本发明涉及单域重链抗体技术(又称纳米抗体技术)，以及基因工程抗体技术，特别是针对c-myc标签的单域重链抗体或多肽。
技术背景
c-myc标签蛋白的发现源于1985年evan制备获得了一株针对人原癌基因产物myc蛋白的单克隆抗体9e10，此后研究发现该抗体识别的表位由10个氨基酸残基组成，其序列为glu-gln-lys-leu-ile-ser-glu-glu-asp-leu，并且这10个氨基酸与其它蛋白融合表达后依然能够保持很强的抗原活性，可以被相应抗体识别，而且不受到蛋白框架的影响。因此，c-myc标签系统广泛应用于免疫学检测、细胞成像、亲和纯化以及蛋白质工程等领域。
本发明公开了一种可以与c-myc标签特异性结合的单域重链抗体(即纳米抗体，下同)，可用于c-myc标签融合蛋白的检测及纯化。
目前市场上已经有针对c-myc标签的单克隆或多克隆抗体用于检测，但单克隆抗体的研发和生产过程及其繁琐和复杂，多克隆抗体来源有限。相比之下，单域重链抗体仅由一个结构域组成，具有耐酸碱、耐高温、特异性高、分子量小和可大规模生产等优点，用单域重链抗体作为配基制备的纯化介质具有成本低、可重复使用等优点，应用前景广阔。
技术实现要素：
本发明的目的是提供针对c-myc标签的单域重链抗体，可以被用于制备检测和纯化c-myc标签的试剂和工具。
本发明提供一个针对c-myc标签的单域重链抗体(即本发明能特异性结合c-myc标签的纳米抗体，下同)，具有seqidno.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的imgt编号和结构域的划分包括四个框架区(frameworkregion,fr)和三个互补决定区(complementarity-determiningregion,cdr)。
本发明提供一个核酸分子，其特征是编码seqidno.:1，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。
本发明还提供一个核酸分子，其特征是编码seqidno.:1部分结构域，通过遗传密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。可以为seqidno.:2核酸分子。
本发明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。
本发明还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸序列可以根据不同的应用目的而不同。
本发明还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体。
本发明还提供一种检测c-myc标签的方法，含有本发明所述针对c-myc标签的单域重链抗体。基于本发明提供的针对c-myc标签的单域重链抗体与c-myc标签特异性结合的能力，建立c-myc标签的检测方法。其中，优选的方法包括酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)，荧光免疫法(fluoroimmunoassay,fia)，免疫芯片法，亲和层析法和免疫层析法等。
本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，该突变体能与c-myc标签特异性结合。
本发明还涉及前述针对c-myc标签的单域重链抗体在免疫检测、富集以及纯化中的应用。这些免疫检测指的是非疾病诊断治疗目的的免疫检测。
本发明还涉及针对c-myc标签的免疫亲和吸附材料，包括载体，搭载在载体上的配基，其特征在于该材料以针对c-myc标签的纳米抗体作为配基，所述针对c-myc标签的纳米抗体具有seqidno.:1所示的氨基酸序列。载体材料不限于琼脂糖凝胶，也可以选用硅球、纳米磁珠等。
本发明所叙述的一些术语具有如下含义：
结构域：蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。
imgt编号：imgt数据库(theinternationalimmunogeneticsdatbase)中的一种已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献(ehrenman,f.,q.kaas,et.al.(2010).imgt/3dstructure-dbandimgt/domaingapalign：adatabaseandatoolforimmunoglobulinsorantibodies,tcellreceptors,mhc,igsfandmhcsf.nucleicacidsres38(databaseissue):d301-307.lefranc,m.p.,c.pommie,etal.(2003).imgtuniquenumberingforimmunoglobulinandtcellreceptorvariabledomainsandigsuperfamilyv-likedomainsdevcompimmunol27(1):55-77.)中的描述。
密码子(codon)：又称为三连体密码子(tripletcode)，指对应于某种氨基酸的核苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
具体实施方式
下面通过单域重链抗体(多肽)的制备、分析及应用，对本发明做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。
实施例1：
抗c-myc标签单域重链抗体(即针对c-myc标签的单域重链抗体)免疫文库的构建
将c-myc标签与牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)共价偶联，得到c-myc人工抗原c-myc-bsa，取300μgc-myc-bsa与弗氏完全佐剂乳化后，对羊驼(lamapacos)进行皮下多点注射免疫。加强免疫采用150μgc-myc-bsa与弗氏不完全佐剂乳化，间隔2周进行，每次免疫7天后静脉取血，采用间接elisa法测定血清效价，选择血清效价最高的样品分离淋巴细胞，提取rna。
rna的提取参照takara公司rnaiso试剂说明书进行。以rna为模板，oligodt为引物，参照takara公司反转录酶说明书合成cdna第一链。
采用primestar高保真dna聚合酶，经巢式pcr获得重链抗体的可变区编码基因(采用的引物见表1)。第一轮pcr分别以引物alpvh-ld和ch2-r扩增cdna，反应条件为，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20个循环，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。
将第一轮pcr产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳，回收600bp～750bp的dna片段，作为第二轮pcr的模板，分别用引物alpvh-sfii和alpvhhr1-noti，alpvh-sfii和alpvhhr2-noti，进行扩增，反应条件为，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5个循环，98℃，10s，68℃，40s，30个循环，72℃延伸10min。经dna片段回收试剂盒回收、定量，于-20℃保存备用。将噬菌粒phen1和pcr扩增产物分别用sfii、noti双酶切，经琼脂糖凝胶回收、定量后，以1∶3摩尔比，在16℃，过夜连接。
表1文库构建及鉴定所用的引物
注：下划线表示限制性内切酶识别序列
连接产物经乙醇沉淀后，溶于10μl无菌水，分十次进行电穿孔转化大肠杆菌tg1。取10μl电击、培养后的菌液倍比稀释，涂布氨苄青霉素2×yt培养板，计算库容。其余部分全部涂布于24cm×24cm氨苄青霉素2×yt培养板，37℃，倒置培养13～16h。用10ml，2×yt培养基将培养板上的菌苔刮洗后，加入终浓度20～30％甘油，分装，-80℃保存备用。
根据计算的库容量结果，接种10倍库容量的活细胞于20ml的2×yt(含2％葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素)，37℃，200r/min培养至od600达0.5，按感染复数20∶1加入辅助噬菌体，37℃，200r/min，60min。将培养物离心，用50ml的2×yt(含100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素)重悬沉淀，37℃，200r/min过夜培养后，8000rpm离心取上清，加入5×peg/nacl溶液，冰上放置1.5h或4℃过夜，8000rpm离心30min，重悬沉淀于含10％甘油的磷酸缓冲液(pbs，0.01m，ph7.4)，即得到抗c-myc标签单域重链抗体免疫文库，取10μl测定滴度，其余分装于-80℃保存备用。
实施例2：
抗c-myc标签单域重链抗体的淘选与鉴定
采用固相亲和淘选的方法从实施例1所得抗c-myc标签单域重链抗体免疫文库中淘选针对c-myc标签的单域重链抗体。向每个酶标孔中加入120μl用pbs稀释的myc-gst融合蛋白(myc标签与谷胱甘肽融合的蛋白)，4℃，包被过夜，每轮淘选的包被浓度分别为100，75，50μg/ml；吸出包被液，pbs洗板5次，每孔加入300μl3％bsa-pbs，37℃，封闭2h；pbs洗板5次，加入100μl噬菌体抗体文库(约含1×1011cfu)，37℃，孵育2.0h；吸出未结合的噬菌体，用pbst(含0.5％tween-20)洗板3-5次(逐轮增加5次)，再用pbs洗板15-25次；以100μl洗脱液(甘氨酸-盐酸，ph2.2)洗脱吸附在酶标孔中的噬菌体，用35μltris-hcl(1mol/l，ph8.0)中和洗脱物，取10μl用于滴度测定，其余125μl洗脱物扩增后用于下一轮淘选。
经四轮淘选后，采用辅助噬菌体km13对随机挑取的单克隆进行救援，分别得到展示抗体可变区的噬菌体颗粒，再用间接phage-elisa测定噬菌体颗粒的结合活性和特异性，实验设定对照，具体加样步骤见表2。
表2间接phage-elisa加样表
将elisa阳性克隆送生物技术服务公司进行序列测定，得到插入片段的dna序列，其编码针对c-myc标签的单域重链抗体。
dna序列(seqidno.:2)：
cagttgcagctcgtggagtcagggggaggcttggtgcagtctggggggtctctaatactctcctgctcagcctctggattcaatatatcacgatattccgtagggtggttccgcgagacctcaggagaaaagcgtgagggaatctcatgtatggacgagaatggcgacattaccgccttctcagacgccatacagggccgattcaccatctctcgagccaatgataagaatatgatatacttacacatggacgccctgaacccttcggacacggccaattatcggtgtgtcgccagttgggactgttcagcacagggttttatcacacacaagaccctcaccggcatctggggtccggggacccaggtcaccgtgtcagca
编码具有seqidno.:1所示的氨基酸序列：
qlqlvesggglvqsggslilscsasgfnisrysvgwfretsgekregiscmdengditafsdaiqgrftisrandknmiylhmdalnpsdtanyrcvaswdcsaqgfithktltgiwgpgtqvtvsa。
实施例3：
抗c-myc标签单域重链抗体的规模制备
编码抗c-myc标签单域重链抗体的dna片段的获取：1.采用限制性内切酶sfii/noti，双酶切噬菌粒phen-anti-c-myc单域重链抗体基因，琼脂糖凝胶电泳回收抗c-myc标签单域重链抗体基因；2.直接将抗c-myc标签单域重链抗体编码序列送生物技术服务公司进行化学合成；3.设计特异性引物，通过pcr技术从羊驼(lamapacos)来源的cdna库中扩增。
将得到的抗c-myc标签标签单域重链抗体基因片段克隆至表达载体pet25-flag(已将载体本身所带c-myc标签替换为flag标签：dykddddk)，经pcr和酶切鉴定，构建完成抗c-myc标签单域重链抗体的大肠杆菌表达质粒。
将表达质粒转化至大肠杆菌rosetta，挑取单菌落进行诱导表达。将单菌落接入5mllb-a(luria-bertanibrothwith100μg/mlampicillin)液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养12h；以1％培养基体积的接种量将其转接到50mllb-a液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养至od600达到0.5(约需3～3.5h)，加入终浓度0.1mm的iptg，30℃、200r/min诱导培养。
诱导培养物8000r/min离心，在细胞沉淀中加入25ml磷酸缓冲液(ph7.4)混匀，8000r/min离心，去上清，保留细胞沉淀；在细胞沉淀中加入15ml相同缓冲液，混匀，冰上超声波细胞破碎处理，超声破碎条件为200w，破碎2s，间歇5s，共250个循环，在4℃下对细胞破碎物8000r/min离心15min，取上清进行亲和层析纯化和sds-page电泳分析，或在上清中加入终浓度20％的甘油，混匀，保存于-20℃冰柜待用。
通过优化诱导表达条件(如宿主菌、表达载体、诱导培养时间、温度以及iptg浓度等)，可以进一步提高目的蛋白(单域重链抗体)表达量，为大量制备抗c-myc标签单域重链抗体提供了途径。
实施例4：
抗c-myc标签单域重链抗体的融合表达
将本发明抗c-myc标签单域重链抗体基因克隆至融合表达载体pap(含有碱性磷酸酶基因)，经pcr和酶切鉴定，构建完成抗c-myc标签单域重链抗体的碱性磷酸酶融合表达质粒。
碱性磷酸酶可以非特异性催化磷酸单酯水解生成无机磷酸和相应的醇、酚或糖类化合物。该酶常作为信号元件用于elisa、免疫印迹、组织化学等检测方法。融合表达质粒将抗c-myc标签单域重链抗体融合于碱性磷酸酶的n端，参考应用实例3中的表达方法，可以在大肠杆菌中表达、纯化出融合蛋白ap-anti-c-myc标签单域重链抗体。
实施例5：
抗c-myc标签单域重链抗体用于亲和纯化材料的制备
1)c-myc标签免疫亲和磁珠的小量制备
采用纳米磁珠作为载体，偶联抗c-myc标签单域重链抗体后，得到c-myc标签免疫磁珠，具体制备方法如下：
取1mg羧基修饰的磁珠于离心管中，加入500μl活化缓冲液(10mm，nah2po4，ph6.0)，涡旋混合均匀，磁力架回收磁珠，再用活化缓冲液洗涤3遍。分别加入2mg碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，涡旋混合后，静置25min。用偶联缓冲液(10mm，na2hpo4，ph7.4)洗涤磁珠3遍，加入溶于偶联缓冲液的抗c-myc标签单域重链抗体1mg，室温反应3.5h，用偶联缓冲液洗涤磁珠5次，加入500μl含1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)或1％(w/v)卵清蛋白(ova)的偶联缓冲液封闭未反应的活性基团，室温反应35min。用偶联缓冲液洗涤磁珠5次，pbs溶液(10mm，ph7.2，0.02％w/v，na3n)重悬后保存于4℃。
2)c-myc标签免疫亲和吸附材料及亲和柱的制备
采用琼脂糖微球作为载体，偶联抗c-myc标签单域重链抗体，具体制备方法如下：
将cnbr活化的干胶用0.1mhcl洗涤10次，每次平衡5min。用偶联缓冲液(10mm，na2hpo4，ph7.2)洗涤10次，加入抗c-myc标签单域重链抗体(2mg/每克琼脂糖微球)，室温反应3.5h，使抗c-myc标签单域重链抗体与cnbr活化的琼脂糖凝胶微球共价偶联。用偶联缓冲液(10mm，na2hpo4，ph7.2)洗涤3次后，加入封闭液室温反应2.5h以封闭未反应的活性基团。用6倍胶体积的磷酸缓冲液(10mm，ph7.2)和醋酸缓冲液(0.1m，ph4.5)交替洗涤3次，得到共价偶联了抗c-myc标签单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。取0.2ml上述免疫亲和吸附材料于容量为1ml的层析柱，8～10倍柱床体积的pbs(10mm，ph7.2)洗涤后，加入20％乙醇溶液，4℃保存。
3)c-myc标签免疫亲和吸附材料及亲和柱的制备
采用硅胶微球作为载体，偶联抗c-myc标签单域重链抗体，具体制备方法如下：
取2g硅胶微球用纯水和磷酸缓冲液(pbs，10mm，ph6.5)交替洗涤6～10次，用10mlpbs缓冲液悬浮硅胶微球，加入5mg抗c-myc标签单域重链抗体，混匀，加入终浓度5mg/ml的碳二亚胺(edc)，迅速混匀，4℃搅拌反应12～20h，得到共价偶联了抗c-myc标签单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。取0.2ml上述免疫亲和吸附材料于容量为1ml的层析柱，58～10倍柱床体积的pbs(10mm，ph6.5)洗涤后，加入含0.02％(w/v)na3n的pbs(10mm，ph6.5)，4℃保存。
4)c-myc标签亲和层析柱的吸附量、重复使用测定
用6倍柱床体积pbs(10mm，ph7.2)清洗柱子，加入蛋白样品溶液，流出液重新过柱。然后用3倍柱床体积纯水淋洗，再用甘氨酸盐酸(ph2.2)洗脱特异性吸附的含c-myc标签重组蛋白，收集的洗脱液，即为纯化后的蛋白溶液。实验结果表明，装填有1ml1)、2)、3)制备的亲和柱/磁珠可以特异性吸附目的蛋白。重复使用10次之后，回收率仍然大于80％。可以通过生物学方法大量培养生产配基为单域重链抗体，避免了人工抗体等繁琐生产方法，大大降低了生产成本，并且可重复使，应用前景广阔。
实施例6：
抗c-myc标签的纳米抗体的耐热实验
通过elisa实验对纳米抗体热稳定性进行测定，实验方法如下：
取浓度为5μg/mlmyc-gst蛋白，以每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃包被过夜；0.05％pbst洗板3次；3％的脱脂牛奶37℃封闭lh；加入稀释后的c-myc纳米抗体，每孔100μl，37℃，孵育1h；加入1：2000工作浓度hrp标记的抗his标签二抗，每孔加入100μl，37℃，孵育1h；加入tmb显色液，每孔加入100μl；在多组不同在温度下孵育30min；反应结束后，加入2m硫酸终止反应，每孔加入50μl，混匀终止反应后测定450nm吸光值。
结果显示即使温度高达70℃、80℃、90℃，蛋白活性依然具有生物活性，od450值分别为1.5、1.3、1.0，具有较好的耐热性。
sequencelisting
<110>南昌大学
<120>能特异性结合c-myc标签的纳米抗体
<130>2017
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