，涡旋振荡仪震荡，使其完全溶解；
(3)在步骤2配制的果胶溶液中加入5mol/LH2O2溶液，使金属离子与过氧化氢摩尔浓度比为1:20，转移到0-50℃环境中进行超声处理，超声强度为1.5-20W/mL。
(4)超声处理后，加入亚硫酸氢钠，终止反应；然后通过阳离子交换树脂柱置换溶液中的阳离子；
(5)对步骤4处理后的溶液进行4000r/min离心，取上清液，调整上清液pH至5-8；
(6)将步骤5处理后的上清液转移至500Da的透析袋，流水透析24h，纯水透析12h，后将其置于真空冷冻机中冻干，得到富含RG-I的超低分子量果胶。
进一步地，所述步骤2中，果胶的浓度为5mg/mL。
进一步地，所述步骤3中，超声处理的环境温度为30℃，超声强度为3-5W/mL
进一步地，所述步骤5中，上清液pH优选6。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明为富含RG-I超低分子量果胶提供一种绿色、安全、快速降解方法，得率可达到65％以上，所得产品纯度较高、质量稳定、成本低。
(2)降解工艺简单，反应时间短，所用树脂可重复利用，工艺条件环保无污染。
(3)本发明所得果胶的重均分子量在5-10kDa，酯化度下降，产物多为富含RG-I的超低分子量果胶，抗氧化活性显著高于原果胶，综合利用率提高。
具体实施方式
本发明通过超声强化氧化反应，促进反应体系(如公式1)中生成的Fe3+还原为Fe2+，强化Fe2+与过氧化氢重新反应，产生羟基自由基，造成果胶糖链氧化断裂，且特异型攻击果胶中的半乳糖醛酸，形成富含RGI结构域的低分子量果胶。
Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-
下面结合具体施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1：
(1)取25mL蒸馏水，加入3mol/L HCl溶液，用pH计调整pH为3.0，加入FeCl2·4H2O，配置成0.5mmol/L Fe2+的溶液A；
(2)取60mg果胶(Sigma公司)溶解于25ml溶液A中，充分溶解后，转移至超声管(内径3cm)中；
(3)将其置于30℃恒温槽中，将超声探头置于液面下1.5cm处进行超声处理，同时加入50μL 5mol/LH2O2溶液，设定超声强度1.5W/mL，超声处理40min；
(4)在降解液中加入过量亚硫酸氢钠，还原多余的双氧水，以终止反应；
(5)将步骤4处理后的溶液通过阳离子交换树脂柱，控制流速为0.5mL/min，使得阳离子交换树脂置换其中的金属阳离子；
(6)将置换后的溶液4000r/min离心，取上清液，调整pH 6.0；
(7)将上述溶液转移至500Da的透析袋流水透析24h，纯水透析12h，后将其置于真空冷冻机中冻干；取果胶样品进行分子量及单糖组成测定，结果如表1所示，处理后，分子量由448.26kDa降至6.32kDa，果胶RG-I域比例增加，主要以RG-I结构为主。
表1 降解前后果胶单糖组成
本实施例通过40分钟快速地完成了果胶的降解，从表中可以看出，降解后的果胶寡糖中，半乳糖含量大大降低，且Rha/GalA比值从0.13升至0.55，，说明RG-I结构域占比分布增加，(Gal+Ara)/Rha代表RG-I侧链长度，侧链长度略微下降，但相对于RG-I结构域占比和半乳糖酸酸含量，其改变较小。此外，GalA/(Fuc+Rha+GlcA+Ara+Gla+Xyl)比值从2.20将至0.56，说明果胶线性度显著下降，即支链度升高，从以上信息可以推测出超声结合氧化降解，主要作用于果胶中HG域，造成HG域含量降低，而RG-I结构较好的保留，从而制备出富含RG-I果胶。
实施例2：
(1)取100mL蒸馏水，加入3mol/L HCl溶液，用pH计调整pH为4.0，加入FeCl2·4H2O，配置成2mmol/L Fe2+的溶液A；
(2)取500mg果胶(Sigma公司)溶解于100ml溶液A中，充分溶解后，转移至超声管(内径6cm)中；
(3)将其置于30℃恒温槽中，将超声探头置于液面下1.5cm处进行超声处理，同时加入800μL高浓度H2O2溶液，设定超声强度4.0W/mL，超声处理30min；
(4)在降解液中加入过量亚硫酸氢钠，还原多余的双氧水，以终止反应；
(5)将步骤4处理后的溶液通过阳离子交换树脂柱，控制流速为1.0mL/min，使得阳离子交换树脂置换其中的金属阳离子；
(6)将置换后的溶液4000r/min离心，取上清液，调整pH 6.0；
(7)将上述溶液转移至500Da的透析袋流水透析24h，纯水透析12h，后将其置于真空冷冻机中冻干；取果胶样品进行分子量及单糖组成测定，结果如表2所示，处理后，分子量由448.26kDa降至7.29kDa，果胶RG-I域比例增加，主要以RG-I结构为主。
表2 降解前后果胶单糖组成
本实施例通过30分钟快速地完成了果胶的降解，从表中可以看出，降解后的果胶寡糖中，半乳糖含量大大降低，且Rha/GalA比值从0.13升高至0.53，说明RG-I结构域占比分布显著增加，(Gal+Ara)/Rha代表RG-I侧链长度，侧链长度略微下降，但相对于RG-I结构域占比和半乳糖酸酸含量，其改变较小。此外，GalA/(Fuc+Rha+GlcA+Ara+Gla+Xyl)比值从2.20将至0.58，说明果胶线性度下降，即支链度升高，从以上信息可以推测出超声结合氧化降解，主要作用于果胶中HG域，造成HG域含量降低，而RG-I结构较好的保留，从而制备出富含RG-I果胶。
实施例3：
(1)取1000mL蒸馏水，加入3mol/L HCl溶液，用pH计调整pH为5.0，加入FeCl2·4H2O，配置成5mmol/L Fe2+的溶液A；
(2)取10g果胶(Sigma公司)溶解于1000ml溶液A中，充分溶解后，转移至超声槽中；
(3)将其置于40℃恒温槽中，并加入20mL高浓度H2O2溶液，设定超声强度4.0W/mL，超声处理30min；
(4)在降解液中加入过量亚硫酸氢钠，还原多余的双氧水，以终止反应；
(5)将步骤4处理后的溶液通过阳离子交换树脂柱，控制流速为2.0mL/min，使得阳离子交换树脂置换其中的金属阳离子；
(6)将置换后的溶液4000r/min离心，取上清液，调整pH 6.0；
(7)将上述溶液转移至500Da的透析袋流水透析24h，纯水透析12h，后将其置于真空冷冻机中冻干；取果胶样品进行分子量及单糖组成测定，结果如表2所示，处理后，分子量由448.26kDa降至2.14kDa，果胶RG-I域比例增加，主要以RG-I结构为主。
表3 降解前后果胶单糖组成
本实施例通过30分钟快速地完成了果胶的降解，从表中可以看出，降解后的果胶寡糖中，半乳糖含量大大降低，且Rha/GalA比值从0.13升高至0.61，说明RG-I结构域占比分布显著增加，(Gal+Ara)/Rha代表RG-I侧链长度，侧链长度略微下降，但相对于RG-I结构域占比和半乳糖酸酸含量，其改变较小。此外，GalA/(Fuc+Rha+GlcA+Ara+Gla+Xyl)比值从2.20将至0.53，说明果胶线性度下降，即支链度升高，从以上信息可以推测出超声结合氧化降解，主要作用于果胶中HG域，造成HG域含量降低，而RG-I结构较好的保留，从而制备出富含RG-I果胶。