一种酰基化黄酮四糖苷及其提取方法和应用与流程

本发明属于化学技术领域，具体涉及一种名为茶山奈酚糖苷c的酰基化黄酮四糖苷及其提取方法和应用。

背景技术：

茶起源于中国，最早是以其药用功能而被我们的祖先发现并利用的，距今已有3000多年的历史，先后经历了从药用到食用至而今普及全球的饮品的演变。作为风靡世界的饮料，茶叶不仅仅是依靠其独特的风味而备受消费者亲睐，更关键的因素是由于茶叶所含有的功能成分和保健功效。随着人们对健康的日益重视，茶叶的健康功能研究也引起了研究者的广泛兴趣。研究表明茶叶具有抗癌、抗氧化、降脂减肥、降血糖、抗过敏、杀菌、抗病毒、保护肝脏等作用。

六安瓜片属于绿茶类，产于安徽六安，为中国十大名茶之一，有着悠久的历史底蕴和深厚的文化内涵。大部分的茶叶都是以芽叶相连采摘加工而成的，而六安瓜片则是以单片叶加工而成的，同时还兼具干燥过程中的独特的拉老火技艺，使得其与其他绿茶不同，同时也深受消费者亲睐。

黄大茶顾名思义属于黄茶类，安徽的黄大茶主要产于安徽霍山一带，黄大茶的特点是叶大、梗长、黄色黄汤，具有浓裂的高火香，俗称锅粑香。黄大茶的加工原料以粗老叶为主，闷黄是其特有的加工工序。近期有相关研究表明黄大茶有很好的降血糖功效且降血糖功效优于绿茶和红茶。

关于六安瓜片和黄大茶生物活性的化学基础的报道比较少，如果能成功的从六安瓜片及黄大茶中研究开发出具有生物活性的黄酮苷类生物成分，将会对皖西地区六安瓜片及黄大茶品牌的发展和宣传提供一定的帮助，同时也能对农业和医药等领域作出重要贡献。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种从六安瓜片和黄大茶中分离制备得到的名为茶山奈酚糖苷c的酰基化黄酮四糖苷，此名为茶山奈酚糖苷c的酰基化黄酮四糖苷具有如下所示结构：

本发明的目的之二是提供一种上述名为茶山奈酚糖苷c的酰基化黄酮四糖苷的制备方法，包括以下两种路径：

路径a：

1)原料粉碎：

取干燥的六安瓜片成品茶或者黄大茶，将其粉碎成粉末状；

2)浸提

用70-80％丙酮水浸提粉碎后的六安瓜片成品茶或者黄大茶得到浸提液，经过分级萃取和减压浓缩得到最后剩余的水部位膏状物；

3)分离纯化

将水部位膏状物分离纯化得到茶山奈酚糖苷c。

作为优选，所述步骤2)浸提中，先用70-80％丙酮水浸提粉碎后的六安瓜片或黄大茶得到浸提液，再用二氯甲烷、乙酸乙酯分级萃取，提取液经过减压浓缩制得相应萃取部位膏状提取物：二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和剩余的水部位膏状物。

作为优选，所述步骤3)中所述的分离纯化是将所述水部位膏状物溶解后依次经mci柱层析、硅胶柱层析、sephadexlh-20凝胶柱层析、toyopearl柱层析分离纯化。

作为优选，所述步骤3)中所述的分离纯化的具体步骤为：将水部位膏状物用水溶解后过mci柱使用meoh-h2o体积比0∶100到100∶0作为梯度洗脱，收集其中meoh-h2o体积比70∶30到80∶20的洗脱组分；然后将所得的洗脱组份经硅胶柱层析，以ch2cl2-meoh体积比20∶1，15∶1，10∶1，5∶1到0∶1作为梯度洗脱，收集其中ch2cl2-meoh体积比5∶1的洗脱组分；所得洗脱组份再经sephadexlh-20凝胶柱层析，以meoh作为洗脱剂洗脱，收集得到洗脱组分；洗脱组分再经toyopearl柱层析、洗脱，得到山奈酚糖苷c。

路径b：

1)原料粉碎：

取干燥的六安瓜片成品茶或者黄大茶，将其粉碎成粉末状；

2)浸提

用70-80％丙酮水浸提粉碎后的六安瓜片成品茶或者黄大茶得到浸提液，经过分级萃取和减压浓缩得到最后剩余的正丁醇部位膏状物；

3)分离纯化

将正丁醇部位膏状物分离纯化得到茶山奈酚糖苷c。

作为优选，所述路径b步骤2)浸提中，先用70-80％丙酮水浸提粉碎后的六安瓜片或黄大茶得到浸提液，再用二氯甲烷、乙酸乙酯分级萃取，提取液经过减压浓缩制得相应萃取部位膏状提取物：二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和剩余的水部位，水部位用正丁醇萃取，最后得到正丁醇部位膏状物。

作为优选，所述路径b步骤3)中所述的分离纯化是将正丁醇部位膏状物溶解后依次经mci柱层析、sephadexlh-20凝胶柱层析分离纯化得到山奈酚糖苷c。

作为优选，所述路径b步骤3)中所述的分离纯化的具体步骤为：

将正丁醇部位膏状物用水溶解后过mci柱层析使用meoh-h2o体积比20∶80到100∶0作为梯度洗脱，收集其中meoh-h2o体积比70∶30到80∶20的洗脱组分；然后将所得的洗脱组份经sephadexlh-20凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂洗脱，收集得到洗脱组分；洗脱组分再经层析、洗脱，得到山奈酚糖苷c。

作为优选，以上a、b两种路径中：所述步骤2)浸提中，有机溶剂提取采用浸泡方式提取，即将粉碎后的六安瓜片或黄大茶都同样分别浸泡在有机溶剂中70-80小时；或者将粉碎后的六安瓜片或黄大茶都同样分别用有机溶剂超声波振荡提取。

本发明的目的之三是将如上所述的名为茶山奈酚糖苷c的酰基化黄酮四糖苷应用于降脂减肥药物方面的应用。

具体地说是将如上所述的茶山奈酚糖苷c的酰基化黄酮四糖苷和药学上所通用的辅料制成一种降脂减肥药物，所述药物剂型包括口服型、外用型和注射型。

本发明的有益效果如下：

1)通过试验证实，本发明所述名为茶山奈酚糖苷c的酰基化黄酮四糖苷在诱导的3t3-l1细胞中有一定抑制脂质积累作用，可以应用于制备降脂减肥药物方面。因此本发明提供的具有医学活性的黄酮苷类化合物，对农业和医药领域具有重要的意义；

2)同时为有效开发利用六安瓜片和黄大茶提供了更为广阔的前景。

3)本发明制备方法简单，成本较低。

附图说明

图1为茶山奈酚糖苷c的化学结构式。

图2为茶山奈酚糖苷c及另外三个黄酮糖苷对3t3-l1细胞中脂质积累的抑制试验示意图，其中1为茶山奈酚糖苷c，2为茶山奈酚糖苷a，3为茶槲皮素糖苷c，4为茶槲皮素糖苷a。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

一、茶山奈酚糖苷c的制备

实施例1：

从六安瓜片中的制备

(1)取9.0公斤干燥的六安瓜片成品茶，并将其粉碎成粉末状；

(2)首先将9.0公斤干燥的六安瓜片用29升80％丙酮水常温浸提72小时，然后在70hz下超声浸提2小时；得80％丙酮水部位提取液；按上述步骤浸提三次，合并提取液并将提取液浓缩至膏状，得提取液5升；

然后将提取液用5升二氯甲烷萃取三次，得水层及二氯甲烷层，合并二氯甲烷层并浓缩，得二氯甲烷提取浸膏400克；

水层再加4升乙酸乙酯萃取三次，得水层及乙酸乙酯层，分别合并乙酸乙酯层及水层浓缩后得乙酸乙酯部位浸膏760克，得水部位浸膏630克。

(3)取400克水部位浸膏用500ml热水溶解，再通过mci柱层析，使用meoh-h2o体积比0∶100到100∶0梯度洗脱，收集其中meoh-h2o体积比70∶30到80∶20的洗脱组分；然后将所得的洗脱组份经硅胶柱层析，以ch2cl2-meoh体积比20∶1，15∶1，10∶1，5∶1到0∶1作为梯度洗脱，收集其中ch2cl2-meoh体积比5∶1的洗脱组分；所得洗脱组份再经sephadexlh-20凝胶柱层析，以meoh作为洗脱剂洗脱，收集得到七个洗脱组分；组分六经toyopearl柱层析，以甲醇作为洗脱剂洗脱，收集得到四个洗脱组分；组分二为茶山奈酚糖苷c(kaempferol3-o-[e-p-coumaroyl-(1→2)][α-l-arabinopyranosyl-(1→3)][β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-d-glucopyranoside，12.7毫克)。该分离流程同时也分到了另外三个黄酮糖苷，分别为茶山奈酚糖苷a，茶槲皮素糖苷a，茶槲皮素糖苷c。

实施例2：从黄大茶中的制备

(1)取10公斤干燥的黄大茶，并将其粉碎成粉末状；

(2)首先将10公斤干燥的黄大茶先用30升80％丙酮水常温浸提72小时，然后在70hz下超声浸提2小时；得80％丙酮水部位提取液；按上述步骤浸提三次，合并提取液并将提取液浓缩至膏状，得提取液5升；

然后将提取液液用5升二氯甲烷萃取三次，得水层及二氯甲烷层，合并二氯甲烷层并浓缩，得二氯甲烷提取浸膏700克。

水层再加4升乙酸乙酯萃取三次，得水层及乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯层得乙酸乙酯部位浸膏625克。

水层加3l正丁醇萃取三次，得水层及正丁醇层，分别合并正丁醇层及水层浓缩后得正丁醇部位浸膏128克，得水部位浸膏150克。

取93.4克正丁醇部位浸膏用150ml热水溶解，经过mci柱层析，使用meoh-h2o体积比20∶80到100∶0作为梯度洗脱，收集其中meoh-h2o体积比70∶30到80∶20的洗脱组分；然后将所得的洗脱组份经sephadexlh-20凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂洗脱，收集得到八个洗脱组分；组分四经sephadexlh-20凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂洗脱，收集得到三个洗脱组分；组分一为山奈酚糖苷c(kaempferol3-o-[e-p-coumaroyl-(1→2)][α-l-arabinopyranosyl-(1→3)][β-d-glucopyranosyl-(1→3)-α-l-rhamnopyranosyl(1→6)]-β-d-glucopyranoside，6.1毫克)。

实施例3

将原料换为9.0公斤干燥的黄大茶，采用实施例1的方法，制备得到本发明茶山奈酚糖苷c4.2毫克。

实施例4

将原料换为10公斤干燥的六安瓜片成品茶，采用实施例2的方法，制备得到本发明茶山奈酚糖苷c12.5毫克。

从以上实施例可以看出，从经过正丁醇萃取后，后续分离纯化得到该化合物的步骤明显简单。

对比例1

购买市场上的一种花茶，采用实施例1和实施例2的方法没有提取到本发明所述的茶山奈酚糖苷c。

本发明茶山奈酚糖苷c的特性如下：

1)、可溶于甲醇和dmso，黄色固体，

2)、ir(kbr)vmax(cm^-1)：3394，1700，1654，1604，1511，1078；

3)、hr-esi-ms：m/z1033.28429([m-h]^-，c24h19o9^-的理论计算值为1033.28251)；核磁共振光谱数据见表1。

表1：茶山奈酚糖苷c的核磁共振光谱数据(¹hnmr在600mhz，¹³cnmr在150mhz条件下测试，δ单位为ppm，耦合常数j单位为hz，溶剂为氘代dmso)。

表1.山奈酚糖苷c的核磁共振光谱数据

所有波谱数据均通过¹hnmr，¹³cnmr，esi-hr-ms及¹h-¹hcosy，hmqc、hmbc等二维核磁共振谱归属，证明了所得化合物的结构。

二、茶山奈酚糖苷c和另外三个黄酮糖苷的抑制3t3-l1脂肪细胞脂质积累试验

细胞培养：取3t3-l1前脂肪细胞，用含10％胎牛血清和1％双抗的dmem培养基，以一定条件(温度37℃，二氧化碳浓度5％，湿度95％)培养于二氧化碳恒温培养箱中。

细胞活力检测：采用噻唑蓝法测定细胞活力。取3t3-l1前脂肪细胞按照3×10⁴个/ml接种于96孔板，培养24h后分别加入不同质量浓度的化合物(25，50，100和200μm)，连续培养72h后加入20μl的噻唑蓝培养液(5mg/ml)，培养4h后将培养液吸干，每孔加入150μl二甲基亚砜，摇床振荡10min后用酶标仪在490nm波长处测定光密度值。

细胞的诱导分化和油红o染色：将3t3-l1前脂肪细胞接种于24孔板，使用dmem培养基(含10％胎牛血清)培养，当细胞完全融合后，加入胰岛素分化诱导剂(10μg/ml胰岛素、0.5mol/l3-异丁基1-甲基黄磦呤和1μmol/l地塞米松)诱导；3天后更换成dmem培养基培养8天。自诱导开始(0天)，实验组加入不同质量浓度(25，50，100μm)化合物，白藜芦醇作为阳性对照组(20μg/me)。8天后细胞用磷酸缓冲液冲洗，用10％的福尔马林固定后再用60％的异丙醇淋洗，使用0.5％油红o染色，观察胞浆中脂肪的沉积并拍照。油红染色后每孔加入400ul异丙醇处理染色的细胞，在酶标仪510nm出检测光密度值。

实验结果表明，茶山奈酚糖苷c及其他三个黄酮糖苷对3t3-l1脂肪细胞几乎不产生细胞毒性，同时能有效降低3t3-l1脂肪细胞中脂质的积累。当山奈酚糖苷c为50μm作用于3t3-l1脂肪细胞时，3t3-l1脂肪细胞中的脂质的相对含量为55.53％；山奈酚糖苷c为100μm时，3t3-l1脂肪细胞中的脂质的相对含量降低到了50％以下。说明茶山奈酚糖苷c能够有效抑制3t3-l1脂肪细胞中脂质的积累，同时这种抑制效果不是由茶山奈酚糖苷c对3t3-l1细胞的细胞毒性所造成的。

表2.四个黄酮糖苷单体化合物对3t3-l1细胞的细胞毒性

1为茶山奈酚糖苷c，2为茶山奈酚糖苷a，3为茶槲皮素糖苷c，4为茶槲皮素糖苷a。

因此本发明名为茶山奈酚糖苷c的酰基化黄酮四糖苷可应用降脂减肥药物方面的制备。

具体地说是将如上本发明的茶山奈酚糖苷c的酰基化黄酮四糖苷按医学上可接受的剂量和药学上所通用的辅料制成一种降脂减肥药物。该药物剂型包括口服型、外用型和注射型等。

以上内容描述了本发明的基本原理和主要特征，本发明不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。