一种羊绒织物的分子鉴定方法与流程

本发明涉及羊绒鉴定方法领域，具体涉及一种羊绒织物的分子鉴定方法。
背景技术：
：我国是世界上主要生产山羊绒(简称羊绒)的国家之一，每年的年产量占世界总产量的70％以上，居于世界第一位，同时羊绒质量也居于世界第一位。羊绒纤维是纺织工业中的高级原料，有着“软黄金”的美称，交易以克论价。近几年来，人们的生活水平都普遍提高，对于高质量的羊绒制品更加青睐，对羊绒市场的需求也更大了。但由于羊绒价格昂贵，附加利润特别高，受利益驱使，一些不法商贩以次充好，导致市场上的掺假现象严重。例如，用羊毛、兔毛等价格较低的动物纤维冒充羊绒作为填充物。由于这些动物纤维在结构、外观形态、理化性能上与羊绒较为接近，但价格上却相差很大，从而赚取巨额差价来牟取暴利。一般这类以次充好的产品保暖性能都达不到标准，从而给消费者带来损失。因此，对羊绒织物进行鉴定，加以区分有助于杜绝市场上这种现象的出现，保证羊绒的质量以及消费者的利益。山羊属于哺乳类的家畜，一般生活在气候变化剧烈的丘陵与高山地区。因此，山羊为了能够适应寒冷的气候变化，在其粗长的根部，有一层薄薄的细软绒毛，即山羊绒(Cashmere)。山羊绒是一种稀有的动物纤维，一般在冬天较寒冷时长出，可以抵御风寒。春天气温回升之后脱落，使山羊能够自然的适应气候。羊绒的来源非常丰富，可以直接从活体上获得所要的样品。羊绒纤维柔软纤细、光泽柔和，在纺织工业中属于高档原料，用其作为原料的制品手感非常柔软，并且保暖舒适，华丽高雅。羊绒由鳞片和皮质层组成，没有髓质层。鳞片较薄，表面及边缘光滑，紧贴毛干。皮质层是纤维的主体，它是由细而长的纺锤体角质细胞顺着纤维纵轴紧密排列而成，纤维的性能主要取决于皮质层，鳞片层与皮质层共同决定了纤维的纵向和横截面的形态特征。山羊绒的强伸度、弹性变化都很好,少卷曲，匀直光滑，具有细、轻、柔软、保暖性好等优良特性。目前主要的鉴别方法有光学投影显微镜法、计算机图形分析法(扫描电子显微镜法)、染色法、溶液鉴别法、基因分析法等，具体如下：一、光学投影显微镜法光学投影显微镜法是目前最常用的方法。在纺织中，毛类纤维使用量最大的就是羊毛，羊毛纤维可分为三个组成部分：包覆在毛干外部的鳞片层。组成羊毛实体主要部分的皮质层，在毛干中心由不透明毛髓组成的髓质层。山羊绒与羊毛纤维相似,也由鳞片层和皮质层构成。光学投影显微镜由于放大倍数和景深的限制,图像分辨率较低,受样品颜色影响较大，因此，无法区分鳞片的细微结构,不能测量鳞片的边缘厚度、边缘高度,特别是对纤维表面进行了化学处理后的样品。所以，在鉴定时主观性比较强，容易产生误判。二、计算机图形分析法计算机图形分析法是通过扫描电子显微镜对羊绒和羊毛纤维实时成像，然后采集图像，将其传送到计算机系统里，并对图像进行一系列处理和计算，从而对羊绒和羊毛纤维进行识别。这种检测方法提高了客观性和准确性,也减少了对检测人员水平、经验的依赖性，但是效率比较低、速度也比较慢、反而成本比较高。三、染色法由于山羊绒具有某些特定的物理性质，例如较细、表面能高，所以其对某一类染料的吸附能力比较强。利用这一特点可以对羊绒与羊毛纤维进行鉴定。一般情况下，选择相同的处方和染料，通过观察是否出现颜色以及颜色的深浅和上色率的不同来鉴别羊绒和羊毛纤维。四、溶液鉴别法因为羊绒的鳞片层比羊毛鳞片层的薄，所以溶液更容易渗透到羊绒的纤维皮质层中。与此同时，羊绒纤维的细度比羊毛更细，使得溶液能够把整根纤维都渗透。故如果用同一种溶液对两种纤维进行处理，两种纤维的卷曲变化会有差异。然后可以借助光学显微镜观察这种差异。但是这种方法只适合对纤维的宏观形态差异进行鉴别,准确度有限。五、基因分析法首先提取样品的DNA，然后对各个样品的DNA序列的差异进行分析。在羊绒织物的分子鉴定中的应用包括分子标记法、探针杂交法以及特异性引物扩增法。这种方法的准确度很高，灵敏度好，同时客观性比较强。但是目前最大的难点就是怎样从羊绒中获得高质量的DNA。技术实现要素：针对目前市场上羊绒产品造假严重的现象，本发明提供了一种羊绒织物的分子鉴定方法，用不同的方法从纯羊绒及羊绒织物中提取到线粒体DNA(mtDNA)，利用根据设计出的cytB基因的特异性引物进行PCR(聚合酶链式反应)扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，可以定性对羊绒分子进行鉴定。一种羊绒织物的分子鉴定方法，包括以下步骤：(1)从羊绒织物中提取线粒体DNA(mtDNA)；(2)进行cytB基因的PCR扩增；(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果，如果出现暗条带，则鉴定含有羊绒成分。羊绒织物包括纯羊绒织物和非纯羊绒织物，非纯羊绒织物包括含有部分量羊绒的织物和不含有羊绒的织物。步骤(1)中，从羊绒织物中提取线粒体DNA(mtDNA)采用Biomega试剂盒法，Biomiga试剂盒包括DNA吸附柱、收集管、BL缓冲液、TL缓冲液、KB缓冲液、DNA洗涤液、洗脱缓冲液、蛋白酶K缓冲液，DNA洗涤缓冲液由DNA洗涤液经乙醇稀释得到；该方法具体包括：a.将羊绒织物样品剪碎；b.加入TL缓冲液，蛋白酶K缓冲液，DTT(二硫苏糖醇)，混匀均匀，然后温育；步骤b中，所述的温育的条件为：45℃～55℃温育20～40min。进一步优选，所述的温育的条件为：50℃温育30min。c.加入BL缓冲液，混合均匀，再加入无水乙醇，混合均匀；d.将样品移至DNA吸附柱中，包括沉淀，然后离心，倒掉液体；步骤d中，所述的离心的条件为：在9000～11000rpm条件下离心0.5～3min。进一步优选，所述的离心的条件为：在10000rpm条件下离心1min。e.向吸附柱加入KB缓冲液，离心，倒掉液体，并将吸附柱重新放在收集管中；步骤e中，所述的离心的条件为：在9000～11000rpm条件下离心0.5～3min。进一步优选，所述的离心的条件为：在10000rpm条件下离心1min。f.加入DNA洗涤缓冲液，离心，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新置于收集管中；步骤f中，所述的离心的条件为：在9000～11000rpm条件下离心0.5～3min。进一步优选，所述的离心的条件为：在10000rpm条件下离心1min。g.加入DNA洗涤缓冲液，离心，倒掉收集管中的液体并丢弃收集管，打开吸附柱的盖子，将其放置在新的收集管中；步骤g中，所述的离心的条件为：在9000～11000rpm条件下离心05～3min。进一步优选，所述的离心的条件为：在10000rpm条件下离心1min。h.离心，使吸附柱中的液体蒸发；步骤h中，所述的离心的条件为：11000～15000rpm离心2-7min，进一步优选，所述的离心的条件为：13000rpm离心4-5min注意：这一步要求吸附柱中的无水乙醇全部蒸发，以防其干扰DNA的含量和纯度。i.将吸附柱放置在灭菌环境中，然后加入洗脱缓冲液，然后温育；步骤i中，所述的洗脱缓冲液为60℃～80℃预热的洗脱缓冲液。所述的温育的条件为：60℃～80℃温育1～5min。进一步优选，所述的洗脱缓冲液为70℃预热的洗脱缓冲液。所述的温育的条件为：70℃温育3min。j.离心洗脱DNA，即为所得，得到线粒体DNA。步骤j中，所述的离心的条件为：9000～11000rpm离心0.5～3min。进一步优选，所述的离心的条件为：10000rpm离心1min。步骤f和j中，所述的DNA洗涤缓冲液采用无水乙醇稀释Biomega试剂盒中的DNA洗涤液得到。Biomega试剂盒能够快速简便的提取羊绒纤维的线粒体DNA。在提取过程中并没有使用苯酚/氯仿的等有机溶剂，提取后的产物可以直接进行PCR。在提取过程中，样品首先被裂解，DNA吸附在管内的吸附柱上。然后用洗涤液可以有效的除去细胞碎片、色素和其他蛋白质，然后用洗脱液洗脱，可以得到纯的羊绒样品的mtDNA。步骤(2)中，所述的cytB基因包括：羊绒的cytB基因的特异性引物，所述的羊绒的cytB基因的特异性引物为goat-cytb-3和goat-cytb-5，所述的goat-cytb-3为TGTGGAGGAAGGGTACAAGTACT，所述的goat-cytb-5为CATCACTAATCTTCTTTCAgCAATC。与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明设计出羊绒的cytB基因的特异性引物，goat-cytb-3为TGTGGAGGAAGGGTACAAGTACT，goat-cytb-5为CATCACTAATCTTCTTTCAgCAATC。本发明采用采用Biomega试剂盒法能够很好地从样品中提取线粒体DNA(mtDNA)，然后进行cytB基因的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，能够准确地鉴定是否含有羊绒成分，准确度高，并且，羊绒的最低检出限的百分含量为7.3％，检测效果好。附图说明图1为采用PCR仪法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图，其中，8—新疆羊绒(羊绒引物)，9—本色羊绒(羊绒引物)，10—本色羊绒(羊绒引物)，8’—新疆羊绒(羊毛引物)，9’—本色羊绒(羊毛引物)，10’—本色羊绒(羊毛引物)；图2为1、2、4、5和7号样品采用PCR仪法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图；图3为采用Promega试剂盒法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图；图4中(a)和(b)分别是采用Promega试剂盒法提取线粒体DNA后2号样品浓缩6倍(a图)和浓缩10倍(b图)后PCR的条带。图5是采用Promega试剂盒法提取线粒体DNA后1号样品浓缩10倍后PCR的条带。图6为9号样品采用Biomega试剂盒法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图；图7为1号和8号样品采用Biomega试剂盒法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图；图8为1号样品和2号样品采用Biomega试剂盒法提取线粒体DNA后浓缩20倍以及9号样品浓缩10倍后PCR的条带；图9为5、7、10号样品采用Biomega试剂盒法提取线粒体DNA后分别加入1μL模板以及2μL模板的PCR的条带。具体实施方式1、实验器材1.1羊绒样品表1羊绒样品及含量样品编号样品类型具体成分重量百分含量(％)1织物羊绒26.6羊毛73.42织物羊绒92.3羊毛7.74织物羊绒8.5羊毛90.7其他纤维0.8(净干)5织物羊绒7.5羊毛61.8兔毛30.7(含微量其他纤维)7织物羊绒7.3羊毛92.7(连结线除外)8散纤维新疆羊绒9散纤维羊绒(本色)10散纤维羊绒(本色)1.2实验材料表2主要试剂及生产厂家表3主要仪器及设备仪器名称产家VS-1300洁净工作台苏州市苏信净化设备厂立式压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司医疗设备厂西门子电冰箱博西华家用电器有限公司AL204电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司VS-15000N台式高速自动平衡离心机韩国制造CHB-100恒温金属浴杭州博日科技有限公司WH-861涡旋振荡仪南京诺泰施格科学仪器有限公司DK-S24型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司YP5102电子天平上海光正医疗仪器有限公司MG-964基因扩增仪杭州朗基科学仪器有限公司Bio-RadGelDocXR+凝胶呈像系统美国制造HE-120垂直电泳槽上海天能科技有限公司EPS-300电泳仪上海天能科技有限公司多用制胶器上海天能科技有限公司2、鉴定方法(1)从羊绒织物和羊绒纤维中提取线粒体DNA(mtDNA)；(2)进行cytB基因的PCR扩增；(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。2.1mtDNA的提取方法一：PCR仪法(1)称取一定量剪碎的羊绒，放入配置好的DNA提取液中。(2)在PCR扩增仪上设置单个循环程序，然后将含羊绒和DNA提取液的PCR管在PCR扩增仪上运行该程序。(3)程序运行结束后将PCR管瞬时离心,即为样品。样品置于-20℃保存。方法二：Promege试剂盒法Promega的DNAIQTM系统使用一种新的顺磁性树脂来纯化DNA，该试剂盒中包含有DNA纯化所需的高效裂解液。同时，有蛋白酶K的预处理协助样品的裂解。除去样品中的蛋白质和其他成分，随后用DNAIQTM系统对样品中的DNA进行纯化。方法三：Biomega试剂盒法Biomega试剂盒能够快速简便的提取羊绒纤维的线粒体DNA。在提取过程中并没有使用苯酚/氯仿的等有机溶剂，提取后的产物可以直接进行PCR。在提取过程中，样品首先被裂解，DNA吸附在管内的吸附柱上。然后用洗涤液可以有效的除去细胞碎片、色素和其他蛋白质，然后用洗脱液洗脱，可以得到纯的羊绒样品的mtDNA。2.2PCR扩增PCR的整个技术过程经若干个循环组成，一个循环包括连续的3个步骤：第1步变性：在高温条件下，使DNA模板变性，即模板DNA在94℃的条件下变性解链；第2步退火：人工合成的寡核苷酸引物与模板DNA链的3’端经在35℃条件下退火；第3步延伸：在4种dNTP底物在TaqDNA聚合酶的作用下，引物链将沿着5’—3’的方向延伸，形成与模板互补的新链。循环次数为30次。由于所加的引物是cytB基因的特异性引物，所以在PCR时加入羊绒的上下游引物就可以对羊绒织物和纤维进行鉴定。2.3琼脂糖凝胶电泳经过琼脂糖凝胶电泳可以得到羊绒的cytB基因的条带，将其与Marker条带进行对比，并观察其亮度，就可以得知其是否是羊绒的cytB基因。如果得到了羊绒的cytB基因，则可以确定该制品中含有羊绒。反之，不含羊绒成分。3实验内容3.1mtDNA的提取方法一：PCR仪法：(1)每份羊绒准确称取0.0001g，放入高压灭菌后的PCR管中；(2)配置DNA提取液。每100μLDNA提取液包括10xPCR缓冲液10μL(PH8.4的Tris-HCl100mM；KCl500mM)、25mMMgCl28μL、10mg/mL的蛋白酶K2μL、用ddH2O(双蒸水)补足体积至80μL；(3)每个装入羊绒样品的PCR管中加入50μL的DNA提取液；(4)在PCR扩增仪上进行扩增。循环程序为65℃30min，95℃15min，4℃10min，单个循环；(5)程序运行结束后，将PCR管进行离心，所得即为样品(置于-20℃保存)。方法二：Promega试剂盒法：(1)试剂配制表4Promega试剂盒法试剂配制方法(2)实验步骤a.将羊绒样品充分剪碎，称量5mg-10mg放入1.5mL离心管中。加入100μL1MDTT和75μL蛋白酶K储存液。混匀，盖紧管盖，56℃温育1h。要确保全部的样品被溶液浸没。注意：此步处理后的样品可能并没有完全溶解，但在下一步加入裂解缓冲液后将全部融化。b.在室温25℃下向样品中加入2倍体积的裂解缓冲液和7μL完全悬浮的DNAIQTM系统中的DNAIQTM树脂。高速涡旋振荡3s后室温25℃温育5min。注意：若裂解缓冲液温育后仍有可见的发根残留，可将残留物去除，液体转移至另一管中。或将残留物保留在管中，它们不会干扰DNA的纯化。c.高速涡旋振荡2s，将管子放在大磁铁上。磁分离立刻进行。小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。d.加入100μL裂解缓冲液，从磁铁上取下管子，并高速涡旋振荡2s。然后将管子放回磁铁上，并去除所有的裂解液。e.加入100μL配制的1x洗涤液，从磁铁上取下管子，并高速涡旋振荡2s。然后将管子放回磁铁上，并去除所有的洗涤液。f.重复e步骤，共洗涤三次，并确保在最后一次洗涤时，除去所有的液体。g.打开盖子，将管子放在磁铁上，空气中干燥5min。然后加入20μL的洗脱液。注意：小的洗脱体积有助于获得终浓度较高的DNA。干燥时间不要超过20min以免DNA难以洗脱。h.盖上管盖并高速涡旋振荡2s，65℃温育5min。然后取出温育的管子，高速涡旋振荡2s。立即放在磁铁上。i.将DNA溶液小心的转移到新的管子中，即为所得。方法三：Biomega试剂盒法(1)试剂配制表5Biomega试剂盒法试剂配制方法(2)实验步骤Biomiga试剂盒(提取羊绒DNA)，厂家：www.biomiga.com，型号：GD2512-01，Biomiga试剂盒包括以下成分及体积：a.将羊绒样品剪碎，称量0.005-0.01g样品于1.5mL的离心管中；b.加入250μLTL缓冲液，25μL蛋白酶K缓冲液，20μL1MDTT。涡旋振荡混匀。然后50℃温育30min。注意：温育过程中，每10min涡旋振荡一次，帮助样品溶解。c.向样品中加入250μLBL缓冲液，涡旋振荡混匀。再向样品中加入250μL无水乙醇，涡旋振荡混匀。d.将样品移至DNA吸附柱中，包括沉淀，然后在10000rpm条件下离心1min。倒掉收集管中的液体并丢弃收集管。e.将吸附柱放置在一个新的收集管中，加入500μLKB缓冲液，10000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，并将吸附柱重新放在收集管中。f.加入650μLDNA洗涤缓冲液，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新置于收集管中。g.加入650μLDNA洗涤缓冲液，10000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体并丢弃收集管，打开吸附柱的盖子，将其放置在新的收集管中。h.13000rpm离心4-5min，使吸附柱中的液体蒸发。注意：这一步要求吸附柱中的无水乙醇全部蒸发，以防其干扰DNA的含量和纯度。i.将吸附柱放置在灭菌的1.5mL离心管中，然后加入100μL70℃预热的洗脱缓冲液。然后70℃温育3min。j.10000rpm离心1min，用DNA洗涤缓冲液洗脱DNA，即为所得。3.2PCR扩增用vectorNIT设计出羊绒的cytB基因的特异性引物如下：goat-cytb-3TGTGGAGGAAGGGTACAAGTACT；goat-cytb-5CATCACTAATCTTCTTTCAgCAATC；羊毛：5’---cattgatctcccagctccatcaaatatt；3’--attgtcgcaaataggaggattactccg；羊驼：Alpaca-cytB-5cttctcttcagtcgcacacatctgc；Alpaca-cytB-3ggttttcaatgattcctgctactggcat；PCR反应体系为：表6PCR反应体系试剂体积10xPCRBuffer(withoutMgCl2)2.5μL25mMMgCl22μL16S(F)0.5μL(25μM)16S(R)0.5μL(25μM)dNTP0.5μL模板1.0μLTaq酶0.5μL加入ddH2O使体系调至25μL，简单离心混匀。设置的循环条件为：94℃10min；94℃1min、35℃45s、72℃1min，30个循环；72℃10min。3.3琼脂糖凝胶电泳称取一定量的琼脂糖，加入相应的1xTAE缓冲溶液，微波加热使其充分溶解。待温度恢复至常温时，加入微量EB溶液，然后倒入制胶器中，待其凝固。注意：倒胶时尽量不要有气泡。将3μL的样品与1μL的上样缓冲液混合均匀，点样，然后电泳。恒压100V，时间35-40min。注意：点样时动作要快，不要戳破胶孔，也不要让样品弥散在缓冲液中。3.4mtDNA的浓缩由于有些织物样品中羊绒的百分含量较低，造成提取液中的DNA浓度低，使得电泳结果并不理想。所以在提取mtDNA后可以对其浓缩，从而提高DNA的浓度。a.将样品离心，6000rpm，1min。b.放置在冰上，加入2倍无水乙醇或2/3倍异丙醇，然后在冰上放置20min左右，使DNA沉降。c.离心，12000rpm，3min，然后吸去上清液。d.将DNA沉淀干燥至完全，然后加入洗脱液，即为所得。4结果与分析4.1羊绒样品8种样品中都含有羊绒成分，8、9、10号样品为纯羊绒，其中8号样品是未处理过的，9、10号样品基本确定是未经过化学处理过的。1、2、4、5、7号样品是织物，都含有羊绒成分，具体含量见表1。4.2实验结果4.2.1PCR仪法经过多次实验，结果如表7。只有未经过任何处理的8号样品新疆羊绒有中等亮度的条带出现，其他均无亮条带出现。表7PCR仪法结果编号样品类型条带亮度1织物)_220151595(织物)_420151545(织物)_520151867(织物)_720152133(织物)_8新疆羊绒+++9本色羊绒_10本色羊绒_注：—无亮条带+暗条带++较暗条带+++中等亮度条带++++较亮条带+++++明亮条带图1为采用PCR仪法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图；注：8—新疆羊绒(羊绒引物)，9—本色羊绒(羊绒引物)，10—本色羊绒(羊绒引物)；8’—新疆羊绒(羊毛引物)，9’—本色羊绒(羊毛引物)，10’—本色羊绒(羊毛引物)。图1中，8、9、10号样品加入的引物是羊绒上下游引物，8’、9’、10’加入的引物是羊毛的上下游引物，由于8、9、10号样品是纯羊绒，所以8号样品有中等亮度条带出现，8’样品无条带出现，证明其有特异性。图2为采用PCR仪法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图；图2中，所有样品加入的均是羊绒引物，但并无条带出现。PCR仪法主要适合于带毛囊的样品，而本实验样品都不带毛囊，故效果不佳。4.2.2Promega试剂盒法经过重复性实验，使用该试剂盒提取的结果如下所示：表8Promega法结果注：—无亮条带+暗条带++较暗条带+++中等亮度条带++++较亮条带+++++明亮条带图3为采用Promega试剂盒法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图；图3中，1—10号样品PCR时模板加入1μL，1’—10’号样品PCR时模板加入2μL。由图可知，8号样品新疆羊绒加入1μL模板出现明亮条带，而加入2μL样品无条带出现。10号样品本色羊绒加入1μL模板无条带，而加入2μL样品后出现暗条带。因为在样品中有其他杂质，可能会影响酶的活性，模板加入的越多，则杂质可能越多，因此会影响酶的活性，造成无条带出现，由此可见，PCR时模板的加入量并不是越多越好。而浓缩过程中可能会造成DNA损伤，所以有时浓缩后无结果。图4中(a)和(b)分别是2号样品浓缩6倍(a图)和浓缩10倍(b图)后PCR的条带，由图可知，条带清晰较明亮。图5是1号样品浓缩10倍后PCR的条带，鉴于1号样品中羊绒含量为26.6％，故将样品1浓缩了10倍，可以看出条带清晰较明亮：总体来讲，Promega试剂盒法比PCR仪法更适合羊绒DNA的提取，提取结果较好，但如果织物中羊绒的百分含量较低，可以提取之后进行浓缩，然后再PCR、电泳。电泳后引物二聚体现象较严重，可能是因为退火温度太低导致。但是PCR过程的退火温度为35℃，属于较低的温度，当退火温度升高之后进行PCR，最后发现并无条带出现。4.2.3Biomega试剂盒法经过多次实验，使用该试剂盒提取的结果如下所示：表9Biomega试剂盒法实验结果注：—无亮条带+暗条带++较暗条带+++中等亮度条带++++较亮条带+++++明亮条带图6为9号样品采用Biomega试剂盒法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图；图6中，9号样品加入了1μL模板，出现亮条带。图7为1号和8号样品采用Biomega试剂盒法提取线粒体DNA后经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳得到的电泳结果图；图7中，1号和8号样品都加入了1μL的模板，如图可以看出，8号样品出现明亮条带，1号样品条带很暗，其他均无条带。之后各样品重新PCR，加入了2μL模板，但无条带出现。由于织物样品中羊绒百分含量大小不一，故将样品进行了浓缩,结果如下：图8为1号样品和2号样品浓缩20倍以及9号样品浓缩10倍后PCR的条带。图8中，1号样品和2号样品浓缩了20倍，出现了明亮的条带。9号样品浓缩了10倍，出现了明亮条带。但均出现拖尾现象，可能上样时样品漂了，可以增加上样缓冲液的用量，小心加样。图9为5、7、10号样品分别加入1μL模板以及2μL模板的PCR的条带。图9中，5、7、10号样品加入了1μL模板，5’、7’、10’号样品中加入了2μL模板，10号样品出现明亮的条带。7号样品1μL模板有暗条带，2μL模板无条带，可能是模板中的其他杂质影响了酶的活性。5号样品1μL和2μL模板都有暗条带，但同时出现了非特异性扩增，可能是退火温度低。之后对4、5、7号样品进行了40倍浓缩，并无条带出现。总的来说，Biomega试剂盒法是三种方法中提取效果最好的方法，但是仍然会出现引物二聚体和非特异性扩增，原因可能是因为模版中含有杂蛋白，退火温度过低，引物浓度过高，可以降低引物量，增加模板量，减少dNTP的浓度，适当降低Mg2+浓度等。经过多次重复性实验，8、9、10号纯羊绒样品利用Biomega试剂盒法都可以成功提取，之后进行cytB基因的PCR扩增，可以鉴定是羊绒成分。2号、1号织物样品羊绒百分含量分别为92.3％、26.6％，用Biomega和Promega试剂盒法提取之后，进行浓缩，也可以鉴定含有羊绒成分。5、7号织物样品中羊绒的百分含量分别为7.5％、7.3％，用Biomega试剂盒法提取出了DNA，之后进行浓缩，出现了暗条带，基本可以鉴定含有羊绒成分。4号织物样品羊绒的百分含量为8.5％，三种方法都没有提取出DNA。由实验结果可以得知，通过Biomega试剂盒法，可以鉴定出样品中含有羊绒的最低的百分含量为7.3％。当前第1页1 2 3